CN108220269B

CN108220269B - 一种耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体及其制备方法

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Publication number: CN108220269B
Application number: CN201711471839.3A
Authority: CN
Inventors: 王永华; 袁红; 蓝东明; 黄伟谦; 杨博
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: CN108220269A

Abstract

本发明公开了一种耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体及其制备方法，该晶体为短棱柱状形貌，其空间结构为精细三维结构，结构中含有440个氨基酸，在每个不对称单元中含有3个分子，每个分子含有21个α螺旋结构和6个β折叠结构；结构中具有

α＝β＝γ＝90°晶包元，晶体的蛋白空间群为P41212。本发明提供的耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体为解析脂肪酶AflB分子结构提供必要条件，为后续蛋白质工程提高脂肪酶AflB性能提供基础。

Description

一种耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体及其制备方法

技术领域

本发明涉及结构生物学领域，特别是涉及一种新型耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体及其制备方法。

背景技术

脂肪酶(EC3.1.1.3，又称三酰甘油酰基水解酶)是重要的工业用酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，广泛应用于饲料、食品、制革、洗涤、油酯化工、前体药物的合成、手性药物的拆分以及生物能源等工业领域。

脂肪酶的开发与应用依赖于酶本身的底物特异性，而脂肪酶的底物特异性取决于酶的分子结构，特别是酶活性中心的三维结构。蛋白质的三维结构对于了解其生物功能、设计药物以及蛋白质药物的基因工程等方面具有非常重要的作用。X-射线单晶衍射方法是通过蛋白质单晶获得其三维结构的最重要的研究方法之一。获得高质量的蛋白质晶体仍旧是蛋白质结构解析的瓶颈问题，当前只有约0.4％的脂肪酶的三维晶体结构被解析。经表达、纯化和浓缩之后，为了能从高纯度、高均一性的蛋白质溶液中获得可用于X射线衍射的晶体，需要使溶液中的蛋白从随机状态转变为一定有序度的固态，即蛋白质的晶体。蛋白质的结晶与蛋白溶液的浓度、pH值、离子强度、缓冲体系、生长温度、沉淀剂浓度以及一些添加剂浓度等等条件有关。由于现有条件下，无法预测晶体生长的最适条件，目前蛋白质的结晶仍是一个不断摸索的“试错”过程，内部结构比较规整的蛋白质晶体仍旧很难获得。

相比一般的对过氧化氢敏感的脂肪酶，耐过氧化氢脂肪酶AflB可在高浓度过氧化氢条件下保持稳定，从而有效催化羧酸与过氧化氢反应生成过氧酸，再通过过氧酸释放到酶分子外再自动把烯烃环氧化。因此，耐过氧化氢脂肪酶AflB在催化油脂环氧化制备无毒增塑剂领域有着重要的应用前景。因此，对耐过氧化氢脂肪酶AflB开展晶体培养及结构解析，对确定其活性中心、底物结合模式、深入研究其催化机制具有重要的理论指导意义和工业应用价值。经文献检索，未发现与本发明的耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体结构相同的公开文献报道。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的不足，发明人在长期从事微生物脂肪酶开发、生产及应用实践过程中，采用现代生物技术，在已筛选得到的耐过氧化氢脂肪酶AflB及其基因序列的前期基础上，开发提供一种耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体及其制备方法。

一种耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体，该晶体为短棱柱状形貌，其空间结构为精细三维结构，结构中含有440个氨基酸，在每个不对称单元中含有3个分子，每个分子含有21个α螺旋结构和6个β折叠结构；结构中具有

α＝β＝γ＝90°晶包元，晶体的蛋白空间群为P41212。

所述晶体结构如下：在A链中能够看见14-48和55-440个残基，在B链中能够看到14-440个残基；在C链中能够看到13-51和56-440个残基；该晶体结构含有一个N端α螺旋结构域和一个脂肪酶催化结构域，α螺旋结构域由第1-127个氨基酸组成，脂肪酶催化结构域由第128-440个氨基酸组成。

