KR20230149602A - 비알코올성 지방간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

비알코올성 지방간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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KR20230149602A
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광주과학기술원
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Abstract

본 발명은 LY6D의 발현 억제제를 담지한 간 세포 특이적 전달체를 포함하는 비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease)의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 이에 바람직하게는 비알코올성 단순 지방간, 비알코올성 지방간염, 간경변에 대한 의약품, 건강기능식품 등으로 활용할 수 있다.

Description

비알코올성 지방간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASES}
본 발명은 LY6D 억제제 및 이를 담지한 간세포 특이적 전달체를 포함하는 비알코올성 지방간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
지방간(fatty liver)은 정상 간에서 지방이 차지하는 비율(5 %)보다 많은 양의 지방이 간에 축적된 증상을 의미한다. 상기 지방간은 크게 과음으로 인한 알코올성 지방간(alcoholic fatty liver)과 비만, 당뇨병, 고지혈증 또는 약물 등으로 인한 비알코올성 지방간(non-alcoholic fatty liver)으로 분류될 수 있다. 알코올성 지방간은 알코올을 많이 섭취하게 되면 간에서 지방 합성이 촉진되고 정상적인 에너지 대사가 이루어지지 않아 발생하고, 비알코올성 지방간은 알코올 이외의 원인으로 인하여 발생하며, 상기 비알코올성 지방간은 지방 대사의 이상을 초래하는 성인병에 동반되는 경우가 빈번한 것으로 알려져 있다.
비알코올성 지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease; 이하 NAFLD)은 전세계 성인 인구의 30%에서 빈번하게 발생하는 급성 간질환에 해당한다. NAFLD에 속하는 질환으로는 지방간(fatty liver), 지방증(steatosis), 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis) 등이 알려져 있고, 간에서 triglyceride(TG)의 축적이나 염증 반응이 유발되는 정도에 따라 차이가 있으며, 궁극적으로 섬유증(fibrosis) 또는 간경화(cirrhosis) 등을 유발할 수 있다. 현재 NAFLD와 관련하여 지질대사장애와 염증성 사이토카인이 어느 정도 병리학에 관여하는 것으로 알려져 있으나, NAFLD 의 진행에 관여하는 분자 수준의 메커니즘이 밝혀지지 않았고, 원인유전자를 타깃으로 하는 치료방법 역시 실용화되지 못한 상태이다.
LY6D(lymphocyte Antigen 6 Family Member D)는 림프구가 B 세포 또는 T 세포로 분화하는 단계 또는 암의 초기 단계에 관여하는 것으로 알려진 유전자로서, 면역과 관련된 기능을 한다고 알려진 바 있다. 간과 관련하여서는 bioinformatics 수준에서 염증반응과 관련된 인자로 보고된 바 있으나, NAFLD와 관련하여 LY6D의 기능에 대해서는 밝혀진 바 없는 실정이다.
한국등록특허 제 2378462 호
본 발명은 비알코올성 지방간질환의 예방 또는 치료를 위하여 간 세포 특이적으로 질병의 원인 유전자를 억제할 수 있는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. LY6D 발현 억제제를 담지한 간세포 특이적 전달체(hepatocyte-selective carrier)를 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 위 1에 있어서, 상기 LY6D 발현 억제제1. LY6D 발현 억제제를 담지한 간세포 특이적 전달체(hepatocyte-selective carrier)를 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 위 1에 있어서, 상기 LY6D 발현 억제제는 LY6D의 mRNA 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열로 이루어진 핵산 분자인 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
3. 위 2에 있어서, 상기 핵산 분자는 gRNA, siRNA, shRNA, dsRNA, PNA 또는 microRNA인, 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
4. 위 1에 있어서, 상기 비알코올성 지방간 질환은 비알코올성 단순 지방간, 비알코올성 지방간염 및 간경변으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
5. 위 1에 있어서, 상기 간세포 특이적 전달체는 아데노부속바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스 및 레트로바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
6, 위 1에 있어서, 상기 간세포 특이적 전달체는 아데노부속바이러스 8(AAV8)인 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
7. 위 1에 있어서, 상기 간세포 특이적 전달체는 간세포에서 특이적으로 발현하는 프로모터를 포함하는 것인 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
8. 위 7에 있어서, 상기 간세포에서 특이적으로 발현하는 프로모터는 알부민 프로모터 염기서열 또는 티록신 결합 글로불린(thyroxine-binding globulin, TBG) 프로모터 염기서열인 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
본 발명은 간세포에서 발현하는 LY6D의 발현 억제제 및 이를 담지하는 간세포 특이적 전달체를 포함하는 비알코올성 지방간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
도 1은 식이요법에 따른 마우스 간의 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 마우스 간세포 전사체(transcriptome) 분석 결과 및 타겟 발굴 과정을 나타낸 것이다. 도 2a는 HFD, HSHF, SCD 전사체에서 각각 2 개의 전사체를 비교하여 겹치는 유전자의 개수를 벤다이어그램으로 나타낸 것이고, 도 2b는 비교 결과를 볼케이노 플랏(volcano plot)으로 나타낸 것이다.
