CN104922164B - 一种治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域，特别涉及了一种治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂。其特征在于：所述的药物复合制剂的有效成分是由虫草粉、水溶性的表没食子儿茶素没食子酸酯、维生素E或/和维生素C组成，该成分的比例关系为：虫草粉的质量分数为1.5‑9%，EGCG的质量分数为0.01‑0.05%，维生素E的质量分数为0‑0.6%，维生素C的质量分数为0‑0.15%。通过试验证实，用虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合组成的复合制剂对D‑半乳糖诱导的阿尔茨海默病小鼠模型的学习记忆障碍有明显改善，降低其脑内Aβ1‑40的沉积，通过升高抗氧化酶、降低氧化产物的抗氧化应激作用及抗凋亡和抗炎作用来发挥其抗阿尔茨海默病作用。
Description
技术领域：本发明属于医药领域，特别涉及了一种治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂。
背景技术：阿尔茨海默病即老年痴呆症，是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍。随着老龄化速度的加快，阿尔茨海默病患者的人数将急剧增加，给家庭和社会带来沉重的负担，并逐渐上升为一种社会问题。因此，阿尔茨海默病的治疗也成为了科学界亟待解决的大问题。
现如今，阿尔茨海默病的病因及发病机制尚未阐明，且至今没有有效的治疗方法，其特征性病理改变为大脑皮质和海马区的细胞外老年斑形成、细胞内神经原纤维缠结以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。其中老年斑的主要成分为β淀粉样蛋白(Amyloidβ,Aβ)，Aβ的大量沉积是由β-淀粉样肽前体蛋白(Amyloid precursor protein,APP)在酶的作用下水解产生，并且通过氧化应激、钙超载和细胞凋亡等方式启动了神经细胞发生退行性改变，出现阿尔茨海默病样病变。此外，根据近些年对阿尔茨海默病发病机制的研究，阿尔茨海默病患者脑内慢性炎症反应的发生也意味着阿尔茨海默病可能是一种慢性的中枢神经系统炎症反应。星形胶质细胞作为中枢神经系统含量最多的一种细胞，参与构成了中枢神经系统的微环境，在阿尔茨海默病的病变中起重要作用。病理状态下，星形胶质细胞受Aβ的激活产生细胞炎性因子、补体等启动炎性反应，促进阿尔茨海默病的进程。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是星形胶质细胞的特异蛋白和骨架成分，其表达增强可以作为星形胶质细胞被激活的一种标志。
在探明阿尔茨海默病的病因、发病机制及防治药物的研究与开发过程中，研究并建立可靠的阿尔茨海默病动物模型具有重要的意义。到目前为止，用于阿尔茨海默病研究的动物模型很多，其中给小鼠慢性注射D-半乳糖已成为一种常见的制备方法，广泛用于阿尔茨海默病等神经退行性疾病的药理学研究。
目前，用于阿尔茨海默病的临床治疗的常用药物很多，依照其作用机制包括胆碱酯酶抑制剂、谷氨酸受体拮抗剂、吡拉西坦和其他草药制剂等。但研究发现，这些治疗措施虽然能够短暂改善症状，但由于其自身的局限性而很难长期应用，如临床应用的西药在缓解症状的同时可能产生恶心、腹泻和呕吐等胃肠道不良反应；中医辨证的治疗方法也因成分复杂而降低了药物的安全性，因此研究开发新型有效的阿尔茨海默病治疗药物具有重要意义。
发明内容：
本发明提供一种治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂，其目的是该制剂对治疗阿尔茨海默病有效，也解决了以往的常用药物存在药物不良反应、长期服用存在安全性等方面存在的问题。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂，其特征在于：所述的药物复合制剂的有效成分是由虫草粉、水溶性的EGCG、维生素E或/和维生素C组成，该成分的比例关系为：虫草粉的质量分数为1.5-9％，EGCG的质量分数为0.01-0.05％，维生素E的质量分数为0-0.6％，维生素C的质量分数为0-0.15％,维生素E和维生素C不能同时为0。
所述的虫草粉为北虫草。
所述的EGCG为绿茶中提取的多酚成分。
该药物复合制剂各组分剂量范围内，能够产生最佳抗阿尔茨海默病效应的两种优选配方如下：虫草粉、EGCG、维生素E、维生素C的质量分数分别为4.5％、0.01％、0.15％、0或者4.5％、0.25％、0、0.15％。
维生素E和维生素C为原料药。
冬虫夏草(Cordycep ssinensis Sacc,以下简称虫草)，是寄生在蝙蝠科昆虫蝙蝠蛾幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，主产于四川、青海、西藏、云南及贵州等海拔4000-5000米的山中。虫草是传统滋补强壮中药，性味甘、平，入肺、肾经，功能益肺、肾，止咳嗽，补虚损、益精气。近年来大量研究报道虫草有扩张支气管、镇静催眠及降压等作用，具有明显抗自由基、抗氧化、耐缺氧、增强记忆、抗炎、提高免疫力、促进能量代谢等独特功效。有文献报道用虫草治疗AD患者取得较好疗效，这可能与虫草所具有的明显抑制自由基反应及脂质过氧化反应，提高血浆皮质醇及睾丸酮含量，增强机体单核-巨噬细胞吞噬功能等多方面综合药理活性作用有关，且未发现明显不良副反应。且虫草的主要成分虫草素可以通过对NO合酶和COX-2基因表达负调控以及对NF-κB活性、AKT和p38磷酸化的抑制拮抗NO产物的生成。另有研究报道，蛹虫草的菌丝提取物可以抑制神经细胞凋亡，改善SD鼠中Aβ沉积导致的记忆衰退。由此看来，虫草对于改善由Aβ引起的AD的炎症反应具有良好的应用前景。
EGCG(epigallocatechin-3-gallate,为表没食子儿茶素没食子酸酯，是绿茶的一种主要多酚成分，具有抗氧化、抗癌、抗突变等活性，能够保护细胞和DNA免受损害。EGCG可以通过抗神经细胞氧化和凋亡改善与痴呆相关的学习记忆功能障碍。EGCG可促进成年小鼠大脑神经干细胞增殖，从而增加其分化产生的新生神经元数量，帮助提高学习记忆能力。维生素E(Vitamin E)是一种脂溶性维生素，又称生育酚，由于VE能捕获氧自由基使其成为最主要的抗氧化剂之一。在阿尔茨海默病相关的动物实验和细胞培养中，发现具有自由基代谢的神经保护作用，还可能通过抑制和清除脑内β-淀粉样蛋白沉积，产生延缓衰老的作用。另有研究发现，采用VE治疗阿尔茨海默病6个月后观察到，VE可以减少患者体内氧化压力，对于缩短衰老相关的端粒长度发挥重要作用。
综上所述，虫草、EGCG、维生素E因其有效的神经保护作用，在阿尔茨海默病的治疗过程中可能起到关键作用，目前国内尚未有联合应用虫草、EGCG、维生素E和维生素C在整体水平抗阿尔茨海默病方面的报道。因此，本发明拟用虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C(Vitamin C)合用组成复合制剂，并根据临床有效剂量设计了几组虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C合用的剂量，用D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠为对象，考察联合使用虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C对D-半乳糖所致模型小鼠的学习记忆能力的改善情况并对其进行评价。
所述的治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂，对D-半乳糖诱导的阿尔茨海默病小鼠模型，分别应用Morris水迷宫、被动避暗试验、生化指标检测、免疫组织化学染色以及蛋白质印迹法等实验方法观察不同剂量的北虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C合用构成的治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂对阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆障碍的改善作用及其抗氧化、抗凋亡和抗炎作用。
另外，对于单因素或两因素试验，因其因素少，试验的设计、实施与分析都比较简单。但在本实验中，在不同剂量的虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C合用的联合剂量组中需要同时考察4个试验因素，若进行全面试验，试验的规模将很大，因试验条件的限制而难于实施。因此，我们采用正交试验设计本次试验。正交试验设计就是利用正交表来安排与分析多因素试验、寻求最优水平组合的一种高效率试验设计方法，即由试验因素的全部水平组合中，挑选部分有代表性的水平组合进行试验的，通过对这部分试验结果的分析了解全面试验的情况，找出最优的水平组合。其中，本实验采用正交表L9(34)进行正交设计。
本发明的优点：
本发明所述的治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂，通过试验的结果证实，用虫草粉、 EGCG、维生素E和维生素C(虫草粉150-900mg/kg+EGCG 1-5mg/kg+VE 0-60mg/kg+VC 0-15mg/kg)合用组成的复合制剂对D-半乳糖诱导的阿尔茨海默病小鼠模型的学习记忆障碍有明显的改善作用，并可降低其脑内Aβ1-40的沉积，通过升高抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)，降低氧化产物(MDA)的抗氧化应激作用及抗凋亡和抗炎作用来发挥其抗阿尔茨海默病作用。