所述晶体活性区域结构特征为：其盖子域的位置为甲硫氨酸(M268)-丙氨酸(A278)；其“催化三联体”由丝氨酸(S233)，天冬氨酸(D318)和组氨酸(H361)构成；其氧负离子空洞区由苏氨酸(T169)与谷氨酰胺(Q234)组成。N末端的α螺旋1-5主要以疏水作用力结合在催化中心上方，形成一个新型的N端结构域。

所述晶体具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。

所述AflB脂肪酶分子量为47KDa。

一种耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体的制备方法，包括下列步骤：

1)结晶缓冲液配制

结晶缓冲液由聚乙二醇3350和pH值缓冲液组成，所述聚乙二醇3350质量百分含量为20-30％；所述pH值缓冲液为摩尔浓度为0.1-0.3M、pH值为4.5-5.5的Bis-Tris溶液；

2)结晶培养

将耐过氧化氢脂肪酶AflB配成蛋白浓度为10-20mg/ml的水溶液，再按体积比1：1接种到步骤1)所述的晶体缓冲溶液中，得到结晶液；将所述结晶液置于培养箱中，4℃培养三天，得到耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体。

所述pH值缓冲液的摩尔浓度为0.1M，pH为5.3。

本发明提供的耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体进行X射线衍射、X射线衍射数据收集和结构解释的步骤如下：首先将耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体分别被依次浸泡于含有5％，10％，15％和25％(v/v)的甘油防冻液中，并于液氮中速冻。用上海同步辐射光源(ShanghaiSynchrotron Radiation Facility，SSRF)的macromolecular crystallography beamLine BL17U1

进行衍射数据采集。晶体的衍射数据由MOSFLM以及CCP4的SCALA软件包进行处理。并随机选择了5％的数据进行R-free的计算。初始结构均以CalB野生型的晶体结构(PDB id：5a71)的模板，通过分子置换获得相位信息。耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体结构模型采用REFMAC及Coot最终被优化到

并用MOLPROBITY对模型的质量进行检测。

本发明提供的耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体及其制备方法中，所述耐过氧化氢脂肪酶AflB是由含有烟曲霉(Aspergillus fumigatus Fresenius)GIM3.19新型脂肪酶B基因编码序列的基因工程菌E.coli Shuffle T7/pET-AflB表达获得的。

耐过氧化氢脂肪酶AflB的表达与纯化

将基因工程菌E.coli Shuffle T7/pET-AflB接种至含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养，培养液的光密度OD600达到0.8，加入0.05mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度为20℃，诱导24小时；6000rpm离心10分钟，收集菌体，加入50mM磷酸缓冲液(pH7.4)(每克菌体加6mL缓冲液)，超声波破碎10分钟(60W，超声2s，停止2s)，10000rpm离心20min，收集上清，即为耐过氧化氢脂肪酶AflB粗酶液。将粗酶液依次经过GE Healthcare公司生产的带Ni的IDA琼脂糖5mL预装柱；G25desalting柱(GEHealthcare)，Q Sepharose FF(1.0×5cm)柱层析纯化后，可获得电泳纯耐过氧化氢脂肪酶AflB酶液。

由上述基因工程菌诱导表达得到耐过氧化氢脂肪酶AflB，其经纯化得到电泳纯的耐过氧化氢脂肪酶AflB按Laemmli法进行分析为单一蛋白条带,分子量为50Kda；最适反应温度40℃，最适pH为7.5；50℃条件下的半衰期的t1/2大于2小时，稳定pH范围为4.0-9.0，最大酶活力为10000U/mg。

