CN114174501A

CN114174501A - 二磷酸尿苷依赖性糖基转移酶酶

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Publication number: CN114174501A
Application number: CN202080051996.2A
Authority: CN
Inventors: 杰森·埃里克·唐纳德; 阿吉库马尔·帕拉伊勒·库马兰; 阿龙·洛夫; 克里斯托夫·图米; 克里斯蒂娜·妮科尔·S·桑托斯
Original assignee: Manus Biosynthesis Inc
Current assignee: Manus Biosynthesis Inc
Priority date: 2019-06-25
Filing date: 2020-06-25
Publication date: 2022-03-11
Also published as: IL289202A; AU2020302789A1; MX2022000150A; KR20220034793A; EP3990628A1; US11788070B2; US20220090031A1; US20210009968A1; EP3990628A4; US11168309B2; WO2020264179A1; JP2022530706A; BR112021026306A2; CA3144658A1

Abstract

在各个方面，本发明提供了二磷酸尿苷依赖性糖基转移酶(UGT)酶，其能够催化单糖部分从NDP‑糖转移到底物，诸如类萜聚糖的糖部分的3’碳上，从而用作“1‑3 UGT”。在其他方面，本发明提供了编码1‑3 UGT的多核苷酸和包含所述多核苷酸的宿主细胞。在另一些其他方面，本发明提供了使用本公开的酶和宿主细胞制备包括甜菊醇糖苷在内的糖基化底物的方法。

Description

二磷酸尿苷依赖性糖基转移酶酶

相关申请

本申请要求2019年6月25日提交的美国临时专利申请No.62/866,148的权益，该申请的全部公开内容在此以引用的方式整体并入。

技术领域

本公开涉及用于产生糖基化底物的酶、编码多核苷酸、宿主细胞和方法。

以电子方式提交的文本文件的描述

随本申请以电子方式提交的下面的文本文件的内容以引用的方式整体并入本文：序列表的计算机可读格式拷贝(文件名称：MAN-024PC_Sequence Listing_ST25.txt；记录日期：2020年6月24日；文件大小：28,457字节)。

背景技术

高强度甜味剂具有比蔗糖甜度水平高许多倍的甜度水平。它们基本上是无热量的，通常用于饮食和低热量产品，包括食品和饮料。高强度甜味剂不会引起血糖响应，使得它们适用于针对糖尿病患者和其他对控制碳水化合物摄入量感兴趣的人的产品。

甜菊醇糖苷是在甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)叶中发现的一类化合物，甜叶菊是原产于南美洲某些地区的菊科(Asteraceae)(菊科(Compositae))多年生灌木。它们的结构特点是单碱基甜菊醇，不同之处在于位置C13和C19处存在碳水化合物残基。它们积聚在甜叶菊叶中，约占总干重的10％至20％。按干重计，甜叶菊叶中发现的四种主要糖苷通常包括甜菊苷(9.1％)、莱鲍迪苷A (3.8％)、莱鲍迪苷C(0.6-1.0％)和杜尔科苷A(0.3％)。其他已知的甜菊醇糖苷包括莱鲍迪苷B、C、D、E、F和M、甜菊醇二苷和甜茶苷。

据估计，次要糖基化产物莱鲍迪苷M(RebM)的效力比蔗糖的效力高大约200-350倍，并被描述为具有干净、甜的味道和微苦或甘草后味。Prakash I.等人，Development of Next Generation Stevia Sweetener:Rebaudioside M,Foods 3(1),162-175(2014)。RebM对全球食品行业非常感兴趣。

用于从甜菊植物制备甜菊醇糖苷的工艺是不可持续的，并且不适合于提供甜菊叶的次要糖基化产物。因此，仍然需要可持续且经济的用于制备包含甜菊醇糖苷的组合物(包括高度纯化的甜菊醇糖苷组合物)的方法。进一步地，需要用于生产大量的次要糖基化产物，诸如RebM等的方法。

发明内容

在各个方面，本发明提供了二磷酸尿苷(UDP)依赖性糖基转移酶(UGT)酶，其能够催化单糖部分从NDP-糖(如，UDP-糖)转移到底物(诸如类萜聚糖)的糖部分的3’碳上，从而用作“1-3 UGT”。在其他方面，本发明提供了编码1-3 UGT的多核苷酸和包含所述多核苷酸的宿主细胞。在其他方面，本发明提供了使用本公开的酶和宿主细胞制备糖基化底物(包括甜菊醇糖苷)的方法。

1-3 UGT对类萜糖苷(诸如甜菊醇糖苷)表现出高糖基转移酶活性。例如，1-3 UGT催化单糖部分从NDP-糖转移到类萜聚糖(诸如甜菊苷和RebD)上糖部分的3'碳上。也就是说，当底物是甜菊醇糖苷时，1-3 UGT可以催化NDP依赖的单糖部分转移到C13-或C19-连接的葡萄糖部分的3’碳上。在各种实施方案中，1-3 UGT催化RebM的生物合成。

在一方面，本发明提供了1-3 UGT酶，其包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少约75％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，该酶包含在对应于SEQ ID NO:1(甜叶菊UGT76G1)的位置29、200、357和414的位置处的氨基酸取代。包括在SEQ ID NO:5和6的酶中的这些位置(分别位于SEQ ID NO:5中的位置183、354、54和111)处的取代可以使活性相对于SEQ ID NO:1的酶急剧提高。

在一些实施方案中，1-3 UGT酶在对应于SEQ ID NO:5的位置155的位置之后包含5至约15个氨基酸，或约6至约12个氨基酸的插入物(相对于SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中，所述插入物(insertion)是柔性且亲水的序列，其可以主要是甘氨酸和丝氨酸残基。在一些实施方案中，该序列是GSGGSG(SEQ ID NO:7)或GSGGSGGSG(SEQ ID NO:8)。

在各种实施方案中，与UGT76G1-L200A(SEQ ID NO:3)相比，1-3 UGT酶表现出改善的甜菊苷向Reb A的转化，以及改善的RebD向RebM的转化。

在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:5的位置183、354、54和111的位置处的氨基酸的同一性(identity)允许在其他位置处进一步修饰。例如，在一些实施方案中，1-3UGT酶包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少约60％同一的氨基酸序列，其中UGT酶包含：在对应于SEQ ID NO:5的位置54的位置处的甘氨酸(G)或苏氨酸(T)；在对应于SEQ ID NO:5的位置111的位置处的亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；在对应于SEQ ID NO:5的位置183的位置处的甲硫氨酸(M)或亮氨酸(L)；和对应于SEQ ID NO:5的位置354的位置处的丙氨酸(A)或甘氨酸(G)或丝氨酸(S)。在一些实施方案中，1-3 UGT酶包含在对应于SEQ ID NO:5的位置183的位置处的甲硫氨酸(M)。在一些实施方案中，1-3 UGT酶包含在对应于SEQ ID NO:5的位置54的位置处的甘氨酸(G)。在一些实施方案中，1-3 UGT酶包含在对应于SEQ ID NO:5的位置111的位置处的亮氨酸(L)。在一些实施方案中，1-3 UGT具有在对应于SEQ ID NO:5的位置183的位置处的两个或三个甲硫氨酸(M)、在对应于SEQ ID NO:5的位置54的位置处的甘氨酸(G)和在对应于SEQ ID NO:5的位置111的位置处的亮氨酸(L)。这些修饰可以使酶活性相对于在SEQ ID NO:1的相应位置处的氨基酸同一性得到实质性改善。

在一些实施方案中，1-3 UGT酶包含以下一项或多项：参考SEQ ID NO:5的氨基酸序列的氨基酸残基159至161的缺失，位置262处的取代(如L262Q)、位置294处的取代(如R294)和位置413处的取代(如D413E)，在每种情况下均是参考SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

在实施方案中，1-3 UGT酶包含氨基酸残基159至161的缺失以及氨基酸取代L262Q、R294P和D413E，每个均参考SEQ ID NO:5的氨基酸序列。根据这些实施方案的示例性UGT酶在本文中作为SEQ ID NO:6被公开)。

在一些实施方案中，1-3 UGT酶包含参考SEQ ID NO:6的氨基酸序列的残基E225至T232中的一个或多个残基的缺失。在这些或其他实施方案中，1-3 UGT酶包含在选自位置72(如S72Q)、位置305(如A305C)、位置345(例如Y345F)和位置428(例如L428I)的位置处的一个或多个氨基酸取代，在每种情况下均是参考SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在示例性实施方案中，1-3 UGT酶包含氨基酸残基E225至T232的缺失以及氨基酸取代S72Q、A305C、Y345F和L428I，在每种情况下均是参考SEQ ID NO:6的氨基酸序列。根据这些实施方案的示例性UGT酶在本文中作为SEQ ID NO:9被公开)。

在一些实施方案中，本文所述的氨基酸修饰可替代地应用于SrUGT76G1或其环状重排体。

在其他方面，本发明提供了编码本文公开的1-3 UGT酶的多核苷酸，以及包含其的宿主细胞。该宿主细胞可以是微生物、真菌细胞、藻类细胞或植物细胞。该植物可以是甜菊植物，或更具体地，甜叶菊(Stevia rebaudiana)植物。甜菊植物天然表达合成甜菊醇和甜菊醇糖苷所需的酶，但它们仅产生痕量的高度糖基化的甜菊醇糖苷，诸如RebM。相比之下，表达编码1-3 UGT的多核苷酸的甜菊或甜叶菊植物的RebM含量可产生相对高水平的RebA、RebD和/或RebM；或其他通常少量的包含1-3个糖基化的甜菊醇糖苷，诸如RebB、RebG、RebI和Reb4。在各种实施方案中，所述细胞是微生物细胞，诸如大肠埃希氏菌。

在各种实施方案中，宿主细胞可表达一种或多种选自C-13 UGT酶、C-19 UGT酶和1-2 UGT酶的额外的UGT酶。“C-13 UGT”或UGTc13是能够将甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C13羟基基团处糖基化的糖基转移酶。“C-19 UGT”或UGTc19是能够将甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C19羧基基团处糖基化的糖基转移酶。“1-2 UGT”或UGT1-2是能够对13-O-葡萄糖和/或19-O-葡萄糖的C2’进行β1,2糖基化的糖基转移酶。“1-3 UGT”或UGT1-3是能够对13-O-葡萄糖和/或19-O-葡萄糖的C3’进行β1,3糖基化的糖基转移酶。

在一些实施方案中，宿主细胞表达(除了1-3 UGT酶之外)异源C-13 UGT酶、异源C-19 UGT酶和异源1-2 UGT酶，并且因此能够对甜菊醇和甜菊醇糖苷底物进行糖基化从而产生RebM。