另外，与其它临床中应用的药物相比，用虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C合用组成的复合制剂不但成分简单、药效明确、制备容易，能够有效地发挥改善患者行为学和学习记忆功能的作用，且大剂量应用时不会产生其它不良反应，作为阿尔茨海默病患者日常生活中的用药更具安全性，因此可以广泛应用于阿尔茨海默病的治疗。
附图说明：
图1为虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用对D-半乳糖小鼠被动避暗试验中避暗潜伏期的影响示意图，n＝16；
图2为虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用对D-半乳糖小鼠被动避暗试验中明暗箱穿梭错误次数的影响示意图，n＝16；
图3为虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用对D-半乳糖小鼠皮质中过氧化氢酶(CAT)水平的影响示意图，n＝16；
图4为虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用优选剂量组对D-半乳糖小鼠被动避暗试验中避暗潜伏期的影响示意图，n＝16；
图5为虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用优选剂量组对D-半乳糖小鼠被动避暗试验中明暗箱穿梭错误次数的影响示意图，n＝16；
图6为虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用优选剂量组对D-半乳糖小鼠水迷宫定向航行试验中寻找平台潜伏期的影响示意图，n＝16；
图7为虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用优选剂量组对D-半乳糖小鼠水迷宫定向航行试验中寻找平台潜伏期距离的影响示意图，n＝16；
图8为虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用优选剂量组对D-半乳糖小鼠水迷宫空间探索试验中经过原平台所在位置的穿梭次数的影响示意图，n＝16；
图9为虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用优选剂量组对D-半乳糖小鼠水迷宫空间探索试验中目的象限停留时间的影响示意图，n＝16；
图10为免疫组织化学染色法考察虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用优选剂量组对D-半乳糖小鼠脑皮质内APP沉积水平的影响示意图；a：空白组；b：模型组；c：EGCG组；d：虫草组；e：优选组1；f：优选组2；放大倍数均为400×，n＝5；
图11为免疫组织化学染色法考察虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用优选剂量组对D-半乳糖小鼠脑海马内APP沉积水平的影响示意图；a：空白组；b：模型组；c：EGCG组；d：虫草组；e：优选组1；f：优选组2；放大倍数均为400×，n＝5；
图12为免疫组织化学染色法考察虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用优选剂量组对D-半乳糖小鼠脑皮质内Aβ1-40沉积水平的影响示意图；a：空白组；b：模型组；c：EGCG组；d：虫草组；e：优选组1；f：优选组2；放大倍数均为400×，n＝5；
图13为免疫组织化学染色法考察虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用优选剂量组对D-半乳糖小鼠脑海马内Aβ1-40沉积水平的影响示意图；a：空白组；b：模型组；c：EGCG组；d：虫草组；e：优选组1；f：优选组2；放大倍数均为400×，n＝5；
图14为免疫组织化学染色法考察虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用优选剂量组对D-半乳糖小鼠脑海马内GFAP沉积水平的影响示意图；a：空白组；b：模型组；c：EGCG组；d：虫草组；e：优选组1；f：优选组2；放大倍数均为400×，n＝5；
图15为虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用优选剂量组对D-半乳糖小鼠皮质中微量丙二醛(MDA)水平的影响示意图，n＝6；
图16为虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用优选剂量组对D-半乳糖小鼠皮质中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平的影响示意图，n＝6；
图17为虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用优选剂量组对D-半乳糖小鼠皮质中总超氧化物歧化酶(T-SOD)水平的影响示意图，n＝6；
图18为虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用优选剂量组对D-半乳糖小鼠皮质中过氧化氢酶(CAT)水平的影响示意图，n＝6；
图19为蛋白质印迹法考察虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用优选剂量组对 D-半乳糖小鼠皮质中APP蛋白表达水平的影响示意图，n＝5；
图20为蛋白质印迹法考察虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用优选剂量组对 D-半乳糖小鼠皮质中Aβ蛋白表达水平的影响示意图，n＝5；
图21为蛋白质印迹法考察虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用优选剂量组对 D-半乳糖小鼠皮质中GFAP蛋白表达水平的影响示意图，n＝5；
图22为比较例中EGCG和VE联合应用对D-半乳糖小鼠皮质中微量丙二醛(MDA)水平的影响示意图，n＝6；
图23为比较例中虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用对D-半乳糖小鼠皮质中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平的影响示意图，n＝6；
图24为比较例中虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用对D-半乳糖小鼠皮质中总超氧化物歧化酶(T-SOD)水平的影响示意图，n＝6；
图25为比较例中虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用对D-半乳糖小鼠皮质中过氧化氢酶(CAT)水平的影响示意图，n＝6；
以上图中：
EGCG为表没食子儿茶素没食子酸酯的英文缩写；
#P<0.05，##P<0.01，空白组与模型组比；*P<0.05，**P<0.01，空白组及各实验组比；△P<0.05，△△P<0.01，联合剂量组与EGCG组比；□P<0.05，□□P<0.01，联合剂量组与虫草组比。
具体实施方式：下面通过实施例对本发明加以具体描述，但本发明的技术方案并不仅局限于以下的这些实施例。
我们的实验总体上是确定了一个四种组分的复合物，这四种组分分别在各自的质量分数范围内任意组合都会对阿尔茨海默症的病理形态和认知障碍方面起到一定的缓解作用。另外，在四种组分及各自配比的基础上我们又确定了两个效果最好的配比，配比的结果是虫草粉、 EGCG、维生素E、维生素C的质量分数分别为4.5％、0.01％、0.15％、0或者4.5％、0.25％、 0、0.15％。四种组分的质量分数指的都是各自质量占最终混悬液质量的百分比，如虫草粉的质量只占最终混悬液质量的1.5-9％，等等。
实施例1
本发明提供了一种治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂，其特征在于：所述治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂的主要成分包括虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C；
水溶性的EGCG和维生素C与虫草粉混合后溶于水，再加入维生素E涡旋，形成混悬液，虫草粉的质量分数为2.0％，EGCG的质量分数为0.02％，维生素E的质量分数为0.5％，维生素C的质量分数为0.10％。
所述的治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂，对D-半乳糖所致的阿尔茨海默病模型小鼠具有减少β淀粉样蛋白聚集的作用。本发明拟用D-半乳糖诱导阿尔茨海默病模型小鼠为对象，考察虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用改善D-半乳糖所致的阿尔茨海默病模型小鼠的学习记忆能力以及其作用机制。试验分别应用Morris水迷宫、被动避暗试验、生化指标检测、免疫组织化学染色以及蛋白质印迹法等实验方法考察不同剂量的虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C合用构成的药物复合物对阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆障碍的改善作用，并初步从抗氧化、抗凋亡和抗炎的角度探讨了其治疗阿尔茨海默病作用的机理。
