KR102274472B1 - 개선된 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 출원은 재조합 단백질을 포함하는 조성물을 함유하는 바이알을 제조하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 이 방법은 (a) 재조합 단백질을 포함하는 조성물을 함유한 용기(선택적으로, 용기는 양압 하에 보관되었음)를 제공하는 단계; (b) 재조합 단백질을 포함하는 조성물을 함유한 용기에 진공을 가하는 단계; (c) 진공이 조성물에서 가스를 제거하도록 하는 단계; 및 (d) 재조합 단백질을 포함하는 탈기된 조성물로 바이알을 충전하는 단계를 포함한다.
Description
계속 출원 데이터
본 출원은 본원에 참조로 통합된 2014년 10월 31일 출원된 미국 가출원 제62/073,459호의 이익을 주장한다.
설명
본 출원은 2015년 10월 30일 작성되고 12킬로바이트 크기의 "RSVAB-305WO1_ST25"라는 제목으로 보관된 ASCII 텍스트 파일로서 미국 특허청에 EFS 웹을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. 전자적으로 제출된 이러한 서열 목록은 37 CFR §1.821(c)에 의해서 요구된 서류 사본 및 §1.821(e)에 의해서 요구된 CRF로서 기능한다. 서열 목록에 포함된 정보는 본 출원에 참조로 포함된다.
기술분야
재조합 단백질을 포함하는 조성물을 함유하는 바이알을 제조하는 방법에 관한 것이다.
항체와 같은 재조합 단백질은 다양한 질병 및 병태의 치료에 이용되었으며, 일반적으로 진핵 또는 원핵 세포주를 이용한 세포 배양으로부터 유래된다. 약학적 응용 분야에 이용되는 항체와 같은 재조합 단백질은 특히 세포 단백질 오염물질, 세포 DNA 오염물질, 바이러스 및 기타 전염성 물질을 포함한 세포 배양으로부터의 오염물질과 관련하여, 높은 수준의 순도를 나타내야 한다. "WHO Requirements for the use of animal cells as in vitro substrates for the production of biologicals: Requirements for Biological Substances No. 50" No. 878 Annex 1, 1998 참조. 항체와 같은 많은 재조합 단백질은 바이알 형태의 1회용 용기 또는 소형 다용도 용기에 포장된다. 투명 유리 바이알과 같은 바이알로 제조될 경우, 재조합 단백질을 포함하는 조성물의 외관뿐만 아니라 바이알 자체의 외관은 최적으로 보존된다. 바이알 또는 조성물에서의 시각적 결함은 환자 및/또는 의사에게 불필요한 불안을 유발할 수 있다. 제품의 성능 저하가 없을 수 있고 의학적으로 허용될 수 있지만, 바이알 제조 회사, 약국, 치료 의사, 또는 환자는 그 외관만으로 바이알을 거부할 수도 있다.
따라서, 재조합 단백질을 포함하는 조성물을 포장하는 데 사용되는 바이알에 링이 형성되지 않도록 하는 개선된 약제 제조 공정이 필요하다.
설명에 따르면, 재조합 단백질을 포함하는 조성물을 함유하는 바이알을 제조하는 방법은,
a. 재조합 단백질을 포함하는 조성물을 함유한 용기(선택적으로, 용기는 양압 하에 보관되었음)를 제공하는 단계;
b. 용기에 진공을 가하는 단계;
c. 진공이 조성물에서 가스를 제거하도록 하는 단계; 및
d. 재조합 단백질을 포함하는 탈기된 조성물로 바이알을 충전하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 재조합 단백질은 시나지스(Synagis®)이다.
일 양태에서, 시나지스를 포함하는 조성물로부터 시나지스를 분리하는 방법은,
a. 조성물에 대해 이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하는 단계;
b. 조성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하는 단계;
c. 조성물에 대해 여과 공정을 수행하는 단계; 및
d. 조성물로 바이알을 충전하기 전에 조성물에서 가스를 제거하는 단계를 포함하되,
시나지스를 포함하는 최종 생성물은 (a), (b), 및 (c)로부터 기인하며, 최종 생성물은 인간에 투여하기에 적합하고 0.5 pg/mg 이하의 DNA 농도를 갖고, 이 방법은 조성물에 벤조나아제를 첨가하는 단계를 포함하지 않는다.
다른 양태에서, 시나지스를 포함하는 조성물로부터 시나지스를 분리하는 방법은,
a. 조성물에 대해 양이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하여 시나지스를 포함하는 제1 생성물을 형성하는 단계;
b. 제1 생성물에 완충액을 첨가하여 완충된 생성물을 형성하는 단계;
c. 완충된 생성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하여 시나지스를 포함하는 제2 생성물을 형성하는 단계;
d. 제2 생성물에 대해 여과 공정을 수행하여 시나지스를 포함하는 제3 생성물을 형성하는 단계;
e. 제3 생성물에 대해 바이러스 불활성화 공정을 수행하는 단계;
제3 생성물을 제형화하여 시나지스를 포함하는 최종 생성물을 형성하는 단계(최종 생성물은 인간에 투여하기에 적합하고 0.5 pg/mg 이하의 DNA 농도를 가짐); 및
f. 조성물로 바이알을 충전하기 전에 조성물에서 가스를 제거하는 단계를 포함하되,
이 방법은 조성물에 벤조나아제를 첨가하는 단계를 포함하지 않는다.
다른 구현예에서, 시나지스를 포함하는 조성물로부터 시나지스를 분리하는 방법은 (a)~(e) 중 적어도 세 단계를 포함하고, (f) 단계를 더 포함한다:
a. 조성물에 대해 양이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하는 단계;
b. 조성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하는 단계;
c. 조성물에 대해 한외여과 공정을 수행하는 단계;
d. 조성물에 대해 바이러스 불활성화 공정을 수행하는 단계;
e. 조성물에 대해 음이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하는 단계; 및
f. 조성물로 바이알을 충전하기 전에 조성물에서 가스를 제거하는 단계,
g. 여기서, (i)~(v) 중 적어도 세 단계로부터 기인하는 생성물은 시나지스를 포함하고, 인간에 투여하기에 적합하고, 0.5 pg/mg 이하의 DNA 농도를 갖고, 이 방법은 조성물에 벤조나아제를 첨가하는 단계를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 조성물로 바이알을 충전하기 전에 조성물에서 가스를 제거하는 단계는,
a. 재조합 단백질을 포함하는 조성물을 함유한 용기(선택적으로, 용기는 양압 하에 보관되었음)를 제공하는 단계;
b. 재조합 단백질을 포함하는 조성물을 함유한 용기에 진공을 가하는 단계;
c. 진공이 조성물에서 가스를 제거하도록 하는 단계; 및
d. 재조합 단백질을 포함하는 탈기된 조성물로 바이알을 충전하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 조성물은
a. 아미노산 서열 SEQ ID NO:1을 나타내는 중쇄 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 나타내는 경쇄;
b. SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 중쇄 가변 부위 및 경쇄 SEQ ID NO:6의 경쇄 가변 부위; 또는
c. 아미노산 서열 TSGMSVG(SEQ ID NO:3)을 나타내는 H1 상보성 결정 부위(CDR), 아미노산 서열 DIWWDDKKDYNPSLKS(SEQ ID NO:4)을 나타내는 H2 CDR, 아미노산 서열 SMITNWYFDV(SEQ ID NO:5)을 나타내는 H3 CDR; 아미노산 서열 KCQLSVGYMH(SEQ ID NO:7)을 나타내는 L1 CDR, 아미노산 서열 DTSKLAS(SEQ ID NO:8)을 나타내는 L2 CDR, 및 아미노산 서열 FQGSGYPFT(SEQ ID NO:9)을 나타내는 L3 CDR을 포함한다.
일 구현예에서, 재조합 단백질을 포함하는 조성물을 함유한 용기는 양압 하에 보관되었다.
다른 구현예에서, 진공은 약 12시간 내지 약 5일 동안 가해진다. 다른 구현예에서, 진공은 약 1일 내지 약 4일 동안 가해진다. 일 구현예에서, 진공은 약 50 내지 약 268 mbar로 가해진다. 다른 구현예에서, 50 mbar 초과 약 268 mbar 이하인 진공이 가해진다. 다른 구현예에서, 약 60 내지 약 268 mbar인 진공이 가해진다. 일 형태에서, 진공은 약 99 내지 약 268 mbar로 가해진다.
일 양태에서, 진공은 약 20 L 내지 약 250 L의 재조합 단백질을 포함하는 조성물의 부피에 가해진다. 다른 양태에서, 진공은 약 40 L, 약 50 L, 약 65 L, 또는 약 125 L의 조성물의 부피에 가해진다. 일 구현예에서, 용기는 조성물의 부피보다 클 수 있다. 일 구현예에서, 약 50 L 이하의 조성물이 약 65 L 탱크에 존재한다. 일 구현예에서, 약 76 L 이하의 조성물이 약 125 L 탱크에 존재한다. 일 구현예에서, 약 46.5 L의 조성물이 약 65 L 탱크에 존재한다. 다른 구현예에서, 약 68.1 L의 조성물이 약 125 L 탱크에 존재한다.
일 형태에서, 기포 지표는 적어도 약 5.9이고 다음 식을 이용하여 계산된다.
BI = (ha * t * 1000)/(hl * PV)
여기서, V= 용액의 부피(mL),
P= 탈기 진공(mbar),
T= 탈기 시간(hr),
hl= 액체의 높이(cm)(원통형 탱크로 가정하여 계산),
ha= 공기/헤드스페이스의 높이(cm)이다.
다른 형태에서, 재조합 단백질을 포함하는 조성물은 계면활성제를 포함하지 않는다. 다른 형태에서, 재조합 단백질을 포함하는 조성물에 계면활성제가 첨가되지 않는다. 다른 형태에서, 적어도 하나의 바이알에 충전될 때, 조성물은 바이알의 공기-액체-유리 계면 상에 링을 형성하지 않는다. 또 다른 형태에서, 적어도 하나의 바이알에 충전될 때, 조성물은 바이알의 표면 상에 링을 형성하지 않는다. 일 구현예에서, 조성물은 탈기 후 기포를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 탈기 후 적어도 하나의 바이알에 충전될 때, 조성물은 바이알 충전 라인 또는 제조에 사용되는 다른 관류에 기포를 포함하지 않는다.
다른 형태에서, 재조합 단백질을 포함하는 조성물에서 재조합 단백질의 단백질 농도는 약 0.1 mg/mL 내지 약 1000 mg/mL이다. 다른 양태에서, 단백질 농도는 약 100 mg/mL이다.
