CN109908201A - 一种中药组合物提取物及制备工艺与应用 - Google Patents

Abstract

一种中药组合物，包括骨碎补、刺五加、北五味子，其重量比为：骨碎补2‑8，刺五加1‑5，北五味子1‑4，其主要用于制备改善动物或人学习能力、记忆能力药物中的应用及制备预防与治疗阿尔兹海默症药物中的应用。其通过常规中药提取方法获得的粗粉进行提取，提取次数为1‑3次，每次提取溶剂用量为药材质量的2‑10倍，浸泡过夜，每次提取0.5‑2h，过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏利用液‑液有机溶剂萃取法或大孔吸附树脂柱层析法。上方方法得到的提取物中总黄酮的含量可达到50.00％以上，柚皮苷含量5.00％以上，新北美圣草苷含量6.00％以上，北五味子醇甲含量3.00％以上，紫丁香苷含量5.00％以上。

Description

一种中药组合物提取物及制备工艺与应用

技术领域

本发明属于中药医药及医药应用领域，具体涉及为一种中药组合物提取物及制备工艺与应用。

背景技术

阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease，AD)是以老年人认知和记忆障碍为特征的一种慢性神经退变性疾病，是老年痴呆症中最常见的形式。据统计，2010年全球有3560万人患有痴呆，其数量预计每20年增加一倍，由于该疾病的复杂性，随着高龄人口的增加，预计到2030年患病人数将达到6570万，到2050年将达到1.545亿，AD被认为是21世纪的公共健康危机。

目前较为公认的阿尔茨海默病可能的致病机制包括β淀粉样肽(β-amyloidpeptide,AB)的自我聚集引起的神经元外淀粉样蛋白沉积以及微管相关蛋白Tau的异常磷酸化导致的胞内神经纤维缠结,二者导致的神经毒性可能是诱发神经元细胞死亡的关键因素,因此在这两个关键事件中发挥作用的一些重要蛋白与酶成为抗阿尔茨海默病药物研发的潜在靶点,包括β-secretase(BACE1)、Y-secre tase、AB42、GSK3B等。此外,抑制脑内乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性以稳定脑内神经递质乙酰胆碱的水平也是目前临床改善AD患者定状的主要手段。另一个潜在的药物研发靶点是小胶质细胞异常活化引起的IL-18、IL-6、TNF-a等炎性因子的释放。由于AD病因及相关致病机制的复杂性,有大量作用于单一靶点的候选药物均面临研发失败的风险,因此针对AD相关的多个关键靶点进行药物研发成为更为合理的选择。然而,发现同时有效作用于多个目标靶点的单一小分子成分具有相当的困难,这使得抗AD药物的单体小分子研发进展缓慢,相对而言,应用复合成分达成这一目标更易于实现。如现有技术的治疗阿尔茨海默的植物提取物201810424712.4；及北美圣草素在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用201711136772.8等相关专利都公开了相关药物在阿尔茨海默症方面的应用，这为从传统中药中发现潜在的有效成分组合提供了理论依据。

如何能发现更多的针对AD治疗的药物及药物提取物对AD的研究及未来的治疗具有非常深远的意义。

骨碎补骨碎补为硕龙骨科植物槲蕨Drynaria fortune(Kunze)J.Sm.的干燥根茎。刺五加目前主要功能为补肾，活血，止血；刺五加抗疲劳作用，增强持久力和能力，北五味子，中药名。为木兰科植物北五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实。具有收敛固涩，益气生津，补肾宁心之功效。

本发明针对骨碎补、刺五加及北五味子为对象，设计了一种包含三种药物的组合物提取物及制备工艺，并研究了提取物在AD各个靶点的作用；提供了一种中药组合物提取物及制备工艺与应用。

发明内容

一种中药组合物，包括骨碎补、刺五加、北五味子，其重量比为：骨碎补2-8，刺五加1-5，北五味子1-4。

进一步，重量比为骨碎补3-6，刺五加2-4，北五味子2-3。

进一步，骨碎补：刺五加：北五味子重量比为5：3：2。

本发明提供一种中药组合物提取物的制备工艺及应用。具体为:

一种中药组合物提取物的制备工艺，其特征在于，1)取骨碎补，刺五加及北五味子干燥药材按照重量比为骨碎补2-8，刺五加1-5，北五味子1-4比例取干燥药材；

2)配比完成后，将干燥药材粉碎成粗粉；

3)提取：使用提取溶剂对步骤(2)获得的粗粉进行提取；具体操作为：使用常规中药提取方法对步骤(1)获得的粗粉进行提取，提取次数为1-3次，每次提取溶剂用量为药材质量的2-10倍，浸泡过夜，每次提取0.5-2h，过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏；

4)利用液-液有机溶剂萃取法或大孔吸附树脂柱层析法对步骤(3)获得的浸膏进行精制；

进一步，所述骨碎补、刺五加、北五味子的重量比为：骨碎补3-6，刺五加2-4，北五味子2-3。

进一步，所述骨碎补、刺五加、北五味子的重量比为：骨碎补：刺五加：北五味子重量比为5：3：2。

进一步，用10倍药材重量的体积分数为65％的乙醇提取3次，每次1.5h；进一步，用非极性大孔吸附树脂D-101-1对组方有效成分的纯化，其静态饱和吸附量与的解吸率为298.4mg/g和95.1％，动态饱和吸附量与解吸率为46.5g/L和94.2％。

进一步，使用大孔吸附树脂柱层析法精制的过程如下：首先将步骤(3)中所得的所述浸膏分散溶解于水中，使浸膏水溶液浓度为0.01-1g/mL；然后将浓度为0.01-1g/mL的浸膏水溶液通过大孔吸附树脂，上样量以浸膏量与树脂量之比计算为1：10，吸附流速为3-9BV/h，树脂柱径高比为1：3-1：20，上样液浓度为0.01-1g/mL，水或者0-5％乙醇洗脱1-3倍树脂体积进行除杂，除杂流速为3-9BV/h，50-95％乙醇洗脱3-7倍树脂体积，洗脱流速为3-9BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得本发明的中药提取物；

进一步，使用液-液有机溶剂萃取法精制的过程如下：首先将步骤(3)中所得的所述浸膏分散溶解于水中，使浸膏水溶液浓度为0.01-1g/mL；然后将浓度为0.01-1g/mL的浸膏水溶液与中等极性有机溶剂充分混合萃取，溶液-溶剂体积比为0.5：1-5：1，静置分层后，收集有机溶剂层，萃取1-3次，收集有机溶剂层，回收溶剂，减压干燥，即得本发明的中药提取物。

进一步，提取物中总黄酮的含量可达到50.00％以上，柚皮苷含量5.00％以上，新北美圣草苷含量6.00％以上，北五味子醇甲含量3.00％以上，紫丁香苷含量5.00％以上。

进一步，该提取物制成液体制剂、油悬浮剂或颗粒制剂中的一种或多种。

进一步，以上所述的使用形式中，优选的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、颗粒、栓剂或注射剂等中的一种或多种，进一步优选片剂、胶囊或注射剂等中的一种或多种，特别优选注射剂。

进一步，颗粒制剂的制备工艺为将组方提取物500g干燥粉，加入乳糖350g，甘露醇125g混合均匀，用75％乙醇制粒，干燥，整粒，再加25g硬脂酸镁混合均匀，制成400袋。