도 3은 인간 GTEx(Genotype-tissue expression) 데이터를 분석한 결과로서, LY6D 발현량에 따른 간 조직의 특징을 나타낸 것이다.
도 4는 세포 수준에서 LY6D siRNA 처리에 따른 지방 축적 및 관련 유전자의 발현량을 분석한 것을 나타낸 것이다.
도 5은 LY6D shRNA를 담지한 Adeno-associated virus(AAV)의 벡터 모식도를 나타낸 것이다.
도 6는 in vivo 수준에서 AAV8-LY6D shRNA 주입 여부에 따른 마우스의 간 조직 분석 결과이다.
본 발명은 LY6D 발현 억제제를 담지한 간세포 특이적 전달체(hepatocyte-selective carrier)를 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 LY6D은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함할 수 있다. 상기 이에 대응하는 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 일부 아미노산의 부가, 치환 또는 결실 등에 의하여 상이한 아미노산 서열이 있더라도 코딩된 단백질의 기능에 차이가 없거나, 효과의 일부 증감 정도의 차이만이 존재하여, 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 단백질을 의미한다. 일부 서열의 차이가 있더라도, 그 서열의 얼라인(align) 및 서열 대비를 통해 대응 여부의 확인이 가능하다. 예를 들면, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 임의의 아미노산 서열을 얼라인 하였을 때, 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 서열이 본 발명의 상기 대응하는 아미노산 서열에 해당할 수 있다.
본 발명에서 상기 LY6D 발현 억제제는 LY6D 유전자의 전사, 전사 후 조절(post-transcriptional regulation), 번역 또는 번역 후 과정(post-translational regulation) 과정 등의 조절 기전에 관여함으로써, 결과적으로 정상적인 활성을 나타내는 상기 LY6D 단백질의 합성을 억제할 수 있는 제제를 의미한다. LY6D 발현 억제제의 예를 들면, LY6D의 mRNA 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열로 이루어진 핵산 분자로서 gRNA, siRNA, shRNA, dsRNA, PNA 또는 microRNA일 수 있고, LY6D 단백질에 결합하는 억제제일 수 있다. 예를 들면, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 shRNA일 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니고, 당업자에 의하여 높은 LY6D 억제 효율을 가지는 gRNA, siRNA, shRNA, dsRNA, PNA 또는 microRNA 서열이 선택될 수 있다.
상기 gRNA는 표적 DNA 서열과 전부 또는 일부 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 서열로 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다. 상기 gRNA는 두 개의 RNA, 즉 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA(dual RNA); 또는 표적 DNA 내 서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 RNA-가이드 뉴클레아제와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(sgRNA) 형태를 말하나, RNA-가이드 엔도뉴클레아제가 표적 DNA 서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한 없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 gRNA는 바람직하게는, 단일 사슬 가이드 RNA(sgRNA) 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 그 유래 미생물 등에 따라서 적절히 선택할 수 있다.
