CN108690838B

CN108690838B - 一种海洋来源单甘酯脂肪酶及其晶体结构和制备方法

Info

Publication number: CN108690838B
Application number: CN201810540961.XA
Authority: CN
Inventors: 蓝东明; 袁红; 王永华; 唐薇; 杨博
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2038-05-30
Also published as: CN108690838A

Abstract

本发明属于酶工程技术领域，具体公开了一种海洋来源单甘酯脂肪酶及其晶体结构和制备方法，所述单甘酯脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述脂肪酶晶体一个晶格含有6个蛋白分子，所述晶体每个单分子含有9个α螺旋结构和9个β折叠片。本发明提供的单甘酯脂肪酶的晶体结构信息可以用以更高效地获得提高底物选择性、热稳定性及催化效率的酶变异体，满足工业化应用的要求。

Description

一种海洋来源单甘酯脂肪酶及其晶体结构和制备方法

技术领域

本发明涉及一种单甘酯脂肪酶晶体结构及其解析方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

研究表明，在神经系统中大麻素系统能够决定生物体的神经元的存活与死亡，体内和体外实验都已经证实，当生命体神经元受到损伤，如兴奋性中毒、外伤性脑损伤、脑缺血时，大麻素能够对机体起到及时保护作用。大麻素系统能够通过减少细胞钙内流，抑制谷氨酸能神经递质、抑制机体自由基的形成、调节神经细胞发育等方式保护机体。大麻素系统对于机体神经元细胞具有双重作用。动物实验发现，长期给与大麻素药物将导致持久的认知功能缺陷。长期被给予大麻素的模型，其海马体的形态学发生了改变，包括神经元死亡、突触密度和锥体细胞树突长度的都明显减少。这表明，长期给予大麻素将对机体产生神经毒性作用。

研究表明，内源性大麻素的酶降解是由两个特殊的酶系统完成的：脂肪酰胺水解酶和单甘酯脂肪酶。尽管脂肪酰胺水解酶能够使2-花生四烯酸甘油失活，但是在降解内源性大麻素的过程中单甘酯脂肪酶发挥主要作用，单甘酯脂肪酶是一种属于丝氨酸水解酶家族的脂肪酶，它主要分布于特定脑神经元的神经末梢中，对生命体的内源性大麻素系统起到调控作用。

近几年来随着流行病学的深入研究，肥胖症与肿瘤之间的关系也被进一步确定，研究表明，生命体脂质的异常代谢会导致肿瘤易感性增强。甘油单酯脂肪酶，主要作用于脂肪的分解代谢，将单酰基甘油进行水解并产生游离脂肪酸。研究表明单甘酯脂肪酶在肿瘤的进展中起到重要调节作用，同时如果单甘酯脂肪酶被敲低后，生命体肿瘤细胞的生长明显被抑制，这表明人体内的单甘酯脂肪酶可以成为一个新的治疗肿瘤的靶点。

单甘酯是油脂的衍生物，是甘油中一个羟基与脂肪酸结合的产物，是一种高效的表面活性剂。单甘酯的合成主要有量汇总方法：化学合成法和酶合成法。其中，化学法生产单甘酯主要有酯交换和酯化法两种方法，其原料主要是甘油、脂肪酸。其中酯交换又称为油脂甘油解法、醇解。除了脂肪醇解、甘油脂肪酸酯化外，单甘酯的化学法生产还有缩水甘油法、环氧氯丙烷法、化学基团保护法等。酶法生产单甘酯目前只是出于实验室研究阶段，限制其工程应用的最大的阻碍是酶与底物的接触困难导致生产效率下降而生产成本大幅度提高。

