KR20220129003A - 재조합 단백질 제조 공정으로부터 불순물을 감소시키기 위한 방법 - Google Patents

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KR20220129003A
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본원 발명은 합성 심층 필터의 이용을 수반하는, 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액에서 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)의 양을 감소시키는 방법에 관계한다. 본원 발명은 단일클론 항체의 정제에서 이용될 수 있다.

Description

재조합 단백질 제조 공정으로부터 불순물을 감소시키기 위한 방법
기술 분야
본원 발명은 단일클론 항체 (mAb)의 용액에서 제품 관련 불순물의 양을 감소시키기 위한 방법에 관계한다. 특히, 본원 발명의 방법은 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)의 양을 감소시키기 위한 심층 필터의 이용을 수반한다.
배경 기술
단일클론 항체 (mAb), 예컨대 이중특이적 항체 (BsAb)는 중요한 치료적 양상이다 (1). 이들의 높은 분자 크기 및 정교한 접힘된 구조는 이들 단백질을 발현하는 선호되는 수단인 포유류 세포 배양을 이끌어 냈다 (2).
포유류 세포 배양 발현은 제품 관련 불순물 및 공정 관련 불순물 둘 모두를 야기하는데, 이들은 mAb 분자의 정제 동안 제거되어야 한다. 이들 불순물을 제거하기 위한 정제 단계는 원심분리, 심층 여과, 단백질 A 크로마토그래피, 바이러스 비활성화, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 다중방식 (혼합 방식) 크로마토그래피, 바이러스 여과 및 한외여과를 포함할 수 있다.
공정 관련 불순물을 액체 배지로부터 제거하고, 그것에 의하여 배지를 '정화하고', 그리고 후속 정제 단계에서 막 파울링을 예방하기 위해 심층 필터가 폭넓게 이용된다. 예를 들면, 세포 배양액으로부터 수확된 항체-내포 배지는 종종, 미세여과 막을 통한 최종 여과 (5) 또는 칼럼 크로마토그래피에 앞서, 세포 배양 과정의 고체, 불용성 성분, 예컨대 숙주 세포 단백질 (HCP) 및 DNA 오염체 (3), 그리고 우발적인 및 내인성 바이러스 (4)를 제거하기 위해 심층 필터에 통과된다.
심층 필터는 다공성 물질 예컨대 셀룰로오스 펄프, 규조토, 폴리아크릴 섬유 및 실리카를 포함하고, 그리고 일부 심층 필터는 다공성 물질의 하나 이상의 층을 포함한다 (6).
심층 필터는 또한, 단백질 A 정제 및 바이러스 비활성화 다음에, 정전 또는 소수성 상호작용을 통해 제품 관련 응집체 종류를 제거하는 것으로 밝혀졌다 (7).
단백질 생성 동안, 제품 관련 불순물은 제품 응집체를 포함하는 복합체인 고차 응집 종류를 포함한다. 이들 제품 관련 응집체와 불순물은 HCP 및 DNA를 포함할 수 있다 (4). 다른 제품 관련 비응집체 불순물은 반응하지 않은 (비대합된) 절반 항체, 비공유적으로 또는 공유적으로 연결된 동종이합체, 그리고 비공유적으로 연결된 이종이합체를 포함하는데, 이들은 관심되는 제품에 밀접하게 관련되고 표준 과정 예컨대 단백질 A 정제에 의해 제거하기가 어렵다 (8).
상이한 단일특이적 단일클론 항체로부터 유래된 중쇄와 경쇄를 포함하는 이중특이적 이종이합체성 항체는 특정 이종이합체의 형성을 편향시키는 "노브 인투 홀" 전략 (9)에 의해 높은 수율로 생성될 수 있다. 이것은 특정한 사슬 사이의 선택적 이종이합체화에 대해 우호적이도록, "노브" (한 항체 사슬의 영역에서 큰 아미노산에 의한 작은 아미노산의 대체)가 "홀" (다른 항체 사슬의 상응하는 영역에서 작은 아미노산에 의한 큰 아미노산의 대체)과 우선적으로 패킹하는 원리에 기초된다. 하지만, 이러한 방법은 예를 들면 가성-대합된 노브-노브 및 홀-홀 부산물로부터 발생하는 추가의 비응집체 부산물을 생성할 수 있다.
제품 관련 비응집체 불순물의 양을 감소시키기 위한 방법을 제공하는 것이 여전히 요구된다.
발명의 개시
본원 발명은 실리카 및 폴리아크릴 섬유를 포함하는 심층 필터를 이용함으로써, 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액에서 제품 관련 비응집체 불순물의 양을 감소시키기 위한 신규한 방법과 용도를 제공한다. 본 발명자들은 이런 심층 필터를 이용하는 것이 제품 관련 비응집체 불순물에서 감소를 야기한다는 것을 발견하였다.
본원에서 논의된 바와 같이, 심층 필터는 재조합 단백질 제조 공정에서, 일정한 공정 관련 불순물, 예컨대 HCP 및 DNA뿐만 아니라 제품 관련 응집체 불순물을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 하지만, 본 발명자들은 심층 필터가 제품 관련 비응집체 불순물을 감소시킬 것으로 예상하지 못하였다. 가장 넓은 범위에서, 본원 발명은 이러한 예상치 못한 발견에 관계한다.
따라서, 본원 발명의 한 가지 양상은 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액에서 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)의 양을 감소시키는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 방법은 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액을, 실리카 및 폴리아크릴 섬유를 포함하는 심층 필터에 통과시켜, NAPRI 중 일부를 완충된 용액으로부터 제거하는 단계를 포함한다. NAPRI의 양은 mAb의 완충된 용액을 심층 필터에 통과시킴으로써 감소된다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 감소된 양의 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)을 갖는 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액을 생성하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 방법은 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액을, 실리카 및 폴리아크릴 섬유를 포함하는 심층 필터에 통과시켜, 감소된 양의 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)을 갖는 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액을 생성하는 단계를 포함한다. NAPRI의 양은 mAb의 완충된 용액을 심층 필터에 통과시킴으로써 감소된다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액에서 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)의 양을 감소시키기 위한, 실리카 및 폴리아크릴 섬유를 포함하는 심층 필터의 용도를 제공한다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액으로서, 여기서 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)의 양이 상기 mAb의 양에 비하여 감소되었고, 본원 발명의 임의의 방법을 수행함으로써, 또는 본원 발명의 임의의 용도에 의해 생성되는, 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액을 제공한다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 mAb를 생성하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) mAb가 NAPRI와 함께 생성되도록, 상기 mAb를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계;
(b) mAb 및 NAPRI의 완충된 용액을 형성하는 단계;
(c) 본원 발명의 방법을 수행함으로써, 또는 본원 발명의 용도에 의해, 감소된 NAPRI의 양을 감소시키는 단계; 그리고 임의적으로
(d) mAb를 완충된 용액으로부터 단리하는 단계.
