CN1559519A - 一种夏枯草提取物及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种夏枯草提取物,其特征在于,所述提取物的活性成分总酚酸的含量为60-70%,迷迭香酸的含量为14%-21%。本发明还公开了该种夏枯草提取物的制备方法与新用途。本发明夏枯草提取物的酚酸部位具有抗炎、镇痛作用,对类风湿性关节炎具有确切的治疗作用,且其酚酸部位具有增强免疫抑制作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种中草药提取物,特别是一种夏枯草提取物;本发明还涉及该提取物的制备方法与用途。
背景技术
夏枯草始载于《神农本草经》,是最常用的中药材之一,现载于2000版《中国药典》一部,为唇形科植物夏枯草(Prunella.vulgaris L.)的干燥果穗。具有清火,明目,散结,消肿之功效。夏枯草中降糖素是降血糖作用的有效成分之一,其降糖机理在于修复胰島细胞,使胰島素分泌正常,从而达治疗目的。醇提物对小鼠血糖的影响的实验中发现,该提取物可对抗肾上腺素升高血糖作用,具有改善糖耐量、增加肝糖元合成的作用,机制可能与促进胰岛素分泌或增加组织对糖转化利用有关。熊果酸及衍生物对细胞P388、L1210和人体肺肿瘤细胞A-549均具有显著的细胞毒作用。在研究植物对SGC-7901细胞的影响,发现抗增殖和诱导肿瘤细胞凋亡是其抗肿瘤作用机制之一。夏枯草皂苷具有明显抗艾滋病毒作用。夏枯草总苷对麻醉大鼠急性心肌梗死的保护作用及降血压作用研究中表明本植物的降血压作用与其总皂苷有关。此外,在现有技术中,还没有提出其它新的提取物及其新用途。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足,提出一种新的夏枯草提取物。
本发明所要解决的另一技术问题是提出了该新的夏枯草提取物的制备方法。
本发明还提出了该种新的夏枯草提取物的医药用途。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。
一种夏枯草提取物,其特点是,所述提取物的活性成份总酚酸的含量为60-70%,迷迭香酸的含量为14%-21%。
本发明还公开了一种夏枯草提取物的制备方法,其特点是,取夏枯草药材,分别以药材4~12倍量的40~85%乙醇回流提取2~4次,每次1~2.5小时,滤过,合并醇提液,回收乙醇至无醇味,浓缩至相对密度至1.0~1.15,静置冷藏12~36小时,倾出上清液,加醇至含醇量达60~75%,加入浓氨水使PH等于7~8,回收乙醇,浓缩液加5-15%的HCL调PH为3~4,用乙酸乙酯萃取5-7次,每次用量为浓缩液的2~4倍,回收乙酸乙酯至密度为1.30~1.40的稠膏,真空干燥,粉碎即得。
本发明还公开了另一种夏枯草提取物的制备方法,其特点是,取夏枯草药材,分别以药材4~12倍量的40~85%乙醇回流提取2-4次,每次1~2.5小时,滤过,水煎液浓缩至密度为1.0~1.15,上大孔树脂柱,用8-10倍柱体积水洗脱,水洗液弃去,再用12~14倍柱体积的50%~70%的乙醇洗脱,收集洗脱液,回收乙醇至密度为1.3-1.4的稠膏,真空干燥,粉碎即得。
本发明还公开了另一种夏枯草提取物的制备方法,其特点是,取夏枯草药材,分别以药材4~12倍量的40~85%乙酸乙酯回流提取2-4次,每次1~2.5小时,滤过,回收乙酸乙酯液并浓缩至密度为1.3-1.4的稠膏,加药材0.5~1.0倍量的0.1~0.5%的NaOH溶解,再用10~20%的HCL调PH至3-4,加乙酸乙酯萃取5-7次,合并乙酸乙酯萃取液,回收乙酸乙酯并浓缩至密度达1.3-1.4的稠膏,真空干燥,粉碎即得。
以上所述的夏枯草提取物的制备方法,其特点是,所述提取物的干膏得率为1.5%-3.5%。
本发明还公开了一种夏枯草提取物制剂,其特点是,以所述的夏枯草提取物为活性成份,加入医用辅料,制成任何一种剂型的药剂。
本发明还公开了以上述的夏枯草提取物作为活性成份在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。
类风湿性关节炎(RA)是一种常见的以慢性多关节炎症为主要表现的全身性自身免疫性疾病。临床表现为关节疼痛、关节肿胀、晨间僵直。该病在美国被视为影响人类健康的五大疾病之一,它使数以百万计的病人丧失生活和工作能力,严重的还会导致死亡。据WHO提供的数字,全球有1%的人患有类风湿性关节炎,仅中国就有1000多万。治疗RA的药物分为两类:一类药是非甾体类抗炎药(NSAIDs),具有镇痛和消炎作用;另一类药物为缓解疾病的抗风湿药物,包括金制剂、青霉胺、抗疟药、柳氮、磺吡啶、皮质激素和免疫抑制剂等。
与现有技术相比,本发明提出了一种新的夏枯草提取物及其制备方法与医药用途。经药效学实验证明,本发明夏枯草提取物的酚酸部位具有抗炎、镇痛作用,对类风湿性关节炎具有确切的治疗作用,且其酚酸部位具有增强免疫抑制作用,与目前中药治疗类风湿性关节炎的机制、趋势相符,酚酸部位所选活性与雷公藤多甙片有异曲同工的作用。
具体实施方式
实施例1。一种夏枯草提取物,所述提取物的活性成份总酚酸的含量为70%,迷迭香酸的含量为21%。
实施例2。一种夏枯草提取物的制备方法,取夏枯草药材,分别以药材6、8、10倍量的60%乙醇回流提取3次,每次2小时,滤过,合并醇提液,回收乙醇至无醇味,浓缩至相对密度至1.10,静置冷藏24小时,倾出上清液,加醇至含醇量达65%,加入浓氨水使PH等于8,回收乙醇,浓缩液加10%的HCL调PH为3,用乙酸乙酯萃取6次,每次用量为浓缩液的3倍,回收乙酸乙酯至密度为1.35的稠膏,真空干燥,粉碎即得。
实施例3。一种夏枯草提取物,所述提取物的活性成份总酚酸的含量为65%,迷迭香酸的含量为18%。其制备方法是,取夏枯草药材,分别以药材4、5、6、7倍量的40%乙醇回流提取4次,每次1小时,滤过,合并醇提液,回收乙醇至无醇味,浓缩至相对密度至1.0,静置冷藏12小时,倾出上清液,加醇至含醇量达60%,加入浓氨水使PH等于8,回收乙醇,浓缩液加5%的HCL调PH为4,用乙酸乙酯萃取5次,每次用量为浓缩液的4倍,回收乙酸乙酯至密度为1.30的稠膏,真空干燥,粉碎即得。
实施例4。一种夏枯草提取物,所述提取物的活性成份总酚酸的含量为60%,迷迭香酸的含量为14%。其制备方法是,取夏枯草药材,分别以药材10、12倍量的85%乙醇回流提取2次,每次2.5小时,滤过,合并醇提液,回收乙醇至无醇味,浓缩至相对密度至1.15,静置冷藏36小时,倾出上清液,加醇至含醇量达75%,加入浓氨水使PH等于7.5,回收乙醇,浓缩液加5-15%的HCL调PH为3.5,用乙酸乙酯萃取7次,每次用量为浓缩液的2倍,回收乙酸乙酯至密度为1.40的稠膏,真空干燥,粉碎即得。所述提取物的干膏得率为1.5%。