在一些实施方案中，宿主细胞(例如，细菌或酵母细胞)通过表达用于甜菊醇生物合成的内源和/或异源酶来产生甜菊醇底物。在这些实施方案中，所述细胞从碳源例如葡萄糖、蔗糖或甘油等产生甜菊醇糖苷，例如RebM。

在一些方面，本发明提供了用于将单糖基团转移至底物的方法。该方法包括使NDP-糖(例如UDP-单糖)和底物与本文所述的1-3 UGT酶或与表达1-3 UGT酶或其裂解物的宿主细胞接触。各种底物可以根据本公开被糖基化，所述底物包括但不限于类萜。在一些实施方案中，底物是类萜底物，并且可以是类二萜，诸如甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，底物包含甜菊苷和/或RebD。在各种实施方案中，二磷酸核苷酸是UDP或ADP，或能够充当糖基供体分子的其他NDP。在各种实施方案中，单糖是葡萄糖、半乳糖、果糖、鼠李糖或木糖。在一些实施方案中，单糖是葡萄糖。对于采用微生物发酵或生物转化反应的实施方案，NDP-糖可以外源提供用于体外反应，或由宿主细胞内源产生。可以对宿主细胞进行各种修饰以增加可用的UDP-葡萄糖以支持反应。

在一些实施方案中，底物包含植物提取物，其任选地是甜菊叶提取物。在各种实施方案中，可以用甜菊醇或低阶(lower order)甜菊醇糖苷喂养表达1-3 UGT的微生物细胞以产生包括RebD和RebM在内的高阶(higher order)甜菊醇糖苷。来自甜菊叶提取物的高级中间体(advanced intermediate)很容易从现有的甜菊醇糖苷工业提取中获得。

在各种实施方案中，1-3 UGT将低阶甜菊醇糖苷转化为高阶甜菊醇糖苷。例如，UGT酶可以具有用于将甜菊双苷(steviobioside)转化为RebB、甜茶苷转化为RebG、甜菊苷转化为Reb A、Reb A转化为RebI、RebG转化为Reb4、RebE转化为Reb D以及/或者Reb D转化为RebM的1-3’UGT活性。可替代地，UGT可以与对某些底物具有特异性偏好的另一种或多种1-3UGT酶组合使用。例如，一种UGT可以优先在C13糖基底物上用作1-3 UGT，而另一种UGT酶在C19糖基底物上优先用作1-3 UGT。

在一些实施方案中，该方法包括使宿主细胞在底物的存在下生长。可以将底物供给到培养物中，或者在一些实施方案中，底物由宿主细胞合成。在一些实施方案中，底物包含甜菊醇或包含甜菊苷和RebA的混合物作为主要组分，并且宿主细胞表达用于产生目标甜菊醇糖苷(诸如RebM)的多种UGT酶。

附图说明

图1示出了莱鲍迪苷M(RebM)的化学结构，莱鲍迪苷M是甜菊醇糖苷家族的一种次要组分。RebM是具有六个葡萄糖基修饰的类二萜甜菊醇(框)的衍生物。

图2示出了从甜菊醇到RebM和其他甜菊醇糖苷的糖基化途径。UGTc13是一种糖基转移酶，其能够将甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C13羟基基团处糖基化。UGTc19是一种糖基转移酶，其能够将甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C19羧基基团处糖基化。UGT1-2是一种糖基转移酶，其能够对13-O-葡萄糖和/或19-O-葡萄糖的C2’进行β1,2糖基化。UGT1-3是一种糖基转移酶，其能够对13-O-葡萄糖和/或19-O-葡萄糖的C3’进行β1,3糖基化。

图3示出了SrUGT76G1(SEQ ID NO:1)和MbUGT1-3_2(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列比对，MbUGT1-3_2(SEQ ID NO:6)是SrUGT76G1的环状重排形式。图A示出了SrUGT76G1的与MbUGT1-3_2的C-末端部分对齐的N-末端部分。图B示出了SrUGT76G1的与MbUGT1-3_2的N-末端部分对齐的C-末端部分。

图4示出了由以下糖基转移酶引起的在体外甜菊苷转化为RebA的百分比和RebD转化为RebM的百分比：UGT76G1-L200A(SEQ ID NO:3)、MbUGT1-3_0(SEQ ID NO:4)、MbUGT1-3_1(SEQ ID NO:5)和MbUGT1-3_2(SEQ ID NO:6)。

图5示出了与UGT76G1-L200A相比，甜菊苷向RebA的转化和RebD向RebM的转化的改善倍数。MbUGT1-3_1和MbUGT1-3_2在针对这两种转化的酶生产率方面都表现出非常明显的改善。

具体实施方式

在各个方面，本发明提供了二磷酸尿苷依赖性糖基转移酶(UGT)酶，其能够催化单糖部分从NDP-糖(如，UGT-糖)转移到底物(诸如类萜聚糖)的糖部分的3’碳上，从而用作“1-3 UGT”。在其他方面，本发明提供了编码1-3 UGT的多核苷酸和包含所述多核苷酸的宿主细胞。在其他方面，本发明提供了使用本公开的酶和宿主细胞制备糖基化底物(包括甜菊醇糖苷)的方法。

1-3 UGT酶对类萜糖苷(诸如甜菊醇糖苷)表现出高糖基转移酶活性。例如，1-3UGT酶催化单糖部分从NDP-糖转移到类萜聚糖(诸如甜菊苷和RebD)上糖部分的3'碳上。也就是说，当底物是甜菊醇糖苷时，1-3 UGT可以催化NDP依赖性单糖部分转移到C13-或C19-连接的糖(如，葡萄糖)部分的3’碳上。在一些实施方案中，与在C13-连接的糖处相比，1-3UGT酶在C19-连接的糖处具有更高的糖基化速率或生产率。在一些实施方案中，单糖是葡萄糖，但在其他实施方案中，单糖可以是半乳糖、果糖、鼠李糖、木糖或其他单糖。

在各种实施方案中，1-3 UGT催化RebM的生物合成。RebM的结构如图1所示。RebM包含具有以下六个糖基化的甜菊醇支架：(1)C13 O-糖基化，(2)C13 1-2糖基化，(3)C13 1-3糖基化，(4)C19 O-糖基化，(5)C19 1-2糖基化，和(6)C19 1-3糖基化。如图2所示，1-3UGT可以通过将额外的葡萄糖转移至RebD底物来产生RebM。进一步地，1-3 UGT酶可以催化单糖向其他甜菊醇糖苷底物的转移，从而产生产物诸如RebB(从甜菊醇二苷产生)、RebG(从甜茶苷产生)、Reb4(从RebG产生)、RebA(从甜菊苷产生)、RebD(从RebE产生)和RebI(从RebA产生)。在一些实施方案中，底物包括植物提取物，诸如甜菊叶提取物，并且1-3 UGT(连同其他糖基转移酶酶的作用)能够对各种主要或次要糖基化产物进行糖基化以产生主要为RebM的产物。

在一方面，本发明提供了1-3 UGT酶，其包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少约75％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，1-3 UGT包含与SEQ ID NO:5或6至少约80％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，氨基酸序列与SEQ ID NO:5或6至少约85％同一、与SEQ ID NO:5或6至少约90％同一，或与SEQ ID NO:5或6至少约95％同一，或与SEQ ID NO:5或6至少约98％同一。在一些实施方案中，氨基酸序列包含SEQ ID NO:5或6的氨基酸。

在一些实施方案中，1-3 UGT酶包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少约75％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，1-3 UGT酶包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少约80％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:9至少约85％同一，或与SEQ ID NO:9至少约90％同一，或与SEQ ID NO:9至少约95％同一，或与SEQ ID NO:9至少约98％同一。在一些实施方案中，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸。

例如，所述氨基酸序列可以具有1至20个独立地选自相对于氨基酸序列SEQ IDNO:5或6的取代、缺失和插入的氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述氨基酸序列具有1至10个独立地选自相对于SEQ ID NO:5或6的氨基酸序列的取代、缺失和插入的氨基酸修饰(如，1至5个)。在一些实施方案中，UGT氨基酸序列具有1至20个独立地选自相对于SEQ ID NO:9的氨基酸序列的取代、缺失和插入的氨基酸修饰。在一些实施方案中，所述氨基酸序列具有1至10个(如，1至5个)独立地选自相对于SEQ ID NO:9的氨基酸序列的取代、缺失和插入的氨基酸修饰。对SEQ ID NO:5、6或9的氨基酸序列的氨基酸修饰可以由可用的酶结构和同源模型构建来引导。示例性结构描述于如，Li等人，“Crystal Structure of Medicagotruncatula UGT85H2–insights into the Structural Basis of a Multifunctional(iso)Flavonoid Glycosyltransferase,”J.of Mol.Biol.370.5(2007):951-963以及Lee等人，“Molecular Basis for Branched Steviol Glucoside Biosynthesis,”PNAS 116:13131-13136(2019)。公开可用的晶体结构(如，PDB条目：2PQ6)可用于告知氨基酸修饰。例如，可以对活性位点或在活性位点附近进行一个或多个氨基酸修饰以改善底物的结合，以及/或者以改善这些具有催化侧链的底物的反应几何构型(geometries)。

在一些实施方案中，该酶包含在对应于SEQ ID NO:1(甜叶菊UGT76G1)的位置29、200、357和414的位置处的氨基酸取代。在包括在SEQ ID NO:5、6和9的酶中的这些位置(分别为在SEQ ID NO:5中的位置183、354、54和111)处的取代可提供显著的活性改善。在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:5的位置183、354、54和111的位置处的氨基酸的同一性(identity)允许在其他位置处进一步修饰。例如，在一些实施方案中，1-3 UGT酶包含与SEQID NO:5、6或9的氨基酸序列至少约60％同一的氨基酸序列，其中UGT酶包含：在对应于SEQID NO:5的位置54的位置处的甘氨酸(G)或苏氨酸(T)；在对应于SEQ ID NO:5的位置111的位置处的亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；在对应于SEQ ID NO:5的位置183的位置处的甲硫氨酸(M)或亮氨酸(L)；和在对应于SEQ ID NO:5的位置354的位置处的丙氨酸(A)，或甘氨酸(G)，或丝氨酸(S)。在一些实施方案中，1-3 UGT酶包含在对应于SEQ ID NO:5的位置183的位置处的甲硫氨酸(M)。在一些实施方案中，1-3 UGT酶包含在对应于SEQ ID NO:5的位置54的位置处的甘氨酸(G)。在一些实施方案中，1-3 UGT酶包含在对应于SEQ ID NO:5的位置111的位置处的亮氨酸(L)。在一些实施方案中，1-3 UGT酶具有以下中的两者或三者：在对应于SEQ ID NO:5的位置183的位置处的甲硫氨酸(M)、在对应于SEQ ID NO:5的位置54的位置处的甘氨酸(G)，和在对应于SEQ ID NO:5的位置111的位置处的亮氨酸(L)。这些修饰可提供对酶活性的显著改善。