본 발명에서 상기 LY6D의 mRNA 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열로 이루어진 핵산 분자는 적어도 하나 이상의 화학적 변형이 일어난 염기를 포함할 수도 있다. 상기 화학적 변형이 일어난 염기에 의하여, 핵산 분자의 LY6D의 억제 효율이 증가할 수 있다. 이러한 변형은 당업자가 통상적으로 사용하는 방식에 의하여 선택되어질 수 있고, 화학적 변형이 일어난 염기의 예를 들면, 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, N1-에틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4'-티오우리딘, 5-메틸시토신, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 5-메톡시우리딘, 및 2'-O-메틸 우리딘을 들 수 있다. 다만 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 간세포는 간 조직을 구성하는 hepatocytes, cholangiocytes, stellate cells, Kupffer cells 및 liver sinusoidal endothelial cells 중에서 특별한 사정이 없는 한, hepatocytes를 의미하는 용어에 해당한다. Hepatocytes는 간 조직의 총 중량 대비 80% 가량을 차지하는 주요 세포로서, 단백질 합성 및 저장, 탄수화물의 변형, 콜레스테롤의 합성, 쓸개즙의 합성, 인지질의 합성, 해독작용 등 여러 기능을 담당하는 세포에 해당한다.
본 발명에서 상기 전달체는 내부에 핵산을 담지하고, 타깃 세포에 전달하여 내부의 핵산을 방출할 수 있는 것이라면 당업자에 의하여 제한 없이 선택될 수 있다. 예를 들면, 아데노부속바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스일 수 있다. 다만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 간세포 특이적 전달체는 간세포에 특이적으로 결합할 수 있거나, 타 조직에 비해 간세포에 대해 전달 효율이 높거나 또는 간세포에서만 특이적으로 발현하는 프로모터를 포함하여 담지된 유전자를 간세포에서만 발현하게 하는 등 내부에 담지된 LY6D 발현 억제제를 간세포에서 특이적으로 발현할 수 있도록 하는 전달체를 의미한다. 따라서, 내부에 담지된 LY6D의 발현 억제제가 타깃이 되는 간세포 이외에 간에 존재하는 Kupffer cells, stellate cells 등 에서 발현하는 것을 최소화 수 있어, 다른 세포 및 조직에 부작용을 최소화하면서도 비알코올성 지방간 질환을 유발하는 간세포의 LY6D의 발현을 선택적으로 억제할 수 있다. 상기 간세포 특이적 전달체의 예를 들면, 앞서 언급한 전달체인 아데노부속바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스의 염기서열 내에 알부민 프로모터를 포함하거나, 티록신 결합 글로불린(thyroxine-binding globulin; TBG) 프로모터를 포함하는 것 일 수 있고, 또는 간세포에 대해 높은 전달 효율을 가지고 있는 아데노 부속바이러스 8(AAV8) 일 수 있다. 보다 바람직하게는, AAV8 염기서열 내에 알부민 프로모터 또는 티록신 결합 글로불린 프로모터를 포함하는 것일 수 있다. 알부민 프로모터는 예를 들면 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 염기서열일 수 있고, 티록신 결합 글로불린 프로모터의 예를 들면 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 다만 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 비알코올성 지방간 질환은 음주 등에 의하여 알코올이 간에 누적되어 유발되는 알코올성 간질환과는 상이한 용어로서, 비알코올성 단순 지방간, 비알코올성 지방간염, 간경변 등을 지칭하는 용어에 해당한다. 본 발명의 상기 조성물은 비알코올성 지방간 질환 유발원인인 LY6D 유전자를 타깃으로 하여 간세포에서 지방의 축적을 억제하고 염증을 완화시킴으로써 질병의 예방 또는 치료를 도모할 수 있다. 구체적으로, 앞서 언급한 비알코올성 단순 지방간, 비알코올성 지방간염 또는 간경변 등의 질병에 대해서 예방 또는 치료 효과를 보일 수 있다. 다만 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 상기 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료와 관련하여 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가 시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며, 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하며, 적정한 투여량은 예를 들면 환자의 체내에 축적된 약물의 양 및/또는 사용되는 본 발명의 전달체의 구체적 효능정도에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면 체중 1 kg당 0.01 μg 내지 1 g 일 수 있으며, 일별, 주별, 월별 또는 연별의 단위 기간으로, 단위 기간 당 일회 내지 수회 나누어 투여될 수 있으며, 또는 인퓨전 펌프를 이용하여 장기간 연속적으로 투여될 수 있다. 반복투여 횟수는 약물이 체내 머무는 시간, 체내 약물 농도 등을 고려하여 결정된다. 질환 치료 경과에 따라 치료가 된 후라도, 재발을 위해 조성물이 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예 1. 식이(SCD, HFD, HFHS)에 따른 마우스 간의 histology 분석 과정
C57BL6 수컷 마우스 8주령에 대해 12 주간 식이 실험을 진행하였다. 간략하게, SCD(standard chow diet) 군, HFD(high fat diet; D12492) 및 HFHS(high fat/high sucrose diet; D12079B)로 분류하여 섭식하는 음식의 종류를 변경하여 실험을 수행하였다. 12 주 경과 이후 상기 마우스를 sacrifice하고, 간 조직을 분리하여 파라핀 블록을 제조하였다. 이후 공지된 방법을 사용하여 H&E staining을 수행하여 hepatic steatosis를 확인하였다(Andrew H.Fischer et al., 2006).