实施例5。一种夏枯草提取物的制备方法,取夏枯草药材,分别以药材7、9、11倍量的60%乙醇回流提取3次,每次1.5小时,滤过,水煎液浓缩至密度为1.0,上大孔树脂柱,用9倍柱体积水洗脱,水洗液弃去,再用13倍柱体积的60%的乙醇洗脱,收集洗脱液,回收乙醇至密度为1.35的稠膏,真空干燥,粉碎即得。
实施例6。一种夏枯草提取物,所述提取物的活性成份总酚酸的含量为68%,迷迭香酸的含量为20%。其制备方法是,取夏枯草药材,分别以药材4、5、6、7倍量的50%乙醇回流提取4次,每次1小时,滤过,水煎液浓缩至密度为1.10,上大孔树脂柱,用8倍柱体积水洗脱,水洗液弃去,再用12倍柱体积的50%的乙醇洗脱,收集洗脱液,回收乙醇至密度为1.3的稠膏,真空干燥,粉碎即得。所述提取物的干膏得率为2.5%。
实施例7。一种夏枯草提取物,所述提取物的活性成份总酚酸的含量为62%,迷迭香酸的含量为16%。其制备方法是,取夏枯草药材,分别以药材12、12倍量的85%乙醇回流提取2次,每次2.5小时,滤过,水煎液浓缩至密度为1.15,上大孔树脂柱,用10倍柱体积水洗脱,水洗液弃去,再用14柱体积的70%的乙醇洗脱,收集洗脱液,回收乙醇至密度为1.4的稠膏,真空干燥,粉碎即得。所述提取物的干膏得率为3.5%。
实施例8。一种夏枯草提取物的制备方法,其特征在于,取夏枯草药材,分别以药材5、6、7、8倍量的70%乙酸乙酯回流提取4次,每次1小时,滤过,回收乙酸乙酯液并浓缩至密度为1.3的稠膏,加药材0.7倍量的0.25%的NaOH溶解,再用15%的HCL调PH至3.5,加乙酸乙酯萃取6次,合并乙酸乙酯萃取液,回收乙酸乙酯并浓缩至密度达1.35的稠膏,真空干燥,粉碎即得。所述提取物的干膏得率为2%。
实施例9。一种夏枯草提取物,所述提取物的活性成份总酚酸的含量为69%,迷迭香酸的含量为19%。其制备方法是,取夏枯草药材,分别以药材10、12倍量的65%乙酸乙酯回流提取2次,每次2.5小时,滤过,回收乙酸乙酯液并浓缩至密度为1.4的稠膏,加药材1.0倍量的0.5%的NaOH溶解,再用20%的HCL调PH至4,加乙酸乙酯萃取7次,合并乙酸乙酯萃取液,回收乙酸乙酯并浓缩至密度这1.4的稠膏,真空干燥,粉碎即得。
实施例10。一种夏枯草提取物,所述提取物的活性成份总酚酸的含量为70%,迷迭香酸的含量为20%。其制备方法是,取夏枯草药材,分别以药材8、10、12倍量的85%乙酸乙酯回流提取3次,每次2小时,滤过,回收乙酸乙酯液并浓缩至密度为1.35的稠膏,加药材0.5倍量的0.1%的NaOH溶解,再用10%的HCL调PH至3,加乙酸乙酯萃取5次,合并乙酸乙酯萃取液,回收乙酸乙酯并浓缩至密度达1.3的稠膏,真空干燥,粉碎即得。
实施例11。一种夏枯草提取物制剂,取实施例1所述的夏枯草提取物150克,取糊精60克,按常规药剂学工艺制成片剂1000片。用于治疗类风湿性关节炎。
实施例12。一种夏枯草提取物制剂,取实施例2所述的夏枯草提取物150克,取淀粉75克,按常规药剂学工艺制成颗粒剂1000袋。用于治疗类风湿性关节炎。
实施例13。一种夏枯草提取物制剂,取实施例9所述的夏枯草总酚酸提取物150克,加入PEG4000 300克,按常规药剂学工艺制成软胶囊1000粒。用于治疗类风湿性关节炎。
实施例14。夏枯草提取物药效实验。
1、夏枯草药材分别以药材10倍、12倍、8倍量的65%乙醇回流提取3次,每次2.5小时,滤过,合并醇提液,回收乙醇至无醇味,浓缩至相对密度至1.15,静置冷藏24小时,倾出上清液,加醇至含醇量达70%,加入浓氨水使PH=8,回收乙醇,浓缩液加10%的HCL调PH=3,用乙酸乙酯萃取6次,每次用量为浓缩液的3倍,回收乙酸乙酯至稠膏(ρ=1.30),真空干燥,粉碎,加辅料,按常规药剂学工艺制成胶囊剂。该胶囊剂以下简称为XKC-AB1。
2、夏枯草药材分别以药材8倍、10倍、12倍量的85%乙醇回流提取3次,每次1.5小时,滤过,水煎液浓缩至ρ=1.0,上大孔树脂柱(D101型,样品量与树脂量为1∶2),先用水洗脱(水量10BV,流速2BV/h),水洗液弃去,再用12柱体积的60%的乙醇洗脱,收集洗脱液,回收乙醇至稠膏(ρ=1.4),真空干燥,粉碎,加辅料,按常规药剂学工艺制成片剂。该片剂以下简称为XKC-AB2。
3、夏枯草药材分别以药材8倍、10倍、12倍量的70%乙醇回流提取3次,每次2.5小时,滤过,回收乙酸乙酯液并浓缩至稠膏(ρ=1.35),加药材1.0倍量的0.5%的NaOH溶解,再用20%的HCL调PH=4,加乙酸乙酯萃取6次,合并乙酸乙酯萃取液,回收乙酸乙酯并浓缩至稠膏(ρ=1.4),真空干燥,粉碎,加辅料,按常规药剂学工艺制成颗粒剂。该颗粒剂以下简称为XKC-AB3。
下面分别以上述的3种方法制成的制剂做药效实验。
(一)、XKC-AB1的药效实验。
1、实验材料
1-1药品与试剂
药品:XKC-AB1,口服,每粒含生药5-7g,由江苏康缘药业股份有限公司提供,临用前用蒸馏水配成所需浓度。批号:030509
痹冲剂,辽宁省本溪第三制药厂与泰国合资,批号:020303。
试剂:
卡介苗,卫生部上海生物制品研究所提供,批号:020701,制备成弗氏(Freund’s)完全佐剂。
角叉菜胶,辽宁省药物研究所产品。
伊文思蓝(Evan’s,blue),上海化学试剂采购供应站,批号030118。
冰醋酸,江苏省启东市精细化工二厂,批号:020128,临用前配成0.6%醋酸溶液。
1-2动物
SD大鼠、ICR小鼠,均出南京中医药大学实验动物中心提供,合格证:苏动(质)02004。
1-3仪器
722型分光关度计,上海分析仪器厂。
2000CA型液闪分析仪,Packard公司。
奥林巴斯显微镜,日本。
1-4统计方法
表1、2、3、6、7、8、11、12,13、14、15采用t检验,表4采用u检验。
2、实验方法
2-1 XKC-AB1对佐剂性关节炎的影响
2-1-1对原发病变的影响
取雄性大鼠40只,160g±20g,随机分为五组,即(1)生理盐水组:生理盐水10ml/kg;(2)痹组:6.0g/Kg;(3)XKC-AB1小剂量组:5.0g/Kg;(4)XKC-AB1中剂量组:10.0g/Kg;(5)XKC-AB1大剂量组:20.0g/Kg。各组按10ml/kg灌胃给药,共给5日、于第3日给药30min后,在大鼠右后肢足跖皮内注射弗氏(Freund’s)完全佐剂0.05ml/只(其中含卡介苗7.5mg/ml),然后继续给药2天。用容积法测定致炎前与致炎后12、18、24、48h大鼠足跖容积,以致炎前后足跖容积之差值为肿胀程度。结果见表1。
表1 XKC-AB1对弗氏完全佐剂致大鼠原发病变的足肿胀的影响
(
X±S,n=8)
致炎前
剂量 致炎后足肿胀度(ml)(h)(足肿胀抑制百分率%)
组别 足容积
(g/kg)
(ml) 12 18 24 48
生理盐水组 1.34 0.52 0.74 0.78 0.80
±0.12 ±0.15 ±0.17 ±0.16 ±0.11
