CS247484B1

CS247484B1 - Způsob přípravy imunoglobulinu proti lidským Iymfocytům

Info

Publication number: CS247484B1
Application number: CS272485A
Authority: CS
Inventors: Eva Hamsikova; Jan Pardon; Stanislav Ulrych
Original assignee: Eva Hamsikova; Jan Pardon; Stanislav Ulrych
Priority date: 1985-04-12
Filing date: 1985-04-12
Publication date: 1987-01-15

Abstract

Řešení se týká oboru výroby imunobiologických preparátů pro terapeutické účely. Řeší se způsob přípravy imunoglobulinu proti lidským Iymfocytům /thymocytům/. Uvedené imunoglobuliny se vyznačují imunosupresivními účinky využívanými při přenosech tkání a orgánů. Podstatou řešení je jednoduchý postup izolace frakce imunoglobulinů ze séra imunizovaných zvířat založený na srážecích reakcích. Při teplotě 18 až 22 °C a pH 4,15 až 4,25 dochází v prvním stupni k oddělení roztoku imunoglobulinů od sraženiny balastních bílkovin s kyselinou kaprylovou. Ve druhém stupni se frakce imunoglobulinů purifikuje srážením etanolem při teplotě -6 až -10 °C. Postupem zůstává zachován nativní charakter molekuly imunoglobulinů, které mají biologické vlastnosti vhodné pro po žadované použití preparátu.

Description

Vynález řeší způsob přípravy imunoglobulinu proti lidským lymfocytům.

Při chirurgických přenosech tkání a orgánů je využíváno imunosupresivních látek. Purifikovaný zvířecí imunoglobulin proti lidským lymfocytům má proti jiným imunosupresivním látkám nebo záření řadu výhod, pro které je při transplantacích využíván.

Zdrojem protilátek je sérum zvířat imunizovaných lidskými lymfocyty. Preparát připravovaný v minulosti z antilymfocytárního séra nevykazoval vhodné imunosupresivní účinky. Pro izolaci imunoglobulinové frakce bylo používáno vysolování síranem amonným s následující sorpcí balastních bílkovin na iontoměničích a konečným vysycením nebo purifikačních postupů využívajících pouze iontoměničů.

Rovněž byla zkoušena izolační metoda založená na srážení rivanolem. Metoda nebyla pro izolaci v provozním měřítku vhodná, v sedmdesátých letech byla využívána v USA - Stanford Univ. Hospital v Kalifornii.

Protože se nejedná o běžný komerční preparát - imunoglobulin proti lidským thymocytům/ je možné aplikovat pouze ve speciálních zdravotnických zařízeních, která se zabývají přenosem tkání a orgánů - je jeho příprava omezena pouze na malý počet výrobců.

Pro produkci malých množství se využívá postupů založených na principech afinitní chromatografie, ionexové chromatografie a sorpce na specifických sorbentech. Společnou nevýhodou citovaných postupů je vysoká cena sorpčních materiálů, použitelnost pouze pro zpracování malých objemů séra a tím i vysoká cena konečného preparátu.

Navržený způsob izolace imunoglobulinu ze séra zvířat imunizovaných lidskými thymocyty, tj. lymfocyty izolovanými z thymu, má veškeré přednosti srážecích postupů, pokud se jedná o zpracovaný objem a protože ostatní sérové bílkoviny zvířecího séra jsou pro terapeutické účely nepoužitelné, je celá izolace zjednodušena do dvou francionačních stupňů - vysrážení balastních bílkovin kyselinou kaprylovou a přesrážení frakce imunoglobulinů za snížené teploty etanolem.

Jednoduchost postupu a nízká cena srážecích činidel zvyšuje efektivnost postupu pro použití ve větších objemech a zaručuje vysoké výtěžky preparátu při nízkých nákladech. Navržený postup je i proti postupu popsanému pro přípravu lidského imunoglobulinu obohacenému o IgA a XgM zjednodušen o purifikační stupeň srážení fosforečnanem vápenatým pro daný preparát vhodnou změnou reakčních podmínek v obou použitých izolačních stupních.

Navrhovaný způsob přípravy imunoglobulinu proti lidským thymocytům spočívá v dvoustupňovém srážení sérových bílkovin. V prvním stupni se při teplotě 20 °C sráží většina sérových bílkovin ze séra zvířat imunizovaných lidskými lymfocyty kyselinou kaprylovou při pH 4,15 až 4,25 a teplotě 10 až 22 °C do koncentrace kyseliny kaprylové 7 až 8 % obj. v prostředí acetátových iontů.