하기 구체예는 본원 발명의 양상의 구체예이다.
일부 구체예에서, mAb의 완충된 용액은 mAb의 농축되고 완충된 용액이다. 일부 구체예에서, mAb의 농축되고 완충된 용액의 농도는 2 mg/mL 내지 20 mg/mL, 5 mg/mL 내지 15 mg/mL, 또는 5 mg/mL 내지 10 mg/mL이다.
일부 구체예에서, mAb는 다중특이적 항체이다. 한 구체예에서 mAb는 이중특이적 항체이다. 일부 구체예에서, mAb는 항체 단편이다. 일부 구체예에서, mAb는 항체 또는 항체 단편 및 다른 생물학적으로 활성 폴리펩티드를 포함하는 항체 융합 단백질이다.
일부 구체예에서, 단일클론 항체의 완충된 용액은 주위 온도 미만인 온도에서 심층 필터에 통과된다. 예를 들면, 온도는 약 4℃ 내지 약 22℃일 수 있다. 온도는 약 10℃ 내지 약 21℃일 수 있다. 온도는 약 15℃ 내지 약 20℃일 수 있다.
본원 발명은 대규모 항체 정제를 가능하게 한다. 대량의 항체가 실리카 및 폴리아크릴 섬유 심층 필터 위에 부하될 수 있다. 예를 들면, 부하는 100 g/㎡ 초과, 200 g/㎡ 초과, 300 g/㎡ 초과, 500 g/㎡ 초과, 또는 700 g/㎡ 초과일 수 있다. 부하는 1500 g/㎡, 2000 g/㎡, 또는 2500 g/㎡까지 일 수 있다. 유동률은 약 1 L/분*㎡ 내지 약 10 L/분*㎡, 예를 들면 1.5 L/분*㎡ 내지 약 8 L/분*㎡ 사이의 범위 안에 있을 수 있다. 바람직한 실례에서, 유동률은 약 3 L/분*㎡ 내지 약 6 L/분*㎡ 사이의 범위 안에 있거나, 또는 약 4.3 L/분*㎡이다. 단위 'L/분*㎡'는 분당, 단위 면적 (㎡)당 필터를 관류하는 용적 (리터)을 표시한다.
심층 필터 통과 전에도, NAPRI는 초기 완충된 mAb 용액에서 상대적으로 낮은 농도, 예를 들면 mAb의 농도보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 1000배 또는 적어도 10,000배 낮은 농도로 존재한다. 본원 발명은 NAPRI 농도가 mAb의 농도에 비하여 더욱 감소되도록 한다.
유사하게, mAb의 절대량에 비하여 NAPRI의 절대량 (예를 들면 몰 단위로 계측됨)이 감소된다 (그리고 용해 상태에서 NAPRI의 절대량이 심층 필터 통과 이후에 감소된다). 게다가, 용액이 심층 필터를 통과하기 전 NAPRI 농도에 비하여, 용액이 심층 필터를 통과한 후 NAPRI 농도가 감소될 수 있다 (다만 반드시 그러한 것은 아니다, 예를 들면 만약 세척 분획물이 용리된 용액 내에 포함되면, 이의 용적이 증가한다).
mAb 농도에 비하여 NAPRI 농도에서 감소는 하기 비율; [mAb]:[NAPRI]에서 감소로서 표현될 수 있다. 이러한 비율은 용액이 심층 필터를 통과한 후 증가된다.
전형적으로, 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)은 mAb의 불완전하게 또는 부정확하게 조립된 폴리펩티드 사슬로 구성되는 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, NAPRI는 mAb의 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 사슬을 결여하는 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, NAPRI는 mAb와 상이한 폴리펩티드 사슬 배열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)은 mAb와 상이한 아미노산 서열 및/또는 상이한 항체 사슬 형상을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
한 구체예에서 mAb는 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬로 구성되는 다중특이적 항체이고, 그리고 NAPRI는 (a) 상기 4개의 폴리펩티드 사슬 중에서 하나 또는 그 이상을 결여하거나, 또는 (b) 동일한 상기 4개의 상이한 폴리펩티드 사슬 중에서 2개 또는 그 이상을 포함하는 폴리펩티드이다. 한 구체예에서 mAb는 서로 연관되는 2개의 중쇄를 포함하는 다중특이적 항체이고, 여기서 한 중쇄는 노브 돌연변이를 포함하고 다른 중쇄는 홀 돌연변이를 포함하며, 그리고 NAPRI는 서로 연관되는 노브 돌연변이를 포함하는 2개의 중쇄, 또는 서로 연관되는 홀 돌연변이를 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 폴리펩티드이다. 한 구체예에서 mAb는 2개 Fab 단편을 포함하는 다중특이적 항체이고, 여기서 첫 번째 Fab 단편은 N 말단에서 C 말단 방향으로 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 첫 번째 경쇄 및 N 말단에서 C 말단 방향으로 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 첫 번째 중쇄를 포함하고; 그리고 여기서 두 번째 Fab 단편은 (a) N 말단에서 C 말단 방향으로 VL 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 두 번째 경쇄 및 N 말단에서 C 말단 방향으로 VH 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 두 번째 중쇄, (b) N 말단에서 C 말단 방향으로 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 두 번째 경쇄 및 N 말단에서 C 말단 방향으로 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 두 번째 중쇄, 또는 (c) N 말단에서 C 말단 방향으로 VH 도메인 및 L 도메인을 포함하는 두 번째 경쇄 및 N 말단에서 C 말단 방향으로 VL 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 두 번째 중쇄 중 어느 한 가지를 포함하고; 그리고 여기서 NAPRI는 (a) 첫 번째 경쇄 및 두 번째 중쇄가 연관되거나, (b) 두 번째 경쇄 및 첫 번째 중쇄가 연관되거나, (c) 2개의 첫 번째 중쇄가 연관되거나, (d) 2개의 두 번째 중쇄가 연관되거나, 또는 (e) 폴리펩티드에서 첫 번째 경쇄, 첫 번째 중쇄, 두 번째 경쇄 및 두 번째 중쇄 중에서 적어도 하나가 결여되는 폴리펩티드이다.