进一步，将药物盛装到铝塑袋中。

进一步，骨碎补、刺五加、北五味子组方提取物在制备改善动物或人学习能力、记忆能力药物中的应用。

进一步，骨碎补、刺五加、北五味子组方提取物在制备预防与治疗阿尔兹海默症药物中的应用。

具体实施方式

实施例1 骨碎补，刺五加及北五味子药物组合物提取物的制备方法

取骨碎补，刺五加及北五味子干燥药材按照重量比例为骨碎补：刺五加：北五味子为5:3:2比例进行配比，配比完成后，将干燥药材粉碎成粗粉，提取：用10倍药材重量的体积分数为65％的乙醇提取3次，每次1.5h；每次提取溶剂用量为药材质量的10倍，浸泡过夜，每次提取0.5-2h，过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏；浸膏分散溶解于水中，使浸膏水溶液浓度为0.01-1g/mL；然后将浓度为0.01-1g/mL的浸膏水溶液通过大孔吸附树脂，上样量以浸膏量与树脂量之比计算为1：10，吸附流速为3-9BV/h，树脂柱径高比为1：3-1：20，上样液浓度为0.01-1g/mL，水或者0-5％乙醇洗脱1-3倍树脂体积进行除杂，除杂流速为3-9BV/h，50-95％乙醇洗脱3-7倍树脂体积，洗脱流速为3-9BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得本发明的中药提取物；用非极性大孔吸附树脂D-101-1对组方有效成分的纯化，其静态饱和吸附量与的解吸率为298.4mg/g和95.1％，动态饱和吸附量与解吸率为46.5g/L和94.2％。得到提取物中总黄酮的含量可达到50.00％以上，柚皮苷含量5.00％以上，新北美圣草苷含量6.00％以上，北五味子醇甲含量3.00％以上，紫丁香苷含量5.00％以上。

实施例2 骨碎补，刺五加及北五味子药物组合物提取物的制备方法

取骨碎补，刺五加及北五味子干燥药材按照重量比例为骨碎补：刺五加：北五味子为6:4:3比例进行配比，配比完成后，将干燥药材粉碎成粗粉，提取：用10倍药材重量的体积分数为65％的乙醇提取3次，每次1.5h；每次提取溶剂用量为药材质量的10倍，浸泡过夜，每次提取0.5-2h，过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏；浸膏分散溶解于水中，使浸膏水溶液浓度为0.01-1g/mL；然后将浓度为0.01-1g/mL的浸膏水溶液通过大孔吸附树脂，上样量以浸膏量与树脂量之比计算为1：10，吸附流速为3-9BV/h，树脂柱径高比为1：3-1：20，上样液浓度为0.01-1g/mL，水或者0-5％乙醇洗脱1-3倍树脂体积进行除杂，除杂流速为3-9BV/h，50-95％乙醇洗脱3-7倍树脂体积，洗脱流速为3-9BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得本发明的中药提取物。

实施例3 骨碎补，刺五加及北五味子药物组合物提取物的制备方法

取骨碎补，刺五加及北五味子干燥药材按照重量比例为骨碎补：刺五加：北五味子为8:5:4比例进行配比，配比完成后，将干燥药材粉碎成粗粉，提取：用10倍药材重量的体积分数为65％的乙醇提取3次，每次1.5h；每次提取溶剂用量为药材质量的10倍，浸泡过夜，每次提取0.5-2h，过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏；浸膏分散溶解于水中，使浸膏水溶液浓度为0.01-1g/mL；然后将浓度为0.01-1g/mL的浸膏水溶液通过大孔吸附树脂，上样量以浸膏量与树脂量之比计算为1：10，吸附流速为3-9BV/h，树脂柱径高比为1：3-1：20，上样液浓度为0.01-1g/mL，水或者0-5％乙醇洗脱1-3倍树脂体积进行除杂，除杂流速为3-9BV/h，50-95％乙醇洗脱3-7倍树脂体积，洗脱流速为3-9BV/h，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得本发明的中药提取物。

实施例4 骨碎补，刺五加及北五味子中药组合物提取物在提取物制备方法

取骨碎补，刺五加及北五味子干燥药材按照重量比例为骨碎补：刺五加：北五味子为5:3:2比例进行配比，配比完成后，将干燥药材粉碎成粗粉；提取：用10倍药材重量的体积分数为65％的乙醇提取3次，每次1.5h；每次提取溶剂用量为药材质量的10倍，浸泡过夜，每次提取0.5-2h，过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏；使用液-液有机溶剂萃取法精制的过程如下：首先将所得的所述浸膏分散溶解于水中，使浸膏水溶液浓度为0.01-1g/mL；然后将浓度为0.01-1g/mL的浸膏水溶液与中等极性有机溶剂充分混合萃取，溶液-溶剂体积比为0.5：1-5：1，静置分层后，收集有机溶剂层，萃取1-3次，收集有机溶剂层，回收溶剂，减压干燥，即得本发明的中药提取物。