试验方法：
实验动物分组及给药方法：
取昆明系小鼠208只，雌雄各半，随机分成13组：空白对照组(生理盐水)、模型组(D- 半乳糖)、EGCG组、虫草组、联合组分处理组1、联合组分处理组2、联合组分处理组3、联合组分处理组4、联合组分处理组5、联合组分处理组6、联合组分处理组7、联合组分处理组8、联合组分处理组9，各联合组分处理组不同成分的剂量见图1-2，每组16只小鼠。具体给药方法如下：模型组：每日给小鼠按150mg/kg皮下注射3％的D-半乳糖一次，连续注射4周，第5周开始每日给小鼠灌胃等量的大豆油及蒸馏水混悬液一次，连续灌胃4周；药物处理组每日给小鼠按150mg/kg皮下注射3％的D-半乳糖一次，连续注射4周，第5周开始分别按以下处理对各组小鼠进行灌胃，连续给药4周：联合组分处理组1、联合组分处理组2、联合组分处理组3、联合组分处理组4、联合组分处理组5、联合组分处理组6、联合组分处理组7、联合组分处理组8、联合组分处理组9每日分别给小鼠按1.5-9％虫草粉 (150-900mg/kg)、0.01-0.05％EGCG(1-5mg/kg)、0-0.6％维生素E(0-60mg/kg)、0-0.15％维生素C(0-15mg/kg)灌胃混悬液一次；EGCG组(EGCG-2.5mg/kg)每日给小鼠按2.5mg/kg 灌胃0.05％的EGCG一次；虫草组(VE-450mg/kg)每日给小鼠按450mg/kg灌胃4.5％的虫草一次；空白对照组：每日给小鼠皮下注射等体积的生理盐水一次，连续注射4周，第5周开始每日给小鼠灌胃等量的生理盐水一次，连续灌胃4周。
其中用于灌胃的混悬液制法如下：水溶性的EGCG和维生素C与虫草粉混合后溶于水，再加入维生素E涡旋，形成混悬液。
行为学观察：
Morris水迷宫试验：Morris水迷宫为不锈钢圆形水池，直径120厘米，高60厘米，水池水深为30-40厘米，一个圆形平台直径为9厘米，藏匿于2厘米的水面下。水池内部不得有任何标记。在圆筒的上缘等距离的设定东南西北4个标记点(E、S、W、N)，作为动物入水点，以这4个入水点在水面和水桶底部的投影点，将水面和水桶部分均等的分为4个象限。按实验要求，可任意地将平台设置于某一象限的中间，适当的恒温设备使水温保持在25℃。水迷宫水池应配有良好的注水和排水设备，水池的位置一旦确定，就不要轻易变动，尤其在同一轮水迷宫的测试中。水迷宫的图像自动采集和系统，能自动地采集动物的入水位置、游泳的速度、搜索目标的所需时间、运行轨迹和搜索策略等参数，并可对所采集的各种数据进行统计和分析。实验前一天，水池中不放置平台，使小鼠在水中自由游泳2分钟，使其适应环境。正式实验包括2个部分：定向航行试验和空间探索试验。
定向航行试验：进行定向航行试验时，将平台放在固定的第二象限，不再移动。该试验训练小鼠每天4次，共5天。训练时，将小鼠面向池壁从四个入水点分别放入水池，记录鼠入水到找到水下隐蔽平台并站立于其上所需时间，作为逃避潜伏期，用秒表示，并记录从小鼠如水至找到平台通过路径的总长度，用米表示。小鼠找到平台后，让其在平台上站立30秒。若入水后60秒若小鼠仍未能找到平台，则将其轻轻从水中引导拖上平台，并停留30秒，然后进行下一次训练。每只鼠从四个入水点分别放入水池为一次训练，两次训练之间间隔120 秒。
空间探索试验：在定向航行试验结束后，也就是试验的第6天，将原来平台撤去，使其在水中寻找原平台所在位置，时间共120秒，记录小鼠在原平台所在目的象限的停留时间，用秒表示，以及小鼠穿越原平台的次数，来评价小鼠记忆重现的能力。
被动避暗实验：BA-200避暗自动测试仪，62厘米×30厘米×23厘米的活动箱分明暗两室，两室之间有一直径为3.0厘米的洞口，箱底有铜栅。试验分为训练期和正式试验期。训练前将小鼠头背着洞口放入明室，先适应环境3分钟，然后给暗室铜栅通36V电流，小鼠进入暗室后受到电击即逃到明室，铜栅持续通电5分钟，此为训练过程。24h后进行小鼠的记忆测验，记录小鼠第一次进入暗室的时间(避暗潜伏期)，以秒表示；并记录5分钟内小鼠进入暗室的次数(避暗错误次数)。若小鼠5分钟内未进入暗室，其潜伏期计作300秒计算。
病理组织形态学观察：
各组小鼠断头处死，迅速取出每组5只小鼠的大脑，放入4％多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，切片，用于免疫组化的检测。
生物化学指标的检测：
脑内SOD、GSH-Px、CAT酶活性及MDA含量的测定：取每组6只小鼠的脑组织，加入预冷的生理盐水制成10％的脑匀浆，2000rpm/分钟离心10分钟，取上清。蛋白定量后，采用羟胺法按试剂盒说明测定脑组织总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性；按试剂盒说明测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性；采用硫代巴比妥酸法测定脑组织丙二醛(MDA)含量；采用可见光法按试剂盒说明测定脑组织过氧化氢酶(CAT)活性。
蛋白质印迹法观察D-半乳糖模型小鼠的APP、Aβ、GFAP蛋白表达水平：
分别取各组5只小鼠的大脑皮质和海马，立即放入预冷的RIPA裂解缓冲液(RIPA：PMSF＝1000：1)中，冰上超声匀浆3次，放置5分钟，4℃，12 000×g离心5分钟，取上清，用BCA试剂盒测定总蛋白含量，以BSA为标准品。用10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，蛋白上样量为每孔50μg。中央泳道加入彩虹Maker 5μL，用于蛋白带分子量的确定。浓缩胶电泳约1小时，分离胶电泳约1小时后，将凝胶中的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，取出后以磷酸盐吐温缓冲液(PBS中加入0.1％(v/v)吐温20)洗膜液洗膜10分钟×3次，将膜放入含5％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液中，摇床上室温封闭120分钟；磷酸盐吐温缓冲液洗膜10分钟×3次后，将膜放入一抗APP(1:1000)、Aβ(1:1000)、GFAP(1:1000)、摇床上室温孵育过夜；磷酸盐吐温缓冲液洗膜10分钟×3次；辣根酶标记山羊抗兔IgG(1:3000)、山羊抗鼠IgG(1:3000)室温摇床上孵育振荡120分钟，磷酸盐吐温缓冲液洗膜10分钟×3次；使用发光液(A:B＝1:1)发光并显影。将蛋白印迹显影图扫描，利用凝胶自动分析成FluorChem V2.0软件(AlphaInnotech Corp.,USA)对蛋白带进行灰度值(分别以目的蛋白的整合密度值比内参β-actin(1:3000)的整合密度值)分析。
统计学分析：实验数据用x±s表示，数据采用SPSS 16.0统计分析软件包进行统计学处理，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Turkey HSD post hoc test法进行统计学分析；对于不服从正态分布的数据，如动物活动次数，穿梭次数等指标，使用非参检验 Kruskal–Wallis H test法进行统计学分析；设定检验水准为α＝0.05，P>0.05差异无显著性， P<0.05差异具有显著性。
结果：
1.正交试验设计筛选出虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用中影响AD的优选剂量组
根据SPSS16.0“Data”菜单中的“Orthogonal Design”(正交设计模
块),以避暗试验潜伏期和避暗试验穿梭错误次数为测定指标,采用L9(34)正交试验表考察虫草粉、EGCG、VE和VC四种处理因素联合应用对D-半乳糖小鼠避暗试验中学习记忆能力的影响。因素水平表中(附表1)，A、B、C、D分别代表北虫草粉、EGCG、VE和VC四种药物，1、2、3分别代表不同药物的处理剂量。正交表L9(34)中(附表2)，1-9分别代表联合组分处理组中A、B、C、D各组分的剂量。
以上实例，以避暗试验潜伏期和避暗试验穿梭错误次数为因变量，北虫草粉、EGCG、 VE和VC为处理因素，用SPSS16.0进行如下步骤：①数据统计：活数据管理窗口，定义变量名：实验结果避暗试验潜伏期以Result表示，处理因素虫草粉、EGCG、VE和VC分别用 A、B、C、D表示,按顺序输入相应数值，建立数据库。②整理分析：打开“Analyze”菜单，进入“General Linear Models”子菜单,选中“Univariate”命令,打开对话框。将因变量“result”选入“Dependent variable”框，因素变量A、B、C、D选入“Fixed Factors”框。单击主对话框中Model，打开模型对话框。选中Custom单选项，指定要求分析的4主效应(即A、B、C、D)，单击 Continue，返回主对话框。单击主对话框中Options，打开选项对话框，在“Foctor(s)and Factor Interaction”框中选择“因素变量”并送入“Display Means for”框。单击Continue,返回主对话框。单击OK完成。