Sediment balastních bílkovin se oddělí odstředěním a filtrací, v roztoku zůstává frakce imunoglobulinů, která se za teploty -6 až -10 °C sráží etanolem v koncentraci 25 až 30 % obj. Sediment imunoglobulinů se rozpustí ve vodě obsahující glukózu a glycin jako stabilizátor. Vodný roztok se suší lyofilizací, rozpustí ve vodě, upraví koncentrace účinné složky a stabilizátoru a po rozplnění znovu lyofilizuje za sterilních podmínek.

i

Příklad 1

Sérum králíků imunizovaných lidskými thymocyty uchovávané při teplotě -20 °C bylo rozmraženo při teplotě +4 °C a spojena skupina sér zvířat č. 62 až 69. Výchozí objem 4 900 ml séra. Bylo přidáno 9 800 ml 0,06 M acetátového pufru pH 3,53 připraveného z redestilované apyrogenní a sterilní vody. pH zředěného séra 4,51 bylo upraveno přidáním 20 ml koncentrované kyseliny octové na hodnotu 4,28.

Ve frakcionačním kotlíku bylo sérum sráženo 375 ml kyseliny kaprylové p.a přidané během 30 minut při teplotě 20 °C. Suspenze míchána 60 minut a sediment oddělen centrifugaci na kyvetové odstředivce vychlazené na +4 °C. Doba odstředování 6 minut při 3 000 ot./min.

Slabě opalescentní supernatant byl zfiltrován přes filtrační papír. pH supernatantu 4,22 bylo upraveno přidáním 79 ml 5 M roztoku hydroxidu sodného na 5,05. 12 300 ml supernatantu bylo vychlazeno ve frakcionačním kotlíku na 0 °C a při této teplotě sráženo pozvolným přidáváním 4 456 g etanolu 96 % obj. podchazeným na -15 °C. Teplota během srážení 0 °C, po přidání etanolu suspenze za stálého míchání vychlazena na teplotu -9 °c a míchána 16 hodin.

Sediment frakce imunoglobulinů byl oddělen centrifugaci na kyvetové odstředivce při 3 000 ot./min. po dobu 20 minut a při teplotě -8 °C. Sediment byl rozmíchán v 1 200 ml ledové apyrogenní vody obsahující 40 g glukózy, 40 g glycinu a 10 g chloridu sodného a roztok rozplněn do 7 lahví NTS 500 ml po 200 ml.

Roztok byl namražen na stěny lahví v lázni o teplotě -50 °C a usušen ve vákuu při maximální teplotě sušení 35 °C. Bylo získáno 129,3 g lyofllizátu, který obsahoval 39,3 g bílkovin, což odpovídá výtěžku 8 g čisté bílkoviny z jednoho litru séra. Lyofilizát byl rozpuštěn v 1 500 ml apyrogenní vody, roztok byl doplněn 2,75 g glycinu a 3,3 g chloridu sodného a vodou do objemu 1 900 ml.

pH roztoku 5,2 bylo upraveno přidáním 1,4 ml 5 M roztoku hydroxidu sodného na hodnotu 6,74. Za semisterilních podmínek byl roztok zfiltrován sadou membránových filtrů o průměru 140 mm v pořadí: preflltr, 1,2 /ím, 0,8 /im, 0,45 /im, 0,22 ^um a za sterilních podmínek sadou membránových filtrů o průměru 90 mm v pořadí: prefiltr, 0,45 a O,22₍/um. Roztok obsahoval:

bílkoviny	1,79	g/100	ml
glycin	2,05	g/100	ml
glukóza	1,97	g/100	ml
chlorid sodný	0,69	g/100	ml
PH	6,9

Elektroforetická čistota Ig 91,8 % hmot., roztok byl sterilní, neškodný na morčatech a myších, hodnoty pyrogenních látek vyhovující /0,0; 0,0; 0,4 °C/, byly stanoveny hemaglutininy 1:16, protilátky proti bazálním membránám glomerulů O, vazba na lidské lymfocyty 80 až 84 %, Inhibice tvorby rozet 1:500, cytotoxický text s lidskými lymfocyty 1:2 560, protilátky proti sérovým bílkovinám: stopy v oblasti IgG, tromboaglutininy a trombolysiny: negativní, inkompletní 1:2.

Roztok byl rozplněn za sterilních podmínek do 34 1 lahviček po 5 ml a lyofilizován 48 hodin- při max. teplotě 35 °C. Po uzavření lahviček ve vákuu a zapertlování uzávěrů byla stanovena vlhkost 1,8 až 1,9 % hmot. a rozpustnost za 30 sec. na čirý bezbarvý roztok. Preparát byl aplikován v Institutu klinické a experimentální medicíny v Praze - Krči pod označením ATG Sevac 02/84.

Preparát ve všech parametrech vyhovoval požadavkům na imunosupresiva na bázi imunoglobulinů pro transplantační účely, která jsou dosud dovážena.