实施例5 一种中药组合物提取物制剂的制备工艺

颗粒制剂的制备工艺为将实施例1组方提取物500g干燥粉，加入乳糖350g，甘露醇125g混合均匀，用75％乙醇制粒，干燥，整粒，再加25g硬脂酸镁混合均匀，制成400袋。

实施例6 一种中药组合物提取物灌胃给药毒性试

1、急性毒性实验

以10g/kg BW剂量(相当于成人用量的120倍)灌胃给予40只小鼠(雌雄各半)，连续灌胃14天，未出现死亡。并且，中枢神经系统及躯体运动(行为、动作、刺激反应、大脑及脊髓反射、肌肉张力)、自主神经系统(瞳孔大小、分泌)、呼吸系统(鼻孔、呼吸性质和速率)、心血管系统(心区触诊)、胃肠系统(腹形、粪便硬度和颜色)、生殖泌尿系统(阴户、乳腺、阴茎)、皮肤和毛皮(颜色、张力、完整性)、粘膜(粘膜、口腔)、眼(眼睑、眼球、透明度)、皮肤温度等均正常。

2、60天喂养试验

选用健康Wistar大鼠，雌雄各半，分别为空白对照组(灌胃给予等体积蒸馏水)、中药组合物提取物低剂量组(剂量为2.5g/kg BW)、中药组合物提取物中剂量组(剂量为5g/kgBW)、中药组合物提取物高剂量组(剂量为g/kg BW，相当于成人用量的120倍)。每组20只Wistar大鼠，雌雄各10只，每日灌胃一次，连续60天。试验期间对大鼠的外观、行为、体重、摄食量等各项指标进行检测，并分别于给药结束和恢复期结束进行血液学及血液生化学各项指标检测和病理组织学检查。

结果各剂量组大鼠活动正常，行为活泼，背毛光润，所有体征与对照组比较未见差别和异常改变。各组动物摄食量与同期对照组比较，未见毒理学意义的异常变化。对体重无负面影响。血液学和血液生化学指标与同期对照组比较，均未见毒理学意义的异常改变。各组动物器官组织均无肉眼可见的病理改变。各组间所有脏器重量及脏器系数亦均无毒理学意义的异常变化。所有镜检脏器均未发现与药物相关的病理改变。恢复期未见延迟性毒性反应，亦未见与药物有关的延迟性病理改变。表明本品具有较大的安全空间，可以长期安全使用。

稳定性考察

格按照新药标准，对三批中试样品，从外观到内在质量进行了保健功能试验用品的稳定性考察。

(1)考核方法：本品按铝塑复合袋包装，于室温条件保存，当月考核一次，以后每月考核一次，共三个月。继上述初步稳定性考核后，放置三个月再考核一次，然后每半年一次。

(2)考核项目：按药典“颗粒剂”的稳定性试验技术要求内容，定为性状、鉴别、水分、溶化性、微生物限度检查等项。

(3)考核标准：依据“临床研究用药品的质量标准”中的方法和限度要求逐项进行考核。

(4)考核结果：考察了六个月，各项指标均符合规定要求，长期稳定性仍在继续考察中。

实施例7 中药提取物对小鼠学习记忆障碍模型的影响

药物处理：取健康成年昆明种小鼠10只，为正常组，记忆获得障碍鼠30只，随机均分为3组，分别为模型组、提物组(剂量100mg·kg^-1，按实施例1的方法制备)；抗脑衰胶囊组(剂量100mg·kg-1，购置于石家庄四药有限公司)。各组均采用灌胃给药，给药体积为10ml·kg^-1，每天一次，正常组、模型组灌胃给予等量的蒸馏水，共4周。