그 결과 도 1에서, SCD 식이 마우스는 간조직을 구성하는 간세포들이 밀집되어 염색되는 것을 확인할 수 있었다. 이와 대조되게, HFHS 또는 HFD 식이를 진행한 마우스 간 조직의 경우, 흰색에 해당하는 지방층이 다수 관찰되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 바탕으로 본 발명에서 수행한 HFHS 또는 HFD 식이요법에 의하여 마우스 간 조직에서 비알코올성 지방간이 명확하게 유도될 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. 비알코올성 지방간 질환 유발 인자 스크리닝
GTEx portal(http://gtexportal.org/home)에 공개된 human liver transcriptome 및 histology 데이터, 그리고 SCD, HFD, HFHS 식이 마우스의 transcriptome 데이터를 분석하여 비알코올성 지방간 질환에서 높게 발현하는 유전자를 선별하였다.
도 2a 및 도 2b에서, HFHS, SCD, HFD에서의 transcriptome 을 각각 비교하였을 때에, 유의미하게 발현량의 차이가 있는 유전자로서 공통적으로 LY6D가 존재함을 확인하였고, 도 3에서 LY6D 발현이 높은 간 조직에서 비알코올성 지방간 질환이 더욱 악화된 것을 확인하였다. 이를 기반으로 간세포에서의 LY6D의 발현이 비알코올성 지방간 질환을 유발할 수 있음을 추론하였다.
실시예 3. 간세포에서 LY6D 기능 확인( in vitro )
보다 구체적인 LY6D의 간 세포에서의 기능을 확인하기 위하여, LY6D siRNA 처리 유무에 따른 간세포의 transcriptome 분석을 수행하였다. 마우스의 일반 간세포(hepatocyte)를 2.5 x 105 내지 1 x 106 의 confluency를 가지도록 분주하고, 5% CO2, 37 ℃하에서 24 시간 동안 배양하였다. LY6D siRNA, TOM media, siRNA MAX Transfection reagent(Invitrogen, USA)를 Invitrogen 사 매뉴얼에 따라 분주하고, 18시간 배양 후 기존 media 또는 기존 media에 fructose를 첨가한 배지를 처리하여 안정화 기간을 거친 후, 세포를 수집하여 RNA를 추출하고, qRT-PCR 실험을 진행하여 LY6D siRNA에 의한 전사체 발현 저해 효능을 확인하였다. 간략하게, 세포의 RNA를 추출한 후, cDNA로 합성한 뒤, SYBR green 형광을 부착하여 LY6D의 발현량 변화를 확인하였다. qRT-PCR 에 사용된 프라이머 및 분석에 사용한 siRNA의 안티센스 서열은 다음과 같다.