综上所述，单甘酯酶在医药科学领域以及食品加工领域具有重要的发展前景。脂肪酶的开发与应用依赖于酶本身的底物特异性，而脂肪酶的底物特异性取决于酶的分子结构，特别是酶活性中心的三维结构。蛋白质的三维结构对于了解其生物功能、设计药物以及蛋白质药物的基因工程等方面具有非常重要的作用。目前，X-射线单晶衍射方法是通过蛋白质单晶获得其三维结构的最重要的研究方法之一。对于X-射线单晶衍射方法，蛋白质单晶必须达到足够大的尺寸和完善程度。然而，由于溶液中蛋白质分子之间的相互作用位点较少，相互作用力比较弱，蛋白质晶体中往往含有很大比重的水，因此，内部结构比较规整的蛋白质晶体仍旧很难获得。获得高质量的蛋白质晶体仍旧是蛋白质结构解析的瓶颈问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供的单甘酯脂肪酶是第一个来自海洋的单甘酯脂肪酶GMGL，对研究来自海洋的酶蛋白具有很高的参考价值。

本发明还提供了上述单甘酯脂肪酶的晶体结构，及其晶体的制备方法。

本发明采用的技术方案如下：

本发明提供的单甘酯脂肪酶GMGL的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，分子量为26.9kDa。所述脂肪酶晶体一个晶格由6个蛋白分子组成，分别为：chain A、chain B、chainC、chain D、chain E、chain F；所述晶体每个单分子含有9个α螺旋结构和9个β折叠片。其晶体外形为针叶状形貌，空间群为P1211；晶胞参数为

α＝γ＝90.00°，β＝92.06°。所述的晶体中由丝氨酸S97、天冬氨酸D196、组氨酸H226构成其“催化三联体”；其盖子区域由赖氨酸K183-精氨酸R234组成；甲硫氨酸M97、丙氨酸A78构成其“氧负离子洞”区域，属于一种典型的丝氨酸水解酶家族类脂肪酶。

本发明还提供了一种海洋来源单甘酯脂肪酶的晶体的制备方法，包括以下步骤：

将海洋来源单甘酯脂肪酶的基因序列连接至pET-30a(+)质粒中，将表达载体转入宿主菌BL21(DE3)中表达、纯化获得纯蛋白；

将纯蛋白浓缩为12mg/mL的蛋白水溶液，将蛋白溶液与池液混合，采取坐滴法对结晶条件进行高通量筛选；对结晶条件进行优化，得到了满足结构解析的晶体。

所述池液含有0.2M硫酸铵、0.1M吗啉乙磺酸pH 5.6～7.0和20％～30％w/v聚乙二醇单甲醚5000。

所述池液含有0.2M硫酸铵、0.1M吗啉乙磺酸pH 6.6和28％w/v聚乙二醇单甲醚5000。

本发明也提供了一种解析脂肪酶晶体结构的方法，即：从母液中可以获得晶体，利用液态氮气流快速冷冻，在100K下利用X射线源获得的晶体数据，具体过程如下：

首先使用的尼龙晶体环(如Hampton Research公司的)，从晶体浸泡液中获取适宜X射线衍射的晶体，并迅速使用冷却系统(如Oxford Cryosystem公司的)产生的低温氮气流中冷冻至零下150-180℃；使X射线通过晶体，利用旋进法收集X射线衍射数据。收集到晶体的X射线衍射数据后，按照下述步骤进行相应的数据处理：首先使用HKL2000等软件对上一步骤中收集得到的衍射数据进行处理，获得完整的数据文件；其次，使用CCP4程序包中的Phaser、Molrep等软件，利用分子置换(MR，Molecular Replacement)方法，以已知的单甘酯脂肪酶的结构为搜索模型，得到来自海洋的单甘酯脂肪酶GMGL的精细结构。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明提供了一种海洋微生物来源的单甘酯酶GMGL的三维结构信息，为该类酶的分子改造提供了酶蛋白结构信息基础，以更高效地获得提高底物选择性、热稳定性及催化效率的酶变异体，满足工业化应用的要求。