일 형태에서, 탈기 단계를 생략하면 조성물에서 기포의 축적을 초래한다. 다른 형태에서, 탈기 단계를 생략하면 충전 라인에서 조성물에 기포의 축적을 초래한다. 다른 양태에서, 탈기 단계를 생략하면 조성물을 함유한 바이알의 공기-액체-유리 계면에서 입자의 침적을 초래한다. 다른 구현예에서, 탈기 단계를 생략할 경우 입자의 침적은 재조합 단백질을 포함하는 침적이다. 다른 형태에서, 입자의 침적은 바이알 상에 링을 형성한다.
추가 목적 및 장점은 다음의 상세한 설명에서 일부 설명되며, 일부는 상세한 설명으로부터 명백해지거나, 실시에 의해 이해될 수 있다. 목적 및 장점은, 특히 첨부된 청구범위에서 언급되는 요소들 및 조합에 의해 실현되고 달성될 것이다.
전술한 일반적인 설명 및 다음의 상세한 설명은 모두 예시적이고 단지 설명적인 것이며 청구범위를 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 통합되고 그 일부를 구성하는 첨부 도면은 하나(몇 가지)의 구현예를 도시하며, 설명과 함께 본원에 기술된 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1의 A와 B는 2일간의 탈기 공정에 미치는 진공의 영향 연구에서의 사진을 나타낸다. 도 1의 A와 B는 충전 라인을 나타내며, 도 1의 A는 268 mbar로 탈기된 조성물에 대한 충전 공정 시작 시 충전 라인의 사진을 나타내고, 도 1의 B는 268 mbar로 탈기된 조성물에 대한 충전 공정의 종료(8.4 kg 충전) 사진을 나타낸다.
도 2의 A와 B는 탈기에 미치는 부피의 영향의 동일한 연구에서, 268 mbar로 탈기된 조성물에 대해, 약 400 mL 충전(패널 A) 시 및 약 1400 mL 충전(패널 B) 시 충전 라인 기포를 나타낸다. 268 mbar로 탈기된 조성물에 대한 충전 공정에서 나중에 더 많은 기포가 육안상 분명히 나타난다.
도 3의 A와 B는 탈기에 미치는 시간의 영향 연구에서, 1일간 탈기된 조성물에 대한 충전 라인 사진을 나타내며, 도 3의 A는 약 300 mL 충전 시 충전 라인의 사진을 나타내고, 도 3의 B는 약 650 mL 충전 시 충전 라인의 사진을 나타낸다. 약 650 mL 충전 시점에 더 많은 기포가 가시화될 수 있다.
도 4는 지시 화살표의 왼쪽으로 바이알 유리 상에 실질적으로 수평으로 나타난 흰색 링의 사진이다.
도 5는 탈기된 약물 및 탈기되지 않은 약물로부터 생성된 파일럿 규모 배치의 육안 검사 결과를 나타낸다.
도 6은 아미드-I 피크의 2차 미분 분석에 의해 평가된, 링으로부터 분리된 단백질의 2차 구조의 평가 결과를 나타낸다. 링 분리물의 단백질은 FTIR로 측정된 고유의 형태를 가지고 있다.
도 7의 A 내지 D는 시나지스를 함유한 바이알의 링 내 단백질에 대해 수행된 트립신 증해의 결과를 나타낸다. 트립신 증해는 링 내 단백질이 시나지스임을 보여준다.
도 2의 A와 B는 탈기에 미치는 부피의 영향의 동일한 연구에서, 268 mbar로 탈기된 조성물에 대해, 약 400 mL 충전(패널 A) 시 및 약 1400 mL 충전(패널 B) 시 충전 라인 기포를 나타낸다. 268 mbar로 탈기된 조성물에 대한 충전 공정에서 나중에 더 많은 기포가 육안상 분명히 나타난다.
도 3의 A와 B는 탈기에 미치는 시간의 영향 연구에서, 1일간 탈기된 조성물에 대한 충전 라인 사진을 나타내며, 도 3의 A는 약 300 mL 충전 시 충전 라인의 사진을 나타내고, 도 3의 B는 약 650 mL 충전 시 충전 라인의 사진을 나타낸다. 약 650 mL 충전 시점에 더 많은 기포가 가시화될 수 있다.
도 4는 지시 화살표의 왼쪽으로 바이알 유리 상에 실질적으로 수평으로 나타난 흰색 링의 사진이다.
도 5는 탈기된 약물 및 탈기되지 않은 약물로부터 생성된 파일럿 규모 배치의 육안 검사 결과를 나타낸다.
도 6은 아미드-I 피크의 2차 미분 분석에 의해 평가된, 링으로부터 분리된 단백질의 2차 구조의 평가 결과를 나타낸다. 링 분리물의 단백질은 FTIR로 측정된 고유의 형태를 가지고 있다.
도 7의 A 내지 D는 시나지스를 함유한 바이알의 링 내 단백질에 대해 수행된 트립신 증해의 결과를 나타낸다. 트립신 증해는 링 내 단백질이 시나지스임을 보여준다.
서열의 설명
표 1은 본원에 참조된 특정 서열의 목록을 제공한다.
| 설명 | 서열 | SEQ ID NO |
| 시나지스 중쇄 가변 부위 | QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMSVGWIRQPPGKALEWLADIWWDDKKDYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLKVTNMDPADTATYYCARSMITNWYFDVWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 1 |
| 시나지스 중쇄 FAB | QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMSVGWIRQPPGKALEWLADIWWDDKKDYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLKVTNMDPADTATYYCARSMITNWYFDVWGAGTTCTCSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTH | 2 |
| 시나지스 중쇄 CDR1 | TSGMSVG | 3 |
| 시나지스 중쇄 CDR2 | DIWWDDKKDYNPSLKS | 4 |
| 시나지스 중쇄 CDR3 | SMITNWYFDV | 5 |
| 시나지스 경쇄 가변 부위 | DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKCQLSVGYMHWYQQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGYPFTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 6 |
| 시나지스 경쇄 CDR1 | KCQLSVGYMH | 7 |
| 시나지스 경쇄 CDR2 | DTSKLAS | 8 |
| 시나지스 경쇄 CDR3 | FQGSGYPFT | 9 |
구현예의 설명
I. 바이알 링을 형성하지 않는 탈기된 조성물의 제조
재조합 단백질을 포함하는 특정 조성물의 바이알 상에 링이 형성될 수 있는 것으로 확인되었다. 본 출원서에서 "링"은, 바이알 또는 다른 용기 상의 육안상 뚜렷한 원형 또는 타원형의 외관 불량으로 이어지는 바이알 또는 다른 용기의 공기-액체-유리 계면에서의 입자 침적물을 지칭한다. 일 구현예에서, 재조합 단백질을 포함하는 조성물은 계면활성제를 포함하지 않는다. 일 구현예에서, 재조합 단백질을 포함하는 조성물은 그 제조 공정 중에 첨가되는 계면활성제를 갖지 않는다. 어떤 경우에, 재조합 단백질을 포함하는 조성물은 적어도 약 24시간, 적어도 약 36시간, 또는 적어도 약 48시간, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 1주, 적어도 약 1개월, 적어도 약 6개월, 적어도 약 1년, 적어도 약 2년, 적어도 약 3년 동안 양압 하에 보관되었다.
놀랍게도, 진공을 가하여 이 조성물들에서 가스를 제거하면 재조합 단백질을 포함하는 이 조성물들을 함유한 바이알 상의 링 형성이 방지되는 것으로 판단되었다.
일 구현예에서, 탈기 단계는 조성물이 적어도 약 24시간, 적어도 약 36시간, 또는 적어도 약 48시간, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 1주, 적어도 약 1개월, 적어도 약 6개월, 적어도 약 1년, 적어도 약 2년, 적어도 약 3년 동안 양압 하에 보관된 후에 수행된다. 다른 구현예에서, 재조합 단백질을 포함하는 조성물은 탈기 단계 후 약 16시간 이내, 약 12시간 이내, 약 8시간 이내, 약 6시간 이내, 약 4시간 이내, 약 3시간 이내, 약 2시간 이내, 약 90분 이내, 약 60분 이내, 또는 약 30분 이내 동안 양압 하에 보관될 수 있다. 다른 구현예에서, 재조합 단백질을 포함하는 조성물은 탈기 단계 후 약 1일 이내, 약 2일 이내, 약 3일 이내, 또는 약 4일 이내 동안 양압 하에 보관될 수 있다.
A. 진공의 적용
이들로 제한되는 것은 아니지만, 진공의 강도, 진공이 가해지는 시간, 뿐만 아니라 용기 및 용액의 특성(예컨대, 이들로 제한되는 것은 아니지만), 용액의 부피, 액체의 높이, 및 공기/헤드스페이스의 높이를 포함하여, 다양한 인자가 재조합 단백질을 포함하는 조성물에서 가스를 제거하는 진공의 능력에 영향을 미친다. 임의의 주어진 상황에서 가해질 수 있는 진공의 양 및 진공의 기간은 변할 수 있고, 테스트 배치를 실행하고 탈기가 어떤 목표를 달성하기에 충분한지를 관찰함으로써 정성적으로 결정될 수 있다. 대안적으로, 그리고 특정 구현예에서만, 다음 식에 따른 기포 지표 계산을 이용하여 진공의 양 및 진공의 기간을 결정할 수 있다.
BI = (ha * t * 1000)/(hl * PV)
여기서, V= 용액의 부피(mL),
P= 탈기 진공(mbar),
T= 탈기 시간(hr),
hl= 액체의 높이(cm)(원통형 탱크로 가정하여 계산),
ha= 공기/헤드스페이스의 높이(cm)이다.
일 구현예에서, 기포 지표는 적어도 약 12, 적어도 약 11, 적어도 약 10, 적어도 약 9, 적어도 약 8, 적어도 약 7, 적어도 약 6, 또는 적어도 약 5.9이다.
일 구현예에서, 진공은 약 50 내지 약 268 mbar로 가해진다. 다른 구현예에서, 약 50 mbar 초과 약 268 mbar 이하인 진공이 가해진다. 다른 구현예에서, 약 60 내지 약 268 mbar인 진공이 가해진다. 일 형태에서, 진공은 약 99 내지 약 268 mbar로 가해진다.