프라이머 서열(5’-3’) 번호
Mouse Ly6D forward GGTTCCGAGGTCACACAATG 서열번호 5
Mouse Ly6D reverse CAGAGAGCCATAACAGTGAGC 서열번호 6
Moue beta-actin forward TTCCAGCCTTCCTTCTTGGG 서열번호 7
Moue beta-actin reverse TGTTGGCATAGAGGTCTTTACGG 서열번호 8
Mouse Acaca forward CTCCCGATTCATAATTGGGTCTG 서열번호 9
Mouse Acaca reverse TCGACCTTGTTTTACTAGGTGC 서열번호 10
Mouse Srebf1 forward CAAGGCCATCGACTACATCCG 서열번호 11
Mouse Srebf1 reverse CACCACTTCGGGTTTCATGC 서열번호 12
Mouse Fasn forward AGGTGGTGATAGCCGGTATGT 서열번호 13
Mouse Fasn reverse TGGGTAATCCATAGAGCCCAG 서열번호 14
Mouse DGAT2 forward CGAGACACCATAGACTACTTGCT 서열번호 15
Mouse DGAT2 reverse GCGGTTCTTCAGGGTGACTG 서열번호 16
Mouse Chrebp forward GAGTGCTTGAGCCTGGCTTACA 서열번호 17
Mouse Chrebp reverse GAGTGCTTGAGCCTGGCTTACA 서열번호 18
LY6D siRNA 안티센스 서열(5'-3') 번호
Target 1 CAGCAGUGGUUCCGAGGUC 서열번호 19
Target 2 UGUAAGAACCCUCAGGUCU 서열번호 20
Target 3 UGUACUUGUUCCAGUUAUU 서열번호 21
Target 4 AUGGGAACCUGGUGAGGAA 서열번호 22
추가적으로, Oil red O 염색 기법을 사용하여, histology 수준에서 지방 축적 여부를 확인하였다. 해당 염색은 붉은 색을 띄는 지용성 염료인 Oil red O를 사용하여 빠른 시간 안에 세포 내의 지방울을 염색하여 세포 내 지방 축적 정도를 확인할 수 있는 실험에 해당한다. 해당 실험 기법은 종래에 공지된 Sigma-Aldrich 사의 방법을 사용하였다.
그 결과, 도 4A에서, si-Control 또는 si-Control+Fructose 군에 비해 si-LY6D를 처리한 실험군에서 붉은 색으로 염색된 지방 축적이 현저히 감소한 것을 확인하였다. 또한, 도 4B의 qRT-PCR 에서 지방 축적과 관련된 유전자인 Acaca, Srebp1c, Dgat2의 발현이 si-LY6D 처리 군에서 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 이를 종합하면, LY6D의 발현을 억제함으로써 간세포에서 지방 축적을 억제함으로써, 비알코올성 지방간 질환을 치료할 수 있음을 의미한다.
실시예 4. AAV8-LY6D shRNA construct 제작
In vivo 수준에서 LY6D의 발현 억제에 따른 간조직의 변화 및 비알코올성 지방간 질환의 완화 여부를 확인하기 위하여, AAV를 이용하여 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 벡터를 제작하였다. 간세포에 대해 효과적인 전달체에 해당하는 AAV subtype 8을 사용하였고, 벡터 빌더 사가 보유한 shRNA 라이브러리 중 가장 효율이 높은 타겟 시퀀스를 선정하여 서열번호 23의 바이러스 벡터를 제작하였다. 도 5는 상기 서열번호 23의 바이러스 벡터의 모식도에 해당한다.
실시예 5. AAV8-LY6D shRNA 의 주입 및 in vivo 수준에서 LY6D 억제에 따른 비알코올성 지방간 질환의 완화 효과 확인
앞서 실시예 4의 AAV8-LY6D shRNA 벡터는 8주령 C57BL6/J 마우스에 대해 container로 몸체를 고정 후, 꼬리 정맥에 1x1011 CFU/개체 가 되도록 인슐린 주사기를 사용하여 intravenous injection 하였다. 상기 바이러스는 PBS에 녹여 주입하였고, 총 용량은 40 μL 이다. 주입 이후 쥐 행동 변화를 관찰하여 스트레스 상황을 최소화 하였고, 실험군에 따라 식이 조건을 달리하여 실험을 수행하였다. 상기 바이러스 주사 이후, 16주 간 식이 조건을 유지하며, 매 주마다 몸무게를 측정하였으며, 11주차에 X-ray 촬영 하였다. 조직 추출시 스트레스 최소화 된 실험 조건 하에서 마우스를 sacrifice 하고, 완충 용액으로 체내 혈액을 완전히 제거한 후, 간의 좌엽, 중엽 및 우엽으로 구별하여 -80 ℃에 조직을 보관하였다. 좌엽 조직은 single cell analysis에 사용하고, 중엽은 histology 분석, 우엽은 RNA 및 단백질 추출에 사용하였다.