1-3 UGT酶可以在对应于SEQ ID NO:5的位置54的位置处包含除丝氨酸以外的其他取代，该丝氨酸在SEQ ID NO:1的相应位置(357)处。因此，在一些实施方案中，对应于SEQID NO:5的位置54的位置处的取代是疏水性氨基酸，诸如丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)或甲硫氨酸(M)。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO：5的位置54的位置处的氨基酸具有不具有提供氢键的能力的侧链。在其他实施方案中，对应于SEQ ID NO:5的位置54的位置处的氨基酸为甘氨酸(G)、天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)或酪氨酸(Y)。

在各种实施方案中，1-3 UGT酶包含在对应于SEQ ID NO：5的位置111的位置处的亮氨酸(L)氨基酸。在一些实施方案中，1-3 UGT酶可在该位置处包含除亮氨酸以外的氨基酸。在各种实施方案中，对应于SEQ ID NO:5的位置111的位置将不是缬氨酸，即在SEQ IDNO:1的相应位置处的氨基酸。在对应于位置111的位置处的其他合适的取代可以包括甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)或甲硫氨酸(M)。在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:5的位置111的位置处的氨基酸具有比缬氨酸的疏水性和/或体积更小的侧链。

在各种实施方案中，UGT包含在对应于SEQ ID NO：5的位置183的位置处的甲硫氨酸(M)氨基酸。在各种实施方案中，UGT在该位置处包含除异亮氨酸以外的另一种合适的氨基酸，该异亮氨酸在SEQ ID NO：1的相应位置处。例如，该位置处的氨基酸可以具有比异亮氨酸的疏水性低和/或可提供氢键的侧链。在对应于SEQ ID NO:5的位置183的位置处的一些示例性取代包括丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。

在各种实施方案中，1-3 UGT包含在对应于SEQ ID NO：5的位置354的位置处的丙氨酸(A)或甘氨酸(G)。在各种实施方案中，该位置处的氨基酸具有比位于SEQ ID NO:1的相应位置处的亮氨酸的疏水性和/或体积更小的侧链。

在一些实施方案中，1-3 UGT酶在对应于SEQ ID NO:5的位置155的位置之后包含5至约15个氨基酸，诸如6至12个氨基酸，或约6或约11个氨基酸的插入物(相对于UGT76G1，SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中，所述插入物是柔性和亲水序列，其主要是甘氨酸和丝氨酸残基。在一些实施方案中，该序列是GSGGSG(SEQ ID NO:7)或GSGGSGGSG(SEQ ID NO:8)。

在各种实施方案中，与UGT76G1-L200A(SEQ ID NO:3)相比，1-3 UGT酶表现出改善的甜菊苷向Reb A的转化，以及改善的RebD向RebM的转化。这种改善的转化在生物转化测定中表现出来，在该生物转化测定中，甜菊苷或RebD底物被供给到表达本公开的1-3UGT酶的微生物细胞中。改善的转化可以在与含有重组表达的1-3UGT的细胞裂解物的反应或者与纯化或部分纯化的1-3 UGT的体外反应中得到证明。这样的反应是本领域公知的。可替代地，可以使用全细胞测定。例如，使表达1-3 UGT酶的大肠埃希氏菌菌株(ΔushA、ΔgalETKM、Δpgi；过度表达的pgm、galU)在96孔板中以250rpm、在37℃下生长过夜。然后将细胞转移到新鲜的生产培养物中至总体积的10％。0.5mM底物(如，甜菊苷或莱鲍迪苷D)包括在生产培养物中。然后使生产培养物在96孔板中以250rpm在37℃下生长48小时。可以使用LC-MS QQQ对产物进行定量。

在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:5的位置183、354、54和111的位置处的氨基酸的同一性(identity)允许在其他位置处进一步修饰。例如，在一些实施方案中，1-3UGT酶包含与SEQ ID NO:5、6或9的氨基酸序列至少约60％同一的氨基酸序列，其中UGT酶包含：在对应于SEQ ID NO:5的位置54的位置处的甘氨酸(G)或苏氨酸(T)；在对应于SEQ IDNO:5的位置111的位置处的亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)；在对应于SEQ ID NO:5的位置183的位置处的甲硫氨酸(M)或亮氨酸(L)；和在对应于SEQ ID NO:5的位置354的位置处的丙氨酸(A)，或甘氨酸(G)，或丝氨酸(S)。在一些实施方案中，1-3 UGT酶包含在对应于SEQ ID NO:5的位置183的位置处的甲硫氨酸(M)。在一些实施方案中，1-3 UGT酶包含在对应于SEQ IDNO:5的位置54的位置处的甘氨酸(G)。在一些实施方案中，1-3 UGT酶包含在对应于SEQ IDNO:5的位置111的位置处的亮氨酸(L)。在一些实施方案中，1-3 UGT酶具有以下中的两者或三者：在对应于SEQ ID NO:5的位置183的位置处的甲硫氨酸(M)、在对应于SEQ ID NO:5的位置54的位置处的甘氨酸(G)，和在对应于SEQ ID NO:5的位置111的位置处的亮氨酸(L)。这些修饰可提供对酶活性的显著改善。在一些实施方案中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5、6或9的氨基酸序列至少约70％同一，或与SEQ ID NO:5、6或9的氨基酸序列至少约80％同一，或与SEQ ID NO:5、6或9的氨基酸序列至少约90％同一，或与SEQ ID NO:5、6或9的氨基酸序列至少约95％同一。

在一些实施方案中，1-3 UGT酶包含在对应于SEQ ID NO:5的位置54的位置处的甘氨酸(G)氨基酸、在对应于SEQ ID NO:5的位置111的位置处的亮氨酸(L)氨基酸；和在对应于SEQ ID NO:5的位置183的位置处的甲硫氨酸(M)氨基酸。

在一些实施方案中，1-3 UGT酶包含在对应于SEQ ID NO:5的位置54的位置处的甘氨酸(G)氨基酸，和在对应于SEQ ID NO:5的位置111的位置处的亮氨酸(L)氨基酸。

在一些实施方案中，1-3 UGT酶包含在对应于SEQ ID NO:5的位置54的位置处的甘氨酸(G)氨基酸，和在对应于SEQ ID NO:5的位置183的位置处的甲硫氨酸(M)氨基酸。

在一些实施方案中，1-3 UGT酶包含在对应于SEQ ID NO:5的位置111的位置处的亮氨酸(L)氨基酸和在对应于SEQ ID NO:5的位置183的位置处的甲硫氨酸(M)氨基酸。

在这些或其他实施方案中，1-3 UGT酶具有相对于SEQ ID NO:6的氨基酸序列的在位置E225至T232处的一个或多个氨基酸的缺失。例如，UGT可以具有对应于SEQ ID NO:6的氨基酸E225-T232的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或八个氨基酸的缺失。

在这些或其他实施方案中，1-3 UGT酶进一步包含在对应于位置72、位置305、位置345和位置428的位置处的一个或多个氨基酸取代。例如，1-3 UGT酶可以具有在对应于SEQID NO:6的位置72的位置处的谷氨酰胺(Q)或天冬酰胺(N)的取代。在一些实施方案中，1-3UGT酶具有在对应于SEQ ID NO:6的位置305的位置处的中性亲水氨基酸(诸如半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T))的取代。在一些实施方案中，1-3 UGT酶具有在对应于SEQ IDNO:6的位置345的位置处的苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)的取代。在一些实施方案中，1-3 UGT酶具有在对应于SEQ ID NO:6的位置428的位置处的异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)或丙氨酸(A)的取代。在一些实施方案中，1-3 UGT酶具有相对于SEQ ID NO:6的以下取代中的2、3或4个：S72Q、A305C、Y345F和L428I。

在一些实施方案中，1-3 UGT酶在对应于SEQ ID NO:5的位置155的位置之后包含5至约15个氨基酸，诸如约6至约12个氨基酸，或约6或约11个氨基酸的插入物(相对于76G1)。在一些实施方案中，所述插入物是柔性和亲水序列(诸如氨基酸序列)，其主要是甘氨酸和丝氨酸残基。在一些实施方案中，该序列是GSGGSG(SEQ ID NO:7)或GSGGSGGSG(SEQ ID NO:8)。

在另一些其他方面和实施方案中，1-3 UGT酶不是UGT76G1的环状重排体，即，该酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约75％序列同一性的氨基酸序列。在此类实施方案中，该酶可包含一个或多个本文所述的氨基酸修饰。UGT76G1(SEQ ID NO:1)的示例性修饰包括选自以下的相对于SEQ ID NO:1的修饰：(i)对应于E74至T81的一个或多个氨基酸的缺失；(ii)在对应于位置357的位置处的取代，其任选地是甘氨酸；(iii)在对应于位置414的位置处的取代，并且其任选地是亮氨酸；(iv)在对应于位置29的位置处的取代，并且其任选地是甲硫氨酸；(v)在对应于位置402的位置处的取代，其任选地是谷氨酰胺；(vi)在对应于位置154的位置处的取代，其任选地是半胱氨酸；(vii)在对应于位置194的位置处的取代，并且其任选地是苯丙氨酸；(viii)在对应于位置277的位置处的取代，并且其任选地是异亮氨酸；(ix)在对应于位置208的位置处的取代，并且其任选地是谷氨酰胺；(x)在对应于位置140的位置处的取代，并且其任选地是脯氨酸；和(xi)在对应于位置259的位置处的取代，并且其任选地是谷氨酸。

例如，在一些实施方案中，UGT酶包含对应于SEQ ID NO:1的E74至T81的至少两个，或至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或所有八个氨基酸的缺失。在各种实施方案中，该酶进一步包含在对应于SEQ ID NO:1的位置200的位置处的丙氨酸的取代。在一些实施方案中，该酶具有以下中的至少两个、三个或四个：357G、414L、29M、402Q、154C、194F、277I、208Q、140P和259E，各自根据SEQ ID NO:1编号。

在此类实施方案中，该酶可以具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的至少约80％序列同一性，或至少约85％序列同一性，或至少约90％序列同一性，或至少约95％序列同一性，或至少约98％序列同一性。例如，该酶可以具有1至20或1至10个独立地选自相对于SEQID NO:1的氨基酸取代、缺失和插入的氨基酸修饰。