일 양태에서, 진공은 약 20 L 내지 약 250 L 또는 약 40 L 내지 약 70 L의 재조합 단백질을 포함하는 조성물의 부피에 가해진다. 다른 양태에서, 진공은 약 40 L, 약 50 L, 약 65 L, 또는 약 125 L의 조성물의 부피에 가해진다. 일 구현예에서, 용기는 조성물의 부피보다 클 수 있다. 일 구현예에서, 약 50 L 이하의 조성물이 약 65 L 탱크에 존재한다. 일 구현예에서, 약 76 L 이하의 조성물이 약 125 L 탱크에 존재한다. 일 구현예에서, 약 46.5 L의 조성물이 약 65 L 탱크에 존재한다. 다른 구현예에서, 약 68.1 L의 조성물이 약 125 L 탱크에 존재한다.
일 구현예에서, 진공은 약 46시간 내지 약 5일 동안 가해진다. 일 구현예에서, 진공은 약 2일 내지 약 4일 동안 가해진다.
II. 탈기 단계의 선정 이점
탈기 단계의 다양한 이점이 다음과 같이 기술될 수 있지만, 모든 이점이 모든 상황에 존재할 수 있는 것은 아니다. 일 양태에서, 탈기 단계는 재조합 단백질을 포함하는 조성물이 양압 하에 보관될 수 있도록 한다. 다른 구현예에서, 재조합 단백질을 포함하는 조성물은 계면활성제를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 재조합 단백질을 포함하는 조성물에 계면활성제가 첨가되지 않는다.
다른 양태에서, 탈기 단계는 재조합 단백질을 포함하는 조성물에서 기포의 축적을 방지한다. 이는 탈기 단계를 생략함으로써 평가될 수 있고, 탈기 단계의 생략은 재조합 단백질을 포함하는 조성물에서 기포의 축적을 초래한다. 다른 양태에서, 탈기 단계는 재조합 단백질을 포함하는 조성물로 바이알을 충전하기 위해 사용되는 충전 라인에서 기포의 축적을 방지한다. 이는 탈기 단계를 생략함으로써 평가될 수 있고, 탈기 단계의 생략은 재조합 단백질을 포함하는 조성물로 바이알을 충전하기 위해 사용되는 충전 라인에서 기포의 축적을 초래한다.
일 구현예에서, 탈기 단계는 재조합 단백질을 포함하는 조성물을 함유한 바이알의 공기-액체-기체 계면에서 입자의 침적을 방지한다. 이는 탈기 단계를 생략함으로써 평가될 수 있고, 탈기 단계의 생략은 재조합 단백질을 포함하는 조성물을 함유한 바이알의 공기-액체-유리 계면에서 입자의 침적을 초래한다. 일 양태에서, 입자의 침적은 재조합 단백질을 포함한다. 다른 구현예에서, 입자의 침적은 바이알 상에 링을 형성한다.
III. 재조합 단백질을 포함하는 조성물
본 공정은 재조합 단백질을 포함하는 복수의 조성물에 적용될 수 있다. 일 구현예에서, 재조합 단백질은 항체이다. 다른 구현예에서, 재조합 단백질은 RSV에 대한 항체이다.
일부 구현예에서, 항체는 시나지스(팔리비주맙)(메디뮨)이다. 시나지스는 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 F(융합) 단백질의 A 항원성 자리의 에피토프에 대해 특이성을 나타내는 재조합 인간화(키메라 쥐-인간) IgG1카파 단일 클론성 항체 당단백질이다. 시나지스는 안정적인 쥣과(마우스) 골수종 세포주(NSO)로부터 발현될 수 있다. 일부 상업적인 구현예에서, 시나지스는 두 개의 중쇄(각각 50.6 kDa)와 두 개의 경쇄(각각 27.6 kDa)로 이루어지며, 중량 기준 1~2%의 탄수화물을 함유하고, 147.7 kDa ± 1 kDa의 분자량(MALDI-TOF)을 나타낸다.
일부 구현예에서, 시나지스 항체는 아미노산 서열 SEQ ID NO:1을 나타내는 중쇄와 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 나타내는 경쇄를 가지고 있다. 일부 구현예에서, 시나지스 항체는 중쇄 아미노산 서열 SEQ ID NO:1의 중쇄 가변 부위 또는 중쇄 FAB 아미노산 서열 SEQ ID NO: 2 및 경쇄 아미노산 서열 SEQ ID NO:6의 경쇄 가변 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 시나지스 항체는 아미노산 서열 TSGMSVG(SEQ ID NO:3)을 나타내는 중쇄 H1 상보성 결정 부위(CDR), 아미노산 서열 DIWWDDKKDYNPSLKS(SEQ ID NO:4)을 나타내는 중쇄 H2 CDR, 아미노산 서열 SMITNWYFDV(SEQ ID NO:5)을 나타내는 중쇄 H3 CDR; 아미노산 서열 KCQLSVGYMH(SEQ ID NO:7)을 나타내는 경쇄 L1 CDR, 아미노산 서열 DTSKLAS(SEQ ID NO:8)을 나타내는 경쇄 L2 CDR 및 아미노산 서열 FQGSGYPFT(SEQ ID NO:9)을 나타내는 경쇄 L3 CDR을 포함한다. 시나지스 항체 및 그 아미노산 서열은 예를 들어, Johnson 등(1997, J.Infec.Dis 76:1215-1224) 및 미국 특허 5,824,307호에 개시되어 있고, 이들 모두는 시나지스 항체 및 그 아미노산 서열의 설명에 대한 참조로 통합된다.
일 구현예에서, 재조합 단백질은 모타비주맙(MEDI-524)이다. MEDI-524에 대한 VH 및 VL 서열은 US 6,818,216로부터 참조로 통합되고, 여기서, MEDI-524에 대한 서열은 다음 서열 위치에서 US 6,818,216의 서열 목록에 제공된 바와 같다: VH CDR1 (SEQ ID NO. 10), VH CDR2 (SEQ ID NO. 19), VH CDR3 (SEQ ID NO: 20), VL CDR1 (SEQ ID NO: 39); VL CDR2 (SEQ ID NO: 5); VL CDR3 (SEQ ID NO: 6).
일부 구현예에서, 분리되는 항체는 아달리무맙(휴미라(Humira®), 애보트래버러토리즈(Abbott Laboratories)), 에쿨리주맙(솔리리스(Soliris®), 알렉시온 파마큐티컬즈(Alexion Pharmaceuticals)), 리툭시맙(리티잔(Ritixan®), 로슈(Roche)/바이오젠 아이덱(Biogen Idec)/쥬가이(Chugai)), 인플릭시맙(레미케이드 (Remicade®), 존슨앤드존슨(Johnson & Johnson)/쉐링-플라우(Schering-Plough)/타나베(Tanabe)), 트라스투주맙(허셉틴(Herceptin®), 로슈/쥬가이), 베바시주맙(아바스틴(Avastin®), 쥬가이/로슈), 팔리비주맙(시나지스(Synagis®), 메디뮨/애보트), 알렘투주맙(캠퍼스(Campath®), 젠자임(Genzyme)) 및 모타비주맙(뉴맥스(Numax®), 메디뮨)으로부터 선택된 상업적으로 이용 가능한 상이한 항체이다.
일부 구현예에서, 본 방법을 이용하여 시나지스 이외의 항체들이 제조된다. 항체들은 또한 키메라, 단일 사슬 및 인간화 항체를 포함한다. 항체의 예로는 나탈리주맙(인간화 항-a4 인테그린 단일 클론성 항체)과 같은 상업화된 항체, 인간화 항-알파 V 베타 6 단일 클론성 항체, 인간화 항-VLA1 IgG1 카파 단일 클론성 항체; huB3F6(인간화 IgG1/카파 단일 클론성 항체)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 항체는 CD-3, CD-4, CD-8, CD-19, CD-20, CD-34, CD-52, HER-4, HER-3, HER-2, TNF 및/또는 VLA-4에 대한 재조합 단일 클론성 항체이다. 일부 구현예에서, 이러한 항체는 RSV의 F 단백질의 A 항원성 자리의 에피토프에 대한 재조합 단일 클론성 항체이다.
본원 방법에 의해 생성된 항체는 조류 및 포유류를 포함하는 임의의 동물 기원으로부터 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법에 의해 정제된 항체는 인간, 쥐(예컨대, 마우스와 랫트), 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니 피그, 낙타, 말 또는 닭일 수 있다. 본 출원에 사용된 "인간" 항체는 인간 면역 글로불린의 아미노산 서열을 나타내는 항체를 포함하고, 인간 면역 글로불린 라이브러리로부터 분리된 항체 또는 하나 이상의 인간 면역 글로불린에 대해 이식 유전자를 가진 동물로부터 분리되며 내인성 면역 글로불린을 발현하지 않는 항체를 포함한다. 예컨대, Kucherlapati 등의 미국 특허 번호 5,939,598 참조.
항체는 예컨대, 고유 항체, 온전한 단일 클론성 항체, 다클론성 항체, 적어도 두 개의 온전한 항체로부터 형성된 다중 특이적인 항체(예컨대, 이중 특이적 항체), 항체 단편(예컨대, 하나 이상의 항원과 결합하고/결합하거나 인식하는 항체 단편), 인간화 항체, 인간 항체(Jakobovits et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol.7:33 (1993); U.S.Pat.Nos.5,591,669 및 5,545,807), 항체 파지 라이브러리로부터 분리된 항체 및 항체 단편(McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks et al., J.Mol.Biol.222:581-597 (1991); Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Waterhouse et al., Nucl.Acids Res.21:2265-2266 (1993))을 포함할 수 있다. 항체는 N 말단 또는 C 말단의 이종 폴리펩티드에 재조합으로 융합되거나 폴리펩티드 또는 다른 조성물에 화학적으로 접합(공유적 및 비공유적 접합 포함)될 수 있다. 예를 들어, 항체는 검출 분석법에서 라벨로서 유용한 분자들 및 이종 폴리펩티드, 약물, 또는 독소와 같은 주효체(effector) 분자들에 재조합으로 융합되거나 접합될 수 있다. 예컨대, PCT 공개문 WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; 미국 특허 번호 5,314,995; 및 EP 396,387 참조.
다른 구현예에서, 재조합 단백질을 포함하는 조성물에서 재조합 단백질의 단백질 농도는 약 0.1 mg/mL 내지 약 1000 mg/mL, 약 10 mg/ml 내지 약 500 mg/ml, 약 50 mg/ml 내지 약 250 mg/ml, 약 75 mg/ml 내지 약 150 mg/ml이다. 일 구현예에서, 재조합 단백질 농도는 약 100 mg/mL이다. 다른 구현예에서, 재조합 단백질 농도는 약 10 mg/mL, 약 50 mg/ml, 약 75 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 125 mg/ml, 약 150 mg/ml, 약 250 mg/ml, 약 500 mg/ml, 약 1000 mg/ml이다.