附表3显示了以避暗试验穿梭错误次数为因变量时各因素不同水平的平均值,从结果直观分析,各因素水平对避暗试验潜伏期影响的强弱顺序是:A2>A1>A3,B1>B3>B2,C2>C1>C3， D3>D2>D1。从附表4分析,A、B、C、D影响因素主次顺序为:B>A>C>D,确定最佳工艺为A2B1C2D3，即恰巧为联合组分处理组4。
2.被动避暗试验和阿尔茨海默病小鼠脑组织中CAT的检测验证优选组分的抗AD作用
通过被动避暗试验对各组小鼠避暗潜伏期(图7)和明暗箱穿梭错误次数(图8)的检测，对各组小鼠学习记忆能力的影响进行了考察。结果显示，与空白组相比，模型组小鼠的避暗潜伏期明显缩短(P<0.01)，错误次数也明显增加(P<0.01)，这提示了D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠存在学习与记忆障碍；而与模型组相比，EGCG组(EGCG-2.5mg/kg)、虫草组(虫草-450mg/kg)以及联合组分处理组1-9小鼠避暗潜伏期均明显延长(P<0.05)，进入暗室的次数明显减少(P<0.05)，且联合组分处理组4的避暗潜伏期明显优于EGCG组、虫草组(P<0.05) 和其他联合组分处理组，说明虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用可改善D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠的学习记忆障碍，且联合组分处理组4是优于其他剂量组合的配方。
另外，如表1及图9所示，与空白组相比，模型组小鼠脑组织CAT活性明显降低(P<0.01)，与模型组相比，联合组分处理组4能显著提高小鼠脑组织CAT的活性(P<0.01)，且明显优于 EGCG组、虫草组(P<0.05)和其他联合组分处理组，说明虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用可以通过抗神经细胞的氧化应激改善与痴呆相关的学习记忆功能障碍，且联合组分处理组4是优于其他剂量组合的配方。
综上所述，利用正交试验设计的结果筛选出的联合组分处理组4是优于其他剂量组合的优选配方，具有明显的抗阿尔茨海默病相关的学习记忆功能障碍的作用，我们将通过以下实验对此进行进一步的验证，以下用优选组1代表联合组分处理组4。
3.北虫草粉、EGCG、VE和VC联用对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠被动避暗试验结果的影响
通过被动避暗试验对各组小鼠避暗潜伏期(图10)和明暗箱穿梭错误次数(图11)的检测，对各组小鼠学习记忆能力的影响进行了考察。结果显示，与空白组相比，模型组小鼠的避暗潜伏期明显缩短(P<0.01)，错误次数也明显增加(P<0.01)；而与模型组相比，EGCG组(EGCG-2.5mg/kg)、虫草组(虫草-450mg/kg)以及优选组1小鼠避暗潜伏期明显延长 (P<0.05)，进入暗室的次数明显减少(P<0.05)，且优选组1的避暗潜伏期明显优于EGCG 组、虫草组(P<0.01)，说明优选组1可改善D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠的学习记忆障碍。
4.北虫草粉、EGCG、VE和VC联用对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠Morris水迷宫结果的影响
定向航行试验:通过对各组小鼠进行为时5天的训练，可得到各组小鼠在训练连续5天期间寻找平台潜伏期(图12)和寻找平台潜伏期距离(图13)的趋势图。试验结果显示，试验开始第1天，联合组分处理组4的寻找平台潜伏期和寻找平台潜伏期距离相对于模型组未显示明显差异。从试验开始第2天至第5天，随着训练次数的增加，各组小鼠的寻找平台潜伏期和寻找平台所经过的路径长度有缩短趋势，且与空白组相比，模型组小鼠的寻找平台潜伏期和寻找平台所经过的路径长度均有显著差异(P<0.01)，并且随着训练时间的延长，模型组小鼠的这两项指标并未呈现出学习记忆过程的特征，这意味着D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠产生了明显的学习记忆障碍。另外，与模型组相比，优选组1的寻找潜伏期和寻找平台路径长度显著缩短(P<0.05)，且第四天、第五天的寻找平台潜伏期距离明显短于EGCG组、虫草组(P<0.05)，结果表明北虫草粉、EGCG、VE和VC联合处理特别是优选组1可以改善D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠的学习与记忆障碍。
空间探索试验：通过对各组小鼠进行为时5天的训练后，于第6天撤去原来的平台，分别对小鼠在原平台所在位置的穿梭次数(图14)以及原平台所在位置停留时间(图15)进行观察，以考察虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠记忆再现能力的影响。模型组小鼠的在原平台所在位置的穿梭次数(P<0.01)以及原平台所在目的象限的停留时间(P<0.01)均较空白组小鼠显著减少，说明D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠的记忆再现能力出现明显障碍；而优选组1小鼠在目的象限的停留时间(P<0.01)和在原平台所在位置穿梭次数(P<0.01)均比模型组小鼠明显延长，且优于EGCG组、虫草组，这说明经过虫草粉、EGCG、VE和VC联合处理特别是优选组1可改善D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠的记忆再现能力低下状况。
5.北虫草粉、EGCG、VE和VC联合处理对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠皮质和海马内APP、Aβ1-40、GFAP表达的影响
APP蛋白免疫组化染色结果显示(图16～17)，与空白组相比，D-半乳糖诱导阿尔茨海默病模型组小鼠皮质和海马内均可见大量APP阳性细胞表达，胞浆着色较深，整合光密度值显著增高(P<0.01)，这说明D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠脑内存在APP的异常沉积。与模型组相比，优选组1小鼠的脑皮质和海马区APP阳性细胞表达明显减少(P<0.01)，胞浆着色变浅，且优于EGCG组、虫草组(P<0.05)，说明虫草粉、EGCG、VE和VC联合处理特别是优选组1可改善D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠皮质和海马内APP的异常沉积。
Aβ1-40蛋白免疫组化染色结果显示(图18～19)，与空白组相比，D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠皮质和海马均可见大量棕黄色Aβ1-40阳性细胞表达，胞浆着色较深，整合光密度值显著增高(P<0.01)，这说明D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠脑内存在Aβ1-40的异常沉积。与模型组相比，优选组1小鼠的脑皮质和海马区Aβ1-40阳性细胞表达明显减少(P<0.01)，且胞浆着色变浅，明显优于EGCG组和虫草组(P<0.01)，说明虫草粉、EGCG、VE和VC联合处理特别是优选组1可改善D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠皮质和海马内Aβ1-40的异常沉积。
GFAP蛋白免疫组化染色结果显示(图20～21)，与空白组相比，D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠海马内可见大量GFAP细胞表达，胞浆着色较深，整合光密度值显著增高 (P<0.01)，这说明D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠脑内存在星形胶质细胞的异常激活。与模型组相比，优选组1小鼠海马区GFAP阳性细胞表达明显减少(P<0.01)，且明显优于EGCG 组、虫草组(P<0.01)，说明虫草粉、EGCG、VE和VC联合处理特别是优选组1可改善D- 半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠海马内异常的炎症反应。
6.北虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠生物化学指标的影响
如表1及图21～24所示，与空白组相比，模型组小鼠脑组织CAT、GSH-Px、SOD活性明显降低(P<0.01)，MDA含量明显升高(P<0.01)，与模型组相比，优选组1能显著提高小鼠脑组织SOD和GSH-Px、CAT的活性(P<0.05)，显著降低MDA含量(P<0.01)，且CAT、GSH-Px、SOD活性优于EGCG组、虫草组，说明虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用特别是优选组1 可以通过抗神经细胞的氧化应激改善与痴呆相关的学习记忆功能障碍。
表1虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病模型小鼠生物化学指标的影响(
n＝6)
#P<0.05，##P<0.01，空白组与模型组比；*P<0.05，**P<0.01，空白组及各实验组比；△P<0.05，△△P<0.01，联合剂量组与EGCG组比；□P<0.05，□□P<0.01，联合剂量组与虫草组比。