痹组 6.0 1.33 0.44(15.4) 0.52*(29.7) 0.54*(30.8) 0.59*(26.3)
±0.11 ±0.21 ±0.18 ±0.26 ±0.24
XKC-AB1小剂量组 5.0 1.32 0.49(5.8) 0.67(9.5) 0.71(9.0) 0.70(12.5)
±0.15 ±0.12 ±0.16 ±0.23 ±0.18
XKC-AB1中剂量组 10.0 1.33 0.45(13.5) 0.58*(21.6) 0.61*(21.8) 0.65*(18.8)
±0.16 ±0.16 ±0.11 ±0.13 ±0.15
XKC-AB1大剂量组 20.0 1.35 0.44(21.2) 0.46**(37.8) 0.49**(37.3) 0.52**(35.0)
±0.13 ±0.11 ±0.20 ±0.19 ±0.10
*p<0.05 **P<0.01与生理盐水组比较
实验结果表明:XKC-AB1中、大二个剂量组均能降低弗氏完全佐剂所致大鼠原发病变的足肿胀度,与生理盐水组比较有显著性差异(P<0.05、P<0.01)。
2-1-2对多发性关节炎(继发性病变)的影响
取雄性大鼠60只,170g±20g,用费氏(Freund’S)完全佐剂0.05ml/只(其中含卡介苗7.5mg/ml)注射于右后足跖皮内,致炎一周后将大鼠随机分为五组,即(1)生理盐水组:生理盐水10ml/kg;(2)痹组:6.0g/Kg;(3)XKC-AB1小剂量组:5.0g/Kg;(4)XKC-AB1中剂量组:10.0g/Kg;(5)XKC-AB1大剂量组:20.0g/Kg。各组每日灌胃给药1次,连续给药21日。同期另设一组正常组。并于注射佐剂前及注射佐剂后用容积法测定大鼠左右足跖容积。同侧足跖于给佐剂前后容积之差为肿胀度(ml),同时观察大鼠前肢、耳部、尾部等部位的病变。实验结束时,大鼠颈动脉放血,以2%EDTA-Na2抗凝,分离血浆,按说明书方法用FMJ-182放射免疫γ计数器测定前列腺素E2(PGE2)。同时取血清,测定大鼠白细胞介素I(IL-1)(其方法为①IL-1诱生:给SD大鼠腹腔内注入冷的含10%小牛血清的1640 20ml,轻揉腹部后取腹腔液,离心洗涤用24孔培养板制备细胞单层(巨噬细胞单层),每孔再加1ml培养液,继续置5%CO2、37℃中培养24小时,-30℃保存待测。②IL-1活性测定:用小鼠胸腺细胞增殖法,取C57BL/6小鼠胸腺制备单个细胞悬液,用含10%小牛血清的1MDM培养液调整细胞浓度为2×107个/ml,加入3μg/ml的ConA,迅速混匀,尽快加入96孔细板中,每孔0.1ml,含细胞2*106个。在加入ConA-胸腺细胞前,先将待测样品每孔加0.1ml,置5%CO2、37℃中培养60小时,每孔加0.2uci3H-TdR,继续培养12小时,收集细胞,测定3H-TdR掺入cpm值)。然后处死各组大鼠,立即取肾上腺、胸腺、脾脏称重,并对大鼠左右后肢踝关节进行病理组织学检查,结果见表2、3、4、5、6、7、8、9、10。
表2 XKC-AB1对弗氏完全佐剂致大鼠多发性关节炎(继发性病变)足
肿胀(右足)的影响(X±S,n=12)
致炎前 致炎后不同时间的足肿胀值(ml)(足肿胀抑制百分率%)
剂量
组别 足容积
(g/kg)
(ml) 8d 10d 14d 18d 22d 28d
生理盐水组 1.36 0.92 0.99 1.61 2.22 1.92 1.84
±0.15 ±0.11 ±0.46 ±0.46 ±0.51 ±0.22 ±0.31
痹组 6.0 1.34 0.95(-3.3) 110**(31.7) 110**(31.7) 1.36**(38.7) 1.15**(40.1) 0.97**(47.3)
±0.12 ±0.25 ±0.35 ±0.35 ±0.33 ±0.37 ±0.28
XKC-AB1小 5.0 1.37 0.89(3.3) 1.42(11.8) 1.42(11.8) 1.78*(19.8) 1.59*(17.2) 1.51*(17.9)
剂量组 ±0.11 ±0.23 ±0.42 ±0.42 ±0.41 ±0.33 ±0.36
XKC-AB1中 10.0 1.38 0.94(-2.2) 1.07**(33.5) 1.07**(33.5) 1.08**(51.4) 1.01**(47.4) 0.91**(50.5)
剂量组 ±0.13 ±0.17 ±0.30 ±0.30 ±0.43 ±0.31 ±0.22
XKC-AB1大 20.0 1.35 0.93(-1.1) 0.86**(46.6) 0.86**(46.6) 0.89**(59.9) 0.81**(57.8) 0.69**(62.5)
剂量组 ±0.17 ±0.21 ±0.62 ±0.62 ±0.60 ±0.34 ±0.36
*p<0.05 **P<0.01与生理盐水组比较
表3 XKC-AB1对弗氏完全佐剂致大鼠多发性关节炎(继发性病变)足
肿胀(左足)的影响(
X±S,n=12)
致炎前 致炎后不同时间的足肿胀值(ml)(足肿胀抑制百分率%)
剂量
组别 足容积
(g/kg)
(ml) 10d 14d 18d 22d 28d
生理盐水组 1.35 0.21 0.68 0.93 0.89 0.75
±0.16 ±0.14 ±0.19 ±0.50 ±0.42 ±0.31
痹组 6.0 1.36 0.22(-4.8) 0.36**(47.1) 0.37**(60.2) 0.40*(55.1) 0.31**(58.7)
±0.18 ±0.10 ±0.16 ±0.19 ±0.25 ±0.28
XKC-AB1小 5.0 1.35 0.23(-9.5) 0.52(23.5) 0.75(19.4) 0.53*(40.4) 0.44*(41.3)
剂量组 ±0.14 ±0.15 ±0.21 ±0.39 ±0.38 ±0.32
XKC-AB1中 10.0 1.37 0.19(9.5) 0.41**(39.7) 0.54**(41.9) 0.39*(56.2) 0.27**(64.0)
剂量组 ±0.17 ±0.10 ±0.30 ±0.26 ±0.25 ±0.30
XKC-AB1大 20.0 1.38 0.24(-14.3) 0.30**(55.9) 0.44**(52.7) 0.36**(59.6) 0.23**(69.3)
剂量组 ±0.16 ±0.17 ±0.18 ±0.31 ±0.34 ±0.27
*p<0.05 **P<0.01与生理盐水组比较
表4 XKC-AB1对弗氏完全佐剂关节炎大鼠结节的影响
剂量 动物数 结节出现动物数(n) 结节出现 结节发
组别 动物总数 生率
(g/kg) (n)
耳部 前肢 尾部 (n) (%)
生理盐水组 - 12 1 6 11 11 91.7
痹组 6.0 12 0 1 2 2 16.6**
XKC-AB1小剂量组 5.0 12 0 3 5 6 50.0*
XKC-AB1中剂量组 10.0 12 0 2 3 4 33.3**