Příklad 2

Sérum králíků Imunizovaných lidskými thymocyty uchovávané při teplotě -20 °C bylo rozmraženo při teplotě +4 °c a spojena skupina č. 70 až 74. Výchozí objem 3 300 ml séra. Bylo přidáno 6 600 ml 60 mM acetátového pufru. pH 3,50 připraveného z redestilované apyrogenní a sterilní vody.

pH zředěného séra 4,48 bylo upraveno přidáním 15 ml koncentrované kyseliny octové na hodnotu 4,21. Ve frakcionačním kotlíku bylo sérum sráženo 250 ml kyseliny kaprylové p.a. přidané během 15 minut při teplotě 21 °C. Suspenze míchána 60 minut a sediment oddělen centrifugací na kyvetové odstředivce vychlazené na +4 °C.

Doba odstředování 10 minut při 2 800 ot./min. Opalescentní roztok byl zfiltrován přes filtrační papír. pH supernatantu 4,20 bylo upraveno přidáním 58 ml 5 M roztoku hydroxidu sodného na hodnotu 5,02. 8 150 ml supernatantu bylo vychlazeno ve frakcionačním kotlíku na Q °C a při této teplotě bylo sráženo pozvolným přidáváním 2 955 g etanolu 96 % obj. podchlazeným na -15 °C.

Teplota během srážení 0 °C, po přidání etanolu suspenze za stálého míchání vychlazena na teplotu -8 °C a míchána 18 hodin. Sediment frakce imunoglobulinů byl oddělen centrifugací na kyvetové odstředivce při 2 900 ot./min. po dobu 20 minut a při teplotě -10 °C. Sediment byl rozmíchán v 850 ml ledové apyrogenní vody obsahující 20 g glukózy, 20 g glycinu a 6 g chloridu sodného a roztok rozplněn do 5 lahví NTS 500 ml po 200 ml.

Roztok byl namražen na stěny lahví v lázni o teplotě -50 °C a usušen ve vakuu při maximální teplotě sušení 35 °C. Bylo získáno 71 g lyofilizátu, který obsahoval 25 g bílkovin, což odpovídá výtěžku 7,5 g čisté bílkoviny z 1 litru séra. Lyofilizát byl rozpuštěn v 1 000 ml apyrogenní vody, roztok byl doplněn do objemu 1 100 ml.

pH roztoku 5,44 bylo upraveno přidáním 0,7 ml 5 M roztoku hydroxidu sodného na hodnotu 6,61. Za semisterilních podmínek byl roztok zfiltrován sadou membránových filtrů o průměru 146 mm v pořadí: prefiltr, 1,2 /um, 0,8 /um, 0,45 /um a 0,22 /am a za sterilních podmínek sadou membránových filtrů o průměru 90 mm v pořadí: prefiltr, 1,2 /um, 0,8/um, O,45^um a O,22_/um. Roztok obsahoval:

bílkoviny	2,06	g/100	ml
glycin	2,17	g/100	ml
glukóza	1,92	g/100	ml
chlorid sodný	0,70	g/100	ml
PH	6,68

Elektroforetická čistota 92,4 % hmot., roztok byl sterilní, neškodný na morčatech a myších, hodnoty pyrogenních látek vyhovující /0,1; 0,0; 0,1 °C/, byly stanoveny hemaglutininy 1:32 /anti A/, resp. 1:64 /anti B/, protilátky proti bazálním membránám glomerulů negativní, vazby na lidské lym{ocyty 88 %, inhibic.e tvorby rozet 1:500, cytotoxický text s lidskými lymfooyty 1:2 560, protilátky .proti sérovým bílkovinám v oblasti igG, tromboaglutininy a trombolyciny negativní.

Roztok byl rozplněn za sterilních podmínek do 186 lahviček a lyofilizován 48 hod. při max. teplotě 35 °C. Po uzavření lahviček ve vakuu a zapertlování uzávěrů byla stanovena zbytková vlhkost 1,7 % hmot. a rozpustnost za 40 s na čirý bezbarvý roztok. Preparát byl aplikován v Institutu klinické a experimentální medicíny v Praze - Krči pod označením ATG Sevac 03/84.

Preparát ve všech parametrech vyhovoval požadavkům na imunosupresiva na bázi imunoglobullnů pro transplantační účely, která jsou dosud dovážena.

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

Způsob přípravy imunoglobulinu proti lidským lymfocytům pro imunosupresivní účely při přenosech tkání a orgánů, vyznačující se tím, že se frakce imunoglobulinů obsažená v sérech zvířat imunizovaných lidskými lymfocyty, s výhodou lymfocyty izolovanými z thymů, izoluje srážením kyselinou kaprylovou při pH 4,15 až 4,25 a teplotě 18 až 22 °C do koncentrace 7 až 8 % obj. v prostředí acetátovýoh lontů, sediment balastních bílkovin se oddělí centrifugací a připadne filtrací a z čirého supernatantu se izoluje frakce imunoglobulinů srážením etanólem při teplotě -6 až -10 °C s výhodou při teplotě -8 °C a při konečné koncentraci etanolu 25 až 30 % obj.