일부 구체예에서, NAPRI는 서로 동일한 2개의 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, NAPRI는 동일한 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 포함한다. 일부 구체예에서, NAPRI는 서로 동일한 2개의 중쇄 및/또는 서로 동일한 2개의 경쇄를 포함한다. 예를 들면, 제품이 노브-홀 상호작용을 통해 대합하도록 조작된 이중특이적 단일클론 항체인 경우에, NAPRI는 노브-노브 및/또는 홀-홀 가성-대합된 사슬을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서 제품 관련 비응집체 불순물은 (a) 가성 사슬 형상을 갖거나; (b) 일부분이 상실되거나, 임의적으로 경쇄가 누락되거나; (c) 일부분이 부가되거나, 임의적으로 여기서 불순물이 경쇄를 갖는 단량체이거나; (d) ¾ 항체이거나; (e) 경쇄 오대합이거나; (f) 노브/노브 항체이거나; 또는 (g) 홀/홀 항체이다. 일부 구체예에서 NAPRI는 경쇄 이합체, 유리 경쇄, 중쇄 중에서 하나가 절두되는 중쇄 이합체, 중쇄 단량체, 또는 1 + 1 클리핑 이합체일 수 있다.
일부 구체예에서, 완충된 용액은 약 4.0 내지 약 7.5의 pH를 갖는다. 일부 구체예에서, 완충된 용액은 약 4.0 내지 약 7.2의 pH를 갖는다. 일부 구체예에서, 완충된 용액은 약 4.0 내지 약 pH 5.5의 pH를 갖는다. 완충된 용액은 아세트산나트륨 또는 구연산나트륨을 포함할 수 있다. 완충된 용액은 아세트산나트륨을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 완충된 용액은 150 mM 아세트산나트륨을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 완충된 용액은 10mM 또는 50mM 구연산나트륨을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 완충된 용액은 히스티딘을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 완충된 용액은 아세트산을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 용액의 pH는 트리스로 완충된다.
일부 구체예에서, NAPRI의 양이 본원 발명의 방법에 따라서 감소된 후, 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)의 농도가 계측되었다.
일부 구체예에서, mAb의 완충된 용액 (또는 mAb의 완충된 용액)에 크로마토그래피가 진행될 수 있었다 (심층 필터가 이용되기 전). 일부 구체예에서, mAb의 완충된 용액에 친화성 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 또는 다중방식 (혼합 방식) 크로마토그래피가 진행될 수 있었다. 일부 구체예에서, mAb의 완충된 용액에 예를 들면 단백질 A 수지, 단백질 L 수지, Fc-선택적 수지, 카파 경쇄-선택적 수지, 또는 람다 경쇄-선택적 수지를 이용한 친화성 크로마토그래피가 진행될 수 있었다. 선행 크로마토그래피, 예를 들면 친화성 크로마토그래피에 추가적으로 또는 대안으로, 일부 구체예에서, mAb의 완충된 용액에 이온 교환 크로마토그래피, 예를 들면 음이온 교환 또는 양이온 교환 칼럼, 또는 다중방식 (혼합 방식) 크로마토그래피가 진행될 수 있었다. mAb의 완충된 용액은 친화성 크로마토그래피가 진행됨으로써 농축될 수 있었다.
심층 필터는 다수준의 심층 필터 매질을 포함하는 다중층 심층 필터일 수 있다. 바람직하게는, 심층 필터는 이중층 심층 필터이다. 바람직하게는, 심층 필터는 규조토를 내포하지 않는다. 심층 필터는 일부 구체예에서 Millistak+® HC Pro 합성 심층 필터 X0SP일 수 있다.
본원 발명의 방법과 용도는 mAb의 완충된 용액이 심층 필터를 통과한 후 상기 용액에서 NAPRI의 존재 또는 부재를 확인하거나, 또는 NAPRI 농도를 계측하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 남아있는 NAPRI의 양이 계측될 수 있다. 유사하게, 용액이 심층 필터를 통과한 후 mAb의 양이 계측될 수 있다. 일부 구체예에서, 남아있는 NAPRI의 양이 모세관 전기이동 SDS Page 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 계측될 수 있다. 일부 구체예에서, NAPRI는 한쪽 중쇄가 절두되는 중쇄 이합체; 중쇄; 또는 산물 경쇄이고, 그리고 이의 양이 환원 환경에서 모세관 전기이동 SDS Page로 계측될 수 있다. 일부 구체예에서, NAPRI는 LMW; 1+1 이합체 (한쪽 중쇄가 절두됨) 1+1 클리핑 이합체 (한쪽 중쇄가 힌지 영역에서 절두되고 클리핑됨) 홀-홀 오대합; 홀-홀 오대합; 절반-홀; 경쇄 또는 경쇄 이합체이고, 그리고 이의 양이 비환원 환경에서 크기 배제 크로마토그래피 및/또는 모세관 전기이동 SDS Page로 계측될 수 있다. 일부 구체예에서, NAPRI는 HMW이고, 그리고 이의 양이 비환원 환경에서 소수성 상호작용 크로마토그래피 및/또는 모세관 전기이동 SDS Page로 계측될 수 있다. 일부 구체예에서, HMW NAPRI는 노브-노브 오대합이다. 일부 구체예에서, NAPRI는 중쇄 노브, 또는 중쇄 홀이다.
일부 구체예에서, 복수의 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI), 또는 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)의 총 농도 또는 양은 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 14% 이하, 13% 이하, 12% 이하, 11% 이하, 10% 이하, 8% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하 또는 1% 이하이다.
일부 구체예에서, 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)의 농도는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 계측되고, 임의적으로 여기서 상기 계측은 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 수행된다.
일부 구체예에서, 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)의 농도는 모세관 전기이동 SDS Page (CE-SDS)에 의해 계측되고, 임의적으로 여기서 상기 계측은 LabChip 장치 또는 LabChip GXII 장치를 이용하여 수행된다.
도면에 관한 간단한 설명
도 1a는 심층 여과가 있는 경우 (회색 선) 및 없는 경우 (검은색 파선)에 2개의 중쇄 폴리펩티드 및 3개의 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 삼가 이중특이적 항체의 정제에 대한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 추적을 도시한다. 심층 여과의 결과로서 불순물에서 감소는 실시예 1에서 논의된다.
도 1b는 심층 여과가 있는 경우 (회색 선) 및 없는 경우 (검은색)에 첫 번째 삼가 이중특이적 항체의 정제에 대한 LabChip (SDS-Page 등가물) 추적을 도시한다. 심층 여과의 결과로서 불순물에서 감소는 실시예 1에서 논의된다. 표지화된 피크 아래 면적은 표 2에서 도시된다.
도 2는 심층 여과 이후에 첫 번째 삼가 이중특이적 항체의 정제에 대한 추가의 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 추적을 도시한다. 피크는 가능한 상응하는 NAPRI (HMW 1, LMW B 및 LMW 3) 및 다른 불순물 (HMW 2, HMW 3)로 표지화되는데, 이것은 실시예 1에서 논의된다.