IV. 제조 공정으로의 통합
본 탈기 방법은 재조합 단백질을 포함하는 조성물에 대한 여러 상이한 제조 공정에 통합될 수 있다. 여기서는 특정 제조 공정의 개요가 설명되지만, 본 탈기 방법은 다른 제조 공정에 포함되어 본원에 설명된 이점을 달성할 수 있다. 일 구현예에서, 탈기 방법이 사용되지 않을 경우 충전 라인에 기포가 존재하고/하거나 탈기 방법이 사용되지 않을 경우 바이알 또는 다른 용기 상에 링이 존재한다.
일 구현예에서, 조성물에 적어도 하나의 계면활성제가 존재한다. 일 구현예에서, 제조 공정은 조성물에 계면활성제를 첨가하지 않는다. 일 구현예에서, 조성물에 계면활성제가 존재하지 않는다.
일 구현예에서, 제조 공정의 개요는 WO2014071344A2에 설명되어 있고, 이는 벤조나아제의 부재 시 시나지스를 분리하는 방법에 대해 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
일 구현예에서, 제조 공정은 시나지스를 포함하는 조성물로부터 시나지스를 분리하는 방법을 포함하며, 이 방법은
a. 조성물에 대해 이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하는 단계;
b. 조성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하는 단계;
c. 조성물에 대해 여과 공정을 수행하는 단계; 및
d. 조성물로 바이알을 충전하기 전에 조성물에서 가스를 제거하는 단계를 포함하되,
시나지스를 포함하는 최종 생성물은 (a), (b), (c), 및 (d)로부터 기인하며, 최종 생성물은 인간에 투여하기에 적합하고 0.5 pg/mg 이하의 DNA 농도를 갖고, 이 방법은 조성물에 벤조나아제를 첨가하는 단계를 포함하지 않는다.
다른 구현예에서, 제조 공정은 시나지스를 포함하는 조성물로부터 시나지스를 분리하는 방법을 포함하며, 이 방법은
a. 조성물에 대해 양이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하여 시나지스를 포함하는 제1 생성물을 형성하는 단계;
b. 제1 생성물에 완충액을 첨가하여 완충된 생성물을 형성하는 단계;
c. 완충된 생성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하여 시나지스를 포함하는 제2 생성물을 형성하는 단계;
d. 제2 생성물에 대해 여과 공정을 수행하여 시나지스를 포함하는 제3 생성물을 형성하는 단계;
e. 제3 생성물에 대해 바이러스 불활성화 공정을 수행하는 단계;
f. 제3 생성물을 제형화하여 시나지스를 포함하는 최종 생성물을 형성하는 단계(최종 생성물은 인간에 투여하기에 적합하고 0.5 pg/mg 이하의 DNA 농도를 가짐); 및
g. 조성물로 바이알을 충전하기 전에 조성물에서 가스를 제거하는 단계를 포함하되,
이 방법은 조성물에 벤조나아제를 첨가하는 단계를 포함하지 않는다.
다른 양태에서, 제조 공정은 시나지스를 포함하는 조성물로부터 시나지스를 분리하는 방법을 포함하고, 이 방법은 (a)~(e) 중 적어도 세 단계를 포함하고, (f) 단계를 더 포함한다:
a. 조성물에 대해 양이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하는 단계;
b. 조성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하는 단계;
c. 조성물에 대해 한외여과 공정을 수행하는 단계;
d. 조성물에 대해 바이러스 불활성화 공정을 수행하는 단계;
e. 조성물에 대해 음이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하는 단계; 및
f. 조성물로 바이알을 충전하기 전에 조성물에서 가스를 제거하는 단계,
여기서, (i)~(v) 및 (vi) 중 적어도 세 단계로부터 기인하는 생성물은 시나지스를 포함하고, 인간에 투여하기에 적합하고, 0.5 pg/mg 이하의 DNA 농도를 갖고, 이 방법은 조성물에 벤조나아제를 첨가하는 단계를 포함하지 않는다.
항체의 분리 방법은 당해 기술 분야에 공지된 다양한 수단, 예컨대, 몇 가지만 언급하자면, 원심분리, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 여과 및 위의 조합을 포함할 수 있다. 정제 방법은 일반적으로 조성물 내에 항체와 공존하는 하나 이상의 불순물로부터 항체를 구분하는 항체의 특징을 기초로 하여 선택된다.
본 출원에 기술된 방법은 조성물에서 하나 이상의 불순물로부터 항체, 예컨대, 시나지스를 분리하기 위하여 이온 교환 크로마토그래피 공정을 활용할 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피 모두를 지칭한다. 본 출원의 목적을 위하여, "양이온 교환 크로마토그래피"는 항체 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 조성물이 양이온 교환 매트릭스를 이용하여 전하 차이를 기초로 분리될 수 있는 임의의 방법을 지칭한다. 양이온 교환 매트릭스는 일반적으로 공유적으로 결합된, 음으로 하전된 기들을 포함한다. 약한 또는 강한 양이온 교환 수지가 이용될 수 있다. 흔히, 강한 양이온 교환 수지는 pH에 따라 설폰산 또는 설폰산염 기를 포함하는 지지된 유기성 기들을 포함한다. 약한 양이온 교환 수지는 흔히 pH에 따라 카르복시산 또는 카르복시산염 기를 포함하는 지지된 유기성 기들을 포함한다. 특정 구현예에서, 다중 모드 양이온 교환 수지가 이용될 수 있는데, 이는 이온 상호작용뿐만 아니라 추가적인 결합 메커니즘, 예를 들어, 하나 이상의 수소 결합 상호작용 및 소수성 상호작용을 통합한다. 적절한 양이온 교환 수지의 예는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 프랙토겔(Fractogel®), 카르복시메틸(CM), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 인산염(P) 및 황산염(S), PROPAC WCX-10TM(디오넥스(Dionex)), 캡토(CaptoTM) S, S-세파로오스(Sepharose) FF, 프랙토겔(Fractogel®) EMD SO3M, 토요펄(Toyopearl®) 메가캡(Megacap®) II SP 550C, 포로스(Poros®) 50 HS 및 SP-세파로오스(sepharose) 매트릭스를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 양이온 수지는 캡토 S, S-세파로오스 FF, 프랙토겔 EMD SO3M, 토요펄 메가캡 II SP 550C, 포로스 50 HS로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 양이온 수지는 포로스 50 HS이다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 양이온 교환 크로마토그래피 공정이 조성물에 대해 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 공정은 항체에 대해 결합 모드로 이용된다. 즉, 양이온 교환 크로마토그래피 공정은 관심 있는 항체가 양이온 교환 매트릭스에 흡착되나, 하나 이상의 불순물은 흡착되지 않아, 불순물로부터 항체를 분리하는 방식으로 이용된다. 일부 구현예에서, 흡착된 항체가 양이온 교환 매트릭스로부터 제거되기 전에 추가적인 불순물을 제거하기 위하여 양이온 교환 매트릭스는 완충액으로 1회 이상 세척된다. 결합 모드로 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 하나 이상의 불순물이 조성물로부터 제거된 후, 흡착된 항체를 양이온 교환 매트릭스로부터 용리시킬 수 있다. 양이온 교환으로부터 항체를 용리시키는 방법은 매트릭스에 따라 다르며, 당업자에게 공지되어 있다.
대안적으로, 일부 구현예에서, 양이온 교환 공정은 관류(flow-thru) 모드로 이용될 수 있다. 즉, 양이온 교환 공정은 관심 있는 항체가 양이온 교환 매트릭스에 흡착되지 않고, 하나 이상의 불순물이 매트릭스에 흡착되어, 불순물로부터 항체를 분리하는 방식으로 이용된다. 관류 모드에서는, 하나 이상의 불순물이 양이온 교환 매트릭스에 흡착(또는 양이온 교환 매트릭스에 의해 저지)되고, 항체는 매트릭스 사이를 통과하여 관류 용액으로 흐른다.
일부 구현예에서, 이온 교환 크로마토그래피 공정은 음이온 교환 크로마토그래피 공정이다. 본 출원의 목적을 위해, "음이온 교환 크로마토그래피"는 항체 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 조성물이 음이온 교환 매트릭스를 이용하여 전하 차이를 기초로 하여 분리될 수 있는 임의의 방법을 지칭한다. 음이온 교환 매트릭스는 일반적으로 공유적으로 결합된, 양으로 하전된 기들을 포함한다. 강한 또는 약한 음이온 교환 매트릭스가 이용될 수 있다. 강한 음이온 교환 매트릭스의 예로는 예컨대, 4차 암모늄 이온을 가지고 있는 것들을 포함한다. 약한 음이온 교환 매트릭스의 예로는 예컨대, DEAE(디에틸아미노에틸)과 같은, 3차 또는 2차 아민 기능성 기를 가지고 있는 것들을 포함한다. 특정 구현예에서는, 다중 모드 음이온 교환 매트릭스가 이용될 수 있는데, 이는 이온 상호작용뿐만 아니라 추가적인 결합 메커니즘, 예를 들어, 하나 이상의 수소 결합 상호작용 및 소수성 상호작용을 통합한다. 적절한 음이온 교환 매트릭스의 예는 당해 분야에 공지되어 있으며, 수퍼(Super) Q, 사르토바인드(Sartobind®) Q, 나트릭스(Natrix®) Q, 크로마조브(ChromasorbTM) Q 및 머스탱(Mustang®) Q를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 음이온 교환 매트릭스는 수퍼 Q이다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 음이온 교환 공정이 조성물에 대해 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 공정은 항체에 대해 결합 모드로 이용된다. 즉, 음이온 교환 크로마토그래피 공정은 관심 있는 항체가 음이온 교환 매트릭스에 흡착되나, 하나 이상의 불순물은 결합하지 않아, 불순물로부터 항체를 분리하는 방식으로 이용된다. 일부 구현예에서, 흡착된 항체가 음이온 교환 매트릭스로부터 제거되기 전에 추가적인 불순물을 제거하기 위하여 음이온 교환 매트릭스는 완충액으로 1회 이상 세척된다. 결합 모드로 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 하나 이상의 불순물이 조성물로부터 제거된 후, 흡착된 항체를 음이온 교환 매트릭스로부터 제거할 수 있다.