그 결과 도 6에서 AAV8-LY6D shRNA를 주입한 마우스 간에서 H&E 분석에서 지방의 축적이 감소한 것을 확인하였고, PSR 분석 결과 fibrosis가 현저히 감소한 것을 확인하였으며, Oil red O 분석에서 붉은 색으로 염색된 지방의 축적이 감소된 것을 확인하였다. 이를 종합하면, AAV8-LY6D shRNA를 처리한 마우스 군에서 간세포의 지방간질환의 증세가 현저히 완화된 것을 의미한다. 이를 바탕으로 AAV-LY6D shRNA가 효과적으로 간세포에 전달되어, 비알코올성 지방간 질환을 in vivo 수준에서 완화시킬 수 있음을 확인하였다.
<110> Gwanju Institute of Science and Technology <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASES <130> P22-0031 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Thr Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Leu Ala Val Ala Thr Gly 1 5 10 15 Pro Ala Leu Thr Leu Arg Cys His Val Cys Thr Ser Ser Ser Asn Cys 20 25 30 Lys His Ser Val Val Cys Pro Ala Ser Ser Arg Phe Cys Lys Thr Thr 35 40 45 Asn Thr Val Glu Pro Leu Arg Gly Asn Leu Val Lys Lys Asp Cys Ala 50 55 60 Glu Ser Cys Thr Pro Ser Tyr Thr Leu Gln Gly Gln Val Ser Ser Gly 65 70 75 80 Thr Ser Ser Thr Gln Cys Cys Gln Glu Asp Leu Cys Asn Glu Lys Leu 85 90 95 His Asn Ala Ala Pro Thr Arg Thr Ala Leu Ala His Ser Ala Leu Ser 100 105 110 Leu Gly Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Val Ile Leu Ala Pro Ser Leu 115 120 125 <210> 2 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LY6D shRNA <400> 2 ccaagagctg atgacatata tctcgagata tatgtcatca gctcttgg 48 <210> 3 <211> 2346 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cgctggagct gtcacagcta ccaatcaggc atgtctggga atgagtacac ggggaccata 840 agttactgac attcgtttcc cattccattt gaatacacac ttttgtcatg gtattgcttg 900 ctgaaattgt tttgcaaaaa aaaccccttc aaattcatat atattatttt aataaatgaa 960 ttttaattta tctcaatgtt ataaaaaagt caattttaat aattaggtac ttatataccc 1020 aataatatct aacaatcatt tttaaacatt tgtttattga gcttattatg gatgaatcta 1080 tctctatata ctctatatac tctaaaaaag aagaaagacc atagacaatc atctatttga 1140 tatgtgtaaa gtttacatgt gagtagacat cagatgctcc atttctcact gtaataccat 1200 ttatagttac ttgcaaaact aactggaatt ctaggactta aatattttaa gttttagctg 1260 ggtgactggt tggaaaattt taggtaagta ctgaaaccaa gagattataa aacaataaat 1320 tctaaagttt tagaagtgat cataatcaaa tattaccctc taatgaaaat attccaaagt 1380 tgagctacag aaatttcaac ataagataat tttagctgta acaatgtaat ttgttgtcta 1440 ttttcttttg agatacagtt ttttctgtct agctttggct gtcctggacc ttgctctgta 1500 gaccaggttg gtcttgaact cagagatctg cttgcctctg ccttgcaagt gctaggatta 1560 aaagcatgtg ccaccactgc ctggctacaa tctatgtttt ataagagatt ataaagctct 1620 ggctttgtga cattaatctt tcagataata agtcttttgg attgtgtctg gagaacatac 1680 agactgtgag cagatgttca gaggtatatt tgcttagggg tgaattcaat ctgcagcaat 1740 aattatgagc agaattactg acacttccat tttatacatt ctacttgctg atctatgaaa 1800 catagataag catgcaggca ttcatcatag ttttctttat ctggaaaaac attaaatatg 1860 aaagaagcac tttattaata cagtttagat gtgttttgcc atcttttaat ttcttaagaa 1920 atactaagct gatgcagagt gaagagtgtg tgaaaagcag tggtgcagct tggcttgaac 1980 tcgttctcca gcttgggatc gacctgcagg catgcttcca tgccaaggcc cacactgaaa 2040 tgctcaaatg ggagacaaag agattaagct cttatgtaaa atttgctgtt ttacataact 2100 ttaatgaatg gacaaagtct tgtgcatggg ggtgggggtg gggttagagg ggaacagctc 2160 cagatggcaa acatacgcaa gggatttagt caaacaactt tttggcaaag atggtatgat 2220 tttgtaatgg ggtaggaacc aatgaaatgc gaggtaagta tggttaatga tctacagtta 2280 ttggttaaag aagtatatta gagcgagtct ttctgcacac agatcacctt tcctatcaac 2340 cccggg 2346 <210> 4 <211> 410 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Thyroxine binding globlulin promoter <400> 4 tgcatgtata atttctacag aacctattag aaaggatcac ccagcctctg cttttgtaca 60 actttccctt aaaaaactgc caattccact gctgtttggc ccaatagtga gaactttttc 120 ctgctgcctc ttggtgcttt tgcctatggc ccctattctg cctgctgaag acactcttgc 180 cagcatggac ttaaacccct ccagctctga caatcctctt tctcttttgt tttacatgaa 240 gggtctggca gccaaagcaa tcactcaaag ttcaaacctt atcatttttt gctttgttcc 300 tcttggcctt ggttttgtac atcagctttg aaaataccat cccagggtta atgctggggt 360 taatttataa ctaagagtgc tctagttttg caatacagga catgctataa 410 