도 3a는 심층 여과가 있는 경우 (검은색 선) 및 없는 경우 (검은색 파선)에 두 번째 삼가 이중특이적 항체의 정제에 대한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 추적을 도시한다. 심층 여과의 결과로서 불순물에서 감소는 실시예 2에서 논의된다.
도 3b는 심층 여과가 있는 경우 (회색) 및 없는 경우 (검은색)에 두 번째 삼가 이중특이적 항체의 정제에 대한 LabChip (SDS-Page 등가물) 추적을 도시한다. 심층 여과의 결과로서 불순물에서 감소는 실시예 2에서 논의된다. 표지화된 피크 아래 면적은 표 4에서 도시된다.
도 4는 심층 여과가 있는 경우 (검은색) 및 없는 경우 (회색)에 첫 번째 항체 융합 단백질의 정제에 대한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 추적을 도시한다. 심층 여과의 결과로서 불순물에서 감소는 실시예 3에서 논의된다.
상세한 설명
항체 생성 및 정제
심층 필터는 단일클론 항체 생성/정제의 다양한 단계에서 이용될 수 있다. 이러한 과정은 하기 단계를 포함할 수 있다:
수확: 단백질-내포 상층액으로부터 세포 및 세포 조직파편을 분리한다. 수확 단계는 전형적으로, 원심분리 및/또는 여과를 이용하여 수행된다;
Fc-결합/단백질 A 친화성 크로마토그래피: 이러한 단계는 중성 pH에서 Fc 영역에 우선적인 결합에 의해 mAb 분자를 포획하고, 그리고 수확된 상층액의 나머지가 제거될 수 있도록 한다. mAb 분자는 이후, 낮은 pH에서 용리된다;
람다 경쇄 결합/단백질 L 친화성 크로마토그래피: 이러한 단계는 중성 pH에서 Fab 영역 내에 람다 경쇄에 우선적인 결합에 의해 mAb 분자를 포획하고, 그리고 수확된 상층액의 나머지가 제거될 수 있도록 한다. mAb 분자는 이후, 낮은 pH에서 용리된다;
카파 경쇄 결합/단백질 L 친화성 크로마토그래피: 이러한 단계는 중성 pH에서 Fab 영역 내에 카파 경쇄에 우선적인 결합에 의해 mAb 분자를 포획하고, 그리고 수확된 상층액의 나머지가 제거될 수 있도록 한다. mAb 분자는 이후, 낮은 pH에서 용리된다;
바이러스 비활성화: 낮은 pH에서 단백질 A/L 용리 풀의 인큐베이션은 우발적인 바이러스를 비활성화할 수 있다;
양이온 교환 크로마토그래피: 이러한 단계는 HCP, mAb 응집체 및 항체 단편을 제거할 수 있고, 그리고 결합-용리 또는 관류 단계를 포함할 수 있다;
음이온 교환 크로마토그래피: 이러한 단계는 DNA, 침출된 단백질 A/L 및 다른 미량 오염체를 제거할 수 있고, 그리고 관류에서 수행될 수 있다;
바이러스 여과: 바이러스를 제거하도록 설계된 막을 이용한 단일-통과 (전량) 여과; 및
한외여과: 이러한 단계에서, 샘플을 반투막 (공극 크기가 0.1-0.01 μm 사이의 범위 안에 있을 수 있다)에 통과시킴으로써, mAb 분자가 더욱 농축될 수 있다. 만약 이것이 최종 정제 단계이면, 용리 완충액이 최종 조제 완충액으로 교체될 수 있다.
심층 여과는 예를 들면, 본원에서 개시된 바와 같은 제품 관련 불용성 불순물 및 공정 관련 불순물을 제거하기 위해, 바이러스 비활성화, 양이온 교환 크로마토그래피, 바이러스 여과 및 한외여과에 앞서 이용될 수 있다. 심층 여과는 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액에서 제품 관련 비응집체 불순물을 감소시키는 데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 심층 여과는 mAb와 상이한 아미노산 서열 및/또는 상이한 항체 사슬 형상을 갖는 폴리펩티드인 제품 관련 비응집체 불순물을 감소시키는 데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 심층 여과는 서로 동일한 2개의 중쇄를 포함하는 제품 관련 비응집체 불순물을 감소시키는 데 이용될 수 있다.
심층 여과는 또한, 이차 정화 처리 및 연무 제거를 위해, 그리고 본원에서 개시된 바와 같은 제품 관련 불순물의 추가 제거를 위해 정제 과정의 더욱 하류 단계에서 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 심층 여과는 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액에서 제품 관련 비응집체 불순물을 감소시키는 데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 심층 여과는 mAb와 상이한 아미노산 서열 및/또는 상이한 항체 사슬 형상을 갖는 폴리펩티드인 제품 관련 비응집체 불순물을 감소시키는 데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 심층 여과는 서로 동일한 2개의 중쇄를 포함하는 제품 관련 비응집체 불순물을 감소시키는 데 이용될 수 있다.
본원에서 개시된 모든 방법은 본원에서 별도로 표시되지 않으면 또는 문맥에 의해 별도로 명백하게 부인되지 않으면, 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다.
다른 정의
본 명세서 및 첨부된 청구항을 위해, 별도로 표시되지 않으면, 본 명세서 및 청구항에서 이용된, 성분의 양, 재료의 백분율 또는 비율, 반응 조건, 그리고 다른 수치 값을 표현하는 모든 숫자는 명시적으로 표시되는지 아닌지에 상관없이 모든 경우에서 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "약"은 일반적으로, 언급된 값과 동등한 (다시 말하면, 동일한 기능 또는 결과를 갖는) 것으로 고려될 숫자의 범위를 지칭한다. 많은 경우에, 용어 "약"은 가장 가까운 유효 숫자로 반올림되는 숫자를 포함할 수 있다.
따라서, 반대로 표시되지 않으면, 다음의 명세서 및 첨부된 청구항에서 진술된 수치 파라미터는 본원 발명에 의해 획득이 추구되는 원하는 특성에 따라서 변할 수 있는 근사치이다. 적어도, 그리고 청구항의 범위에 균등론의 적용을 제한하는 시도로서가 아닌 한, 각 수치 파라미터는 적어도, 보고된 유효 숫자 자리수의 숫자에 비추어, 그리고 일상적인 반올림 기술을 적용함으로써 해석되어야 한다.