附图说明

图1为GMGL经过Ni柱纯化之后的SDS-PAGE电泳图；1：裂解液；2：裂解液上清；3：20mM咪唑洗脱液；4:500mM咪唑洗脱液。

图2为GMGL经过分子筛纯化之后的SDS-PAGE电泳图。1：上样前样品；2-9：分子筛不同时段的出峰样品。

图3为GMGL高通量筛选的针叶状晶体示意图。

图4为GMGL优化后的针叶状晶体示意图。

图5为GMGL晶体结构示意图。

图6为GMGL单分子晶体示意图。

具体实施方式

本发明主要涉及GMGL的晶体结构及其解析方法。一方面，本发明在分子水平的基础上解析了GMGL的晶体结构。晶体结构及其衍生出的信息适用于设计和鉴定新底物，适用于设计具有高稳定性和底物特性的突变酶，适用于设计具有高催化活性的酶。本发明可用于诸如，改善单甘酯产量、提高酶活性、改变底物特异性、提高温度和pH稳定性、构建单甘酯脂肪酶突变体库、医药领域筛选抑制剂等方面。另一方面，本发明提供了解析单甘酯脂肪酶晶体结构的方法，通过该方法成功获得单甘酯脂肪酶GMGL的晶体结构。本发明公布的GMGL晶体结构信息可用于解释基于构效关系的脂肪酶催化机制。本发明可以用于设计和/或修改单甘酯脂肪酶以提高酶的催化活性，提高稳定性以及调节底物特异性。

下面通过实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1单甘酯脂肪酶GMGL的表达与纯化

人工合成编码海洋来源单甘酯脂肪酶GMGL的DNA序列，其序列如SEQ ID NO.2所示。用双酶切位点(EcoRⅠ和BgIⅡ)连入pET-30a(+)载体中。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将所得到的转化子克隆挑取转接入适量LB培养基(加入卡那霉素至终浓度为50μg/mL)中，37℃培养至600nm吸光度为0.8，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.02％，20℃诱导18h。以4200r/min离心30min收取菌体后，用缓冲液：20mMTris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)，pH8.0以菌体：缓冲液＝1(g)：10(mL)比例加入缓冲液使菌体重悬。菌体重悬之后用超声破碎法裂解菌体，破碎程序为：振幅度70％，15min。将重悬菌体用冰块包被放置托盘上。破碎后，以12000r/min低温离心40min去除沉淀和其他颗粒状杂质。将离心后上清液与Ni-NTA亲和介质结合后，用含有500mM氯化钠、100mM磷酸盐缓冲液、20mM咪唑的缓冲液冲洗介质，去除杂蛋白。最终用含有500mM氯化钠、100mM磷酸盐缓冲液、500mM咪唑的洗脱液将目的蛋白从亲和介质上洗脱下来，收集各个不同浓度洗脱液的峰尖蛋白，利用SDS-PAGE电泳检测。SDS-PAGE电泳结果如图1所示。以10KD横纵切向流超滤膜将洗脱液浓缩并更换至20mMTris-HCl，pH 8.0的缓冲液里储存，用液氮速冻后放置-80℃冰箱保存。

实施例2单甘酯脂肪酶GMGL晶体的筛选与优化

缓冲液:10mMTris-HCl、100mMNaCl pH 7.5；分子筛：Hiload16/60Superdex 200

(1)将GMGL基因序列与pET-30a(+)质粒相连接，将表达载体转入宿主菌BL 21(DE3)中表达，可获得可溶表达产物。培养条件是：采用LB培养基培养，按照2％比例扩大培养，培养到一定时间加入IPTG诱导，诱导时间为18h。离心收集菌体超声破碎，离心收集上清液，用亲和层析柱进行蛋白粗酶液的纯化，最后用10KD横纵切向流超滤膜获得浓缩后的高浓度蛋白溶液。利用Hiload 16/60Superdex200分子筛进一步纯化蛋白。实验流程：先用1.2倍柱体积的缓冲液平衡分子筛，流速为1ml/min；将5ml离心后的蛋白加载到分子筛，收集洗脱的蛋白，并用SDS-PAGE电泳鉴定(结果如图2所示)。