7.蛋白质印迹法检测虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠脑内APP、Aβ、GFAP蛋白表达的影响
应用蛋白质印迹法分别对各组D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠大脑皮质内Aβ、APP、 GFAP蛋白表达水平进行分析。结果显示，与空白组相比，模型组小鼠脑组织APP、Aβ、GFAP 蛋白表达明显升高(P<0.01)，与模型组相比，优选组1小鼠脑组织内APP、Aβ、GFAP蛋白表达明显降低(P<0.01)，且与单独应用EGCG或者虫草时相比，APP、Aβ、GFAP蛋白表达降低，见图25，说明虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用特别是优选组1可以明显降低D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠脑内Aβ相关蛋白的表达和异常炎症反应的发生。
实施例2
本发明提供了一种治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂，其特征在于：所述治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂的主要成分包括虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C；
水溶性的EGCG和维生素C与虫草粉混合后溶于水，再加入维生素E涡旋，形成混悬液，虫草粉的质量分数为4.5％，EGCG的质量分数为0.01％，维生素E的质量分数为0.1％，维生素C的质量分数为0.15％。
所述的治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂，对D-半乳糖所致的阿尔茨海默病模型小鼠具有减少β淀粉样蛋白聚集的作用。本发明拟用D-半乳糖诱导阿尔茨海默病模型小鼠为对象，考察虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用改善D-半乳糖所致的阿尔茨海默病模型小鼠的学习记忆能力以及其作用机制。试验分别应用Morris水迷宫、被动避暗试验、生化指标检测、免疫组织化学染色以及蛋白质印迹法等实验方法考察不同剂量的虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C合用构成的药物复合物对阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆障碍的改善作用，并初步从抗氧化、抗凋亡和抗炎的角度探讨了其治疗阿尔茨海默病作用的机理。
试验方法：
实验动物分组及给药方法：
取昆明系小鼠208只，雌雄各半，随机分成13组：空白对照组(生理盐水)、模型组(D- 半乳糖)、EGCG组、虫草组、联合组分处理组1、联合组分处理组2、联合组分处理组3、联合组分处理组4、联合组分处理组5、联合组分处理组6、联合组分处理组7、联合组分处理组8、联合组分处理组9，各联合组分处理组不同成分的剂量见图1-2，每组16只小鼠。具体给药方法如下：模型组：每日给小鼠按150mg/kg皮下注射3％的D-半乳糖一次，连续注射4周，第5周开始每日给小鼠灌胃等量的大豆油及蒸馏水混悬液一次，连续灌胃4周；药物处理组每日给小鼠按150mg/kg皮下注射3％的D-半乳糖一次，连续注射4周，第5周开始分别按以下处理对各组小鼠进行灌胃，连续给药4周：联合组分处理组1、联合组分处理组2、联合组分处理组3、联合组分处理组4、联合组分处理组5、联合组分处理组6、联合组分处理组7、联合组分处理组8、联合组分处理组9每日分别给小鼠按1.5-9％虫草粉 (150-900mg/kg)、0.01-0.05％EGCG(1-5mg/kg)、0-0.6％维生素E(0-60mg/kg)、0-0.15％维生素C(0-15mg/kg)灌胃混悬液一次；EGCG组(EGCG-2.5mg/kg)每日给小鼠按2.5mg/kg 灌胃0.05％的EGCG一次；虫草组(VE-450mg/kg)每日给小鼠按450mg/kg灌胃4.5％的虫草一次；空白对照组：每日给小鼠皮下注射等体积的生理盐水一次，连续注射4周，第5周开始每日给小鼠灌胃等量的生理盐水一次，连续灌胃4周。
其中用于灌胃的混悬液制法如下：水溶性的EGCG和维生素C与虫草粉混合后溶于水，再加入维生素E涡旋，形成混悬液。
行为学观察：
Morris水迷宫试验：Morris水迷宫为不锈钢圆形水池，直径120厘米，高60厘米，水池水深为30-40厘米，一个圆形平台直径为9厘米，藏匿于2厘米的水面下。水池内部不得有任何标记。在圆筒的上缘等距离的设定东南西北4个标记点(E、S、W、N)，作为动物入水点，以这4个入水点在水面和水桶底部的投影点，将水面和水桶部分均等的分为4个象限。按实验要求，可任意地将平台设置于某一象限的中间，适当的恒温设备使水温保持在25℃。水迷宫水池应配有良好的注水和排水设备，水池的位置一旦确定，就不要轻易变动，尤其在同一轮水迷宫的测试中。水迷宫的图像自动采集和系统，能自动地采集动物的入水位置、游泳的速度、搜索目标的所需时间、运行轨迹和搜索策略等参数，并可对所采集的各种数据进行统计和分析。实验前一天，水池中不放置平台，使小鼠在水中自由游泳2分钟，使其适应环境。正式实验包括2个部分：定向航行试验和空间探索试验。
定向航行试验：进行定向航行试验时，将平台放在固定的第二象限，不再移动。该试验训练小鼠每天4次，共5天。训练时，将小鼠面向池壁从四个入水点分别放入水池，记录鼠入水到找到水下隐蔽平台并站立于其上所需时间，作为逃避潜伏期，用秒表示，并记录从小鼠如水至找到平台通过路径的总长度，用米表示。小鼠找到平台后，让其在平台上站立30秒。若入水后60秒若小鼠仍未能找到平台，则将其轻轻从水中引导拖上平台，并停留30秒，然后进行下一次训练。每只鼠从四个入水点分别放入水池为一次训练，两次训练之间间隔120 秒。
空间探索试验：在定向航行试验结束后，也就是试验的第6天，将原来平台撤去，使其在水中寻找原平台所在位置，时间共120秒，记录小鼠在原平台所在目的象限的停留时间，用秒表示，以及小鼠穿越原平台的次数，来评价小鼠记忆重现的能力。
被动避暗实验：BA-200避暗自动测试仪，62厘米×30厘米×23厘米的活动箱分明暗两室，两室之间有一直径为3.0厘米的洞口，箱底有铜栅。试验分为训练期和正式试验期。训练前将小鼠头背着洞口放入明室，先适应环境3分钟，然后给暗室铜栅通36V电流，小鼠进入暗室后受到电击即逃到明室，铜栅持续通电5分钟，此为训练过程。24h后进行小鼠的记忆测验，记录小鼠第一次进入暗室的时间(避暗潜伏期)，以秒表示；并记录5分钟内小鼠进入暗室的次数(避暗错误次数)。若小鼠5分钟内未进入暗室，其潜伏期计作300秒计算。
病理组织形态学观察：
各组小鼠断头处死，迅速取出每组5只小鼠的大脑，放入4％多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，切片，用于免疫组化的检测。
生物化学指标的检测：
脑内SOD、GSH-Px、CAT酶活性及MDA含量的测定：取每组6只小鼠的脑组织，加入预冷的生理盐水制成10％的脑匀浆，2000rpm/分钟离心10分钟，取上清。蛋白定量后，采用羟胺法按试剂盒说明测定脑组织总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性；按试剂盒说明测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性；采用硫代巴比妥酸法测定脑组织丙二醛(MDA)含量；采用可见光法按试剂盒说明测定脑组织过氧化氢酶(CAT)活性。
蛋白质印迹法观察D-半乳糖模型小鼠的APP、Aβ、GFAP蛋白表达水平：
分别取各组5只小鼠的大脑皮质和海马，立即放入预冷的RIPA裂解缓冲液(RIPA：PMSF＝1000：1)中，冰上超声匀浆3次，放置5分钟，4℃，12 000×g离心5分钟，取上清，用BCA试剂盒测定总蛋白含量，以BSA为标准品。用10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，蛋白上样量为每孔50μg。中央泳道加入彩虹Maker 5μL，用于蛋白带分子量的确定。浓缩胶电泳约1小时，分离胶电泳约1小时后，将凝胶中的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，取出后以磷酸盐吐温缓冲液(PBS中加入0.1％(v/v)吐温20)洗膜液洗膜10分钟×3次，将膜放入含5％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液中，摇床上室温封闭120分钟；磷酸盐吐温缓冲液洗膜10分钟×3次后，将膜放入一抗APP(1:1000)、Aβ(1:1000)、GFAP(1:1000)、摇床上室温孵育过夜；磷酸盐吐温缓冲液洗膜10分钟×3次；辣根酶标记山羊抗兔IgG(1:3000)、山羊抗鼠IgG(1:3000)室温摇床上孵育振荡120分钟，磷酸盐吐温缓冲液洗膜10分钟×3次；使用发光液(A:B＝1:1)发光并显影。将蛋白印迹显影图扫描，利用凝胶自动分析成FluorChem V2.0软件(AlphaInnotech Corp.,USA)对蛋白带进行灰度值(分别以目的蛋白的整合密度值比内参β-actin(1:3000)的整合密度值)分析。
统计学分析：实验数据用