본원 발명의 광범위한 범위를 진술하는 수치 범위와 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 특정한 실례에서 진술된 수치 값은 가능한 정확하게 보고된다. 하지만, 일정한 수치 값은 그들의 개별 시험 계측에서 발견되는 표준 편차로부터 필연적으로 발생하는 일정한 오차를 생래적으로 내포한다. 게다가, 본원에서 개시된 모든 범위는 그 안에 포함된 모든 부분범위를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, "1 내지 10"의 범위는 1의 최솟값 및 10의 최댓값 (이들 포함) 사이의 임의의 모든 부분범위, 다시 말하면, 1과 동등하거나 또는 그 이상인 최솟값 및 10과 동등하거나 또는 그 이하인 최댓값을 갖는 임의의 모든 부분범위, 예를 들면, 5.5 내지 10을 포함한다.
본원 발명을 더 상세하게 설명하기에 앞서, 다수의 용어가 규정될 것이다. 이들 용어의 이용은 발명의 범위를 제한하지 않으며, 본원 발명에 관한 설명을 용이하게 하는 역할만을 한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "폴리펩티드 사슬 배열"은 mAb 내에 폴리펩티드 사슬의 연관을 지칭한다. 정규적인 IgG 항체는 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 포함하는데, 여기서 IgG 분자를 형성하기 위해, 폴리펩티드 사슬은 아래와 같이 배열된다: 2개의 중쇄가 서로 연관되고, 그리고 경쇄 각각이 이들 중쇄 중 하나와 연관된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 관용구 "세포 배양액"은 세포, 세포 조직파편 및 콜로이드성 입자, 관심되는 생체분자, HCP, 그리고 DNA를 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "크로마토그래피"는 관심되는 피분석물 (예를 들면 단일클론 항체 (mAb))을, 혼합물 내에 존재하는 다른 분자 (예를 들면 제품 관련 비응집체 불순물)로부터 분리하는 임의의 종류의 기술을 지칭한다. 통상적으로, 관심되는 피분석물은 혼합물의 개별 분자가 이동상의 영향 하에 정지 매질을 통해 이주하는 비율에서, 또는 결합과 용리 과정에서 차이의 결과로서 다른 분자로부터 분리된다.
용어 "크로마토그래피 수지" 또는 "크로마토그래피 매질"은 본원에서 교체가능하게 이용되고, 그리고 관심되는 피분석물 (예를 들면 단일클론 항체 (mAb))을 혼합물 내에 존재하는 다른 분자 (예를 들면 제품 관련 비응집체 불순물)로부터 분리하는 임의의 종류의 상 (예를 들면, 고체상)을 지칭한다. 통상적으로, 관심되는 피분석물은 혼합물의 개별 분자가 이동상의 영향 하에 정지 고체상을 통해 이주하는 비율에서, 또는 결합과 용리 과정에서 차이의 결과로서 다른 분자로부터 분리된다. 다양한 유형의 크로마토그래피 매질의 실례는 예를 들면 양이온 교환 수지, 친화성 수지, 음이온 교환 수지, 다중방식 (혼합 방식) 수지 (예를 들면 다중 방식의 상호작용 예컨대 이온 교환, 수산화인회석, 친화성, 크기 배제 및 소수성 상호작용을 할 수 있는 리간드로 기능화된 수지), 이온 교환 막, 소수성 상호작용 수지, 그리고 이온 교환 모놀리스를 포함한다.
용어 "정화 처리 단계" 또는 "정화 처리"는 본원에서 교체가능하게 이용되고, 그리고 일반적으로 생체분자의 정제에서 초기에 이용된 하나 또는 그 이상의 단계를 지칭한다. 정화 처리 단계는 일반적으로 임의의 하기 단독 또는 이들의 다양한 조합 예를 들면 원심분리 및 심층 여과, 침전, 응집 및 침강을 비롯한 하나 또는 그 이상의 단계를 이용한, 세포 및/또는 세포 조직파편의 제거를 포함한다. 정화 처리 단계는 일반적으로 하나 또는 그 이상의 바람직하지 않은 실체의 제거를 수반하고, 그리고 전형적으로 원하는 표적 분자의 포획을 수반하는 단계에 앞서 수행된다. 정화 처리의 다른 양상은 정제 과정에서 세균 필터의 파울링을 추후에 야기할 수 있는, 샘플 내에 가용성 및 불용성 성분을 제거하고, 그것에 의하여 전체 정제 과정을 더 경제적으로 만드는 것이다.
일부 구체예에서, 정제 과정은 하나 또는 그 이상의 "크로마토그래피 단계"를 추가적으로 이용한다. 전형적으로, 이들 단계는 필요하면, 본원 발명에 따른 자극 반응성 중합체를 이용한, 하나 또는 그 이상의 바람직하지 않은 실체로부터 표적 분자의 분리 후 실행될 수 있다. 일부 구체예에서, 크로마토그래피 단계는 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 일부 구체예에서, 친화성 크로마토그래피는 Fc-결합/단백질 A 친화성 크로마토그래피이다. 일부 구체예에서, 친화성 크로마토그래피는 람다 경쇄 결합/단백질 L 친화성 크로마토그래피이다. 일부 구체예에서, 친화성 크로마토그래피는 카파 경쇄 결합/단백질 L 친화성 크로마토그래피이다. 일부 구체예에서, mAb의 완충된 용액에 예를 들면 단백질 A 수지, 단백질 L 수지, Fc-선택적 수지, 카파 경쇄-선택적 수지, 또는 람다 경쇄-선택적 수지를 이용한 친화성 크로마토그래피가 진행될 수 있었다. 일부 구체예에서, 친화성 크로마토그래피는 칼럼을 이용하여 수행되고, 여기서 항체가 자체의 표적에 대한 친화성에 의해 정제되도록, 항체 결합의 표적이 칼럼 상에 고정된다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "조성물", "용액" 또는 "샘플"은 하나 또는 그 이상의 바람직하지 않은 실체 또는 불순물 (예를 들면 제품 관련 비응집체 불순물)과 함께, 본원에서 설명된 표적 분자 또는 원하는 제품 (예를 들면 단일클론 항체 (mAb))의 혼합물을 지칭한다. 일부 구체예에서, 샘플은 표적 분자 또는 원하는 제품이 분비되는 공급원료 또는 세포 배양 배지를 포함한다. 일부 구체예에서, 샘플은 하나 또는 그 이상의 불순물 (예를 들면 숙주 세포 단백질, DNA, RNA, 지질, 세포 배양 첨가제, 세포 및 세포 조직파편)과 함께 표적 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 샘플은 제품 관련 비응집체 불순물과 함께 표적 분자 (예를 들면 단일클론 항체 (mAb))를 포함한다.