本发明提供的基因工程菌E.coli Shuffle T7/pET-AflB是具有良好商业应用前景的耐过氧化氢脂肪酶AflB高产菌株，发酵周期短，产酶温度稳定，生产成本低廉，有利于进一步开拓脂肪酶催化的应用领域。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明提供了一种耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体，为解析脂肪酶AflB分子结构提供必要条件。脂肪酶AflB是一种重要的生物催化剂，具有耐受高浓度过氧化氢的特点，可以广泛应用于油脂环氧化催化领域。AflB晶体结构涵盖了酶活性位点及其表面特性的细节信息，为通过蛋白质工程技术改造该酶分子来提高该酶催化活性，改变底物特异性，提高稳定性(pH和热稳定)提供了必要基础，使其更能满足工业应用的要求。同时为其他具有工业应用潜力酶分子的理性设计，达到提高耐受双氧水能力的目的提供了借鉴。

附图说明

图1耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体偏光显微镜照片。

图2耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体X射线衍射图谱。

图3耐过氧化氢脂肪酶AflB不对称三聚体结构的示意图。

图4耐过氧化氢脂肪酶AflB单体体结构的示意图。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1耐过氧化氢脂肪酶AflB的表达

挑取因工程菌E.coli Shuffle T7/pET-AflB，加入2L LB液体培养基(含50ug/ml卡那霉素)中，37℃摇床培养至OD600约为0.8，加入诱导剂IPTG(终浓度0.05mM)，20℃诱导24h，6000rpm离心10分钟，收集菌体，加入50mM磷酸缓冲液(pH7.4)(每克菌体加6mL缓冲液)，超声波破碎10分钟(60W，超声2s，停止2s)，10000rpm离心20min，收集上清，即为粗酶液。

实施例2耐过氧化氢脂肪酶AflB的纯化

(1)将粗酶液上样于GE Healthcare公司生产的带Ni的IDA琼脂糖5ml预装柱；然后用20ml溶液A(20mM pH7.4PB，0.5M NaCl，25mM咪唑)冲洗柱子，以去除大部分杂蛋白；然后用20ml溶液B(20mM pH7.4PB，0.5M NaCl，125mM咪唑)洗脱，收集洗脱液(蛋白质浓度为1.5mg/ml，总体积约20ml)。

(2)将洗脱液用快速蛋白液相色谱系统进行脱盐：采用G25desalting柱(GEHealthcare)，平衡和洗脱缓冲液为20mM pH7.9Tris-Cl，流速2mL/min收集具有蛋白峰的洗脱液，即脱盐后洗脱液。

(3)将脱盐后洗脱液进行阴离子交换层析，具体参数如下：Q Sepharose FF(1.0×5cm)；首先用20ml溶液QA(20mM pH7.9Tris-Cl)冲洗柱子，以去除部分杂蛋白；然后用20ml溶液B(20mM pH7.9Tris-Cl，50mM NaCl)洗脱，收集洗脱液(蛋白质浓度为1mg/ml，总体积约20ml)。

(4)将步骤(3)的洗脱液经过截留子量10KDa的超滤管AmiconUltra-15(Millipore)，使体积浓缩至1ml，即为酯酶AflB蛋白溶液(蛋白浓度为20mg/ml)，用EP管分装成100ul每份-80℃保藏备用。

实施例3耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体的制备

1)结晶(生长)缓冲液的配制结晶缓冲液由沉淀剂聚乙二醇3350和pH值缓冲液组成，所述沉淀剂聚乙二醇质量百分含量为20％；所述pH值缓冲液为Bis-Tris溶液，缓冲液的摩尔浓度为0.1M，pH值5.3。

2)耐过氧化氢脂肪酶AflB水溶液的配制

将酶活力为200000U/mL的耐过氧化氢脂肪酶AflB配制成浓度为10mg/ml的水溶液；

3)结晶液的配制：

将步骤2)0.2μl的耐过氧化氢脂肪酶AflB水溶液接种到步骤1)0.2μl的晶体缓冲溶液中；利用悬滴法，将上述结晶液置于塑料盖玻片上，然后将该结晶液滴倒扣于96孔结晶板上，中间缝隙用凡士林密封，置于4℃的生物培养箱进行晶体培养，三天后置于偏光显微镜下采集晶体照片，如图1所示，所得晶体为短棱柱状形貌。