일부 구현예에서, 음이온 교환 공정은 관류 모드로 이용된다. 즉, 음이온 교환 공정은 관심 있는 항체가 음이온 교환 매트릭스에 실질적으로 흡착되지 않고, 하나 이상의 불순물이 매트릭스에 흡착(또는 저지)되어, 불순물로부터 항체를 분리하는 방식으로 이용된다. 하나 이상의 불순물이 관류 모드의 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 조성물로부터 제거된 후, 흡착된 항체는 음이온 교환 매트릭스의 관류로부터 얻어질 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법은 둘 이상의 이온 교환 공정, 예컨대, 제2의 이온 교환 공정을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 이온 교환 공정은 양이온 교환 공정이고, 제2 이온 교환 공정은 음이온 교환 공정이다. 일부 구현예에서, 세 가지의 이온 교환 크로마토그래피 공정이 이용된다.
본 출원에 기술된 방법은 조성물 내의 하나 이상의 불순물로부터 항체를 분리하기 위하여 친화도 정제 공정을 활용할 수 있다. 본 출원에 사용된 바와 같이, "친화도 정제 공정" 또는 "친화도 크로마토그래피"는 항체에 대한 친화도 리간드와의 특이적인 결합 성질에 의해 항체가 정제되는 분리 방법을 지칭한다. 일부 구현예에서, 기능적인 친화도 리간드는 고체 또는 반고체 지지체 상에 고정될 수 있으며, 따라서 항체를 포함하는 조성물이 리간드 및 고체 지지체 위로 통과될 때, 리간드에 대해 특이적인 결합 친화도를 나타내는 항체는 리간드에 흡착되고, 조성물의 하나 이상의 다른 성분들은 흡착되지 않거나 낮은 친화도로 결합되어, 항체로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드를 포함하는 고체 지지체는, 흡착된 항체가 리간드 및 지지체로부터 제거되기 전에, 추가적인 불순물을 제거하기 위하여 완충액으로 1회 이상 세척된다. 하나 이상의 불순물이 제거된 후에, 흡착된 항체는 리간드 및 지지체로부터 제거될 수 있으며, 그 결과, 본래의 조성물로부터 항체의 분리가 일어난다.
리간드 및 지지체로부터 항체를 제거하는 방법은 리간드에 따라 다르며, 당업자에게 공지되어 있고, 예컨대, 환경, 예컨대, pH의 변화, 카오트로픽제(chaotropic agent) 또는 변성제의 첨가, 또는 상업적으로 이용 가능한 용리 완충액의 첨가를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 친화도 정제 공정이 항체를 포함하는 조성물에 대해 이용될 수 있다.
다양한 친화도 정제 공정이 당해 분야에 공지되어 있으며, 리간드로서 단백질 A, 단백질 G, 또는 이의 조합을 이용하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 리간드는 다양한 지지체, 예컨대, 수지 상에 고정될 수 있다. 일부 구현예에서, 친화도 정제 공정은 예컨대, 단백질 A 정제 공정을 포함할 수 있는데, 이때, 항체는 단백질 A에 흡착되고, 단백질 A는 고정된 지지체, 예컨대, 수지와 결합된다. 다양한 단백질 A 친화도 시스템이 상업적으로 이용 가능하며, 맵셀렉트(MabSelectTM), 맵셀렉트 슈어(MabSelectTM SuReTM), 맵셀렉트 엑스트라(MabSelect XtraTM), 세파로오스(Sepaharose) CL-4B, 프로셉(ProSep®) vA, 프로셉(ProSep®) vA 울트라(Ultra), 세라믹(Ceramic) HyperD® 및 포로스 맵셀렉트(Poros® MabSelectTM)를 포함한다. 일부 구현예에서, 친화도 정제 공정은 예컨대, 단백질 G 정제 공정을 포함하는데, 이때, 항체는 단백질 G에 흡착되고, 단백질 G는 고정된 지지체, 예컨대, 수지에 결합된다. 즉시 사용 가능한 수지 및 정제 키트가 당업자에게 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 리간드는 고정된 지지체에 결합된 항원, 예컨대, 펩타이드 또는 햅텐으로, 이때, 항체는 이러한 항원에 선택적으로 흡착된다. 활성화된 수지 및 다양한 화학을 통한 고정된 항원을 제조하는 완성 키트는 당업자에게 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 다른 리간드가 이용될 수 있으며, 당해 분야에 공지되어 있다. 예컨대, 참고 교재 Affinity Separations: A Practical Approach (Practical Approach Series), Paul Matejtschuk (Editor), Irl Pr (1997); 및 Affinity Chromatography, Herbert Schott, Marcel Dekker, New York (1997) 참고. 예를 들어, 친화도 리간드는 항체 및 항체 단편, (예컨대, 특정 수용체에 대한) 자연적인 리간드 또는 리간드 유사체 및 (예컨대, 다중 서브유닛 복합체에 대한) 자연적인 결합 상대 또는 이의 유사체를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 이러한 조성물은 여러 사이클의 친화도 정제 공정을 거친다.
본 방법은 조성물의 하나 이상의 불순물로부터 항체를 분리하기 위하여 여과 공정을 활용할 수 있다. 용어 "여과 공정" 및 "여과"는 조성물을 소정의 공극 직경의, 하나 이상의 반투과성 여과기(또는 막 또는 매체) 사이로 통과시켜 조성물로부터 부유 입자들을 제거하는 공정을 지칭하는데, 이때, 더 큰 분자들(일반적으로 >103~106 Da)은 여과기 상에 보유되지만, 물과 그보다 작은 분자량의 분자들은 여과기 사이를 통과한다.
일부 구현예에서, 여과 후, 항체는 실질적으로 투과물(permeate) 스트림에 있지만(즉, 본 발명의 항체는 여과기 공극 사이를 통과하여 수집된다), 불순물(예컨대, 세포 파편, DNA 및/또는 숙주 세포 단백질)은 실질적으로 투과유물(retentate) 스트림에 있다. 일부 구현예에서, 여과 후, 항체는 실질적으로 투과유물 스트림에 있지만, 불순물은 실질적으로 투과물 스트림에 있다. 여과를 지칭할 때 용어 "투과물 스트림"은 여과 중에 여과기 공극 사이로 통과하는 조성물의 분획을 지칭한다. 여과를 지칭할 때 용어 "투과유물 스트림"은 여과기 상에 남아있거나 여과 중에 여과기 공극 사이를 통과하지 않는 조성물의 분획을 지칭한다.
적절한 유형의 여과 장치가 당업자에게 공지되어 있으며, 다양한 요인, 예컨대, 여과되는 항체의 분자량, 여과되는 조성물의 성분들의 양과 크기, 여과되는 조성물의 부피 및 여과되는 조성물의 세포 밀도 및 생존 능력을 기초로 하여 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 막 한외여과기, 플레이트 한외여과기, 카트리지 한외여과기, 백(bag) 한외여과기 또는 진공 한외여과기와 같은 여과기가 이용될 수 있다. 이용될 수 있는, 상업적으로 이용 가능한 한외여과기는 밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation, 미국 매사추세츠 주 빌러리카), 폴 코포레이션(Pall Corporation, 미국 뉴욕 주 이스트힐), GE 헬스케어 사이언스(GE Healthcare Sciences, 미국 뉴저지 주 피스카타웨이) 및 사르토리우스 코포레이션(Sartorius Corporation, 독일 괴팅겐)과 같은 다양한 판매회사에 의해 제조된다.
다른 형태에서, 한외여과 공정은, 조성물에 재조합 단백질을 유지하고 한외여과 장치를 통해 용질이 흐를 수 있도록 하여 농축하는 공정을 포함한다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 바이러스 불활성화 공정을 더 포함한다. 본 출원에 사용된 바와 같이, "바이러스 불활성화 공정"은 (1) 바이러스의 불활성화, (2) 바이러스의 물리적 제거 또는 (3) 이의 조합을 지칭한다. 바이러스의 불활성화를 지칭할 때, 이러한 바이러스는 최종 생성물에 남아 있을 수 있으나, 비감염형으로 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 바이러스 불활성화 공정은 예컨대, 바이러스를 불활성화하기에(예컨대, 변성시키에) 충분한 낮은 pH에, 조성물을 배양하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 불활성화 공정은 조성물의 pH를 약 5.0 이하, 약 4.5 이하, 약 4.0 이하 또는 약 3.5 이하의 pH까지 조정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물의 pH는 약 1.0 내지 약 5.0, 약 1.5 내지 약 4.5, 약 2.0 내지 약 4.0 또는 약 2.5 내지 약 3.5까지의 pH로 조정된다. 일부 구현예에서, 이러한 바이러스 불활성화 공정은 약 4.0, 약 2.8 내지 약 3.2 또는 약 3.0 미만의 pH에서 조성물을 배양하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 바이러스 불활성화 공정은 4.0 미만의 pH에서 항체를 포함하는 조성물을 배양하는 것을 포함한다.
조성물의 pH는 바이러스 불활성화가 일어나기에 충분한 다양한 시간 길이, 예컨대, 약 1분 내지 약 2시간, 또는 약 10분 내지 약 90분, 약 20분 내지 약 80분, 약 25분 내지 약 35분, 또는 약 30분 동안 낮춰질 수 있다. pH를 변경하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 이러한 바이러스 불활성화 공정은 용매 또는 세제 처리, 방사선 조사 및/또는 바이러스를 불활성화하기에 충분히 높은 온도에 잠시 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 이러한 수단에 의한 바이러스 불활성화 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 당업자라면 항체 분리 중에 이용될 적절한 처리법을 선택할 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 불활성화 공정은 나노 여과를 이용하여 조성물로부터 바이러스를 물리적으로 제거하는 것을 포함할 수 있다. 용어 "나노 여과"는 조성물을 매트릭스, 예컨대, 여과기, 막 등 사이로 물리적으로 통과시켜, 조성물의 항체가 하나 이상의 바이러스로부터 분리되도록 하는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 나노 여과는 조성물을 75 nm, 50 nm, 40 nm, 35 nm, 30 nm, 25 nm, 20 nm 또는 15 nm 미만의 공극 크기를 나타내는 매트릭스 사이로 통과시키는 것을 포함한다. 다양한 나노 여과기를 상업적으로 이용할 수 있고, 당해 분야에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 예컨대, (1) 조성물을 4.0 미만의 pH에 배양하는 것을 포함하는 바이러스 불활성화 공정 및 (2) 조성물을 나노 여과 공정의 대상으로 하는 것을 포함하는 바이러스 불활성화 공정의, 두 가지의 개별적인 바이러스 불활성화 공정이 활용된다. 일부 구현예에서, 세 가지 이상의 개별적인 바이러스 제거 공정이 활용된다.