본원에서 교체가능하게 이용된 바와 같이, 용어 "중국 햄스터 난소 세포 단백질" 및 "CHOP"는 중국 햄스터 난소 ("CHO") 세포 배양액으로부터 유래된 숙주 세포 단백질 ("HCP")의 혼합물을 지칭한다. HCP 또는 CHOP는 일반적으로, 세포 배양 배지 또는 용해물 (예를 들면 관심되는 단백질 또는 폴리펩티드 (예를 들면, CHO 세포에서 발현된 항체 또는 면역부착소)를 내포하는 수확된 세포 배양 유체) 내에 불순물로서 존재한다. 일반적으로, 관심되는 단백질을 포함하는 혼합물 내에 존재하는 CHOP의 양은 관심되는 단백질에 대한 순도의 척도를 제공한다. 전형적으로, 단백질 혼합물에서 CHOP의 양은 혼합물 내에 관심되는 단백질의 양에 상대적인 백만분율로 표현된다. 이것은 예를 들면 ELISA 또는 COBAS 면역검정을 이용하여 계측함으로써 정량될 수 있다.
용어 "오염체", "불순물" 및 "조직파편"은 본원에서 교체가능하게 이용되고, 본원에서 설명된 방법을 이용하여 하나 또는 그 이상의 외래 또는 부적당한 분자로부터 분리되는 관심되는 단백질 또는 폴리펩티드 (예를 들면, 항체)를 내포하는 샘플 내에 존재할 수 있는 생물학적 거대분자 예컨대 제품 관련 비응집체 불순물, DNA, RNA, 하나 또는 그 이상의 숙주 세포 단백질 (HCP 또는 CHOP), 내독소, 바이러스, 지질, 그리고 하나 또는 그 이상의 첨가제를 비롯한, 임의의 외래 또는 부적당한 물질을 지칭한다.
숙주 세포가 다른 포유류 세포 유형, 대장균 (E. coli), 효모 세포, 곤충 세포, 또는 식물 세포인 경우에, HCP는 숙주 세포의 용해물에서 발견되는, 표적 단백질 이외의 단백질을 지칭하는 것으로 이해된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "심층 필터"는 필터 재료의 깊이 내에서 여과를 달성한다. 이런 필터의 통상적인 부류는 흐름 통로의 복잡하고 구불구불한 미로를 형성하기 위해, 결합된 (또는 만약 그렇지 않으면 고정된) 섬유의 무작위 매트릭스를 포함하는 것들이다. 이들 필터에서 입자 분리는 일반적으로, 섬유 매트릭스에 의한 포획 또는 섬유 매트릭스에 흡착으로부터 발생한다. 세포 배양 액상배지 및 다른 공급원료의 생물공정을 위해 가장 빈번하게 이용되는 심층 필터 매질은 셀룰로오스 섬유, 필터 보조제 예컨대 규조토 (DE), 그리고 양으로 하전된 수지 결합제로 구성된다. 본원 발명의 맥락에서 이용된 심층 필터는 실리카 및 폴리아크릴 섬유를 포함하는 심층 필터이다. 일부 구체예에서, 심층 필터는 합성 필터이다. 일부 구체예에서, 심층 필터는 실리카 필터 보조제 및/또는 폴리아크릴 섬유를 포함한다. 일부 구체예에서, 심층 필터는 실리카 필터 보조제 및/또는 폴리아크릴 섬유 및/또는 부직포 물질을 포함한다. 일부 구체예에서, 심층 필터는 실리카 및 부직포 물질로서 폴리아크릴 섬유를 포함한다. 심층 필터는 나일론을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 심층 필터는 규조토를 내포하지 않는다. 일부 구체예에서, 심층 필터는 셀룰로오스를 내포하지 않는다. 심층 필터 매질은 절대 필터와 달리, 다공성 매질의 전역에서 입자를 유지하여, 공극 크기보다 큰 입자 및 작은 입자 둘 모두의 체류를 허용한다. 입자 체류는 크기 배제, 그리고 소수성, 이온성 및 다른 상호작용을 통한 흡착 둘 모두를 수반하는 것으로 생각된다. 파울링 기전은 공극 폐쇄, 덩어리 형성 및/또는 공극 수축을 포함할 수 있다. 심층 필터는 이들이 오염체를 제거하고, 그리고 또한 일회용 형식이어서 검증 문제가 없기 때문에 유리하다. 심층 필터는 직렬로 적층되는 다수준의 심층 필터 매질을 포함하는 다중층 심층 필터일 수 있다. 바람직하게는, 심층 필터는 이중 층 심층 필터이다. 다중 심층 필터를 이용하는 것은 더 많은 여과액 흐름이 심층 필터 매질에 효율적으로 접촉하여, 불순물에 대한 더 나은 흡착 프로필이 가능하도록 담보한다 (3).
일부 구체예에서, 심층 필터는 23 cm2 또는 그 이상, 0.11 m2 또는 그 이상, 0.55 m2 또는 그 이상, 또는 1.1 m2 또는 그 이상의 표면적을 갖는다. 일부 구체예에서, 청구항에서 규정된 바와 같은 완충된 용액은 100-1000 mL, 50-500 L, 250-2500 L, 또는 500-5000 L의 용적을 갖는다.
일부 구체예에서, 심층 필터는 23 cm2 또는 그 이상의 표면적을 갖고, 그리고 청구항에서 규정된 바와 같은 완충된 용액은 100-1000 mL의 용적을 갖는다. 일부 구체예에서, 심층 필터는 0.11 m2 또는 그 이상의 표면적을 갖고, 그리고 청구항에서 규정된 바와 같은 완충된 용액은 50-500 L의 용적을 갖는다. 일부 구체예에서, 심층 필터는 0.55 m2 또는 그 이상의 표면적을 갖고, 그리고 청구항에서 규정된 바와 같은 완충된 용액은 250-2500 L의 용적을 갖는다. 일부 구체예에서, 심층 필터는 1.1 m2 또는 그 이상의 표면적을 갖고, 그리고 청구항에서 규정된 바와 같은 완충된 용액은 500-5000 L의 용적을 갖는다.
일부 구체예에서, 심층 여과는 심층 필터 표면적의 m2당 10-1000 L, 20-800 L, 30-600 L, 40-440 L, 또는 50-200 L의 완충된 용액에서 실행된다.
본원에서 이용된 바와 같이, "합성 심층 필터"의 문맥에서 용어 "합성"은 이용에 앞서, 심층 필터가 자연적으로 유래된 물질 (예컨대 규조토, 셀룰로오스 등)을 포함하지 않거나, 또는 매우 적게 포함한다는 것을 의미한다. 다시 말하면, 심층 필터는 합성 물질 (예컨대 실리카, 폴리아크릴산, 나일론 등)로 구성되거나 또는 이들로 본질적으로 구성된다.