实施例4耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体的结构测定

首先将耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体分别被依次浸泡于含有5％，10％，15％和25％(v/v)的甘油防冻液中，并于液氮中速冻。用上海同步辐射光源(Shanghai SynchrotronRadiation Facility，SSRF)的macromolecular crystallography beam Line BL17U1

并用MOLPROBITY对模型的质量进行检测。数据收集和结构修正参数如下：

晶体空间群：P41212

晶胞参数：

α＝β＝γ＝90°

分辨率范围

：42.014-1.998

数据完整性(％)：99.57

实施例5耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体空间结构特征

如图3所示，在每个不对称单元中含有3个分子，每个分子含有21个α螺旋结构和6个β折叠结构。在A链中能够看见14-48和55-440个残基，在B链中能够看到14-440个残基；在C链中能够看到13-51和56-440个残基；该晶体结构含有一个N端α螺旋结构域和一个脂肪酶催化结构域，α螺旋结构域由第1-127个氨基酸组成，脂肪酶催化结构域由第128-440个氨基酸组成。

如图4所示，AflB盖子区域的由甲硫氨酸(M268)-丙氨酸(A278)组成；其“催化三联体”由丝氨酸(S233)，天冬氨酸(D318)和组氨酸(H361)构成；其氧负离子空洞区由苏氨酸(T169)与谷氨酰胺(Q234)组成。其中AflB盖子域中的色氨酸(W275)侧链中的N原子能与过氧化氢分子形成氢键，稳定过氧化氢从而提高了AflB酶分子对过氧化氢的耐受性。同时，N末端的α螺旋1-5主要以疏水作用力结合在催化中心上方，形成一个新型的N端结构域。该结构域表面具有较强亲水性，内侧较强疏水性，对疏水性的醇基结合口袋有较大的保护作用。

AflB晶体结构涵盖了酶活性位点及其表面特性的细节信息，可指导酶的分子改造来提高酶活性、改变底物特异性和提高其结构的稳定性(pH、热稳定性及耐受过氧化氢的能力，符合生产的应用的需求。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体及其制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 440

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Val Ile Pro Arg Gly Ala Val Pro Val Ala Ser Asp Leu Ser Leu