表示，数据采用SPSS 16.0统计分析软件包进行统计学处理，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Turkey HSD post hoc test法进行统计学分析；对于不服从正态分布的数据，如动物活动次数，穿梭次数等指标，使用非参检验 Kruskal–Wallis H test法进行统计学分析；设定检验水准为α＝0.05，P>0.05差异无显著性， P<0.05差异具有显著性。
结果：
1.正交试验设计筛选出北虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用中影响AD的优选剂量组根据SPSS16.0“Data”菜单中的“Orthogonal Design”(正交设计模
块),以避暗试验潜伏期和避暗试验穿梭错误次数为测定指标,采用L9(34)正交实验表考察虫草粉、EGCG、VE和VC四种处理因素联合应用对D-半乳糖小鼠避暗试验中学习记忆能力的影响。因素水平表中(附表1)，A、B、C、D分别代表虫草粉、EGCG、VE和VC四种药物，1、2、3分别代表不同药物的处理剂量。正交表L9(34)中(附表2)，1-9分别代表联合组分处理组中A、B、C、D各组分的剂量。
以上实例，以避暗试验潜伏期和避暗试验穿梭错误次数为因变量，虫草粉、EGCG、VE 和VC为处理因素，用SPSS16.0进行如下步骤：①数据统计：活数据管理窗口，定义变量名：实验结果避暗试验潜伏期以Result表示，处理因素虫草粉、EGCG、VE和VC分别用A、B、 C、D表示,按顺序输入相应数值，建立数据库。②整理分析：打开“Analyze”菜单，进入“GeneralLinear Models”子菜单,选中“Univariate”命令,打开对话框。将因变量“result”选入“Dependent variable”框，因素变量A、B、C、D选入“Fixed Factors”框。单击主对话框中Model，打开模型对话框。选中Custom单选项，指定要求分析的4主效应(即A、B、C、D)，单击Continue，返回主对话框。单击主对话框中Options，打开选项对话框，在“Foctor(s)andFactor Interaction”框中选择“因素变量”并送入“Display Means for”框。单击Continue,返回主对话框。单击OK 完成。
附表5显示了以避暗试验潜伏期为因变量时各因素不同水平的平均值，从结果直观分析，各因素水平对避暗试验潜伏期影响的强弱顺序是:A2>A3>A1,B1≥B2>B3,C1>C3>C2， D3≥D1>D2。从附表6分析，A、B、C、D影响因素主次顺序为:A>B>C>D，确定最佳工艺为A2B1(2)C1D(1)3，即组分最接近联合组分处理组5，本实施例中暂以联合组分处理组5代替此最优处方检验其对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠的影响。
2.被动避暗试验和阿尔茨海默病小鼠脑组织中CAT的检测验证两组优选组分的抗AD作用
通过被动避暗试验对各组小鼠避暗潜伏期(图7)和明暗箱穿梭错误次数(图8)的检测，对各组小鼠学习记忆能力的影响进行了考察。结果显示，与空白组相比，模型组小鼠的避暗潜伏期明显缩短(P<0.01)，错误次数也明显增加(P<0.01)，这提示了D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠存在学习与记忆障碍；而与模型组相比，EGCG组(EGCG-2.5mg/kg)、虫草组(虫草-450mg/kg)以及联合组分处理组1-9小鼠避暗潜伏期均明显延长(P<0.05)，进入暗室的次数明显减少(P<0.05)，且联合组分处理组5的避暗潜伏期优于EGCG组、虫草组，说明虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用特别是联合组分处理组5的配比可改善D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠的学习记忆障碍。
另外，如表2及图9所示，与空白组相比，模型组小鼠脑组织CAT活性明显降低(P<0.01)，与模型组相比，联合组分处理组5能显著提高小鼠脑组织CAT的活性(P<0.01)，且明显优于 EGCG组、虫草组(P<0.05)，说明虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用特别是联合组分处理组5的配比可以通过抗神经细胞的氧化应激改善与痴呆相关的学习记忆功能障碍。
综上所述，利用正交试验设计的结果筛选出的联合组分处理组5是优于其他剂量组合的优选配方，具有明显的抗阿尔茨海默病相关的学习记忆功能障碍的作用，我们将通过以下实验对此进行进一步的验证，以下用优选组2代表联合组分处理组5。
3.虫草粉、EGCG、VE和VC联用对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠被动避暗试验结果的影响
通过被动避暗试验对各组小鼠避暗潜伏期(图10)和明暗箱穿梭错误次数(图11)的检测，对各组小鼠学习记忆能力的影响进行了考察。结果显示，与空白组相比，模型组小鼠的避暗潜伏期明显缩短(P<0.01)，错误次数也明显增加(P<0.01)；而与模型组相比，EGCG组(EGCG-2.5mg/kg)、虫草组(虫草-450mg/kg)以及优选组2小鼠避暗潜伏期均明显延长 (P<0.05)，进入暗室的次数明显减少(P<0.05)，且优选组2的避暗潜伏期优于EGCG组、虫草组，说明优选组2可改善D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠的学习记忆障碍。
4.虫草粉、EGCG、VE和VC联用对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠Morris水迷宫结果的影响
定向航行试验:通过对各组小鼠进行为时5天的训练，可得到各组小鼠在训练连续5天期间寻找平台潜伏期(图12)和寻找平台潜伏期距离(图13)的趋势图。试验结果显示，试验开始第1天，优选组2的寻找平台潜伏期和寻找平台潜伏期距离相对于模型组未显示明显差异。从试验开始第2天至第5天，随着训练次数的增加，各组小鼠的寻找平台潜伏期和寻找平台所经过的路径长度有缩短趋势，且与空白组相比，模型组小鼠的寻找平台潜伏期和寻找平台所经过的路径长度均有显著差异(P<0.01)，并且随着训练时间的延长，模型组小鼠的这两项指标并未呈现出学习记忆过程的特征，这意味着D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠产生了明显的学习记忆障碍。另外，与模型组相比，优选组2的寻找潜伏期和寻找平台路径长度显著缩短(P<0.05)，且第四天、第五天的寻找平台潜伏期距离明显短于EGCG组、虫草组(P<0.05)，结果表明虫草粉、EGCG、VE和VC联合处理特别是优选组2可以改善D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠的学习与记忆障碍。
空间探索试验：通过对各组小鼠进行为时5天的训练后，于第6天撤去原来的平台，分别对小鼠在原平台所在位置的穿梭次数(图14)以及原平台所在位置停留时间(图15)进行观察，以考察虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠记忆再现能力的影响。模型组小鼠的在原平台所在位置的穿梭次数(P<0.01)以及原平台所在目的象限的停留时间(P<0.01)均较空白组小鼠显著减少，说明D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠的记忆再现能力出现明显障碍；而优选组2小鼠在目的象限的停留时间(P<0.01)和在原平台所在位置穿梭次数(P<0.01)均比模型组小鼠明显延长，且明显优于EGCG组、虫草组，这说明经过虫草粉、EGCG、VE和VC联合处理特别是优选组2可改善D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠的记忆再现能力低下状况。
5.优选组2联合处理对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠皮质和海马内APP、Aβ1-40、GFAP 表达的影响
APP蛋白免疫组化染色结果显示(图16～17)，与空白组相比，D-半乳糖诱导阿尔茨海默病模型组小鼠皮质和海马内均可见大量APP阳性细胞表达，胞浆着色较深，整合光密度值显著增高(P<0.01)，这说明D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠脑内存在APP的异常沉积。与模型组相比，优选组2小鼠的脑皮质和海马区APP阳性细胞表达明显减少(P<0.01)，胞浆着色变浅，且明显优于EGCG组、虫草组(P<0.05)，说明虫草粉、EGCG、VE和VC联合处理特别是优选组2可改善D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠皮质和海马内APP的异常沉积。