(2)将经过分子排阻层析纯化后的蛋白浓缩到12mg/ml，用坐滴法对初始结晶条件进新了高通量筛选，共筛选了10个结晶kit。7天后，在20度，在含有0.4μl蛋白和0.2μl池液(0.2M Ammoniumsulfate(硫酸铵)，0.1M MES monohydrate(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物)pH 6.5，30％w/v Polyethylene glycol monomethyl ether(聚乙二醇单甲醚)5000)的结晶液滴中长出了晶体。对培养条件进行优化，优化后，含有2μL蛋白和1μl池液(0.2MAmmonium sulfate，0.1M MES monohydrate pH 6.6，28％w/v Polyethyleneglycolmonomethyl ether 5，000)的结晶液滴中长出了形状较好的晶体(结果如图3、图4所示)。

实施例3

产酶菌株的发酵培养

将带有目的基因的表达菌株涂于平板上于生化培养箱中37℃培养18h，挑取单克隆于含有一定浓度抗生素的液体培养基里，按2％接种量扩大到装有500mL培养基的2L带有挡板的摇瓶里面，37℃摇菌2h后，降温至20℃，继续摇菌0.5h后添加诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，终浓度为0.02％)，诱导18h后收集菌体，超声破碎，离心取上清，利用亲和层析柱纯化蛋白，用10KD横纵切向流超滤膜浓缩得到高纯度蛋白溶液。经过上述操作得到的脂肪酶蛋白溶液浓度可达到8.5mg/mL，比酶活可达到2000U/mg，纯化倍数可达12倍(脂肪酶活性的测定：采用中华人民共和国行业标准(中华人民共和国轻工业部1993)。脂肪酶的水解活力单位定义为：以脂肪酶水解油脂，每分钟产生1μmol脂肪酸的酶量，定义为一个脂肪酶活力单位。

由上述产酶菌株的发酵培养得到单甘酯脂肪酶GMGL，经过SDS-PAGE分析为单一蛋白条带，分子量为26.9kDa；最适反应温度65℃，最适pH为8.0；在70℃温度下孵育90min依然具有超过50％的酶活力；其在偏碱的环境里稳定。

实施例4

单甘酯脂肪酶GMGL晶体结构的解析

从母液中可以获得晶体，利用液态氮气流快速冷冻，在100K下利用X射线源获得的晶体数据，具体过程如下：

脂肪酶晶体一个晶格含有6个蛋白分子，分别为：chain A、chainB、chain C、chainD、chain E、chain F。晶胞参数为

α＝γ＝90.00°，β＝92.06°。晶胞参数如表1所示。

表1.GMGL晶体结构的数据统计

实施例5

单甘酯脂肪酶GMGL的晶体空间结构特征

如图5所示，该脂肪酶晶体每个晶格有6个蛋白分子，分别为chain A、chain B、chain C、chain D、chain E、chain F。每个单分子由256个氨基酸组成，含有9个α螺旋结构和9个β折叠片结构，丝氨酸S 97、天冬氨酸D 196、组氨酸H 226构成其“催化三联体”；其盖子区域由赖氨酸K 183-精氨酸R 234组成；甲硫氨酸M 97、丙氨酸A 78构成其“氧负离子洞”区域，属于典型的丝氨酸水解酶家族。

表2原子坐标文件

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种海洋来源单甘酯脂肪酶及其晶体结构和制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 251

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Glu Thr Tyr Pro Val Val Lys Gly Ala Glu Pro Phe Phe Phe

1 5 10 15

Glu Gly Asn Asp Ile Gly Ile Leu Val Leu His Gly Phe Thr Gly Ser

20 25 30

Pro Gln Ser Met Arg Pro Leu Gly Glu Ala Tyr His Glu Ala Gly Tyr

35 40 45

Thr Val Cys Gly Pro Arg Leu Lys Gly His Gly Thr His Tyr Glu Asp

50 55 60

Met Glu Lys Thr Thr Cys Gln Asp Trp Ile Asp Ser Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Tyr Glu Trp Leu Lys Asn Arg Cys Gly Thr Ile Phe Val Thr Gly Leu