XKC-AB1大剂量组 20.0 12 0 1 3 3 25.0**
*p<0.05 **P<0.01与生理盐水组比较
表5 XKC-AB1对弗氏完全佐剂关节炎大鼠各部位结节的
影响(
X±S)
剂量 结节出现动物数(n)
组别
(g/kg) 耳部 前肢 尾部
生理盐水组 - 5.0±0.0(1) 5.7±1.9(6) 12.7±2.8(11)
痹组 6.0 0.0±0.0(0) 3.0±0.0(1) 9.5±2.1(2)
XKC-AB1小剂量组 5.0 0.0±0.0(0) 4.0±1.0(3) 9.8±1.9(5)
XKC-AB1中剂量组 10.0 0.0±0.0(0) 3.5±0.7(2) 8.3±1.5(3)
XKC-AB1大剂量组 20.0 0.0±0.0(0) 2.0±0.0(1) 5.3±1.5(3)
注:表内括号中的数据为出现结节的动物数
表6 XKC-AB1对弗氏完全佐剂关节炎大鼠血浆前列腺素E2(PGE2)(X±S)
组别 剂量(g/kg) 动物数(n) PGE2(cpm)
正常组 - 12 415±72
生理盐水组 - 12 645±97△△
痹组 6.0 12 495±90**
XKC-AB1小剂量组 5.0 12 556±105*
XKC-AB1中剂量组 10.0 12 517±132*
XKC-AB1大剂量组 20.0 12 458±73**
△△ P<0.01 与正常组比较
*p<0.05 **P<0.01与生理盐水组比较
表7 XKC-AB1对弗氏完全佐剂关节炎大鼠血清白细胞介素I(IL-1)
的影响(
X±S)
组别 剂量(g/kg) 动物数(n) IL-1(cpm)
正常组 - 12 653±87
生理盐水组 - 12 2298±416△△
痹组 6.0 12 1195±215**
XKC-AB1小剂量组 5.0 12 1951±309*
XKC-AB1中剂量组 10.0 12 1287±268**
XKC-AB1大剂量组 20.0 12 941±394**
△△ P<0.01 与正常组比较
*p<0.05 **P<0.01与生理盐水组比较
表8 XKC-AB1对弗氏完全佐剂关节炎大鼠胸腺、脾脏、肾上腺重量的影
响(X±S)
剂量 动物数 胸腺 脾脏 肾上腺
组别
(g/kg) (只) (g/100g) (g/100g) (g/100g)
正常 - 12 0.18±0.05 0.35±0.08 0.02±0.01
组 - 12 0.19±0.04 0.37±0.06 0.03±0.01
生理盐水 6.0 12 0.20±0.06 0.35±0.07 0.03±0.01
组 5.0 12 0.21±0.03 0.38±0.06 0.02±0.01
痹 10.0 12 0.17±0.04 0.36±0.08 0.03±0.01
组 20.0 12 0.18±0.05 0.37±0.09 0.03±0.01
XKC-AB1小剂量组
XKC-AB1中剂量组
XKC-AB1大剂量
组
表9 XKC-AB1对大鼠关节病理组织学的影响(右足)
关节 关节腔内分泌 关节软骨破 滑膜炎 关节外软组织炎
组别
数 物 坏 症 症
正常组 3 0/3 0/3 0/3 0/3
生理盐水组 6 4/6 5/6 6/6 6/6
痹组 6 1/6 0/6 3/6 1/6
XKC-AB1小剂量组 6 1/6 3/6 5/6 4/6
XKC-AB1大剂量组 6 0/6 1/6 3/6 2/6
表10 XKC-AB1对大鼠关节病理组织学的影响(左足)
关节 关节腔内分泌 关节软骨破 滑膜炎 关节外软组织炎
组别
数 物 坏 症 症
正常组 3 0/3 0/3 0/3 0/3
生理盐水组 6 1/6 2/6 6/6 1/6
痹组 6 0/6 0/6 2/6 1/6
XKC-AB1小剂量组 6 0/6 0/6 2/6 0/6
XKC-AB1大剂量组 6 1/6 0/6 1/6 0/6
2-3、结果
实验结果表明:
1.XKC-AB1三个剂量组能明显抑制因弗氏完全佐剂引起的大鼠致炎侧和对侧后肢因迟发型超敏反应引起的足肿胀,与生理盐水组比较具有显著性差异(P<0.05、P<0.01)(见表2、3)。
2.生理盐水组大鼠于12天后前肢关节部位红肿,有点状结节;耳部出现结节,直径约3mm左右;尾部关节有结节状突起,呈串珠状。XKC-AB1三个剂量组能明显降低上述的结节发生率,与生理盐水组比较具有显著性差异(P<0.05、P<0.01)(见表4、5)。
3.XKC-AB1三个剂量组能明显降低佐剂关节炎大鼠血浆前列腺素E2、血清白细胞介素I,与生理盐水组比较具有显著性差异(P<0.05、P<0.01)(见表6、7)。
4.XKC-AB1小、中、大三个剂量组对弗氏完全佐剂关节炎大鼠的胸腺、脾脏和肾上腺重量无明显影响,与生理盐水组比较无显著性差异(P<0.05>(见表8)。
5.组织学检查:(1)正常组:双侧踝关节组织学结构正常。
(2)生理盐水组:右侧踝关节腔内可见分泌物,成分为浆液、纤维素及炎细胞,关节软骨部分破坏,滑膜出现血管轻度扩张充血、水肿及炎细胞浸润,关节外软组织也见程度不等的炎细胞浸润。左侧踝关节主要表现为滑膜轻度充血、水肿及炎细胞浸润。
(3)痹组:右侧踝关节有1例外关节腔内出现分泌物,未见关节软骨的破坏、脱落,3例出现滑膜炎症,关节外软组织仅1例出现炎症反应。左侧关节有2例主要表现为滑膜轻度炎症,1例关节外软组织少量炎细胞浸润,余末见异常。
(4)XKC-AB1小剂量组:右侧踝关节腔内仅1例出现分泌物,3例出现关节软骨的破坏,5例出现滑膜炎症反应,4例出现关节外软组织炎症。左侧关节仅1例出现滑膜炎症,余末见异常。
(5)XKC-AB1大剂量组:右侧踝关节腔内均未见分泌物,1例出现关节软骨破坏,3例出现滑膜炎症反应,2例出现关节外软组织炎细胞浸润。左侧关节有1例关节腔内出现少量分泌物,1例出现滑膜轻度炎症,余末见异常。(见表9、10)。
2-2、XKC-AB1对其它炎症反应的影响
2-2-1对角叉菜胶诱发足肿胀的影响
取雄性大鼠40只,170g±20g,随机分为五组,即(1)生理盐水组:生理盐水10ml/kg;(2)痹组:6.0g/Kg;(3)XKC-AB1小剂量:5.0g/kg;(4)XKC-AB1中剂量组:10.0g/Kg;(5)XKC-AB1大剂量组:20.0g/Kg。各组按10ml/kg灌胃给药,共给3日。末次给药30分钟后,在大鼠右后肢足跖皮下注射1%角叉菜胶0.05ml/只,用容积法测定致炎前与致炎后1、2、4、6h大鼠足跖容积。以致炎前后足跖容积之差值为肿胀程度。结果见表11。
表11 XKC-AB1对角叉菜胶致大鼠足肝脏的影响(X±S,n=8)
剂量 致炎前
致炎后足肿胀度(ml)(h)(足抑制百分率%)
组别 (g/kg) 足容积
(ml) 1 2 4 6
生理盐水组 1.33 0.52 0.73 1.07 0.90
±0.15 ±0.15 ±0.28 ±0.18 ±0.11