Aβ1-40蛋白免疫组化染色结果显示(图18～19)，与空白组相比，D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠皮质和海马均可见大量棕黄色Aβ1-40阳性细胞表达，胞浆着色较深，整合光密度值显著增高(P<0.01)，这说明D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠脑内存在Aβ1-40的异常沉积。与模型组相比，优选组2小鼠的脑皮质和海马区Aβ1-40阳性细胞表达明显减少(P<0.01)，且胞浆着色变浅，优于EGCG组和虫草组，说明虫草粉、EGCG、VE和VC联合处理特别是优选组2可改善D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠皮质和海马内Aβ1-40的异常沉积。
GFAP蛋白免疫组化染色结果显示(图20)，与空白组相比，D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠海马内可见大量GFAP细胞表达，胞浆着色较深，整合光密度值显著增高(P<0.01)，这说明D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠脑内存在星形胶质细胞的异常激活。与模型组相比，优选组2小鼠海马区GFAP阳性细胞表达明显减少(P<0.01)，且优于EGCG组、虫草组，说明虫草粉、EGCG、VE和VC联合处理特别是优选组2可改善D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠海马内异常的炎症反应。
6.虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠生物化学指标的影响
如表2及图21～24所示，与空白组相比，模型组小鼠脑组织CAT、GSH-Px、SOD活性明显降低(P<0.01)，MDA含量明显升高(P<0.01)，与模型组相比，优选组2能显著提高小鼠脑组织SOD和GSH-Px、CAT的活性(P<0.05)，降低MDA含量，且CAT、GSH-Px、SOD活性优于EGCG组、虫草组，说明虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用特别是优选组2可以通过抗神经细胞的氧化应激改善与痴呆相关的学习记忆功能障碍。
表2虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病模型小鼠生物化学指标的影响(
n＝6)
#P<0.05，##P<0.01，空白组与模型组比；*P<0.05，**P<0.01，空白组及各实验组比；△P<0.05，△△P<0.01，联合剂量组与EGCG组比；□P<0.05，□□P<0.01，联合剂量组与虫草组比。
7.蛋白质印迹法检测虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠脑内APP、Aβ、GFAP蛋白表达的影响
应用蛋白质印迹法分别对各组D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠大脑皮质内Aβ、APP、 GFAP蛋白表达水平进行分析。结果显示，与空白组相比，模型组小鼠脑组织APP、Aβ、GFAP 蛋白表达明显升高(P<0.01)，与模型组相比，优选组2小鼠脑组织内APP、Aβ、GFAP蛋白表达明显降低(P<0.01)，且与单独应用EGCG或者虫草时相比，APP、Aβ、GFAP蛋白表达明显降低，说明虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用特别是优选组2可以明显降低D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠脑内Aβ相关蛋白的表达和异常炎症反应的发生。
实施例3
本发明提供了一种治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂，其特征在于：所述治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂的主要成分包括虫草粉、EGCG和维生素E；
水溶性的EGCG与虫草粉混合后溶于水，再加入维生素E涡旋，形成混悬液，虫草粉的质量分数为8.6％，EGCG的质量分数为0.03％，维生素E的质量分数为0.6％。
所述的治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂，对D-半乳糖所致的阿尔茨海默病模型小鼠具有减少β淀粉样蛋白聚集的作用。本发明拟用D-半乳糖诱导阿尔茨海默病模型小鼠为对象，考察虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用改善D-半乳糖所致的阿尔茨海默病模型小鼠的学习记忆能力以及其作用机制。试验分别应用Morris水迷宫、被动避暗试验、生化指标检测、免疫组织化学染色以及蛋白质印迹法等实验方法考察不同剂量的虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C合用构成的药物复合物对阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆障碍的改善作用，并初步从抗氧化、抗凋亡和抗炎的角度探讨了其治疗阿尔茨海默病作用的机理。
试验方法：
实验动物分组及给药方法：
取昆明系小鼠224只，雌雄各半，随机分成14组：空白对照组(生理盐水)、模型组(D- 半乳糖)、EGCG组、虫草组、联合组分处理组1、联合组分处理组2、联合组分处理组3、联合组分处理组4、联合组分处理组5、联合组分处理组6、联合组分处理组7、联合组分处理组8、联合组分处理组9，最高剂量处理组。各联合组分处理组不同成分的剂量见图1-2，每组16只小鼠。具体给药方法如下：模型组：每日给小鼠按150mg/kg皮下注射3％的D-半乳糖一次，连续注射4周，第5周开始每日给小鼠灌胃等量的大豆油及蒸馏水混悬液一次，连续灌胃4周；药物处理组每日给小鼠按150mg/kg皮下注射3％的D-半乳糖一次，连续注射4周，第5周开始分别按以下处理对各组小鼠进行灌胃，连续给药4周：联合组分处理组 1、联合组分处理组2、联合组分处理组3、联合组分处理组4、联合组分处理组5、联合组分处理组6、联合组分处理组7、联合组分处理组8、联合组分处理组9、联合组分处理组10每日分别给小鼠按1.5-9％虫草粉(150-900mg/kg)、0.01-0.05％EGCG(1-5mg/kg)、0-0.6％维生素E(0-60mg/kg)、0-0.15％维生素C(0-15mg/kg)灌胃混悬液一次，其中，联合组分处理组 10按1.5％虫草粉(150mg/kg)、0.01％EGCG(1mg/kg)，即各组分的最低剂量灌胃混悬液一次；EGCG组(EGCG-2.5mg/kg)每日给小鼠按2.5mg/kg灌胃0.05％的EGCG一次；虫草组(VE-450mg/kg)每日给小鼠按450mg/kg灌胃4.5％的虫草一次；空白对照组：每日给小鼠皮下注射等体积的生理盐水一次，连续注射4周，第5周开始每日给小鼠灌胃等量的生理盐水一次，连续灌胃4周。
其中用于灌胃的混悬液制法如下：水溶性的EGCG和维生素C与虫草粉混合后溶于水，再加入维生素E涡旋，形成混悬液。
生物化学指标的检测：
脑内SOD、GSH-Px、CAT酶活性及MDA含量的测定：取每组6只小鼠的脑组织，加入预冷的生理盐水制成10％的脑匀浆，2000rpm/分钟离心10分钟，取上清。蛋白定量后，采用羟胺法按试剂盒说明测定脑组织总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性；按试剂盒说明测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性；采用硫代巴比妥酸法测定脑组织丙二醛(MDA)含量；采用可见光法按试剂盒说明测定脑组织过氧化氢酶(CAT)活性。
统计学分析：实验数据用
表示，数据采用SPSS 16.0统计分析软件包进行统计学处理，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Turkey HSD post hoc test法进行统计学分析；对于不服从正态分布的数据，如动物活动次数，穿梭次数等指标，使用非参检验 Kruskal–Wallis H test法进行统计学分析；设定检验水准为α＝0.05，P>0.05差异无显著性， P<0.05差异具有显著性。
结果：
虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠生物化学指标的影响
如表3所示，与空白组相比，模型组小鼠脑组织CAT、GSH-Px、SOD活性明显降低 (P<0.01)，MDA含量明显升高(P<0.01)，与模型组相比，优选组1、优选组2和最低剂量处理组能显著提高小鼠脑组织SOD和GSH-Px、CAT的活性(P<0.05)，显著降低MDA含量(P<0.01)，且CAT、GSH-Px、SOD活性优于EGCG组、虫草组。从图中还可以看出优选组1、优选组2 小鼠脑组织SOD和GSH-Px、CAT的活性明显高于最低剂量处理组，且MDA含量明显低于最低剂量处理组，说明最低剂量虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用的抗神经细胞的氧化应激作用不如筛选出的两种最优剂量联合应用的作用明显，也就是说,虫草粉、EGCG、维生素 E、维生素C的质量分数分别为4.5％、0.01％、0.15％、0或者4.5％、0.25％、0、0.15％时可以明显改善D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠的学习与记忆障碍，效果优于其他配比。
表3虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病模型小鼠生物化学指标的影响(