在另一些其他方面和实施方案中，1-3 UGT酶是SrUGT76G1的环状排列体(参见US2017/0332673，其通过引用在此整体并入)并且任选地具有1至20或1至15，或1至10个独立地选自相对于SEQ ID NO:1的相应位置的氨基酸取代、缺失和插入的氨基酸修饰。示例性的相对于SEQ ID NO:1的位置的修饰可以选自：(i)对应于E74至T81的一个或多个氨基酸的缺失(如本文所述)；(ii)在对应于位置357的位置处的取代，其任选地是甘氨酸；(iii)在对应于位置414的位置处的取代，并且其任选地是亮氨酸；(iv)在对应于位置29的位置处的取代，并且其任选地是甲硫氨酸；(v)在对应于位置402的位置处的取代，其任选地是谷氨酰胺；(vi)在对应于位置154的位置处的取代，其任选地是半胱氨酸；(vii)在对应于位置194的位置处的取代，并且其任选地是苯丙氨酸；(viii)在对应于位置277的位置处的取代，并且其任选地是异亮氨酸；(ix)在对应于位置208的位置处的取代，并且其任选地是谷氨酰胺；(x)在对应于位置140的位置处的取代，并且其任选地是脯氨酸；和(xi)在对应于位置259的位置处的取代，并且其任选地是谷氨酸。在一些实施方案中，UGT酶包含对应于E74至T81的氨基酸的缺失。

酶的氨基酸序列的变化可改变其活性或没有可测量的影响。没有可测量影响的无声变化最有可能是保守取代和远离活性位点和底物结合位点的溶剂暴露表面上的小的插入或缺失。相比之下，酶促活性更可能受到非保守取代，大插入或缺失，以及在活性位点、底物结合位点内以及在对蛋白质折叠或构象很重要的掩埋位置处的变化的影响。改变酶促活性的变化可增加或减少反应速率或者增加或减少对特定底物的亲和力或特异性。例如，使底物结合位点尺寸增加的变化可允许酶作用于更大的底物，并且将催化氨基酸侧链定位成更靠近底物上的靶位点的变化可增加酶促速率。

了解酶的三维结构以及相关活性位点、底物结合位点和其他相互作用位点的位置可以促进突变的合理设计，并提供对特定变化表型的机制洞察。植物UGT共有高度保守的二级和三级结构，同时具有相对较低的氨基酸序列同一性。Osmani等人，Substrate specificity of plant UDP-dependent glycosyltransferases predicted from crystal structures and homology modeling,Phytochemistry 70(2009)325–347。UGT的糖受体和糖供体底物被容纳在N-和C-末端结构域之间形成的裂缝中。一级序列的几个区域有助于形成底物结合袋，其包括结构上保守的结构域以及在氨基酸序列和序列长度方面都不同的环区。

UGT衍生物的构建可以基于结构分析和同源建模进行指导。参见，Soon Goo Lee等人，Molecular Basis for Branched Steviol Glucoside Biosynthesis,PNAS，2019年6月19日。

例如，基于SrUGT76G1_L200A的独立晶体结构制备和分析以及SrUGT76G1与MbUGT3-1_1的氨基酸序列比对，预测甜菊苷的甜菊醇核心与MbUGT3-1_1的以下残基接近(在

内)：I244、L280、W351、A354、I357、M362和T438。进一步地，预测C19 1-2糖基化与T438接近(在

内)。预计RebD的甜菊醇核心与MbUGT3-1_1的以下疏水侧链接近(在

内)：L239、M242、I244、L280、I353、A354和I357。预计C13 1-2'糖基化与MbUGT3-1_1的以下氢键合侧链接近(在

内)：S301和D77。MbUGT3-1_1的V341-Q352和K355-A367螺旋的定位和氨基酸含量对于催化可能很重要，因为对应于L200A的突变位于这些螺旋之间的环中。MbUGT3-1_1的位置L76和/或D77可能与甜菊苷的C13糖基化相互作用。

氨基酸的取代可以是保守取代或非保守取代。保守取代被定义为其中旧氨基酸和新氨基酸具有相似的特征(诸如大小和电荷)的取代。

天然存在的残基基于常见的侧链特性分为几组：

(组1)疏水性(脂肪族)：甲硫氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)；

(组2)中性亲水性：半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)；

(组3)酸性：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)；

(组4)碱性：组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)；

(组5)影响链取向的残基：甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)；和

(组6)芳香族：色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)。

非保守取代将需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的另一氨基酸。

UGT酶的氨基酸序列可以任选地包含在位置2处插入或取代的丙氨酸以减少细胞中的周转。在各种实施方案中，1-3 UGT酶包含在相对于SEQ ID NO:5、6或9的位置2处插入或取代的丙氨酸氨基酸残基，以提供额外的体内稳定性。

氨基酸序列的同一性，即序列同一性百分比，可以通过序列比对来确定。此类比对可以用数种已知的算法，诸如Karlin及Altschul所描述的算法(Karlin&Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877)，用hmmalign(HMMER包)，或者用CLUSTAL算法(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.&Gibson,T.J.(1994)Nucleic Acids Res.22,4673-80)进行。可以使用如BLAST、BLAT或BlastZ(或BlastX)计算序列同一性(序列匹配)等级。将相似算法并入到Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的BLASTN和BLASTP程序中。BLAST蛋白比对可用BLASTP程序，评分＝50，词长＝3进行。为了获得有空位的比对以进行比较，如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述的那样来利用GappedBLAST。在利用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各个程序的默认参数。

在其他方面，本发明提供了编码本文公开的1-3 UGT酶的多核苷酸，以及包含其的宿主细胞。该宿主细胞可以是微生物、真菌细胞、藻类细胞或植物细胞。该植物可以是甜菊植物，或更具体地，甜叶菊(Stevia rebaudiana)植物。甜菊植物天然表达合成甜菊醇和甜菊醇糖苷所需的酶，但它们仅产生痕量的高度糖基化的甜菊醇糖苷，诸如RebM。相比之下，表达编码1-3 UGT的多核苷酸的甜菊或甜叶菊植物的RebM含量可以是该植物叶的甜菊醇糖苷含量的超过约1％，或超过约2％，或超过约5％，或超过约10％。此外，表达编码1-3 UGT的多核苷酸的甜菊或甜叶菊植物的RebA含量可以是该植物叶的甜菊醇糖苷含量的超过约5％，或超过约10％，或超过约15％。

微生物宿主细胞在各种实施方案中可以是原核的或真核的。在一些实施方案中，微生物宿主细胞是选自以下的细菌：埃希氏菌属(Escherichia spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)、红细菌属(Rhodobacter spp.)、发酵单胞菌属(Zymomonas spp.)、弧菌属(Vibrio spp.)和假单胞菌属(Pseudomonasspp.)。例如，在一些实施方案中，细菌宿主细胞是选自以下的物种：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、需钠弧菌(Vibrionatriegens)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。在一些实施方案中，细菌宿主细胞是大肠埃希氏菌。可替代地，微生物细胞可以是酵母细胞，诸如但不限于酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)或耶氏酵母属(Yarrowia)的种，包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。

编码1-3 UGT酶的多核苷酸可以被整合到微生物细胞的染色体中，或者可替代地，在染色体外表达。例如，1-3 UGT酶可以从细菌人工染色体(BAC)或质粒表达。

可以使用例如基因模块(如操纵子)或UGT酶的独立表达来调整UGT酶的表达以获得最佳活性。例如，基因或操纵子的表达可以通过选择具有不同强度(例如强、中或弱)的启动子诸如诱导型启动子或组成型启动子来调控。具有不同强度的启动子的几个非限制性实例包括Trc、T5和T7。另外，可以通过操纵细胞中基因或操纵子的拷贝数来调控基因或操纵子的表达。在一些实施方案中，所述细胞表达每种UGT酶的单个拷贝。在一些实施方案中，可以通过操纵模块内基因的顺序来调节基因或操纵子的表达，其中先转录的基因一般以更高的水平表达。在一些实施方案中，通过将一个或多个基因或操纵子整合到染色体中来调节基因或操纵子的表达。

对UGT表达的优化也可以通过选择适当的启动子和核糖体结合位点来实现。在一些实施方案中，这可以包括选择高拷贝数的质粒，或单拷贝数、低拷贝数或中拷贝数的质粒。转录终止步骤的目标也可以是通过引入或消除诸如茎-环的结构来调控基因表达。

在一些实施方案中，所述细胞为植物细胞。例如，所述多核苷酸可以在合适的启动子诸如组成型或诱导型启动子的控制下在甜菊植物中异源表达。

在各种实施方案中，宿主细胞可表达一种或多种选自C-13 UGT酶、C-19 UGT酶和1-2 UGT酶的额外的UGT酶。在一些实施方案中，宿主细胞表达(除了1-3 UGT酶之外)异源C-13 UGT酶、异源C-19 UGT酶和异源1-2 UGT酶，并且因此能够对甜菊醇和甜菊醇糖苷底物进行糖基化从而产生RebM。

图2例示了甜菊醇和各种甜菊醇糖苷的结构，并标识出由甜菊醇产生RebM的生物合成途径中的酶促活性。同样，表1标识出由甜菊醇产生RebM的生物合成途径上的底物和产物。对于每个底物和产物对，表1描述了糖基化的类型并标识出具有必要活性的酶。产生RebM需要四种类型的糖基化活性：C13和C19碳的初级糖基化，以及初级聚糖的2'或3'位置处的二级糖基化。聚糖一次被添加一个6碳单糖单元。因此，一级聚糖必须缀合至甜菊醇或甜菊醇糖苷的C13或C19，然后二级聚糖才可缀合至一级聚糖。然而，甜菊醇糖苷的糖基化顺序不以其他方式被限制。表2标识出在由甜菊醇产生Reb M的生物合成途径中具有所需活性的各种来源的酶，并提供了它们的核苷酸和氨基酸序列的参考文献。参见美国专利申请公开20170332673，其在此通过引用整体并入。

表1：产生Reb M的酶催化反应.

表2：用于生物合成甜菊醇糖苷的酶/基因序列

在一些实施方案中，宿主细胞通过表达用于甜菊醇生物合成的内源和/或异源酶来产生甜菊醇。宿主细胞可以被工程化为共表达1-3 UGT以及对类萜和类萜糖苷有活性的其他UGT酶(诸如C-13 UGT酶、C-19 UGT酶和1-2 UGT酶)(参见表1-2)。微生物细胞可以另外被工程化成共表达用于甜菊醇生物合成的酶，诸如MEP或MVA途径的酶、柯巴基合酶和贝壳杉烯合酶(其在一些实施方案中可以作为双功能酶存在)、P450酶诸如贝壳杉烯氧化酶和贝壳杉烯酸羟化酶和P450还原酶酶。表3.用于甜菊醇生物合成的途径和酶公开在据此通过引用整体并入本文的US 20170332673中。

表3：使甜菊醇生物合成成为可能的酶/基因序列概述.