记忆获得障碍模型制造：昆明种小鼠，训练前10min腹腔注射东莨菪碱5mg/kg BW、训练前10min腹腔注射环己酰亚胺120mg/kg BW、重测验前30min灌胃30％的乙醇10mL/(kg·bw)。

1.1新物体识别实验

实验方法：

实验分为三个阶段进行：熟悉期、训练期和测试期。第一天为熟悉期，小鼠在箱体内自由活动5min。第二天分为训练期和测试期，训练期将两个形状、大小、颜色和质地完全相同的物体，放到箱体一端，将小鼠背向物体放置在对侧箱壁中点，让其熟悉5min。1h后为测试期，用另外一个形状、大小、颜色和质地完全不同的物体替换其中一个。从相同位置放入小鼠，记录小鼠5min内对新物体的接触时间为(Tn)和对旧物体的接触时间为(Tf)。用识别指数＝(Tn-Tf)/(Tn+Tf)表示小鼠对物体的识别能力。识别指数的高低代表小鼠的记忆能力的强弱。

实验结果：

新物体识别实验结果见表，与空白组相比，模型组小鼠新物体识别指数显著减小(P<0.01)；与模型组相比，多奈哌齐组、抗脑衰胶囊组和骨碎补，刺五加，北五味子组合物提取物组小鼠新物体识别指数显著增加(P<0.01)；骨碎补，刺五加，北五味子组合物提取物组和抗脑衰胶囊组没有显著差异(P>0.05)。

表1骨碎补，刺五加，北五味子组合物提取物对APP/PS1小鼠新物体识别实验的影响(n＝15)

注：与空白组比较，**表示P<0.01；与模型组比较，##表示P<0.01。

1.2水迷宫实验测试

Morris水迷宫(MWM)由直径150cm，高70cm的圆形水池组成，水温22～24℃，水中加入适量的脱脂奶粉，使其呈现白色不透明状。并在实验过程中，每3d更换一次水。水迷宫实验由两部分组成，第一部分为，灌胃30d后，4d的定位航行实验：将圆形平台放在第四象限处，没入水下2cm，在实验过程中保持平台位置不动。于1、2、3象限规定的入水点，面向池壁将小鼠至于水迷宫中。90s内，能找到目标平台的小鼠，使其在平台上停留30s，未能找到平台的小鼠，人为将其放置在平台上30s，以加强记忆。实验结束后擦干，放回鼠笼。每天进行3次训练。(1、2、3象限入水点各一次)。实验过程中记录小鼠的逃避潜伏期。水迷宫实验第二部分，空间探索实验：撤去平台，于1、2、3象限入水点将小鼠置于水迷宫中，90s内，记录其在目标象限(第4象限)的停留时间。平台位置、有效区域(2倍平台直径区域)穿过的次数。数据采用SPSS18.0统计软件包处理。数据用平均值±标准差表示，采用单因素方差分析进行显著性分析

1.2.1定位航行实验

实验结果：结果见表2，与空白组相比，模型组小鼠潜伏期显著增加(P<0.01)与模型组相比，多奈哌齐组、抗脑衰胶囊组和骨碎补，刺五加，北五味子组合物提取物组小鼠潜伏期显著减少(P<0.01)；骨碎补，刺五加，北五味子组合物提取物组与多奈哌齐组和抗脑衰胶囊组没有显著差异(P>0.05)。

表2骨碎补，刺五加，北五味子组合物提取物对APP/PS1小鼠定位航行潜伏期的影响(n＝15)

注：与空白组比较，**表示P<0.01；与模型组比较，##表示P<0.01。

1.2.2空间探索实验

实验结果：

结果见表3，与空白组相比，模型组小鼠平台穿越次数和目标象限停留时间显著减少(P<0.01)；与模型组相比，多奈哌齐组、抗脑衰胶囊组和骨碎补，刺五加，北五味子组合物提取物组小鼠平台穿越次数和靶象限停留时间显著增加(P<0.01)；骨碎补，刺五加，北五味子组合物提取物组与多奈哌齐组和抗脑衰胶囊组没有显著差异(P>0.05)。