분리 공정 중에 다양한 완충액 시스템이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 완충액은 MES 완충액, 트리스(Tris) 완충액, 인산나트륨 완충액, 프탈산염 완충액, 시트르산염 완충액, 아세트산염 완충액 및 이의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 이러한 완충액은 트리스 완충액, 선택적으로는 트리스/마그네슘 완충액이다.
실시예
실시예 1. A 65 L 탱크 탈기 실험
탈기에 미치는 진공, 부피, 및 시간의 영향을 결정하기 위한 연구를 수행하였다. 65 L 탱크를 사용하여, 약물을 깨끗한 탱크에 여과시키고, 20 psig로 가압하고, 2~8℃에서 1주 동안 보관하여 용존 산소를 증가시켰다. 탈기를 위해, 진공을 가해 목표 진공을 달성하고, 밸브를 잠그고 지정된 기간 동안 가스를 제거하였다.
탱크 배출구는 피스톤 펌프 유입구에 직접 부착하였다. 펌프 배출구로부터, 바이알의 충전을 모사하기 위해 용기를 충전할 노즐까지 투명 튜브 라인을 연장하였다. 라인은 거꾸로 된 U 형상으로 구성되었다. 라인에 기포를 확실히 없애기 위해 충전 시작 시 튜브 라인을 퍼징하였다. 충전을 시작하고, 루프 및 펌프 배출구에서의 기포 형성을 모니터링하였다. 처음 기포가 형성된 순간에 분배된 약물의 시간과 부피도 기록하였다.
실시예 2. 65 L 탱크 내 40 L 용액의 탈기에 미치는 진공의 영향
실시예 1의 프로토콜을 따라, 1 mg/ml의 MEDI-524를 포함하는 조성물의 탈기에 미치는 진공의 영향을 평가하였다. 탈기 압력은 99, 268, 및 505 mbar의 값으로 변화시켰다. 탈기 시간은, 아래 표에 명시된 바와 같이, 1 내지 4일에 걸쳐 이어졌다.
| 진공 | 99 mBar | 268 mBar | 505 mBar |
| 탈기 시간(hr) | 46 | 72 | 94 |
| 충전 라인 기포 | 없음 | 없음 | 있음 |
505 mbar로 탈기된 조성물에서 기포가 관찰되었다. 이는 용액에서 가스를 제거하기 위해 진공과 시간의 조합이 사용될 수 있고 더 오랜 시간이라도 약한 진공은 가스 제거에 효율적이지 않을 수 있음을 보여준다.
실시예
3. 2일의 기간에 걸친 65 L 탱크 내 40 L 용액의
탈기에
미치는 진공의 영향
실시예 1의 프로토콜을 따라, 1 mg/ml의 MEDI-524를 포함하는 조성물의 탈기에 미치는 진공의 영향을 평가하였다. 탈기 압력은 99 및 268 mbar의 값으로 변화시켰다. 아래 나타낸 바와 같이, 정확한 시간은 샘플들 간에 약간 달랐지만, 2일의 기간에 걸쳐 탈기를 수행하였다.
| 압력 | 99 mbar | 268 mbar |
| 탈기 시간(hr) | 46 | 48 |
| 충전 라인 기포 | 없음 | 있음 |
99 mbar로 탈기된 조성물에서는 기포가 관찰되지 않았지만, 268 mbar로 탈기된 조성물에서는 상당량의 기포가 관찰되었다. 도 1의 A와 B는 충전 라인을 나타내며, 도 1의 A는 268 mbar로 탈기된 조성물에 대한 충전 공정 시작 시 충전 라인의 사진을 나타내고, 도 1의 B는 268 mbar로 탈기된 조성물에 대한 충전 공정의 종료(8.4 kg 충전) 사진을 나타낸다. 피스톤 펌프 하류 충전 라인에서의 기포는 상업적 제조 및 바이알 충전 공정에서 충전 무게 변화를 초래할 수 있고, 충전 중단 및 라인 퍼징을 필요로 할 수 있다. 이는 상당한 제품 손실을 초래할 수 있다.
실시예 4. 탈기에 미치는 부피의 영향
실시예 1의 프로토콜을 따라, 1 mg/ml의 MEDI-524를 포함하는 조성물의 탈기에 미치는 부피의 영향도 평가하였다. 탈기 압력은 99 및 268 mbar의 값으로 변화시켰다. 탈기 시간은 72시간(268 mbar 탈기 압력의 경우) 내지 46시간(99 mbar 탈기 압력의 경우)에 걸쳐 이어졌다.
| 진공(mbar) | 268 | 99 | ||
| 부피 | 40 L | 60 L | 40 L | 60 L |
| 탈기 시간(hr) | 72 | 72 | 46 | 46 |
| 충전 라인 기포 | 없음 | 있음 | 없음 | 있음 |
60 L 용액의 경우, 99 mbar 샘플 및 268 mbar 샘플 모두에 대해 충전 시작부터 충전 라인 기포가 관찰되었다. 분배 부피가 증가함에 따라 기포 또한 증가하였다. 데이터는 부피가 용액 탈기 능력에 영향을 미칠 수 있음을 보여준다.
도 2의 A와 B는 약 400 mL 충전(도 2의 A) 및 약 1400 mL 충전(도 2의 B)에서의 충전 라인 기포를 나타낸다. 268 mbar로 탈기된 조성물에 대한 충전 공정에서 나중에 더 많은 기포가 육안상 분명히 나타난다.
실시예 5. 탈기에 미치는 시간의 영향
실시예 1의 프로토콜에 따라, 1 mg/ml의 MEDI-524를 포함하는 조성물의 탈기에 미치는 시간의 영향을 40 L의 일정한 용액 부피와 99 mbar의 일정한 압력에서 또한 평가하였다. 탈기 시간은 24시간과 46시간(대략 1일 또는 2일을 모사)에서의 조건으로 변화시켰다.
| 부피 | 40 L | 40 L |
| 탈기 시간(hr) | 24 | 46 |
| 충전 라인 기포 | 있음 | 없음 |
1일간 탈기된 조성물에 대한 충전 라인의 사진을 도 3의 A와 B에 나타내었고, 여기서 도 3의 A는 약 300 mL 충전 시 충전 라인의 사진을 나타내고, 도 3의 B는 약 650 mL 충전 시 충전 라인의 사진을 나타낸다. 약 650 mL 충전 시점에 더 많은 기포가 가시화될 수 있다.
실시예 6. 탈기에 미치는 단백질 농도의 영향
실시예 1의 프로토콜에 따라, 조성물의 탈기에 미치는 단백질 농도의 영향을 40 L의 일정한 용액 부피와 99 mbar의 일정한 압력에서 2일의 시간 동안(실제 시간은 아래 나타낸 바와 같이 약간 다름) 또한 평가하였다. 1 mg/ml 농도(MEDI-524)와 100 mg/ml(시나지스) 모두 평가하였다. 어느 시험 조건에서도 기포가 관찰되지 않았다. 결과를 표 6에 나타내었다.
| 단백질 농도 | 1 mg/mL | 100 mg/mL |
| 탈기 시간(hr) | 46 | 47.5 |
| 충전 라인 기포 | 없음 | 없음 |
이는 단백질 농도가 충전 라인에서의 기포 형성에 영향을 주지 않거나 최소한의 영향을 미친다는 것을 보여준다.
실시예 7. 기포 지표의 적용으로부터 탈기 예측
기포 형성의 사건을 예측하기 위해 다음 파라미터들을 고려하였고 기포 지표 식에 적용하였다.
BI = (ha * t * 1000)/(hl * P * V)
용액의 부피(V, mL 단위)
탈기 진공(P, mbar 단위)
탈기 시간(t, hr 단위)
액체의 높이(hl, cm 단위) - 원통형 탱크로 가정하여 계산
공기/헤드스페이스의 높이(ha, cm 단위)
다양한 실험 조건에 대해 기포 지표를 계산하였고, 탈기 후 충전 라인에 기포가 존재하는지에 대한 실제 실험적 관찰과 비교하였다. 결과를 표 7에 나타내었다. 특별히 언급하는 경우를 제외하고, 탈기는 65 L 탱크에서 수행하였다.
| 부피 (L) | 진공 (mBar) | 탈기 시간 (일) | 기포 (있음/없음) | B.I | |
| 1 mg/mL MEDI-524 (개발) | 40 | 99 | 1 | 있음 | 5.5 |
| 40 | 99 | 2 | 없음 | 10.6 | |
| 40 | 268 | 3 | 없음 | 5.9 | |
| 40 | 505 | 4 | 있음 | 4.1 | |
| 60 | 268 | 3 | 있음 | 1.1 | |
| 60 | 99 | 2 | 있음 | 1.9 | |
| 시나지스 실행(개발) | 38.8 | 99 | 2 | 없음 | 10.6 |
| 45.1 | 133 | 3 | 없음 | 7.0 | |
| 68.1* | |||||
| 시나지스 제조 시설에서 실행 |
40 | 100 | 3 | 없음 | 15.8 |
| 45.2* | 100 | 3 | 없음 | 28.4 | |
| 24.6 | 100 | 3 | 없음 | 60 | |
| 44.8* | 100 | 3 | 없음 | 29 | |
| 46.2* | 100 | 3 | 없음 | 26.8 | |
| 26.5 | 100 | 3 | 없음 | 49.7 | |
| 44.4* | 100 | 3 | 없음 | 29.8 | |
| 45.3* | 100 | 3 | 없음 | 28.2 | |
| 29.4 | 100 | 3 | 없음 | 37.9 |
* 65 L 탱크 대신 125 L 탱크에서 탈기를 수행하였음.
이 데이터에 기초하면, 적어도 약 5.9의 기포 지표가 충전 라인에서 기포를 생기게 하지 않을 것으로 예상된다.
실시예 8. 시나지스 링 조사
시나지스 바이알, 즉 예를 들어 50 mg 바이알과 100 mg 바이알에서 링이 관찰되었다. 이는, 도 4에서 지시 화살표의 왼쪽으로 바이알 유리 상에 실질적으로 수평으로 나타난 흰색 링으로 도시된 바와 같이, 유리 벽의 측면에 단단히 부착된 공기-액체 계면에 위치한 매우 희미한 흰색 링으로 나타난다.