在一些方面，本发明提供了用于将单糖基团转移至底物的方法。该方法包括使NDP-糖(如UDP-单糖)和底物与本文所述的1-3 UGT酶，或表达1-3 UGT酶的宿主细胞或其裂解物接触。各种底物可以根据本公开被糖基化，所述底物包括但不限于类萜。在一些实施方案中，底物是类萜底物，并且可以是类二萜，诸如甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，底物包含甜菊苷和/或RebD。在各种实施方案中，单糖是葡萄糖、半乳糖、果糖、鼠李糖或木糖。在一些实施方案中，单糖是葡萄糖。在一些实施方案中，该方法用重组1-3 UGT在体外进行，并且包括外源添加的NDP-糖(如UDP-葡萄糖或ADP-葡萄糖)试剂。在其他实施方案中，1-3 UGT在细胞中重组表达，并且NDP-葡萄糖是内源可用的。在这些实施方案中，底物可以被供给到细胞中，并且在细胞中可用于糖基转移酶反应。

全细胞转化(即“生物转化反应”)需要底物(如糖苷中间体)和产物分别被转运进和转运出细胞，并且细胞提供UDP-葡萄糖辅因子再生。这与使用细胞裂解或细胞外分泌的酶的过程形成对比，后者需要外源性NDP-葡萄糖供应或NDP-葡萄糖前体或NDP-葡萄糖再生机制或NDP-葡萄糖再生酶系统。在本发明的实施方案中，催化(糖基化)在活微生物细胞内进行。UDP-葡萄糖辅因子再循环利用天然细胞代谢进行，不需要外部提供的酶或供给昂贵的底物。根据一些实施方案，糖苷中间体被转运到细胞中，并且产物被转运出细胞。

US 2017/0332673描述了过表达MEP途径酶的大肠埃希氏菌菌株，连同下游甜菊醇生物合成途径和驱动葡萄糖产生RebM的UGT酶。然而，这些菌株不能将供给的甜菊醇糖苷中间体生物催化成RebM，这可能部分是由于宿主细胞无法输入甜菊醇糖苷底物。在一些实施方案中，对微生物细胞的遗传修饰允许糖基化中间体易位到细胞中，而高级糖基化产物分泌到培养基中。

在一些实施方案中，微生物细胞具有一种或多种增加UDP-葡萄糖可用性的遗传修饰。在一些实施方案中，不希望受理论束缚，这些修饰还可对细胞的葡萄糖可用性施加压力，导致内源性转运蛋白的表达增加从而将甜菊醇糖苷输入到细胞中。指数生长的大肠埃希氏菌中的野生型UDP-葡萄糖水平为约2.5mM(Bennett BD等人，Absolute metabolite concentrations and implied enzyme active site occupancy in Escherichia coli.Nat Chem Biol.2009；5(8):593-9)。在一些实施方案中，对宿主细胞的遗传修饰被工程化成使呈指数生长的细胞(如，不具有UGT酶的重组表达的细胞)中的UDP-葡萄糖增加，例如增加至至少5mM或至少10mM。

在一些实施方案中，微生物细胞具有编码消耗UDP-葡萄糖的酶的基因的缺失、失活，或者活性或表达降低。例如，微生物细胞可具有ushA (UDP-糖水解酶)以及/或者galE、galT、galK和galM(其负责从UDP-葡萄糖生物合成UDP-半乳糖)中的一种或多种，或其在微生物物种中的直系同源物的缺失、失活，或活性降低。在一些实施方案中，galETKM基因失活、缺失，或表达显著降低。

在这些或其他实施方案中，微生物细胞具有编码消耗UDP-葡萄糖前体的酶的基因的缺失、失活，或者活性或表达降低。例如，在一些实施方案中，微生物细胞具有pgi(葡萄糖-6磷酸酯异构酶)或其在宿主细胞的微生物物种中的直向同源物的缺失、失活，或者活性或表达降低。

在这些或其他实施方案中，所述细胞具有编码参与将葡萄糖-6-磷酸酯转化为UDP-葡萄糖的酶的一种或多种基因的过度表达或活性增加。例如，pgm(磷酸葡萄糖变位酶)和/或galU(UTP-葡萄糖-1-磷酸酯尿苷酰转移酶)(或其直系同源物或衍生物)可以被过表达，或被修饰成增加酶生产力。参见US 2020/0087692，其通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，底物是植物提取物，其任选地是甜菊叶提取物。在各种实施方案中，可以用甜菊醇或低阶甜菊醇糖苷喂养表达1-3 UGT的微生物细胞以生产包括Reb D和Reb M在内的高阶甜菊醇糖苷。来自甜菊叶提取物的高级中间体可容易地从现有的甜菊醇糖苷工业提取中获得。如表4所示，可用的叶提取物主要含有途径中间体甜菊苷和莱鲍迪苷A (RebA)。在各种实施方案中，甜菊叶提取物是甜菊醇糖苷的提取物。在一些实施方案中，所述提取物包含甜菊苷、甜菊醇二苷和莱鲍迪苷A中的一种或多种作为主要组分。主要组分一般构成提取物中甜菊醇糖苷的至少约10％，但在一些实施方案中，可构成提取物中甜菊醇糖苷的至少约20％，或至少约25％，或至少约30％。

表4：可用甜菊叶提取物的甜菊醇糖苷组成

％	第1批	第2批	第3批
				莱鲍迪苷A	38.2	10.5	30.3
甜菊苷	8.5	9.0	18.4
				莱鲍迪苷C	12.9	4.2	16.6
莱鲍迪苷B	4.3	7.1	1.2
				甜茶苷	5.0	2.2	2.0
莱鲍迪苷F	2.0	2.7	2.1
				甜菊醇二苷	0.3	3.7	0.3
莱鲍迪苷D	0.2	2.1	0.9
				杜尔可苷A	0.9	0.4	0.5

在一些实施方案中，用RebD喂养表达1-3 UGT酶的微生物细胞，该细胞将至少约15％，或至少约20％，或至少约25％，或至少约30％，或至少约50％，或至少约75％，或至少约90％的Reb D转化为Reb M。在各种实施方案中，允许此类转化进行至少约8小时，或在一些实施方案中至少约24小时。例如，可以允许所述转化在培养物中进行8小时到约72小时。在一些实施方案中，可以允许所述转化进行约24小时至约60小时。在一些实施方案中，微生物细胞在约48小时或更短或约24小时或更短的时间内将至少约40％，或至少约50％，或至少约75％，或至少约90％的Reb D转化为Reb M。

在一些实施方案中，用甜菊苷喂养微生物细胞，该微生物细胞表达1-3 UGT，并且将至少约15％，或至少约20％，或至少约25％，或至少约30％，或至少约50％的甜菊苷转化为Reb A。在一些实施方案中，该酶将至少约75％或至少约90％的甜菊苷转化为RebA。在各种实施方案中，允许此类转化进行至少约8小时，或在一些实施方案中至少约24小时。例如，可以允许所述转化在培养物中进行8小时到约72小时。在一些实施方案中，可以允许所述转化进行约24小时至约60小时。在一些实施方案中，微生物细胞在约48小时或更短或约24小时或更短的时间内将至少约40％，或至少约50％，或至少约75％的甜菊苷转化为Reb A。

虽然天然UGT酶一般是植物酶(其往往具有在20-24℃范围内的最佳温度)或源自植物酶，但本公开在一些实施方案中能够在微生物细胞(如，细菌细胞，诸如大肠埃希氏菌)中以高产率以在高于24℃的温度(诸如24℃到37℃，或27℃至37℃，或30℃至37℃)下的酶生产力生产糖基化产物。在一些实施方案中，培养在30至34℃下进行。

在一些实施方案中，该过程对于大规模生产是可放大的。例如，在一些实施方案中，培养物的大小为至少约100L、至少约200L、至少约500L、至少约1,000L，或至少约10,000L、至少约100,000L或至少约500,000L。

在各种实施方案中，方法进一步包括从细胞培养物或从细胞裂解物中回收糖基化产物。在一些实施方案中，培养物产生至少约100mg/L，或至少约200mg/L，或至少约500mg/L，或至少约1g/L，或至少约2g/L，或至少约5g/L，或至少约10g/L，或至少约20g/L，或至少约30g/L，或至少约40g/L，或至少约50g/L的糖基化产物，其在一些实施方案中是从培养基中提取的。

在一些实施方案中，底物是类萜，诸如类单萜、类倍半萜或类三萜。在一些实施方案中，类萜是类三萜，其任选地是罗汉果醇或罗汉果苷。在一些实施方案中，本公开的1-3UGT酶对糖苷、脂肪族支化醇、取代酚、类黄酮和没食子酸酯具有广泛的底物活性。参见如Dewitt,G.等人，Screening of recombinant glycosyltransferases reveals the broad acceptor specificity of stevia UGT-76G1,J.Biotechnology 233(2016)49–55。UGT酶的底物可包括类萜糖苷(类异戊二烯)，包括类二萜糖苷(诸如甜菊醇糖苷)和类三萜糖苷(诸如罗汉果苷)。

在一些实施方案中，该方法包括使宿主细胞在底物的存在下生长。可以将底物供给到培养物中，或者在一些实施方案中，底物由宿主细胞合成。在一些实施方案中，底物是甜菊醇，并且宿主细胞表达多种UGT酶以产生目标甜菊醇糖苷，诸如RebM。

在一些实施方案中，糖基化产物(如，RebM)是从培养基组分中纯化的。因此，在一些实施方案中，该方法包括将生长培养基与大肠埃希氏菌细胞分离，并从生长培养基中分离出所需的糖基化产物(如，RebM)。在一些实施方案中，进一步从细胞材料中提取诸如RebM的产物。

在一些方面，本发明提供了用于制备包含糖基化产物(诸如RebM)的产品的方法。该方法包括将目标甜菊醇糖苷(根据本公开生产)掺入到诸如以下的产品中：食品、饮料、口腔护理产品、甜味剂、调味剂或其他产品。根据本发明制备的纯化甜菊醇糖苷可用于多种产品，包括但不限于食品、饮料、调质剂(如淀粉、纤维、树胶、脂肪和脂肪模拟物以及乳化剂)、药物组合物、烟草产品、营养组合物、口腔卫生组合物和化妆品组合物。RebM可被组合使用于其中的风味剂的非限制性实例包括酸橙、柠檬、桔子、水果、香蕉、葡萄、梨、菠萝、芒果、苦杏仁、可乐果、肉桂、糖、棉花糖和香草风味剂。其它食品成分的非限制性实例包括风味剂、酸化剂和氨基酸、着色剂、增量剂、改性淀粉、树胶、调质剂、防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、稳定剂、增稠剂和胶凝剂。