n＝6)
#P<0.05，##P<0.01，空白组与模型组比；*P<0.05，**P<0.01，空白组及各实验组比；△P<0.05，△△P<0.01，联合剂量组与EGCG组比；□P<0.05，□□P<0.01，联合剂量组与虫草组比。
实施例4
本发明提供了一种治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂，其特征在于：所述治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂的主要成分包括虫草粉、EGCG和维生素C；
水溶性的EGCG和维生素C与虫草粉混合后溶于水，再加入维生素C涡旋，形成混悬液，虫草粉的质量分数为5％，EGCG的质量分数为0.02％，维生素C的质量分数为0.12％。
所述的治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂，对D-半乳糖所致的阿尔茨海默病模型小鼠具有减少β淀粉样蛋白聚集的作用。本发明拟用D-半乳糖诱导阿尔茨海默病模型小鼠为对象，考察虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用改善D-半乳糖所致的阿尔茨海默病模型小鼠的学习记忆能力以及其作用机制。试验分别应用Morris水迷宫、被动避暗试验、生化指标检测、免疫组织化学染色以及蛋白质印迹法等实验方法考察不同剂量的虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C合用构成的药物复合物对阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆障碍的改善作用，并初步从抗氧化、抗凋亡和抗炎的角度探讨了其治疗阿尔茨海默病作用的机理。
试验方法：
实验动物分组及给药方法：
取昆明系小鼠224只，雌雄各半，随机分成14组：空白对照组(生理盐水)、模型组(D- 半乳糖)、EGCG组、虫草组、联合组分处理组1、联合组分处理组2、联合组分处理组3、联合组分处理组4、联合组分处理组5、联合组分处理组6、联合组分处理组7、联合组分处理组8、联合组分处理组9，最高剂量处理组，各联合组分处理组不同成分的剂量见图1-2，每组16只小鼠。具体给药方法如下：模型组：每日给小鼠按150mg/kg皮下注射3％的D-半乳糖一次，连续注射4周，第5周开始每日给小鼠灌胃等量的大豆油及蒸馏水混悬液一次，连续灌胃4周；药物处理组每日给小鼠按150mg/kg皮下注射3％的D-半乳糖一次，连续注射4周，第5周开始分别按以下处理对各组小鼠进行灌胃，连续给药4周：联合组分处理组 1、联合组分处理组2、联合组分处理组3、联合组分处理组4、联合组分处理组5、联合组分处理组6、联合组分处理组7、联合组分处理组8、联合组分处理组9每日分别给小鼠按1.5-9％虫草粉(150-900mg/kg)、0.01-0.05％EGCG(1-5mg/kg)、0-0.6％维生素E(0-60mg/kg)、0-0.15％维生素C(0-15mg/kg)灌胃混悬液一次，其中，最高剂量处理组按9％虫草粉(900mg/kg)、 0.05％EGCG(5mg/kg)、0.6％维生素E(60mg/kg)、0.15％维生素C(15mg/kg)，即各组分的最高剂量灌胃混悬液一次；EGCG组(EGCG-2.5mg/kg)每日给小鼠按2.5mg/kg灌胃0.05％的EGCG一次；虫草组(VE-450mg/kg)每日给小鼠按450mg/kg灌胃4.5％的虫草一次；空白对照组：每日给小鼠皮下注射等体积的生理盐水一次，连续注射4周，第5周开始每日给小鼠灌胃等量的生理盐水一次，连续灌胃4周。
其中用于灌胃的混悬液制法如下：水溶性的EGCG和维生素C与虫草粉混合后溶于水，再加入维生素E涡旋，形成混悬液。
生物化学指标的检测：
脑内SOD、GSH-Px、CAT酶活性及MDA含量的测定：取每组6只小鼠的脑组织，加入预冷的生理盐水制成10％的脑匀浆，2000rpm/分钟离心10分钟，取上清。蛋白定量后，采用羟胺法按试剂盒说明测定脑组织总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性；按试剂盒说明测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性；采用硫代巴比妥酸法测定脑组织丙二醛(MDA)含量；采用可见光法按试剂盒说明测定脑组织过氧化氢酶(CAT)活性。
统计学分析：实验数据用x±s表示，数据采用SPSS 16.0统计分析软件包进行统计学处理，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Turkey HSD post hoc test法进行统计学分析；对于不服从正态分布的数据，如动物活动次数，穿梭次数等指标，使用非参检验 Kruskal–Wallis H test法进行统计学分析；设定检验水准为α＝0.05，P>0.05差异无显著性， P<0.05差异具有显著性。
结果：
虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠生物化学指标的影响
如表4所示，与空白组相比，模型组小鼠脑组织CAT、GSH-Px、SOD活性明显降低 (P<0.01)，MDA含量明显升高(P<0.01)，与模型组相比，优选组1、优选组2和最高剂量处理组能显著提高小鼠脑组织SOD和GSH-Px、CAT的活性(P<0.05)，显著降低MDA含量(P<0.01)，且CAT、GSH-Px、SOD活性优于EGCG组、虫草组。从图中还可以看出优选组1、优选组2 小鼠脑组织SOD和GSH-Px、CAT的活性明显高于最低剂量处理组、且MDA含量明显低于最高剂量处理组，说明最高剂量虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用的抗神经细胞的氧化应激作用不如筛选出的两种最优剂量联合应用的作用明显，也就是说,虫草粉、EGCG、维生素 E、维生素C的质量分数分别为4.5％、0.01％、0.15％、0或者4.5％、0.25％、0、0.15％时可以明显改善D-半乳糖诱导阿尔茨海默病小鼠的学习与记忆障碍，效果优于其他配比。
表4虫草粉、EGCG、VE和VC联合应用对D-半乳糖诱导阿尔茨海默病模型小鼠生物化学指标的影响(
n＝6)
#P<0.05，##P<0.01，空白组与模型组比；*P<0.05，**P<0.01，空白组及各实验组比；△P<0.05，△△P<0.01，联合剂量组与EGCG组比；□P<0.05，□□P<0.01，联合剂量组与虫草组比。
附表1为虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用对D-半乳糖小鼠作用的正交设计因素水平表；
附表2为虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用对D-半乳糖小鼠作用的正交设计的四因素三水平正交表；
L9(34)
附表3为虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用对D-半乳糖小鼠避暗试验明暗箱穿梭错误次数的正交设计中得出的单因素统计表；
附表4为虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用对D-半乳糖小鼠避暗试验明暗箱穿梭错误次数的正交设计中得出的方差分析表；
Tests of Between-Subjects Effects
DependentVariable：穿梭次数
附表5为虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用对D-半乳糖小鼠避暗试验潜伏期的正交设计中得出的单因素统计表；
附表6为虫草粉、EGCG、维生素E和维生素C联合应用对D-半乳糖小鼠避暗试验潜伏期的正交设计中得出的方差分析表；
通过试验结果证实，用虫草粉、表没食子儿茶素没食子酸酯、维生素E和维生素C合用组成的复合制剂对D-半乳糖诱导的阿尔茨海默病小鼠模型的学习记忆障碍有明显的改善作用，并可降低其脑内Aβ1-40的沉积，通过升高抗氧化酶，降低氧化产物的抗氧化应激作用及抗凋亡和抗炎作用来发挥其抗阿尔茨海默病作用。另外，与其它临床中应用的药物相比，用虫草粉、表没食子儿茶素没食子酸酯、维生素E和维生素C合用组成的复合制剂不但成分简单、药效明确、制备容易，能够有效地发挥改善患者行为学和学习记忆功能的作用，且大剂量应用时不会产生其它不良反应，作为阿尔茨海默病患者日常生活中的用药更具安全性，因此可以广泛应用于阿尔茨海默病的治疗。
Tests of Between-Subjects Effects
DependentVariable潜伏期
Claims (1)
1.一种治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂，其特征在于：所述治疗阿尔茨海默病的药物复合制剂的有效成分是虫草粉、水溶性的EGCG、维生素E和维生素C；其质量分数分别为4.5%、0.05%、0.15%、0或者4.5%、0.025%、0、0.15%；其中，所述的虫草粉为北虫草粉，所述的维生素E为原料药，所述的维生素C为原料药；所述的EGCG为绿茶中提取的多酚成分；所述各有效成分的质量分数是以虫草粉、水溶性的EGCG、维生素E、维生素C制备的混悬液的质量为100%计算得出的。
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