조사에서 다음과 같은 요인들이 결정되었다:
* 용존 가스 및 기포는 시나지스에 대한 약물 공정에 내재되어 있다;
* 기포의 존재 및 계면활성제의 부재는 바이알에 링 형성을 초래한다;
* 의약품 충전 마무리 공정은 링 형성에 영향을 주지 않고, 링은 탱크로부터 직접 손으로 충전된 약물에 대해 형성된다;
* 링의 존재는 제품 품질에 영향을 주지 않지만, 시각적으로 문제가 되는 외관 불량일 수 있다;
* 트립신 증해에 의한 링 분리는 링 내 단백질이 시나지스임을 보여준다;
* 링 형성은 소규모로 재현 가능하다.
그러나, 인라인 기포는 링 형성을 나타내는 것보다 더 많은 분자로 나타나기 때문에 기포 형성과 인라인 기포의 문제가 링 형성과 연관될 것으로 예상되지는 않는다.
놀랍게도, 탈기는 링 형성을 방지하는 것으로 나타났다. 도 5는 탈기된 약물 및 탈기되지 않은 약물로부터 생성된 파일럿 규모 배치의 육안 검사 결과를 나타낸다. 각각 약 20 L의 팔리비주맙 DS를 함유한 2개의 65 L 스테인리스 스틸 탱크를 본 연구에 사용하였다. 하나의 탱크는 양압 하에 보관하였고(탈기되지 않은 약물), 두 번째 탱크는 진공 하에 보관하였다(탈기된 약물). 탈기된 DS와 탈기되지 않은 DS 모두를 스테인리스 스틸 로터리 피스톤 펌프가 있는 M&O Perry 여과기를 사용하여 3 cc 투명 라인 유리 바이알에 충전하였다. 약 387개의 바이알을 탈기된 DS로 충전하였고, 389개의 바이알을 탈기되지 않은 DS로 충전하였다. 충전 후 48시간, 7일, 및 2개월에 모든 바이알을, 링을 발견하기 위해 흑백 배경에 대고 육안 검사하였다.
실시예 9. 시나지스 링 조성
시나지스 바이알의 벽에 형성된 링의 조성을 결정하기 위한 평가를 수행하였다. FTIR을 사용하여 여과기 표면에 채취된 링 분리물을 확인하였다. 전술한 바와 같이 제조된 샘플을 FTIR 현미경을 이용하여 분석하였다. 채취물은 단백질(아미드-I 대역: 1600~1700 cm-1 및 아미드-II 대역: 1510~1580 cm-1) 및 폴리디메틸 실록산(1260 cm-1)과 일치하는 IR 특징을 나타냈다. 아미드 II 대역의 2차 미분은 고유의 IgG 분자에서 일반적으로 관찰되는 고유의 베타 시트 구조에 해당하는 1638 cm-1에서 주된 대역을 나타냈다. 이 결과는 링 단백질이 고유의 베타 시트 구조로 구성된다는 것을 나타낸다. 열 또는 전단 응력 IgG1은 2차 미분의 주 피크를 1628 cm-1로 이동시킬 것이며, 이는 분자간 상호작용이 응집(가용성 또는 불용성)과 함께 나타났음을 보여준다. FTIR은 링이 단백질과 실리콘 오일을 함유한다는 것을 보여준다.
링으로부터 분리된 단백질의 2차 구조를 아미드-I 피크의 2차 미분 분석에 의해 평가하였다. 링 분리물의 단백질은 FTIR로 측정된 고유의 형태를 가지고 있다. 결과를 도 6에 나타내었다.
링 내 단백질에 대해 트립신 증해를 수행하였다. 바이알을 제형 완충액으로 조심스럽게 세척하고, 별도의 분액을 사용하여 볼텍싱과 강력한 피펫팅에 의해 링을 분리하였다. 그리고 나서, 0.2 μm 여과기를 통해 채취물을 여과하고, 세척하고 건조시켰다. 여과기를 37℃의 구아니딘 용액에서 배양하였고, 트립신 증해 전에 용액을 환원 및 알킬화시켰다. UV(Abs 220 nm)와 질량(질량 분석, MS에 의함)을 모니터링하는 C18 컬럼을 사용하여 트립신 증해를 분리하였다. (아미노산 조성에 해당하는) 질량 및 (MS/MS를 이용한) 분열 패턴에 의해 트립신 펩타이드를 표준 시료에 대해 확인하였다. 완충액은 단독으로 대조물로서 여과기에 적용되었다. 결과를 도 7에 나타내었다. 트립신 증해는 링 내 단백질이 시나지스임을 보여준다.
실시예 10. 계면활성제는 링 형성을 방지할 수 있다
계면활성제 PS-80(0.02%)가 있거나 없는 약물을 가압하여 용존 가스 및 기포를 증가시켰다. 스테인리스 스틸 로터리 피스톤 펌프가 있는 M&O Perry 여과기를 사용하여 바이알을 충전하였다. 약 160 mL의 팔리비주맙 DS를 2개의 250 mL PETG 용기 각각에 여과하였다. 용기 중 하나에는 0.02% 폴리소르베이트 80(PS-80)을 첨가하였다. 두 PETG 용기를 맞춤형 스테인리스 스틸 탱크에 넣고 공기로 20 psig까지 가압하였다. 탱크를 회전 교반기 상에서 2~8℃에 약 43시간 동안 보관하여 용존 가스/기포를 증가시켰다. B&S 로터리 피스톤 펌프가 있는 M&O Perry 충전을 사용하여 약 112개의 바이알을 각각의 PETG 용기로부터 3 cc 바이알에 충전하였다. 바이알을 각각 56개의 바이알로 이루어진 두 세트로 나누고, 충전 후 2일 및 7일에 링을 발견하기 위해 흑백 배경에 대고 육안 검사하였다. 대조 바이알은 모두 링이 있었고, PS-80이 첨가된 바이알에는 링이 없었다. PS-80이 첨가된 약물과 대조물 모두 충전 라인에서 기포가 관찰되었다. 이는 PS-80이 공기-액체 계면(기포)에 단백질이 흡수되는 것을 방지한다는 가설을 뒷받침한다.
실시예 11. 구현예
다음 항목들은 복수의 가능한 구현예를 나타낸다.
항목 1. 재조합 단백질을 포함하는 조성물을 함유하는 바이알을 제조하는 방법으로서,
a. 재조합 단백질을 포함하는 조성물을 함유한 용기(선택적으로, 용기는 양압 하에 보관되었음)를 제공하는 단계;
b. 용기에 진공을 가하는 단계;
c. 진공이 조성물에서 가스를 제거하도록 하는 단계; 및
d. 재조합 단백질을 포함하는 탈기된 조성물로 바이알을 충전하는 단계를 포함하는, 방법.
항목 2. 항목 1에 있어서, 재조합 단백질은 시나지스인 방법.
항목 3. 시나지스를 포함하는 조성물로부터 시나지스를 분리하는 방법으로서,
a. 조성물에 대해 이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하는 단계;
b. 조성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하는 단계;
c. 조성물에 대해 한외여과 공정을 수행하는 단계;
d. 조성물로 바이알을 충전하기 전에 조성물에서 가스를 제거하는 단계를 포함하는 방법,
여기서, 시나지스를 포함하는 최종 생성물은 (a), (b), 및 (c)로부터 기인하며, 최종 생성물은 인간에 투여하기에 적합하고 0.5 pg/mg 이하의 DNA 농도를 갖고, 이 방법은 조성물에 벤조나아제를 첨가하는 단계를 포함하지 않는다.
항목 4. 시나지스를 포함하는 조성물로부터 시나지스를 분리하는 방법으로서,
a. 조성물에 대해 양이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하여 시나지스를 포함하는 제1 생성물을 형성하는 단계;
b. 제1 생성물에 완충액을 첨가하여 완충된 생성물을 형성하는 단계;
c. 완충된 생성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하여 시나지스를 포함하는 제2 생성물을 형성하는 단계;
d. 제2 생성물에 대해 여과 공정을 수행하여 시나지스를 포함하는 제3 생성물을 형성하는 단계;
e. 제3 생성물에 대해 바이러스 불활성화 공정을 수행하는 단계;
제3 생성물을 제형화하여 시나지스를 포함하는 최종 생성물을 형성하는 단계(최종 생성물은 인간에 투여하기에 적합하고 0.5 pg/mg 이하의 DNA 농도를 가짐); 및
f. 조성물로 바이알을 충전하기 전에 조성물에서 가스를 제거하는 단계를 포함하되,
조성물에 벤조나아제를 첨가하는 단계를 포함하지 않는 방법.
항목 5. 시나지스를 포함하는 조성물로부터 시나지스를 분리하는 방법으로서, (a)~(e) 중 적어도 세 단계를 포함하고, (f) 단계를 더 포함하는 방법:
a. 조성물에 대해 양이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하는 단계;
b. 조성물에 대해 친화도 정제 공정을 수행하는 단계;
c. 조성물에 대해 한외여과 공정을 수행하는 단계;
d. 조성물에 대해 바이러스 불활성화 공정을 수행하는 단계;
e. 조성물에 대해 음이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행하는 단계; 및
f. 조성물로 바이알을 충전하기 전에 조성물에서 가스를 제거하는 단계,
여기서, (i)~(v) 중 적어도 세 단계로부터 기인하는 생성물은 시나지스를 포함하고, 인간에 투여하기에 적합하고, 0.5 pg/mg 이하의 DNA 농도를 갖고, 이 방법은 조성물에 벤조나아제를 첨가하는 단계를 포함하지 않는다.
항목 6. 항목 3 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 조성물로 바이알을 충전하기 전에 조성물에서 가스를 제거하는 단계는,
a. 재조합 단백질을 포함하는 조성물을 함유한 용기(선택적으로, 용기는 양압 하에 보관되었음)를 제공하는 단계;
b. 재조합 단백질을 포함하는 조성물을 함유한 용기에 진공을 가하는 단계;
c. 진공이 조성물에서 가스를 제거하도록 하는 단계; 및
d. 재조합 단백질을 포함하는 탈기된 조성물로 바이알을 충전하는 단계를 포함하는, 방법.