용어 "단리하는", "정제하는" 및 "분리하는"은 본원에서 개시된 방법을 이용하여, 표적 분자 및 하나 또는 그 이상의 불순물 (예를 들면 제품 관련 비응집체 불순물)을 포함하는 조성물 또는 샘플로부터 표적 분자 (예를 들면 단일클론 항체 (mAb))를 정제하는 문맥에서, 본원에서 교체가능하게 이용된다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 방법을 이용하여 샘플로부터 하나 또는 그 이상의 불순물을 제거 (완전하게 또는 부분적으로)함으로써 샘플 내에 표적 분자의 순도가 증가된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체" 또는 "mAb"는 실제적으로 균질한 항체의 모집단으로부터 항체를 지칭한다, 다시 말하면, 이러한 모집단을 구성하는 모든 개별 항체는 가능한 제품 관련 불순물 예컨대 변이체 항체, 예를 들면, 자연적으로 발생하거나 또는 단일클론 항체 제조물의 생성 동안 발생하는 돌연변이를 내포하는 항체를 제외하고, 동일하고 및/또는 서로 동일한 에피토프에 결합하며, 이런 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다. (동일한 mAb 분자는 본원에서 "제품"으로서 지칭될 수 있다). 상이한 결정인자 (에피토프)를 향해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체 제조물과는 대조적으로, 단일클론 항체 제조물의 각 단일클론 항체는 전형적으로 항원 상에서 서로 동일한 결정인자 (또는 다중특이적 단일클론 항체의 경우에, 결정인자들)를 향해 지향된다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 실제적으로 균질한 모집단으로부터 획득되는 것으로서 항체의 특징을 표시하고, 그리고 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "mAb"는 항체, 항체 단편 및 항체 융합 단백질을 포함한다. mAb는 단일특이적 또는 다중특이적 (예를 들면 이중특이적)일 수 있다. 단일클론 항체는 상이한 폴리펩티드 사슬로 구성된다. 정규적인 IgG 항체는 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 포함한다. 더 복잡한 항체, 특히 다중특이적 항체는 통상적으로 2개 이상의 상이한 폴리펩티드를 포함하는데, 이것은 재조합 발현 시에 가능한 오대합 또는 불완전의 문제를 야기한다. 본원 발명의 구체예에서 "mAb"는 3개 또는 그 이상의 상이한 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 실례는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (예를 들면, scFv 및 scFab); 단일 도메인 항체 (dAb); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 항체 단편에 관한 검토를 위해, Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)을 참조한다.
"다중특이적 항체"는 적어도 2개의 상이한 부위, 다시 말하면, 상이한 항원 상에서 상이한 에피토프 또는 동일한 항원 상에서 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 일정한 양상에서, 다중특이적 항체는 3개 또는 그 이상의 결합 특이성을 갖는다. 다중특이적 항체를 만들기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동발현 (참조: Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)) 및 "노브-인-홀" 조작 (참조: 예를 들면, U.S. 특허 번호 5,731,168 및 Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997))을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 다중특이적 항체는 또한, 항체 Fc-이종이합체성 분자를 만들기 위해 정전 스티어링 효과를 조작함으로써 (참조: 예를 들면, WO 2009/089004); 2개 또는 그 이상의 항체 또는 단편을 교차연결함으로써 (참조: 예를 들면, US 특허 번호 4,676,980 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); 류신 지퍼를 이용하여 이중특이적 항체를 생성함으로써 (참조: 예를 들면, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 및 WO 2011/034605); 경쇄 오대합 문제를 회피하기 위해 공통 경쇄 기술을 이용함으로써 (참조: 예를 들면, WO 98/50431); 이중특이적 항체 단편을 만들기 위해 "디아바디" 기술을 이용함으로써 (참조: 예를 들면, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); 그리고 단일 사슬 Fv (sFv) 이합체를 이용함으로써 (참조: 예를 들면, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); 그리고 예를 들면, Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)에서 설명된 바와 같이 삼중특이적 항체를 제조함으로써 만들어질 수 있다.
예를 들면, "문어 항체", 또는 DVD-Ig를 비롯한, 3개 또는 그 이상의 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체 또한 본원에 포함된다 (참조: 예를 들면, WO 2001/77342 및 WO 2008/024715). 3개 또는 그 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다중특이적 항체의 다른 실례는 WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO 2010/145792 및 WO 2013/026831에서 발견될 수 있다. 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한, 첫 번째뿐만 아니라 두 번째 상이한 항원, 또는 동일한 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (참조: 예를 들면, US 2008/0069820 및 WO 2015/095539).
다중특이적 항체는 또한, 동일한 항원 특이성의 하나 또는 그 이상의 결합 팔에서 도메인 교차로, 다시 말하면, VH/VL 도메인 (참조: 예를 들면, WO 2009/080252 및 WO 2015/150447), CH1/CL 도메인 (참조: 예를 들면, WO 2009/080253) 또는 완전한 Fab 팔 (참조: 예를 들면, WO 2009/080251, WO 2016/016299, 또한 Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191 및 Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20 참조)을 교환함으로써 비대칭적 형태로 제공될 수 있다. 한 양상에서, 다중특이적 항체는 교차-Fab 단편을 포함한다. 용어 "교차-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "교차 Fab 단편"은 중쇄와 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역 중 어느 한 가지가 교환되는 Fab 단편을 지칭한다. 교차-Fab 단편은 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 불변 영역 1 (CH1)로 구성되는 폴리펩티드 사슬, 그리고 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 불변 영역 (CL)으로 구성되는 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 비대칭적 Fab 팔은 또한, 정확한 Fab 대합을 주도하기 위해 하전된 또는 비-하전된 아미노산 돌연변이를 도메인 인터페이스 내로 도입함으로써 조작될 수 있다. 참조: 예를 들면, WO 2016/172485.