在一些方面，本发明提供了用于制备包含多种高强度甜味剂的甜味剂产品的方法，所述多种高强度甜味剂包括以下中的两者或多种：甜菊醇糖苷、罗汉果苷、三氯蔗糖、阿斯巴甜、纽甜、阿凡甜、乙酰磺胺酸钾、糖精、甜蜜素、新橙皮苷二氢查尔酮、买麻藤素E和/或白皮杉醇4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。该方法可进一步包括将甜味剂产品掺入到食品、饮料、口腔护理产品、甜味剂、调味剂或包括上述那些产品在内的其他产品中。

一种或多种目标甜菊醇糖苷(诸如RebM)和包含其的甜味剂组合物可以与各种生理活性物质或功能成分组合使用。功能成分通常分为以下几类诸如：类胡萝卜素、膳食纤维、脂肪酸、皂苷、抗氧化剂、营养品、类黄酮、异硫氰酸酯、酚、植物固醇和甾烷醇(植物甾醇和植物甾烷醇)；多元醇；益生元、益生菌；植物雌激素；大豆蛋白；硫化物/硫醇；氨基酸；蛋白质；维生素；和矿物质。功能成分也可以基于其健康益处(诸如心血管、降胆固醇和抗炎益处)进行分类。

进一步地，可施加一种或多种目标甜菊醇糖苷(诸如RebM)和根据本发明获得的甜味剂组合物作为高强度甜味剂，以生产具有改善的口味特征的零卡路里、低卡路里或糖尿病饮料和食品。它也可以用于其中不能使用糖的饮料、食料、药品和其他产品中。此外，RebM和甜味剂组合物不仅可以用作饮料、食料和其他专供人类食用的产品中的甜味剂，还可以用作具有改善的特征的动物饲料和草料中的甜味剂。

一种或多种目标甜菊醇糖苷和甜味剂组合物可用于其中的产品的实例包括但不限于：酒精饮料，诸如伏特加、葡萄酒、啤酒、烈酒和清酒，天然果汁，碳酸软饮料，减肥饮料，零卡路里饮料，低卡路里饮料和食品，酸奶饮料，速溶果汁，速溶咖啡，粉状速溶饮料，罐头产品，糖浆，发酵豆瓣酱，酱油，醋，调味品，蛋黄酱，番茄酱，咖喱，汤，速食肉汤，酱油粉(powdered soy sauce)，醋粉(powdered vinegar)，各类饼干，米饼，薄脆饼干，面包，巧克力，焦糖，糖果，口香糖，果冻，布丁，果蔬脯，鲜奶油，果酱，柑橘酱，花膏，奶粉，冰淇淋，果汁冰糕，瓶装果蔬，罐装煮豆，用甜酱烹煮的肉类和食品，农业蔬菜食品，海鲜，火腿，香肠，鱼肉火腿，鱼肉香肠，鱼酱，油炸鱼制品，干海鲜产品，冷冻食品，腌制海带，腌肉，烟草，药品，及许多其他产品。

在诸如食料、饮料、药品、化妆品、桌面产品(table top product)和口香糖的产品的制造过程中，可以使用常规方法诸如混合、揉捏、溶解、酸洗、渗透、渗滤、喷洒、雾化、灌注和其他方法。

现在将参考以下实施例描述本发明的方面和实施方案。

实施例

现在将参考以下实施例描述本发明的方面和实施方案。

实施例1：筛选MbUGT1-3_1(SEQ ID NO：5)的突变体

将包含编码UGT MbUGT1-3_1(SEQ ID NO:5)的多核苷酸和95个选定突变体的质粒转化到大肠埃希氏菌细胞(ΔushA、ΔgalETKM、Δpgi；过表达的pgm、galU)中。将所得菌株接种到丰富的种子培养基中，并在96孔板中以250rpm在37℃下孵育过夜以制备种子培养物。

通过如下方式在生产培养物中接种种子培养物：将40μL种子添加到360μL含有0.5mM甜菊苷和0.5mM莱鲍迪苷D的新鲜生产培养基中。随后将生产培养物在96孔板中在37℃下以250rpm生长48小时。使用LC-MS QQQ对产物进行定量。

筛选的95个突变体包括以下(这些突变体的氨基酸位置是相对于MbUGT1-3_1(SEQID NO:5)：

i)取代：

F11L、K13R、T16E、V18L、E19A、G48T、S62A、D73P、L89W、V93L、Y94E、W99F、E100C、N106R、E115K、Y119T、Q122E、K130W、V133A、V133S、M136K、S153L、G164R、R165N、R166G、I169L、F200L、F204H、F204P、K206A、K208D、K208N、F219D、F219S、L221P、R229A、I230F、L233I、G241A、R243M、P245S、I246L、R257D、E260A、L261K、L262Q、L264S、D269E、E271P、S273A、R294P、L296I、S301N、F304S、H309F、V310A、T327S、A333V、F336L、V341I、Y348T、Q352A、Q352D、Q352E、A354S、A354T、K355Y、L358I、M361Q、I362V、S375T、E383F、V387L、I388E、I388S、R389Q、L400F、L404F、A406S、D413E、V418C、P426A、S428K、S428G、V441I、D445E、D455N、Q457G、Q457K/S458Q或Q457K。

ii)取代和缺失：

Q457K并缺失S458(ΔS458)。

iii)缺失：

ΔG159；ΔG159ΔG161；或ΔG159ΔS160ΔG161。

iv)插入：

S插入在位置158和159之间或者K插入在456和457之间。

筛选了所有95个MbUGT1-3_1突变体从甜菊苷(底物)产生RebA和RebI以及RebM的能力。表5给出了选定的MbUGT1-3_1突变体在产生RebA和RebI(通过C-13-葡萄糖处的1-3葡萄糖基化)以及RebM(通过C-19-葡萄糖处的1-3葡萄糖基化)方面的改善倍数。在表5中，第2列一般对应于底物的C13-葡萄糖处的糖基化，而第3列一般对应于底物的C19-葡萄糖处的糖基化。如所示，C-19糖基化比C-13糖基化增强。用表5中的突变构建的突变体在本文中称为MbUGT1-3_2(SEQ ID NO：6)。

表5：MbUGT1-3_1(先导突变)

实施例2：由1-3'糖基化酶进行的生物转化

将包含编码三种UGT，即SrUGT76G1-L200A (SEQ ID NO:1)、MbUGT1-3_0(SEQ IDNO:4)、MbUGT1-3_1(SEQ ID NO:5)和MbUGT1-3_2(SEQ ID NO:6)的多核苷酸的质粒单独地转化到大肠埃希氏菌细胞(ΔushA、ΔgalETKM、Δpgi；过表达的pgm、galU)中。将所得菌株接种到含有1mM甜菊苷或1mM RebD的培养基中。生长后，从培养基中回收甜菊醇糖苷。将菌株在96孔板中以250rpm在37℃下生长过夜。然后将细胞转移到新鲜的生产培养物中至总体积的10％。甜菊苷(0.5mM)和莱鲍迪苷D(0.5mM)中的每一种均包含在生产培养物中。然后使生产培养物在96孔板中以250rpm在37℃下生长48小时。使用LC-MS QQQ对产物进行定量。

图4示出了甜菊苷至RebA的转化百分比和RebD至RebM的转化百分比。这两个反应的转化百分比最高的是分别具有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列的MbUGT1-3_1和MbUGT1-3_2。图5示出了MbUGT1-3_1和MbUGT1-3_2与SrUGT76G1-L200A相比的改善倍数。

实施例3：筛选MbUGT1-3_2(SEQ ID NO:6)的突变体

将包含编码UGT MbUGT1-3_2(SEQ ID NO:6)的多核苷酸和96个选定的MbUGT1-3_2突变体的质粒转化到大肠埃希氏菌细胞(ΔushA、ΔgalETKM、Δpgi；ΔaraA、过表达的pgm、galU、UGT1-2酶)中。将所得菌株接种到丰富的种子培养基中，并在96孔板中以250rpm在37℃下孵育过夜以制备种子培养物。

然后，通过如下方式在生产培养物中接种种子培养物：将40μL种子添加到360μL含有1g/L甜菊苷/RebA叶提取物的新鲜生产培养基中。然后使生产培养物在96孔板中以250rpm在37℃下生长48小时。使用UPLC-DAD对产物进行定量。

筛选的突变体包括以下(氨基酸位置是相对于MbUGT1-3_1(SEQ ID NO:5)：

i)取代：

T16G、V18L、E19A、D23E、R31K、C64S、I70V、L76N、P79M、W99F、D114E、R125L、V133A、S150D、T202M、F204E、Y212F、Y212H、R218L、D227S、E228S、I230F、I230Y、L233I、G237S/P238A、P238S、L239E、L239G、A240S、A240V、M242A、M242I、I246Y、I247F、A252I、D253E、L261K、L264E、A265D、E271P、S273A、C274G、C274L、Y282W、N292K、S302G、L303M、F306W、L312M、Q314L、L318W、P323L、E331A、K340R、S346V、Y348F/S349D/N350T/W351L/Q352E/I353N、Y348G/S349E/N350F/W351G/Q352E/I353K、Y348T/S349N/N350E/W351P/Q352E/I353E、W351F/Q352E/A354G、W351P、Q352D/A354G、Q352E、A354S、I362L、A367N、E383S、E385A、H403Y、L404F、F419K、S428K、L431I、D445E、D445I、A450L或Q457G。

ii)取代和缺失：

D227T和Δ228至234

iii)缺失：

ΔG158至G161；ΔG159至G161；ΔS160至ΔG161；ΔG161；Δ228；Δ228至229；Δ228至230；Δ228-231；Δ228至232；Δ228至233；Δ228至234；Δ228至235；Δ228至236；Δ228至237；ΔY320至P323；ΔD325至K326；或ΔK326。

iv)插入：

LEA插入在F25和L26之间；

iv)替换：

用INPQG交换Y348-I353

表6给出了选定的MbUGT1-3_2(SEQ ID NO：6)突变体产生RebM的能力。表6的第2列给出了反应产物中RebM百分比的改善倍数。

表6：MbUGT1-3_2先导突变

氨基酸E225至T232的缺失使RebM的产生令人惊讶地改善了11倍。基于同源建模，氨基酸E225至T232似乎在被结合的底物附近形成环。氨基酸E225-T232的缺失可能会导致UGT酶的底物特异性转变成有利于RebD到RebM的反应。具有相对于MbUGT1-3_2(SEQ ID NO:6)的E225-T232环缺失和S72Q、A305C、Y345F和L428I突变的序列被称为MbUGT1-3_3(SEQ IDNO:9)。