1 5 10 15

Val Ser Ile Leu Ser Ser Ala Ala Asn Asp Ser Ser Ile Glu Ser Glu

20 25 30

Ala Arg Ser Ile Ala Ser Leu Ile Ala Ser Glu Ile Val Ser Lys Ile

35 40 45

Gly Lys Thr Glu Phe Ser Arg Ser Thr Lys Asp Ala Lys Ser Val Gln

50 55 60

Glu Ala Phe Asp Lys Ile Gln Ser Ile Phe Ala Asp Gly Thr Pro Asp

65 70 75 80

Phe Leu Lys Met Thr Arg Glu Ile Leu Thr Val Gly Leu Ile Pro Ala

85 90 95

Asp Ile Leu Ser Phe Leu Asn Gly Tyr Leu Asn Leu Asp Leu Asn Ser

100 105 110

Ile His Asn Arg Asn Pro Ser Pro Lys Gly Gln Ala Ile Tyr Pro Val

115 120 125

Lys Ala Pro Gly Asp Ala Arg Tyr Ser Val Ala Glu Asn Ala Leu Arg

130 135 140

Ala Ala Ile His Ile Pro Ala Ser Phe Gly Tyr Gly Lys Asn Gly Lys

145 150 155 160

Lys Pro Val Ile Leu Val Pro Gly Thr Ala Thr Pro Ala Gly Thr Thr

165 170 175

Tyr Tyr Phe Asn Phe Gly Lys Leu Gly Ser Ala Ala Asp Ala Asp Val

180 185 190

Val Trp Leu Asn Ile Pro Gln Ala Ser Leu Asn Asp Val Gln Ile Asn

195 200 205

Ser Glu Tyr Val Ala Tyr Ala Ile Asn Tyr Ile Ser Ala Ile Ser Glu

210 215 220

Ser Asn Val Ala Val Leu Ser Trp Ser Gln Gly Gly Leu Asp Thr Gln

225 230 235 240

Trp Ala Leu Lys Tyr Trp Pro Ser Thr Arg Lys Val Val Asp Asp Phe

245 250 255

Ile Ala Ile Ser Pro Asp Phe His Gly Thr Val Met Arg Ser Leu Val

260 265 270

Cys Pro Trp Leu Ala Ala Leu Ala Cys Thr Pro Ser Leu Trp Gln Gln

275 280 285

Gly Trp Asn Thr Glu Phe Ile Arg Thr Leu Arg Gly Gly Gly Gly Asp

290 295 300

Ser Ala Tyr Val Pro Thr Thr Thr Ile Tyr Ser Thr Phe Asp Glu Ile

305 310 315 320

Val Gln Pro Met Ser Gly Ser Gln Ala Ser Ala Ile Leu Ser Asp Ser

325 330 335

Arg Ala Val Gly Val Ser Asn Asn His Leu Gln Thr Ile Cys Gly Gly

340 345 350

Lys Pro Ala Gly Gly Val Tyr Thr His Glu Gly Val Leu Tyr Asn Pro

355 360 365

Leu Ala Trp Ala Leu Ala Val Asp Ala Leu Ser His Asp Gly Pro Gly

370 375 380

Asp Pro Ser Arg Leu Asp Leu Asp Val Val Cys Gly Arg Val Leu Pro

385 390 395 400

Pro Gln Leu Gly Leu Asp Asp Leu Leu Gly Thr Glu Gly Leu Leu Leu

405 410 415

Ile Ala Leu Ala Glu Val Leu Ala Tyr Lys Pro Lys Thr Phe Gly Glu

420 425 430

Pro Ala Ile Ala Ser Tyr Ala His

435 440

Claims

1.一种耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体，其特征在于，该晶体为短棱柱状形貌，其空间结构为精细三维结构，结构中含有440个氨基酸，在每个不对称单元中含有3个分子，每个分子含有21个α螺旋结构和6个β折叠结构；结构中具有a=b=152.273 Å，c=134.381 Å，α=β=γ=90 °晶胞参数，晶体的蛋白空间群为P41212；所述晶体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1中所示。

2.根据权利要求1所述的耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体，其特征在于，所述晶体结构如下：该晶体结构含有一个N端α螺旋结构域和一个脂肪酶催化结构域，α螺旋结构域由第1-127位氨基酸组成，脂肪酶催化结构域由第128-440位氨基酸组成。

3.根据权利要求2所述的耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体，其特征在于，所述晶体的活性区域结构特征为：其盖子域的位置为甲硫氨酸M268-丙氨酸A278；其“催化三联体”由丝氨酸S233，天冬氨酸D318和组氨酸H361构成；其氧负离子空洞区由苏氨酸T169与谷氨酰胺Q234组成。

4.根据权利要求1或2或3所述的耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体，其特征在于，耐过氧化氢脂肪酶AflB的分子量为47KDa。

5.一种权利要求1~4任意一项所述的耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

1）结晶缓冲液配制

结晶缓冲液由聚乙二醇3350和pH值缓冲液组成，所述聚乙二醇3350质量百分含量为20%；所述pH值缓冲液为摩尔浓度为0.1M、pH值为 5.3的Bis-Tris溶液；

2）结晶培养

将酶活力为200000U/mL的耐过氧化氢脂肪酶AflB配成蛋白浓度为10mg/ml 的水溶液，再按体积比1：1接种到步骤1）所述的结晶缓冲液中，得到结晶液；将所述结晶液置于培养箱中，4℃培养三天，得到耐过氧化氢脂肪酶AflB晶体。