痹组 6.0 1.36 0.19**((51.3)0.27**(63.0) 0.59**(44.9) 0.54**(40.0)
±0.17 ±0.11 ±0.18 ±0.26 ±0.24
XKC-AB1小剂量组 5.0 1.32 0.34(12.8) 0.52(28.8) 0.8*5(25.9) 0.66**(26.7)
±0.21 ±0.09 ±0.17 ±0.15 ±0.09
XKC-AB1中剂量组 10.0 1.35 0.26*(50.0) 0.44*(39.7) 0.67**(37.4) 0.57**(36.7)
±0.22 ±0.13 ±0.18 ±0.09 ±0.16
XKC-AB1大剂量组 20.0 1.38 0.21**(16.2) 0.32**(56.2) 0.49**(54.2) 0.41**(51.4)
±0.16 ±0.12 ±0.10 ±0.1 ±0.09
*p<0.05 **P<0.01与生理盐水组比较
实验结果表明:XKC-AB1三个剂量组均能降低角叉菜胶致大鼠足肿胀度,与生理盐水组比较有显著性差异(P<0.05、P<0.01>。
2-2-2对大鼠棉球肉芽肿形成的影响[3]
取雄性大鼠40只,体重150±20g,将两个10mg灭菌消毒棉球分别植人大鼠左右腋下,缝合皮肤、消毒。次日将大鼠分为五组,即(1)生理盐水组:生理盐水10ml/Kg;(2)痹组:6.0g/Kg;(3)XKC-AB1小剂量组:5.0g/Kg;(4)XKC-AB1中剂量组:10.0g/Kg;(5)XKC-AB1大剂量组:20.0g/Kg。各组按10ml/kg灌胃给药,共给8日,停药后次日脱椎处死大鼠;取出棉球,剔除脂肪组织。称取棉球湿重和干重(60℃烘干),计算肉芽组织湿重和干重及其抑制率,结果见表12。
表12 XKC-AB1对大鼠棉球肉芽肿形成的影响(X±S,n=8)
湿重抑制 干重抑制
剂量 肉芽组织湿重 肉芽组织干重
组别 率 率
(g/kg) (mg) (mg)
(%) (%)
生理盐水 45.6±7.8
组
- 60.5±8.8 - -
痹 23.8±6.3**
6.0 39.7±6.1** 34.4 47.8
组 38.0±5.2*
5.0 52.4±7.2 13.4 16.7
XKC-AB1小剂量组
10.0 47.3±6.0** 21.8 28.3
XKC-AB1中剂量组 32.7±4.6**
20.0 36.6±5.9** 39.5 50.7
XKC-AB1大剂量组
22.5±6.1**
*p<0.05 **P<0.01与生理盐水组比较
实验结果表明:XKC-AB1三个剂量组均能减少肉芽组织重量,与生理盐水组比较有显著性差异(P<0.05、P<0.01>。
2-2-3对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响
取19-22gICR小鼠50只,雌雄各半,随机均分为五组,即叫生理盐水组:生理盐水20ml/kg;(2)痹组:12.0g/Kg;(3)XKC-AB1小剂量组:10.0g/kg;(4)XKC-AB1中剂量组:20.0g/kg;(5)XKC-AB1大剂量组:40.0g/kg。各组按20ml/Kg每日灌胃给药,共给3日。末次给药后1h,尾静脉注射0.05%伊文思兰0.05ml/10g,并同时腹腔注射0.6%醋酸0.2ml/只,20分钟后脱颈椎处死,剪开腹腔,用5ml生理盐水冲洗腹腔三次,取出腹腔液约4.5ml,离心5分钟,在722型分光光度计590nm处测定OD值及其抑制率,见表13。
表13 XKC-AB1对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响
动物数 剂量 OD值 抑制率
组别
(只) (g/kg) (X±S) (%)
生理盐水组 10 - 0.661±0.162
痹组 10 12.0 0.363±0.177** 45.1
XKC-AB1小剂量组 10 10.0 0.548±0.138 17.1
XKC-AB1中剂量组 10 20.0 0.481±0.165* 27.2
XKC-AB1大剂量组 10 40.0 0.445±0.121** 32.7
*p<0.05 **P<0.01与生理盐水组比较
实验结果表明,XKC-AB1中、大剂量组均能显著地对抗醋酸所致小鼠腹腔毛细血管的通透性的增加,与生理盐水组比较有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。
3、XKC-AB1的镇痛作用
3-1对热刺激的影响(热板法)
取18-21gICR雌性小鼠,恒温(55±0.5℃)热刺激致痛,预先测定痛阈值(以小鼠舔后足为疼痛反应信息,以痛反应的潜伏期为痛阈指标,若不超过30s为合格小鼠)。挑选合格小鼠50只,随机分为五组,即(1)生理盐水组:生理盐水20ml/kg;(2)痹组:12.0g/Kg;(3)XKC-AB1小剂量组;10.0g/Kg;(4)XKC-AB1中剂量组:20.0g/Kg;(5)XKC-AB140.0g/Kg。各组均按20ml/kg灌胃给药,并于给药后30、60、90、120分钟各测其痛阈值。结果见表14。
表14 XKC-AB1对小鼠的镇痛作用(热板法)(X±S,n=10)
痛阈值(s)
剂量
组别 给药前 给药后(min)(痛阈提高百分率%)
(g/kg)
30 60 90 120
生理盐水组 - 20.3 23.1(13.8) 21.2(-4.4) 19.1(-5.9) 19.6(-3.4)
±5.8 ±7.5 ±11.7 ±8.4 ±8.0
痹组 12.0 19.8 28.6*(14.4) 32.6**(64.6) 38.0**(91.9) 31.5*(59.1)
±4.4 ±8.7 ±10.5 ±14.1 ±12.1
XKC-AB1小剂量组 10.0 19.4 24.5(26.3) 27.8(43.3) 28.5*5(46.9) 26.6**(37.1)
±5.1 ±6.1 ±12.4 ±12.6 ±11.5
XKC-AB1中剂量组 20.0 20.7 27.2(31.4) 33.9**(63.8) 35.6**(72.0) 30.4*(46.9)
±5.6 ±8.1 ±9.8 ±12.2 ±10.8
XKC-AB1大剂量组 40.0 21.1 30.1*(12.7) 36.5**(73.0) 40.3**(91.0) 37.8**(79.1)
±4.2 ±10.6 ±12.7 ±14.5 ±13.9
*p<0.05 **P<0.01与给药前比较
实验结果表明:XKC-AB1三个剂量组能提高小鼠的痛阈值,与给药前组比较有显著性差异(P<0.05、P<0.01>。
3-2对化学刺激的影响(扭体法)