测试了E225至T232区域中的几个缺失，并且这些也表现出了RebM产生的增强。表7给出了E225-T232区(根据SEQ ID NO:6编号)的各种有益缺失

表7：MbUGT1-3_2缺失

突变	％RebM改善倍数
		缺失E225-T232	11.1
缺失E225-L230	3.2
		缺失E225-H233	3.2
缺失E225-P231	3.1
		缺失E225-N229	1.7
缺失E225-S228	1.6
		缺失E225	1.6
缺失E225-I227	1.5
		缺失E225-G234	1.5

序列

SEQ ID NO:1

UGT76G1[甜叶菊]

(SEQ ID NO:1)

MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQILKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSL

SEQ ID NO:2

MbUGT1-3

参考文献：US 2017/0332673

MANWQILKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSLENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYS

SEQ ID NO:3

UGT76G1_L200A

参考文献：US 2017/0332673

MAENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQIAKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSL

SEQ ID NO:4

MbUGT1-3_0

MAKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSLENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQIAKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDS

SEQ ID NO:5

MbUGT1-3_1

MAFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHGGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRLMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSLGSGGSGGSGRRRRIILFPVPFQGHINPMLQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQIAKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSQS

SEQ ID NO:6

MbUGT1-3_2

MAFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHGGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRLMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSLGSGGSGRRRRIILFPVPFQGHINPMLQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELQMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLPRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQIAKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLEHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSQS

SEQ ID NO:7

接头

GSGGSG

SEQ ID NO:8

接头

GSGGSGGSG

SEQ ID NO:9

MbUGT1-3_3

MAFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHGGWNSTLESVCEGVPMIFQDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRLMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSLGSGGSGRRRRIILFPVPFQGHINPMLQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELQMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLPRLVLMTSSLFNFHCHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAFSNWQIAKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLEHDRTVFQWLDQQPPSSVIYVSFGSTSEVDEKDFLEIARGLVDSQS

序列表

<110> 马努斯生物公司(Manus Bio, Inc.)

阿吉库玛·帕拉伊尔·库马兰(KUMARAN, Ajikumar Parayil)

詹森·埃里克·唐纳德(DONALD, Jason Eric)

艾伦·洛夫(LOVE, Aaron)

克里斯多夫·图米(Toomey, Christopher)

克里斯汀·尼科尔·S.·桑托斯(SANTOS, Christine Nicole S.)

<120> 二磷酸尿苷依赖性糖基转移酶酶

<130> MAN-024PC/107590-5023

<150> US 62/866,148

<151> 2019-06-25

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 458

<212> PRT

<213> 甜叶菊(Stevia rebaudiana)

<400> 1

Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile

1 5 10 15

Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu

20 25 30

Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr

35 40 45

Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg

50 55 60

Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro

65 70 75 80

Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His

85 90 95

Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser

100 105 110

Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr

115 120 125

Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu

130 135 140

Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln

145 150 155 160

Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu

165 170 175

Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser

180 185 190

Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile

195 200 205

Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu

210 215 220

Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro

225 230 235 240

Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser

245 250 255

Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro

260 265 270

Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp

275 280 285

Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln

290 295 300

Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp

305 310 315 320

Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val

325 330 335

Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala

340 345 350

Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu

355 360 365

Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn

370 375 380

Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn

385 390 395 400

Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val

405 410 415

Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln

420 425 430

Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu

435 440 445

Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu

450 455

<210> 2

<211> 459

<212> PRT

<213> 甜叶菊(Stevia rebaudiana)

<400> 2

Met Ala Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile Lys

1 5 10 15

Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu Leu

20 25 30

Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro Ser

35 40 45

Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Leu

50 55 60

Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro Pro

65 70 75 80

Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp Glu

85 90 95

Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln Ser

100 105 110

Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp Val

115 120 125

Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val Lys

130 135 140

Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala Phe

145 150 155 160

Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu Gly

165 170 175

Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn Ala

180 185 190

Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn Gly

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Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val Asp

210 215 220

Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln Lys

225 230 235 240

Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu Glu

245 250 255

Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr

260 265 270

Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly

275 280 285

His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly

290 295 300

Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser

305 310 315 320

Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln

325 330 335

Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met

340 345 350

Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu

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Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys

370 375 380

Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser

385 390 395 400

Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe

405 410 415

His Ala His Val Ser Leu Pro Gln Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp

420 425 430

Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met

435 440 445

Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser Ala Tyr Ser

450 455

<210> 3

<211> 459

<212> PRT

<213> 甜叶菊(Stevia rebaudiana)

<400> 3

Met Ala Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile

1 5 10 15

Ile Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln

20 25 30

Leu Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His

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Thr Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe

50 55 60

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Pro Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu

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His Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala

100 105 110

Ser Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp

115 120 125

Tyr Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val

130 135 140

Leu Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro

145 150 155 160

Gln Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu

165 170 175

Glu Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys

180 185 190

Ser Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met

195 200 205

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210 215 220

Glu Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala

225 230 235 240

Pro Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser

245 250 255

Ser Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln

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Pro Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val

275 280 285

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Gln Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr

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325 330 335

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Asn Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu

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405 410 415

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Gln Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser

435 440 445

Leu Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu

450 455

<210> 4

<211> 459

<212> PRT

<213> 甜叶菊(Stevia rebaudiana)

<400> 4

Met Ala Lys Gln Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys

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Gly Ser Thr Trp Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg

20 25 30

Gly Arg Ile Val Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly

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Arg Val Met Val Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg

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Tyr Glu Ser Leu Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu Glu Asn

145 150 155 160

Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile Leu Phe Pro

165 170 175

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180 185 190

Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr Asn Phe Asn

195 200 205

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275 280 285

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290 295 300

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Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu Glu Gln Ala

325 330 335

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355 360 365

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370 375 380

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405 410 415

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420 425 430

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450 455

<210> 5

<211> 458

<212> PRT

<213> 甜叶菊(Stevia rebaudiana)

<400> 5

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1 5 10 15

Trp Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile

20 25 30

Val Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly

35 40 45

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Asn Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu

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Asn Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Leu Met

100 105 110

Val Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys

115 120 125

Gln Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser

130 135 140

Leu Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu Gly Ser Gly Gly Ser

145 150 155 160

Gly Gly Ser Gly Arg Arg Arg Arg Ile Ile Leu Phe Pro Val Pro Phe

165 170 175

Gln Gly His Ile Asn Pro Met Leu Gln Leu Ala Asn Val Leu Tyr Ser

180 185 190

Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr Asn Phe Asn Lys Pro Lys

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Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg Phe Ile Leu Asp Asn Asp

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Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His Gly Ala Asp Glu Leu Arg

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Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr Phe Ala Gln Ser Val Ala

275 280 285

Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu Met Thr Ser Ser Leu Phe

290 295 300

Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln Phe Asp Glu Leu Gly Tyr

305 310 315 320

Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu Glu Gln Ala Ser Gly Phe

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Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp Glu Lys Asp Phe Leu Glu

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Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Gln Ser

450 455

<210> 6

<211> 455

<212> PRT

<213> 甜叶菊(Stevia rebaudiana)

<400> 6

Met Ala Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr

1 5 10 15

Trp Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile

20 25 30

Val Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Asn Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu

85 90 95

Asn Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Leu Met

100 105 110

Val Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys

115 120 125

Gln Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser

130 135 140

Leu Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu Gly Ser Gly Gly Ser

145 150 155 160

Gly Arg Arg Arg Arg Ile Ile Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His

165 170 175

Ile Asn Pro Met Leu Gln Leu Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe

180 185 190

Ser Ile Thr Ile Phe His Thr Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn

195 200 205

Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp

210 215 220

Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg

225 230 235 240

Ile Pro Ile Ile Asn Glu His Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu

245 250 255

Glu Leu Gln Met Leu Ala Ser Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu

260 265 270

Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu

275 280 285

Asn Leu Pro Arg Leu Val Leu Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His

290 295 300

Ala His Val Ser Leu Pro Gln Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro

305 310 315 320

Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu

325 330 335

Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Ala Lys

340 345 350

Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val

355 360 365

Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val

370 375 380

Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His

385 390 395 400

Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Leu Leu Glu His Asp Arg Thr Val Phe

405 410 415

Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe

420 425 430

Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg

435 440 445

Gly Leu Val Asp Ser Gln Ser

450 455

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成序列

<400> 7

Gly Ser Gly Gly Ser Gly

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成序列

<400> 8

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

1 5

<210> 9

<211> 447

<212> PRT

<213> 甜叶菊(Stevia rebaudiana)

<400> 9

Met Ala Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr

1 5 10 15

Trp Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile

20 25 30

Val Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly

35 40 45

Ala Phe Trp Thr His Gly Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys

50 55 60

Glu Gly Val Pro Met Ile Phe Gln Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu

65 70 75 80

Asn Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu

85 90 95

Asn Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Leu Met

100 105 110

Val Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys

115 120 125

Gln Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser

130 135 140

Leu Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu Gly Ser Gly Gly Ser

145 150 155 160

Gly Arg Arg Arg Arg Ile Ile Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His

165 170 175

Ile Asn Pro Met Leu Gln Leu Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe

180 185 190

Ser Ile Thr Ile Phe His Thr Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn

195 200 205

Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp

210 215 220

His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His Gly

225 230 235 240

Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Gln Met Leu Ala Ser Glu

245 250 255

Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr Phe

260 265 270

Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Pro Arg Leu Val Leu Met

275 280 285

Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Cys His Val Ser Leu Pro Gln Phe

290 295 300

Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu Glu

305 310 315 320

Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser Ala

325 330 335

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340 345 350

Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu Leu

355 360 365

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Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Leu

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Leu Glu His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro Pro

405 410 415

Ser Ser Val Ile Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp Glu

420 425 430

Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Gln Ser

435 440 445

Claims

1.一种二磷酸尿苷依赖性糖基转移酶(UGT)酶，其包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少约75％同一的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的酶，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6至少约80％同一。

3.如权利要求1所述的酶，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6至少约85％同一。

4.如权利要求1所述的酶，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6至少约90％同一。

5.如权利要求1所述的酶，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6至少约95％同一。

6.如权利要求1所述的酶，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6至少约98％同一。

7.如权利要求1所述的酶，其中所述氨基酸序列是SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸。

8.如权利要求1所述的酶，其中所述氨基酸序列具有1至20个独立地选自相对于SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的取代、缺失和插入的氨基酸修饰。

9.如权利要求8所述的酶，其中所述氨基酸序列具有1至10个独立地选自相对于SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的取代、缺失和插入的氨基酸修饰。

10.如权利要求8所述的酶，其中所述氨基酸序列具有1至5个独立地选自相对于SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的取代、缺失和插入的氨基酸修饰。