表3骨碎补，刺五加，北五味子组合物提取物对APP/PS1小鼠空间探索的影响(n＝15)

注：与空白组比较，**表示P<0.01；与模型组比较，##表示P<0.01。

1.3避暗实验

实验方法：避暗仪暗室底部铜栅通36v、50Hz交流电，先将小鼠放入避暗仪反应箱中训练3min，小鼠受电击逃往明室。正式测试开始时将小鼠背对洞口放入明室，小鼠进入暗室则受到电击，避暗仪自动记录5min内小鼠进入暗室的次数，即为错误次数，和首次进入暗室的时间，即为避暗潜伏期

实验结果：

结果见表4，与空白组相比，模型组小鼠逃避潜伏期显著减小，错误次数显著增加(P<0.01)；与模型组相比，多奈哌齐组、抗脑衰胶囊组和骨碎补，刺五加，北五味子组合物提取物组小鼠逃避潜伏期显著增加，错误次数显著减少(P<0.01)；骨碎补，刺五加，北五味子组合物提取物组与多奈哌齐组和抗脑衰胶囊组没有显著差异(P>0.05)。

表4骨碎补，刺五加，北五味子组合物提取物对APP/PS1小鼠避暗潜伏期及错误次数的影响(n＝15)

注：与空白组比较，**表示P<0.01；与模型组比较，##表示P<0.01。

上述实施例的说明只是用于理解本发明。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进，这些改进也将落入本发明权利要求的保护范围内。上述实施例的说明只是用于理解本发明。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进，这些改进也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种中药组合物，包括骨碎补、刺五加、北五味子，其重量比为：骨碎补2-8，刺五加1-5，北五味子1-4。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，重量比为骨碎补3-6，刺五加2-4，北五味子2-3。

3.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，骨碎补：刺五加：北五味子重量比为5：3：2。

4.一种中药组合物提取物的制备工艺，其特征在于，

1)取骨碎补，刺五加及北五味子干燥药材按照重量比为骨碎补2-8，刺五加1-5，北五味子1-4比例取干燥药材；

2)配比完成后，将干燥药材粉碎成粗粉；

3)提取：使用提取溶剂对步骤(2)获得的粗粉进行提取；具体操作为：使用常规中药提取方法对步骤(1)获得的粗粉进行提取，提取次数为1-3次，每次提取溶剂用量为药材质量的2-10倍，浸泡过夜，每次提取0.5-2h，过滤，合并滤液，减压浓缩得浸膏；

4)利用液-液有机溶剂萃取法或大孔吸附树脂柱层析法对步骤(3)获得的浸膏进行精制。

5.根据权利要求4所述的制备工艺，其特征在于，所述骨碎补、刺五加、北五味子的重量比为：骨碎补3-6，刺五加2-4，北五味子2-3。

6.根据权利要求4所述的制备工艺，其特征在于，骨碎补、刺五加、北五味子的重量比为：骨碎补：刺五加：北五味子重量比为5：3：2。

7.根据权利要求6所述的制备工艺，其特征在于，提取物中总黄酮的含量可达到50.00％以上，柚皮苷含量5.00％以上，新北美圣草苷含量6.00％以上，五味子醇甲含量3.00％以上，紫丁香苷含量5.00％以上。

8.根据权利要求6所述的制备工艺，其特征在于，用10倍药材重量的体积分数为65％的乙醇提取3次，每次1.5h；进一步，用非极性大孔吸附树脂D-101-1对组方有效成分的纯化，其静态饱和吸附量与的解吸率为298.4mg/g和95.1％，动态饱和吸附量与解吸率为46.5g/L和94.2％。

9.上述中药组合物提取物在制备改善动物或人学习能力、记忆能力药物中的应用。

10.上述中药组合物提取物在制备预防与治疗阿尔兹海默症药物中的应用。