取18-21gICR小鼠60只,雌雄各半,随机分为五组,即(1)生理盐水组:生理盐水20ml/kg;(2)痹组:12.0g/Kg;(3)XKC-AB1小剂量组:10.0g/Kg;(4)XKC-AB1中剂量组:20.0g/Kg;(5)XKC-AB1大剂量组:40.0g/Kg。各组均按20ml/kg灌胃给药,给药后30分钟后腹腔注射0.5%醋酸0.2ml/只,观察10分钟内各组小鼠出现扭体反应的次数。结果见15。
表15 XKC-AB1对小鼠的镇痛作用(扭体法)(X±S,n=10)
剂量 扭体反应的次数(次/min)
组别
(g/kg)
生理盐水组 - 32.8±12.9
痹组 12.0 17.5±9.6**
XKC-AB1小剂量组 10.0 24.7±8.5
XKC-AB1中剂量组 20.0 21.3±6.1*
XKC-AB1大剂量组 40.0 16.4±10.3**
*p<0.05 **P<0.01与生理盐水组比较
实验结果表明:XKC-AB1中、高剂量组能显著降低小鼠扭体反应次数,与生理盐水组比较有显著性差异(P<0.05、P<0.01>。
3、结论
实验结果表明:1①XKC-AB110.0g/Kg、20.0g/Kg二个剂量组均能降低弗氏完全佐剂致大鼠原发病变的足肿胀度,与生理盐水组比较有显著性差异(P<0.05、P<0.01>。②XKC-AB15.0g/Kg、10.0g/Kg、20.0g/Kg三个剂量组能明显抑制因弗氏完全佐剂引起的大鼠致炎侧和对侧后肢因迟发型超敏反应引起的足肿胀,降低大鼠前肢、耳部、尾部结节的发生率;降低大鼠血浆前列腺素E2、血清白细胞介素I,与生理盐水比较有显著性差异(P<0.05、P<0.01>;但对弗氏完全佐剂关节炎大鼠的胸腺、脾脏和肾上腺重量无明显影响;组织学检查结果也表明XKC-AB15.0g/Kg、20.0g/Kg二个剂量组能够减少大鼠踝关节腔内分泌物、关节软骨破坏、滑膜炎症和关节外软组织炎症的关节数。提示XKC-AB1对佐剂性关节炎有对抗作用。
2.XKC-AB15.0g/Kg、10.0g/Kg、20.0g/Kg三个剂量组能明显降低角叉菜胶所致大鼠足肿胀度,减少棉球所致大鼠肉芽组织重量;而且XKC-AB110.0g/kg、20.0g/Kg、40.0g/Kg三个剂量组能显著地对抗醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的增加。各指标与生理盐水组比较有显著性差异(P<0.05、P<0.01>。提示XKC-AB1具有抗炎作用。
3.XKC-AB110.0g/Kg、20.0g/Kg、40.0g/Kg三个剂量组均能提高热刺激(热板法)所致小鼠的痛阈值,与给药前组比较有显著性差异(P<0.05、P<0.01>;也能显著降低醋酸所致小鼠扭体反应次数,与生理盐水组比较有显著性差异(P<0.05、P<0.01>。提示XKC-AB1具有镇痛作用。
综上所述,XKC-AB1对弗氏完全佐剂所致大鼠的原发性和继发性损害具有显著的对抗作用,同时又能明显减轻角叉菜胶性大鼠足肿胀,抑制大鼠肉芽组织的形成,降低小鼠腹腔毛细血管通透性,减轻热刺激、化学刺激所致的小鼠的疼痛性反应,表明XKC-AB1具有抗炎和镇痛作用。
(二)、XKC-AB2的药效实验
1、实验材料
1-1.实验动物:Wistar大鼠,雄性,由南京中医药大学实验动物中心提供室提供。
1-2.药品与试剂:
XKC-AB2,口服,每粒含生药5-7g,由江苏康缘药业股份有限公司提供,临用前用蒸馏水配成所需浓度。
雷公藤多甙片:上海医科大学红旗制药厂生产,批号:030105
氟氏完全佐剂:北京邦定泰克生物技术有限公司主产,批号:030117
2、实验方法
2-1.动物分组
选雄性健康Wistar大鼠60只,体重180±20克,实验室条件下驯养一周,随机分为6组,每组各10只大鼠。
2-2.造模方法
除空白对照组外各组大鼠在乙醚麻醉下于右后足趾皮内注射氟氏完全佐剂0.1ml,先向下注射一半,再掉转针头向上注射完毕。
2-3.足趾容积的测量
用玻璃容器法测量大鼠足趾容积:取一20毫升量筒,内径2厘米,用记号笔在每只大鼠的左后及右后踝关节周围作一标记,大鼠乙醚麻醉后,将其待测足趾慢慢浸入量筒内,使标记与液面重叠,多余的液体自缺口处流出。取出大鼠足趾,可见量筒内液面下降,其下降容积即为足趾容积。用1毫升移液管慢慢将液体注入到量筒内,直到液面与缺口处相平而液体不流出,移液管的读数即为大鼠的足趾容积,重复二次取均值。
2-4.给药及观测方法
各组给药剂量按人体-大鼠体表面积比值换算如下:雷公藤多甙片组:6.3mg/kg.d,XKC-AB2小剂量组:5.0g生药/kg.d:XKC-AB2中剂量组:10.0g生药/kg.d;XKC-AB2大剂量组:20g生药/kg.d;正常组及模型组:等容量生理盐水。以上各组给药容量相等。于注射佐剂前1小时,各组大鼠灌胃一次,并测量不同时间间隔大鼠右后足跖容积,计算其足跖肿胀度(足跖肿胀度=致炎前足跖容积-致炎后足跖容积);于致炎后第8d开始,各组大鼠继续灌胃,每天1次,连续16天,并测量不同时间间隔大鼠左后足跖容积,计算其足跖肿胀度,同时观察大鼠脚爪、耳及尾部出现红斑、结节惰况,第24天采集标本后处死全部大鼠。
2-5.数据统计
所有数据使用SAS软件包统计,进行方差分析及q检验,结果用x±SD表示。
3、实验内容
3-1.XKC-AB2对佐剂性关节炎大鼠原发性病变的影响:
于致炎前1小时给药一次,并分别于致炎前1小时及致炎后第3、6.12、18、24h各测大鼠右足跖容积1次,计算其足跖肿胀度,结果见表1:
表1:XKC-AB2对AA大鼠原发性足跖肿胀的影响(x±SD)
大鼠右后足跖肿胀度(ml)
组别 N 3h 6h 12h 18h 24h
空白对照组 10 0.002±0.004 0.006±0.007 0.01±0.007 0.008±0.006 0.011±
0.007
模型对照组 10 0.60±0.10* 0.71±0.10* 0.91±0.11* 1.06±0.12* 1.00±
0.10*
雷公藤多甙片 10 0.36±0.07▲* 0.46±0.08▲* 0.57±0.07▲* 0.59±0.06▲* 0.51±
0.08▲*
XKC-AB2(小) 10 0.46±0.08▲* 0.57±007▲* 0.67±0.07▲* 0.73±0.08▲* 0.65±
0.08▲*
XKC-AB2(中) 10 0.38±0.08▲* 0.49±0.06▲* 0.59±0.05▲* 0.66±0.05▲* 0.53±
0.09▲* XKC-AB2(大) 10 0.33±0.06▲* 0.42±0.07▲* 0.49±0.06▲* 0.56±0.05
▲* 0.42±0.08▲*
与模型对照组比较 ▲P<0.05 与空白对照组比较 *P<0.05
从表1可以看出,注射佐剂后,模型组大鼠右后足跖逐渐肿胀,于造模后18h左右达到高峰,随后开始下降。与模型组大鼠相比,雷公藤多甙片组和XKC-AB2各剂量组对AA大鼠原发性足跖肿胀均有很好的抑制作用,其中以雷公藤多甙片组和XKC-AB2大剂量组效果最好。
2.XKC-AB2对佐剂性关节炎大鼠继发性病变的影响:
模型对照组大鼠右后足趾在致炎后逐渐肿胀并于第24h达到高峰,持续3天后开始消退,于第8天后再次肿胀,于第15天达到高峰,以后逐渐消退。肿胀局部皮肤充血、红肿、增厚、皮温升高,触之有明显的躲避行为,大鼠爬行困难,倦怠,活动和进食均减少,体重增长缓慢并于第15天开始有所下降,皮毛暗淡无光泽。从第10无起,左后肢、左前肢开始明显肿账,主要表现在踝关节,并逐渐累及整个脚趾,于脚趾关节间及前足跖出现关节肿大,耳和尾部出现红斑和炎性小结;XKC-AB2各剂量组大鼠所出现的症状较轻,且进食情况较好,体重持续增加,表现活跃,皮毛光华有光泽;雷公藤多甙组大鼠虽症状较轻,但进食较少,体重增加缓慢,倦怠,不喜活动,皮毛粗糙或发黄.于致炎后第8、10、12、16、20、24d所测各组大鼠足跖肿胀度结果见表2:
表2:XKC-AB2对AA大鼠继发性足跖肿胀的影响(x±SD)
大鼠左后足跖肿胀度(ml)
组别 N 8d 10d 12d 16d 20d 24
d
空白对照组 10 0.06±0.03 0.07±0.03 0.10±0.02 0.16±0.03 0.19±0.04 0.23±
0.04
模型对照组 10 0.10±0.05 0.31±0.13* 0.64±0.14* 0.84±0.16* 0.95±0.19* 0.89
±0.19*
雷公藤多甙片 10 0.06±0.04 0.33±0.08* 0.52±0.13* 0.51±0.11▲* 0.47±0.12▲* 0.42
±0.11▲*
XKC-AB2(小) 10 0.07±0.03 0.33±0.12* 0.54±0.12* 0.62±0.17▲* 0.66±0.18▲* 0.58
±0.15▲*
KKC-AB2(中) 10 0.07±0.03 0.27±0.07* 0.50±0.09* 0.47±0.11▲* 0.44±0.12▲* 0.40
±0.11▲*
XKC-AB2(大) 10 0.07±0.03 0.30±0.12* 0.59±0.13* 0.59±0.14▲* 0.56±0.13▲* 0.52
±0.11▲*
与模型对照组比较 ▲P<0.05 与空白对照组比较 *P<0.05
从表2可以看出,从往射后第十天开始,模型组大鼠左后足跖逐渐肿胀,于造模后20d左右达到高峰,随后开始下降。雷公藤多甙片组和XKC-AB2各剂量组对AA大鼠原发性足跖肿胀均有很好的抑制作用,其中以雷公藤多甙片组和XKC-AB2中剂量组效果最好,说明XKC-AB2中剂量抗免疫作用效果好。
(三)、XKC-AB3的药效实验
1、实验材料
1-1药品与试剂
XKC-AB3,含量为5-7g生药/粒,口服,由江苏康缘药业股份有限公司提供,临用前用蒸馏水配成所需浓度。批号:020904。
疏风活络片,具有疏风活络、散寒祛湿之功,用于风寒湿痹,四肢麻木,关节、腰膝酸痈等症。含量为0.76(生药)g/片,由珠海金沙(湖南)制药有限公司生产,批号:020508。
雷公藤多甙片,主治风湿、类风湿性关节炎,含量为30mg/片,株洲制药三厂生产,批号:020324。
胃蛋白酶,中国医药(集团)上海化学试剂公司生产,批号:020308丑。
冰醋酸,武汉市中南化学试剂厂生产,批号:030204。
DE-52层析树脂,sigma公司北京天象人生物制品公司提供,批号:011106。
小牛II型胶原蛋白,自制。
1-2、动物
ICR系、BALB/C系清洁级小鼠,体重18-20g,由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。合格证号:152号。
SD系清洁级大鼠,体重140-160g,雄性,由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。合格证号:153号。
SD系清洁级大鼠,体重180-220g,由省中医研究院实验动物中心提供。合格证号:035。
实验动物环境设施合格证号:027号。
1-3、仪器
751G-W分光光度计,上海分析仪器厂生产。电子天平,湘仪仪器厂。
数字体温仪,WMY-01型,上海分析仪器厂生产。NXE-1型锥板粘度计,成都仪器厂生产。QCC-A型磁性测厚仪,天津建筑实验仪器厂生产。
SN-695B型智能Y测量仪,上海原子核研究所日环仪器一厂生产。游标卡尺,上海医用仪表厂生产。HHS-85数显恒温水浴锅,上海天平仪器厂。
1-4、统计方法
除特别说明外,均采用成组t检验。
2、实验内容
1.对佐剂性关节炎模型大鼠的影响
1-1.方法
取SD大鼠60只,雄性,随机分成6组,体重150.0±7.6g,分别为模型空白组(蒸馏水10ml/kg)、模型对照组(蒸馏水10ml/kg)、疏风活络片组(疏风活络片0.4g生药/kg,灌胃剂量为10ml/kg)、XKC-AB3低、中、高剂量组(分别XKC-AB35g、10g、20g生药/kg,10ml/kg)。除模型空白组外,于其余动物右后趾皮下注入Freunds’完全佐剂0.3ml/Kg以致炎,于致炎前1h灌胃给药,每天1次,连续24天,停药后观察3天,观察药物对佐剂性关节炎的治疗作用。
观察指标:A、肿胀度测定:采用游标卡尺测定大鼠踝关节下约0.5Cm处的足趾中厚度代表足趾肿胀厚度,于致炎前及致炎后第8、12、15、18、21、24、27天测量左右后趾的厚度,右后足肿胀为原发性病变,左后足肿胀为继发性病变,以所测厚度减去致炎前足趾厚度作为肿胀度,以肿胀度进行统计比较。
1-2.内容
表1.XKC-AB3对佐剂性关节炎大鼠原发性病变的影响(N=10,X±S)
致炎后不同时间足趾肿胀度(mm)
组 剂量
第8天 第12天 第15天 第18天 第21天 第24天 第27天
别 (g/kg)
空白 蒸馏 0.02 0.02 0.03 0.03 0.03 0.05 0.05
组 水 ±0.014* ±0.018*** ±0.016*** ±0.014*** ±0.016*** ±0.021*** ±0.019***
模型 蒸馏 0.02 0.93 1.96 2.17 2.48 2.26 2.00
组 水 ±0.012 ±0.45 ±0.74 ±0.83 ±0.73 ±0.68 ±0.81
阳性 0.4 0.02 0.70 0.89 1.08 1.20 1.06 0.98
组 ±0.009* ±0.29* ±0.36*** ±0.51*** ±0.45*** ±0.39*** ±0.45***
低剂 5.0 0.02 0.79 1.11 1.12 1.26 1.06 0.82
量 ±0.018* ±0.32* ±0.44*** ±0.44*** ±0.49*** ±0.41*** ±0.31***
中剂 10.0 0.01 0.76 0.98 1.08 1.16 0.94 0.81
量 ±0.011* ±0.31* ±0.42*** ±0.36*** ±0.38*** ±0.35*** ±0.29***