11.如权利要求8至10中任一项所述的酶，其中所述酶包含在对应于SEQ ID NO:1的位置29、200、357和414中的一个或多个位置的位置处的氨基酸取代。

12.如权利要求1至11中任一项所述的酶，其包含以下中的一者或多者：

在对应于SEQ ID NO:5的位置54的位置处的甘氨酸(G)；

在对应于SEQ ID NO:5的位置111的位置处的亮氨酸(L)；和

在对应于SEQ ID NO:5的位置183的位置处的甲硫氨酸(M)。

13.如权利要求12所述的酶，其中所述酶具有在对应于SEQ ID NO:5的位置54的位置处的Gly、在对应于SEQ ID NO:5的位置111的位置处的Leu，和在对应于SEQ ID NO:5的位置183的位置处的Met。

14.如权利要求1至13中任一项所述的酶，其中所述酶在对应于SEQ ID NO:5的位置155的位置之后包含约6至约12个氨基酸的插入物。

15.如权利要求14所述的酶，其中所述插入物是主要是甘氨酸和丝氨酸残基的柔性亲水性序列，并且任选地是GSGGSG(SEQ ID NO:7)或GSGGSGGSG(SEQ ID NO:8)。

16.如权利要求1至15中任一项所述的酶，其中所述酶包含相对于SEQ ID NO:6的氨基酸序列的对应于氨基酸E225至T232的一个或多个氨基酸的缺失。

17.如权利要求16所述的酶，其中所述酶包含对应于SEQ ID NO:6的氨基酸E225至T232的氨基酸的缺失。

18.如权利要求1至17中任一项所述的酶，其中所述酶包含在对应于SEQ ID NO:6的位置72、位置305、位置345和位置428的一个或多个位置处的氨基酸取代。

19.如权利要求18所述的酶，其中所述酶包含选自以下的一个或多个氨基酸取代：在对应于SEQ ID NO:6的位置72的位置处的谷氨酰胺(Q)；在对应于SEQ ID NO:6的位置305的位置处的半胱氨酸(C)；在对应于SEQ ID NO:6的位置345的位置处的苯丙氨酸(F)；和在对应于SEQ ID NO:6的位置428的位置处的异亮氨酸(I)。

20.一种二磷酸尿苷依赖性糖基转移酶(UGT)酶，其包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少约60％同一的氨基酸序列，其中所述UGT酶包含：

在对应于SEQ ID NO:5的位置54的位置处的甘氨酸(G)；

在对应于SEQ ID NO:5的位置111的位置处的亮氨酸(L)；和

在对应于SEQ ID NO:5的位置183的位置处的甲硫氨酸(M)。

21.如权利要求20所述的酶，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少约70％同一。

22.如权利要求20所述的酶，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少约80％同一。

23.如权利要求20所述的酶，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少约90％同一。

24.如权利要求20所述的酶，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少约95％同一。

25.如权利要求20至24中任一项所述的酶，其中所述1-3UGT酶在对应于SEQ ID NO:5的位置155的位置之后包含约5至约15个氨基酸的插入物。

26.如权利要求25所述的酶，其中所述插入物是主要是甘氨酸和丝氨酸残基的柔性亲水性序列，并且任选地是GSGGSG(SEQ ID NO:7)和GSGGSGGSG(SEQ ID NO:8)。

27.如权利要求20至26中任一项所述的酶，其中所述酶包含相对于SEQ ID NO:6的氨基酸序列的对应于氨基酸E225至T232的一个或多个氨基酸的缺失。

28.如权利要求27所述的酶，其中所述酶包含对应于SEQ ID NO:6的氨基酸E225至T232的氨基酸的缺失。

29.如权利要求20至28中任一项所述的酶，其中所述酶包含在对应于SEQ ID NO:6的位置72、位置305、位置345和位置428的一个或多个位置处的氨基酸取代。

30.如权利要求29所述的酶，其中所述酶包含选自以下的一个或多个氨基酸取代：在对应于SEQ ID NO:6的位置72的位置处的谷氨酰胺(Q)；在对应于SEQ ID NO:6的位置305的位置处的半胱氨酸(C)；在对应于SEQ ID NO:6的位置345的位置处的苯丙氨酸(F)；和在对应于SEQ ID NO:6的位置428的位置处的异亮氨酸(I)。

31.如权利要求20至30中任一项所述的酶，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％同一。

32.如权利要求20-31中任一项所述的酶，其中所述氨基酸序列具有1至20个独立地选自相对于所述SEQ ID NO:9的氨基酸序列的取代、缺失和插入的氨基酸修饰。

33.如权利要求20-31中任一项所述的酶，其中所述氨基酸序列具有1至10个独立地选自相对于所述SEQ ID NO:9的氨基酸序列的取代、缺失和插入的氨基酸修饰。

34.如权利要求20-31中任一项所述的酶，其中所述氨基酸序列具有1至5个独立地选自相对于所述SEQ ID NO:9的氨基酸序列的取代、缺失和插入的氨基酸修饰。

35.一种二磷酸尿苷依赖性糖基转移酶(UGT)酶，其包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约75％序列同一性的氨基酸序列，并且包含一个或多个选自以下的相对于SEQ IDNO:1的修饰：

对应于E74至T81的一个或多个氨基酸的缺失；

在对应于位置357的位置处的取代，其任选地是甘氨酸；

在对应于位置414的位置处的取代，并且其任选地是亮氨酸；

在对应于位置29的位置处的取代，并且其任选地是甲硫氨酸；

在对应于位置402的位置处的取代，其任选地是谷氨酰胺；

在对应于位置154的位置处的取代，其任选地是半胱氨酸；

在对应于位置194的位置处的取代，并且其任选地是苯丙氨酸；

在对应于位置277的位置处的取代，并且其任选地是异亮氨酸；

在对应于位置208的位置处的取代，并且其任选地是谷氨酰胺；

在对应于位置140的位置处的取代，并且其任选地是脯氨酸；和

在对应于位置259的位置处的取代，并且其任选地是谷氨酸。

36.如权利要求35所述的UGT酶，其中所述UGT酶包含对应于E74至T81的至少两个或至少三个氨基酸的缺失。

37.如权利要求35所述的UGT酶，其中所述UGT酶包含对应于E74至T81的至少四个或至少五个氨基酸的缺失。

38.如权利要求35所述的UGT酶，其中所述UGT酶包含对应于E74至T81的至少六个或至少七个氨基酸的缺失。

39.如权利要求35所述的UGT酶，其中所述UGT酶包含对应于E74至T81的氨基酸的缺失。

40.如权利要求35至39中任一项所述的UGT酶，其中所述酶进一步包含在对应于SEQ IDNO:1的位置200的位置处的丙氨酸取代。

41.如权利要求35至40中任一项所述的UGT酶，其中所述酶具有以下中的至少2、3或4者：357G、414L、29M、402Q、154C、194F、277I、208Q、140P和259E，各自根据SEQ ID NO:1进行编号。

42.如权利要求35至41中任一项所述的UGT酶，其中所述酶与所述SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少约80％，或至少约85％，或至少约90％，或至少约95％，或至少约98％同一。

43.如权利要求42所述的UGT酶，其中所述酶具有1至20个，或1至10个独立地选自相对于SEQ ID NO:1的氨基酸取代、缺失和插入的氨基酸修饰。

44.一种二磷酸尿苷依赖性糖基转移酶(UGT)酶，其是SrUGT76G1的环状排列体，并且任选地具有1至20个或1至15个，或1至10个独立地选自相对于SEQ ID NO:1的相应位置的氨基酸取代、缺失和插入的氨基酸修饰，条件是所述环状排列体具有一个或多个选自以下的相对于SEQ ID NO:1的修饰：

对应于E74至T81的一个或多个氨基酸的缺失；

在对应于位置357的位置处的取代，其任选地是甘氨酸；

在对应于位置414的位置处的取代，并且其任选地是亮氨酸；

在对应于位置402的位置处的取代，其任选地是谷氨酰胺；

在对应于位置154的位置处的取代，其任选地是半胱氨酸；

在对应于位置259的位置处的取代，并且其任选地是谷氨酸。

45.一种编码权利要求1至44中任一项所述的酶的多核苷酸。

46.一种宿主细胞，其包含权利要求45所述的多核苷酸。

47.如权利要求46所述的宿主细胞，其中所述细胞是微生物。

48.如权利要求47所述的宿主细胞，其中所述微生物是细菌。

49.如权利要求48所述的宿主细胞，其中所述细菌是大肠埃希氏菌。

50.如权利要求49所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含ushA和galETKM的缺失或失活、pgi的缺失或失活，以及pgm和galU的过表达或活性增加。

51.如权利要求47所述的宿主细胞，其中所述微生物是酵母。

52.如权利要求46所述的宿主细胞，其中所述细胞是植物。

53.如权利要求52所述的宿主细胞，其中所述植物是甜菊植物。

54.如权利要求46至53中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞表达一种或多种选自以下的额外的UGT酶：C-13UGT酶、C-19UGT酶和1-2'UGT酶。

55.如权利要求54所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞进一步表达异源C-13UGT酶、异源C-19UGT酶和异源1-2UGT酶。

56.如权利要求47至55中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞通过表达用于甜菊醇生物合成的内源和/或异源酶来生产甜菊醇。

57.一种用于将单糖基团转移至底物的方法，其包括使NDP-糖和所述底物与权利要求1至44中任一项所述的UGT酶，或权利要求46至56中任一项所述的宿主细胞或其裂解物接触。

58.如权利要求57所述的方法，其中所述底物是类萜。

59.如权利要求58所述的方法，其中所述类萜是类二萜。

60.如权利要求59所述的方法，其中所述类二萜是甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。

61.如权利要求60所述的方法，其中所述甜菊醇糖苷是甜菊苷和/或RebD。

62.如权利要求57所述的方法，其中所述底物是植物提取物，其任选地是甜菊叶提取物。

63.如权利要求58所述的方法，其中所述类萜是类单萜、类倍半萜或类三萜。

64.如权利要求63所述的方法，其中所述类萜是类三萜，其任选地是罗汉果醇或罗汉果苷。

65.如权利要求57至64中任一项所述的方法，其中所述NDP-糖是UDP-葡萄糖。

66.如权利要求65所述的方法，其中所述反应在具有内源UDP-葡萄糖的宿主细胞中发生。

67.一种用于将糖基基团转移至底物的方法，其包括使权利要求46至56中任一项所述的宿主细胞在所述底物的存在下生长。

68.如权利要求67所述的方法，其中所述底物由所述宿主细胞合成。

69.如权利要求67或68所述的方法，其中所述底物是类萜。

70.如权利要求69所述的方法，其中所述类萜是类二萜。

71.如权利要求70所述的方法，其中所述类二萜是甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。

72.如权利要求71所述的方法，其中所述甜菊醇糖苷是甜菊苷和/或RebD。

73.如权利要求69所述的方法，其中所述类萜是类三萜，其任选地是罗汉果醇或罗汉果苷。