항목 7. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 조성물은,
a. 아미노산 서열 SEQ ID NO:1을 나타내는 중쇄 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 나타내는 경쇄;
b. SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 중쇄 가변 부위 및 경쇄 SEQ ID NO:6의 경쇄 가변 부위; 또는
c. 아미노산 서열 TSGMSVG(SEQ ID NO:3)을 나타내는 H1 상보성 결정 부위(CDR), 아미노산 서열 DIWWDDKKDYNPSLKS(SEQ ID NO:4)을 나타내는 H2 CDR, 아미노산 서열 SMITNWYFDV(SEQ ID NO:5)을 나타내는 H3 CDR; 아미노산 서열 KCQLSVGYMH(SEQ ID NO:7)을 나타내는 L1 CDR, 아미노산 서열 DTSKLAS(SEQ ID NO:8)을 나타내는 L2 CDR, 및 아미노산 서열 FQGSGYPFT(SEQ ID NO:9)을 나타내는 L3 CDR을 포함하는 방법.
항목 8. 항목 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 재조합 단백질을 포함하는 조성물을 함유한 용기는 양압 하에 보관되었던 방법.
항목 9. 항목 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 진공은 약 12시간 내지 약 5일 동안 가해지는 방법.
항목 10. 항목 9에 있어서, 진공은 약 1일 내지 약 4일 동안 가해지는 방법.
항목 11. 항목 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 진공은 약 50 내지 약 268 mbar로 가해지는 방법.
항목 12. 항목 11에 있어서, 가해지는 진공은 50 mbar 초과 268 mbar 이하인 방법.
항목 13. 항목 11에 있어서, 진공은 약 60 내지 약 268 mbar로 가해지는 방법.
항목 14. 항목 11에 있어서, 진공은 약 99 내지 약 268 mbar로 가해지는 방법.
항목 15. 항목 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 진공은 약 20 L 내지 약 250 L 또는 약 40 L 내지 약 70 L의 재조합 단백질을 포함하는 조성물의 부피에 가해지는 방법.
항목 16. 항목 15에 있어서, 진공은 약 40 L, 약 65 L, 또는 약 125 L의 조성물의 부피에 가해지는 방법.
항목 17. 항목 15에 있어서, 약 50 L 이하의 조성물이 약 65 L 탱크에 존재하는 방법.
항목 18. 항목 15에 있어서, 약 76 L 이하의 조성물이 약 125 L 탱크에 존재하는 방법.
항목 19. 항목 15에 있어서, 약 45.1 L의 조성물이 약 65 L 탱크에 존재하는 방법.
항목 20. 항목 15에 있어서, 약 68.1 L의 조성물이 약 125 L 탱크에 존재하는 방법.
항목 21. 항목 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 기포 지표는 적어도 약 5.9이고 다음 식
BI = (ha * t * 1000)/(hl * PV)을 이용하여 계산되는 방법:
여기서, V= 용액의 부피(mL),
P= 탈기 진공(mbar),
T= 탈기 시간(hr),
hl= 액체의 높이(cm)(원통형 탱크로 가정하여 계산),
ha= 공기/헤드스페이스의 높이(cm)이다.
항목 22. 항목 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 재조합 단백질을 포함하는 조성물은 계면활성제를 포함하지 않는 방법.
항목 23. 항목 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 재조합 단백질을 포함하는 조성물에 계면활성제가 첨가되지 않는 방법.
항목 24. 항목 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 바이알에 충전될 때, 조성물은 바이알의 공기-액체-유리 계면 상에 링을 형성하지 않는 방법.
항목 25. 항목 24에 있어서, 적어도 하나의 바이알에 충전될 때, 조성물은 바이알의 표면 상에 링을 형성하지 않는 방법.
항목 26. 항목 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 탈기 후 기포를 포함하지 않는 방법.
항목 27. 항목 26에 있어서, 탈기 후 적어도 하나의 바이알에 충전될 때, 조성물은 바이알 충전 라인 또는 제조에 사용되는 다른 관류에 기포를 포함하지 않는 방법.
항목 28. 항목 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 재조합 단백질을 포함하는 조성물 중 재조합 단백질 농도는 약 0.1 mg/mL 내지 약 1000 mg/mL인 방법.
항목 29. 항목 28에 있어서, 단백질 농도는 약 100 mg/mL인 방법.
항목 30. 항목 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 탈기 단계를 생략하면 조성물에서 기포의 축적을 초래하는 방법.
항목 31. 항목 30에 있어서, 탈기 단계를 생략하면 충전 라인에서 조성물에 기포의 축적을 초래하는 방법.
항목 32. 항목 1 내지 31에 있어서, 탈기 단계를 생략하면 조성물을 함유한 바이알의 공기-액체-유리 계면에서 입자의 침적을 초래하는 방법.
항목 33. 항목 32에 있어서, 입자의 침적은 재조합 단백질을 포함하는 침적인 방법.
항목 34. 항목 32 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 입자의 침적은 바이알 상에 링을 형성하는 방법.
균등물
전술한 명세서는 당업자가 구현예를 실시할 수 있도록 하는 데 충분한 것으로 간주된다. 전술한 설명 및 실시예는 특정 구현예를 상술하며, 본 발명자들이 생각하는 최상의 형태를 기술한다. 그러나, 앞서 본문에 아무리 상세한 설명이 있더라도, 구현예는 많은 방식으로 실시될 수 있고 첨부된 청구범위 및 그 균등물에 따라 해석되어야 함은 이해될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 약은, 명시적으로 나타냈는지에 관계없이, 예를 들어 정수, 분수, 및 백분율을 포함한 수치를 나타낸다. 용어 약은 일반적으로 당업자가 인용된 값과 동등한 것으로 간주하는(예를 들어, 동일한 기능 또는 결과를 갖는) 수치의 범위(예를 들어, 인용된 값의 +/-5~10%)를 나타낸다. 어떤 경우에, 용어 약은 가장 가까운 유효 숫자로 반올림 한 수치를 포함할 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> MedImmune, LLC
<120> AN IMPROVED MANUFACTURING METHOD
<130> RSVAB-305WO1
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
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<223> Heavy chain of SYNAGIS humanized antibody
<400> 1
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 2
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> N-terminal antigen binding fragment (Fab) of SYNAGIS heavy chain
humanized antibody
<400> 2
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala
100 105 110
Gly Thr Thr Cys Thr Cys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His
225
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Complementary determining region (CDR) H1 of SYNAGIS heavy chain
humanized antibody
<400> 3
Thr Ser Gly Met Ser Val Gly
1 5
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Complementary determining region (CDR) H2 of SYNAGIS heavy chain
humanized antibody
<400> 4
Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Complementary determining region (CDR) H3 of SYNAGIS heavy chain
humanized antibody
<400> 5
Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Light chain of SYNAGIS humanized antibody
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Cys Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
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100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
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Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 7
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<213> Artificial sequence
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<223> Complementary determining region (CDR) L1 of SYNAGIS light chain
humanized antibody
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Lys Cys Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met His
1 5 10
<210> 8
<211> 7
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Complementary determining region (CDR) L2 of SYNAGIS light chain
humanized antibody
<400> 8
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Complementary determining region (CDR) L3 of SYNAGIS light chain
humanized antibody
<400> 9
Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
1 5
Claims (20)
- 용액 중에 재조합 단백질을 포함하는 조성물을 함유하는 바이알을 제조하는 방법으로서,
a. 재조합 단백질을 포함하는 조성물을 함유한 용기를 제공하는 단계로서, 선택적으로, 상기 용기는 양압 하에 보관되었던 것인 단계;
b. 상기 용기에 진공을 가하는 단계;
c. 진공이 상기 조성물에서 가스를 제거하도록 하는 단계로서, 상기 진공의 양 및 상기 진공의 기간이, 적어도 5.9의 기포 지표(BI)를 가져오고, 상기 기포 지표(BI)는 다음 식:
BI = (ha * t * 1000)/(hl * PV)
을 이용하여 계산되며,
상기 식에서,
V = 용액의 부피(mL),
P = 탈기 진공(mbar),
t = 탈기 시간(hr),
hl = 액체의 높이(cm)(원통형 탱크로 가정하여 계산),
ha = 공기/헤드스페이스의 높이(cm)인 단계; 및
d. 재조합 단백질을 포함하는 탈기된 상기 조성물로 바이알을 충전하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 팔리비주맙인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은,
a. SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄;
b. SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 중쇄 가변 부위 및 경쇄 SEQ ID NO:6의 경쇄 가변 부위; 또는
c. 아미노산 서열 TSGMSVG(SEQ ID NO:3)을 갖는 H1 상보성 결정 부위(CDR), 아미노산 서열 DIWWDDKKDYNPSLKS(SEQ ID NO:4)을 갖는 H2 CDR, 아미노산 서열 SMITNWYFDV(SEQ ID NO:5)을 갖는 H3 CDR; 아미노산 서열 KCQLSVGYMH(SEQ ID NO:7)을 갖는 L1 CDR, 아미노산 서열 DTSKLAS(SEQ ID NO:8)을 갖는 L2 CDR, 및 아미노산 서열 FQGSGYPFT(SEQ ID NO:9)을 갖는 L3 CDR
을 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 재조합 단백질을 포함하는 조성물을 함유한 상기 용기는 양압 하에 보관되었던 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 진공은 12시간 내지 5일 동안, 또는 1일 내지 4일 동안 가해지는 방법.
- 제1항에 있어서, 진공은 50 내지 268 mbar 또는 60 내지 268 mbar로 가해지는 방법.
- 제1항에 있어서, 가해지는 진공이 50 mbar 초과 268 mbar 이하인 방법.
- 제1항에 있어서, 진공이, 20 L 내지 250 L 또는 40 L 내지 70 L의, 재조합 단백질을 포함하는 상기 조성물의 부피에 가해지는 방법.
- 제1항에 있어서, 진공이 40 L, 65 L, 또는 125 L의 상기 조성물의 부피에 가해지는 방법.
- 제1항에 있어서, 50 L 이하의 조성물이 65 L 탱크에 존재하거나, 또는 76 L 이하의 조성물이 125 L 탱크에 존재하는 방법.
- 제1항에 있어서, 45.1 L의 조성물이 65 L 탱크에 존재하거나, 또는 68.1 L의 조성물이 125 L 탱크에 존재하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합 단백질을 포함하는 상기 조성물은 계면활성제를 포함하지 않는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합 단백질을 포함하는 상기 조성물에 계면활성제가 첨가되지 않는 방법.
- 제1항에 있어서, 재조합 단백질을 포함하는 상기 조성물 중 상기 재조합 단백질 농도가 0.1 mg/mL 내지 1000 mg/mL이거나, 또는 재조합 단백질을 포함하는 상기 조성물 중 상기 재조합 단백질 농도가 100 mg/mL인 방법.
- 삭제
- 삭제
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- 삭제
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