高剂 20.0 0.02 0.62 0.72 0.80 0.86 0.69 0.64
量 ±0.01* ±0.29* ±0.33*** ±0.32*** ±0.27*** ±0.28*** ±0.26***
与模型对照组比较,*p>0.05 **p<0.05 ***P<0.01
表2.XKC-AB3对佐剂性关节炎大鼠继发性病变的影响(N=10,X±S)
组 剂量
第8天 第12天 第15天 第18天 第21天 第24天 第27天
别 (g/kg)
空白 蒸馏 0.02 0.02 0.03 0.03 0.03 0.05 0.05
组 水 ±0.014* ±0.018*** ±0.016*** ±0.014*** ±0.016*** ±0.021*** ±0.019***
模型 蒸馏 0.02 0.93 1.96 2.17 2.48 2.26 2.00
组 水 ±0.012 ±0.45 ±0.74 ±0.83 ±0.73 ±0.68 ±0.81
阳性 0.4 0.02 0.70 0.89 1.08 1.20 1.06 0.98
组 ±0.009* ±0.29* ±0.36*** ±0.51*** ±0.45*** ±0.39*** ±0.45***
低剂 5.0 0.02 0.79 1.11 1.12 1.26 1.06 0.82
量 ±0.018* ±0.32* ±0.44*** ±0.44*** ±0.49*** ±0.41*** ±0.31***
中剂 10.0 0.01 0.76 0.98 1.08 1.16 0.94 0.81
量 ±0.011* ±0.31* ±0.42*** ±0.36*** ±0.38*** ±0.35*** ±0.29***
高剂 20.0 0.02 0.62 0.72 0.80 0.86 0.69 0.64
量 ±0.01* ±0.29* ±0.33*** ±0.32*** ±0.27*** ±0.28*** ±0.26***
与模型对照组比较,*p>0.05 **p<0.05 ***P<0.01
2.对胶原诱导性关节炎模型大鼠的影响
2-1方法
制备II型胶原:在4℃中将新鲜小牛关节软骨捣碎,用Tris-HCI液浸泡洗涤得残渣,再用胃蛋白酶消化,取上清液盐析出胶原,过DE-52柱得到II型胶原蛋白。
胶原诱导性关节炎(CIA)的制作:取SD大鼠60只,雄性,体重为148.6±6.5g,随机分成6组,分别为模型空白组(蒸馏水10ml/kg)、模型对照组(蒸馏水10ml/kg)、疏风活络片组(疏风活络片5-7g(生药)/kg,灌胃剂量为10ml/kg)、XKC-AB3低、中、高剂量组(分别口服XKC-AB35g、10g、20g生药/kg)取冰醋酸溶解的II型胶原加入Freunds’佐剂研磨乳化,每只动物(除模型空白组外)于尾根部、颈背部皮内多点注入胶原共2.5mg/kg。7天后再于尾根部、颈背部皮内注射胶原1.0mg/kg作加强免疫。
给药治疗观察:每鼠于第1次免疫后第10天开始给药,每天1次,连续3周,观察药物对类风湿性关节炎的治疗作用。从第1次免疫后第10天开始,每隔10天观察下述指标:关节炎症积分:按文献给大鼠计分,1分:足爪或足垫单个区域炎症,2分:足爪或足垫两个以上区域炎症,3分:整个肢体的轻度炎症,4分:引起关节强直、畸形、功能障碍的重度炎症,每足最高积分为4分,每鼠的总积分最高为16分。
1-2.内容
表3.XKC-AB3对II型胶原诱导性关节炎大鼠关节通透性的影响
(X±S)
动物数 剂量 不同时间的炎症积分
组别
(n) (g/kg) 第10天 第20天 第30天
模型空白组 10 蒸馏水 0.00±0.00*** 0.00±0.00*** 0.00±0.00***
模型对照组 10 蒸馏水 3.80±1.90 5.60±1.85 5.90±1.92
疏风活络片组 10 0.4 3.40±2.46* 2.60±2.63*** 2.20±1.54***
XKC-AB3低剂量组 10 5.0 4.00±2.02* 3.10±1.45*** 2.70±1.35***
XKC-AB3中剂量组 10 10.0 3.90±1.57* 2.90±1.51*** 2.50±1.36***
XKC-AB3高剂量组 10 20.0 4.10±2.80* 2.00±1.41*** 1.40±1.02***
与模型对照组比较,*p>0.05 **p<0.05 ***P<0.01
3、结论
表1、2、3可见:与模型对照组比较,XKC-AB3各剂量组大鼠炎症积分有显著性降低。XKC-AB3各剂量对弗氏完全佐剂所致大鼠的原发性和继发性损害具有显著的对抗作用,对II型胶原诱导性关节炎也有显著的对抗作用。
Claims (7)
1、一种夏枯草提取物,其特征在于,所述提取物的活性成份总酚酸的含量为60-70%,迷迭香酸的含量为14%-21%。
2、如权利要求1所述的一种夏枯草提取物的制备方法,其特征在于,取夏枯草药材,分别以药材4~12倍量的40~85%乙醇回流提取2~4次,每次1~2.5小时,滤过,合并醇提液,回收乙醇至无醇味,浓缩至相对密度至1.0~1.15,静置冷藏12~36小时,倾出上清液,加醇至含醇量达60~75%,加入浓氨水使PH等于7~8,回收乙醇,浓缩液加5-15%的HCL调PH为3~4,用乙酸乙酯萃取5-7次,每次用量为浓缩液的2~4倍,回收乙酸乙酯至密度为1.30~1.40的稠膏,真空干燥,粉碎即得。
3、如权利要求1所述的一种夏枯草提取物的制备方法,其特征在于,取夏枯草药材,分别以药材4~12倍量的40~85%乙醇回流提取2-4次,每次1~2.5小时,滤过,水煎液浓缩至密度为1.0~1.15,上大孔树脂柱,用8-10倍柱体积水洗脱,水洗液弃去,再用12~14倍柱体积的50%~70%的乙醇洗脱,收集洗脱液,回收乙醇至密度为1.3-1.4的稠膏,真空干燥,粉碎即得。
4、如权利要求1所述的一种夏枯草提取物的制备方法,其特征在于,取夏枯草药材,分别以药材4~12倍量的40~85%乙酸乙酯回流提取2-4次,每次1~2.5小时,滤过,回收乙酸乙酯液并浓缩至密度为1.3-1.4的稠膏,加药材0.5~1.0倍量的0.1~0.5%的NaOH溶解,再用10~20%的HCL调PH至3-4,加乙酸乙酯萃取5-7次,合并乙酸乙酯萃取液,回收乙酸乙酯并浓缩至密度达1.3-1.4的稠膏,真空干燥,粉碎即得。
5、根据权利要求2或3或4的一种夏枯草提取物的制备方法,其特征在于,所述提取物的干膏得率为1.5%-3.5%。
6、如权利要求1所述的一种夏枯草提取物制剂,其特征在于,以所述的夏枯草提取物为活性成份,加入医用辅料,制成任何一种剂型的药剂。
7、如权利要求1-4中任何一项所述的夏枯草提取物作为活性成份在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。
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