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Ly6D forward primer <400> 5 ggttccgagg tcacacaatg 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Ly6D reverse primer <400> 6 cagagagcca taacagtgag c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse beta-catenin forward primer <400> 7 ttccagcctt ccttcttggg 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse beta-catenin reverse primer <400> 8 tgttggcata gaggtcttta cgg 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA 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ccatgattcc ttcatatttg 180 catatacgat acaaggctgt tagagagata attggaatta atttgactgt aaacacaaag 240 atattagtac aaaatacgtg acgtagaaag taataatttc ttgggtagtt tgcagtttta 300 aaattatgtt ttaaaatgga ctatcatatg cttaccgtaa cttgaaagta tttcgatttc 360 ttggctttat atatcttgtg gaaaggacga aacaccggcc aagagctgat gacatatatc 420 tcgagatata tgtcatcagc tcttggtttt tgaattccaa ctttgtatag aaaagttgta 480 gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg 540 ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga 600 cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat 660 gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa 720 gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca 780 tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca 840 tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat 900 ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg 960 actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac 1020 ggtgggaggt ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg tcagatccaa gtttgtacaa 1080 aaaagcaggc tgccaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca 1140 tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg 1200 agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc 1260 ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct 1320 accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc 1380 aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt 1440 tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg 1500 gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg 1560 ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg 1620 gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc 1680 tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga 1740 agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg 1800 acgagctgta caagtaaacc cagctttctt gtacaaagtg gtgatggccg 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agcgcaacgc 5220 aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc 5280 tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca 5340 tgattacgaa ttg 5353

Claims (8)

  1. LY6D 발현 억제제를 담지한 간세포 특이적 전달체(hepatocyte-selective carrier)를 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 LY6D 발현 억제제는 LY6D의 mRNA 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 서열로 이루어진 핵산 분자인 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 핵산 분자는 gRNA, siRNA, shRNA, dsRNA, PNA 또는 microRNA인, 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 비알코올성 지방간 질환은 비알코올성 단순 지방간, 비알코올성 지방간염, 간경변으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 간세포 특이적 전달체는 아데노부속바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스 및 레트로바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 간세포 특이적 전달체는 아데노부속바이러스 8(AAV8)인 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 간세포 특이적 전달체는 간세포에서 특이적으로 발현하는 프로모터를 포함하는 것인 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 간세포에서 특이적으로 발현하는 프로모터는 알부민 프로모터 염기서열 또는 티록신 결합 글로불린(thyroxine-binding globulin, TBG) 프로모터 염기서열인 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR102378462B1 (ko) 2018-06-19 2022-03-24 한국과학기술원 비알코올성 간질환 동물 모델 및 비알코올성 간질환의 진단, 예방 또는 치료용 조성물

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KR102378462B1 (ko) 2018-06-19 2022-03-24 한국과학기술원 비알코올성 간질환 동물 모델 및 비알코올성 간질환의 진단, 예방 또는 치료용 조성물

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