85 90 95

Ser Met Gly Gly Thr Leu Thr Leu Tyr Met Ala Glu His His Pro Glu

100 105 110

Ile Cys Gly Ile Ala Pro Ile Asn Ala Ala Ile Asn Met Pro Ala Leu

115 120 125

Ala Gly Ala Leu Ala Gly Val Gly Asp Leu Pro Arg Phe Leu Asp Ala

130 135 140

Ile Gly Ser Asp Ile Lys Lys Pro Gly Val Lys Glu Leu Ala Tyr Glu

145 150 155 160

Lys Thr Pro Ala Ala Ser Ile Arg Gln Ile Val Gln Leu Met Glu Arg

165 170 175

Val Lys Thr Asp Leu His Lys Ile Thr Cys Pro Ala Ile Leu Phe Cys

180 185 190

Ser Asp Glu Asp His Val Val Pro Pro Asp Asn Ala Pro Phe Ile Tyr

195 200 205

Asp His Ile Ala Ser Ala Asp Lys Lys Leu Val Arg Leu Pro Asp Ser

210 215 220

Tyr His Val Ala Thr Leu Asp Asn Asp Arg Gln Lys Ile Ile Asp Thr

225 230 235 240

Ser Leu Ala Phe Phe Lys Lys His Ala Asp Arg

245 250

<210> 2

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaccgaaa cctatccggt ggtaaagggt gcggagccgt ttttctttga aggaaacgac 60

atcggaattt tggtcttgca cggatttacg ggatcgccgc agagcatgcg cccgttgggg 120

gaagcctatc acgaagcggg ttacacggtc tgcgggccaa ggcttaaggg ccacggcacg 180

cattacgaag acatggagaa gacaacttgc caagattgga tcgattcggt cgaagcgggt 240

tatgaatggc tgaaaaaccg atgcgggacg attttcgtca ccggcttgtc gatgggtggc 300

acgttgacgc tatatatggc cgaacaccat ccggaaatct gtggcatcgc gcccatcaat 360

gccgccatta acatgccggc gctggccggt gcgctggccg gcgtcggcga tttgccgcga 420

ttcctggatg ccatcggttc ggacataaaa aaaccgggcg tgaaagaact cgcttatgaa 480

aagacgccgg cggcctctat ccggcaaatc gtccagctca tggaacgggt gaagacggat 540

ctccacaaaa tcacctgtcc cgccatttta ttttgttcgg acgaagatca cgtcgttccc 600

cccgacaatg cgccgttcat ttacgaccat atcgcctcgg cggataagaa actcgtgcgt 660

ttgccggaca gctaccacgt cgcgacgctc gacaacgacc ggcaaaaaat cattgatacg 720

tccttggcgt ttttcaaaaa gcatgccgac cgttaa 756

Claims

1.一种海洋来源单甘酯脂肪酶的晶体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将海洋来源单甘酯脂肪酶的基因序列连接至pET-30a(+)质粒中，将表达载体转入宿主菌BL21(DE3)中表达、纯化获得纯蛋白；所述海洋来源单甘酯脂肪酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；

将纯蛋白浓缩为12mg/mL的蛋白水溶液，将蛋白溶液与池液混合，采取坐滴法对结晶条件进行高通量筛选；对结晶条件进行优化，得到了满足结构解析的晶体；结晶条件为：所述池液含有0.2M硫酸铵、0.1M吗啉乙磺酸pH 6.5～7.0和20％～30％w/v聚乙二醇单甲醚5000。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述池液含有0.2M硫酸铵、0.1M吗啉乙磺酸pH 6.6和28％w/v聚乙二醇单甲醚5000。