다중특이적 항체에 대한 다양한 추가의 분자 형식은 당해 분야에서 공지되고 본원에 포함된다 (참조: 예를 들면, Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106). 용어 "이중특이적 항체"는 2개의 상이한 에피토프 (표적)에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "제품 관련 비응집체 불순물" 또는 "NAPRI"는 원하는 mAb의 불완전하게 또는 부정확하게 조립된 폴리펩티드 사슬로 구성될 수 있는, 원하는 "mAb"의 부산물이다. 일부 구체예에서, NAPRI는 mAb의 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 사슬을 결여하는 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, NAPRI는 mAb와 상이한 폴리펩티드 사슬 배열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, NAPRI의 분자량은 원하는 mAb의 분자량보다 낮다. 한 가지 실례에서, 원하는 mAb는 첫 번째 항원에 특이적으로 결합하는 항체로부터 유래된 첫 번째 중쇄 및 첫 번째 경쇄, 그리고 두 번째 항원에 특이적으로 결합하는 항체로부터 유래된 두 번째 중쇄 및 두 번째 경쇄를 포함하는 이중특이적 항체이고, 여기서 첫 번째와 두 번째 경쇄의 CH3 도메인은 노브 인투 홀 기술에 의해 변경된다 (Merchant AM et al. Nat Biotechnol. 1998 Jul;16(7):677-81.). 본 실시예에서, 불완전하게 조립된 폴리펩티드 사슬을 갖는 NAPRI는 예를 들면, 경쇄 중에서 하나 또는 그 이상을 결실하는 항체이다. 또한 본 실시예에서, 부정확하게 조립된 폴리펩티드 사슬을 갖는 NAPRI는 동일한 중쇄의 이합체 (노브-노브 이합체 또는 홀-홀 이합체), 또는 경쇄가 잘못된 중쇄와 대합하여 비기능적 결합 부위의 형성이 야기되는 완전 이중특이적 항체와 유사하게 발생할 수 있다. mAb의 NAPRI는 고분자량 ("HMW") 및 저분자량 ("LMW") 폴리펩티드로서 구별될 수 있다. LMW 폴리펩티드는 mAb의 분자량보다 낮은 분자량을 갖는다. HMW 폴리펩티드는 mAb와 동일하거나 또는 이보다 높은 분자량을 갖는다 (예를 들면 도 2에서 HMW 1). 하지만, 본원 발명과 관련하여, 그리고 정의에 의해, NAPRI는 응집체를 명시적으로 배제한다. 응집체는 원하는 mAb, 예를 들면 경쇄와 연관된 원하는 mAb의 하나 이상의 사본으로 구성되는 것으로 규정된다. 응집체는 이런 이유로, 원하는 mAb의 2개 또는 그 이상의 사본을 갖는 종류, 예를 들면 관심되는 제품의 이합체 또는 다합체를 포함한다. 한 구체예에서, NAPRI는 LMW 폴리펩티드이다. 한 구체예에서, NAPRI는 HWM 폴리펩티드이다.
용어 "백만분율" 또는 "ppm"은 본원에서 교체가능하게 이용되고, 그리고 본원에서 개시된 방법을 이용하여 정제된 원하는 표적 분자 (예를 들면 단일클론 항체 (mAb))의 순도의 척도를 지칭한다. 따라서, 이러한 척도는 정제 과정 후 존재하는 표적 분자의 양을 재거나 또는 바람직하지 않은 실체의 양을 재는 데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 단위 "ppm"은 밀리그램에서 관심되는 단백질/밀리리터의 나노그램에서 용액 내에 불순물, 예를 들면, HCP 또는 CHOP/밀리리터의 양 (다시 말하면, CHOP ppm=(CHOP ng/ml)/(관심되는 단백질 mg/ml)을 지칭하기 위해 본원에서 이용된다. 단백질이 건조될 때 (예를 들면, 동결 건조에 의해), ppm은 (CHOP ng)/(관심되는 단백질 mg))을 지칭한다.
본원에서 교체가능하게 이용된 바와 같이, 폴리펩티드의 용어 "pI" 또는 "등전점"은 폴리펩티드의 양성 전하가 이의 음성 전하와 균형을 이루는 pH를 지칭한다. pI는 폴리펩티드의 부착된 탄수화물의 아미노산 잔기 또는 시알산 잔기의 순전하로부터 계산될 수 있거나 또는 등전위 초점에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "공극 크기" 및 "명목상 공극 크기"는 평가된 공극 크기의 60-98%에서 대다수의 미립자를 유지하는 공극 크기를 지칭한다.
일부 구체예에서, 본원에서 개시된 방법을 이용하여 원하는 표적 분자 (예를 들면 단일클론 항체 (mAb))를 단리하거나, 분리하거나 또는 정제하는 "정제 단계"는 "균질한" 또는 "순수한" 조성물 또는 샘플을 야기하는 전체 정제 과정의 일부일 수 있는데, 상기 용어는 원하는 표적 분자를 포함하는 조성물 내에 100 ppm 이하의 HCP, 대안으로 90 ppm 이하, 80 ppm 이하, 70 ppm 이하, 60 ppm 이하, 50 ppm 이하, 40 ppm 이하, 30 ppm 이하, 20 ppm 이하, 10 ppm 이하, 5 ppm 이하, 또는 3 ppm 이하의 HCP를 포함하는 조성물 또는 샘플을 지칭하기 위해 본원에서 이용된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "염"은 산 및 염기의 상호작용에 의해 형성된 화합물을 지칭한다. 본원에서 설명된 방법에서 이용된 다양한 완충액에서 이용될 수 있는 다양한 염은 아세트산염 (예를 들면 아세트산나트륨), 구연산염 (예를 들면, 구연산나트륨), 염화물 (예를 들면, 염화나트륨), 황산염 (예를 들면, 황산나트륨), 또는 칼륨 염을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "용매"는 일반적으로, 하나 또는 그 이상의 다른 물질을 용해시키거나 또는 분산시켜, 용액을 제공할 수 있는 액체 물질을 지칭한다. 용매는 수성 용매 및 유기 용매를 포함하는데, 여기서 유용한 유기 용매는 비극성 용매, 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 아세토니트릴, 헥실렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 2,2-티오디글리콜을 포함한다.
용어 "표적 분자", "표적 생체분자", "원하는 표적 분자" 및 "원하는 표적 생체분자"는 본원에서 교체가능하게 이용되고, 그리고 일반적으로, 관심되는 폴리펩티드 또는 제품을 내포하는 샘플 내에 존재할 수 있는 하나 또는 그 이상의 바람직하지 않은 실체, 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 불순물로부터 정제되거나 또는 분리되는 것이 요망되는 단일클론 항체 (mAb) 분자를 지칭한다.
실시예
하기 실시예는 본원 발명의 조성물을 어떻게 만들고 본원 발명의 방법을 어떻게 실시하는지에 관한 완전한 개시와 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되고, 그리고 본 발명자가 자신의 발명으로서 간주하는 것의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 이용된 숫자 (예를 들면, 양, 온도 등)에 대하여 정확도를 담보하기 위한 노력이 이루어졌지만, 일부 실험 오차와 편차가 고려되어야 한다. 별도로 표시되지 않으면, 온도는 섭씨 온도이다, 화학 반응은 대기압 또는 막경유 압력에서 수행되었고, 표시된 바와 같이, 용어 "주위 온도"는 대략 25℃를 지칭하고, 그리고 "주위 압력"은 대기압을 지칭한다. 본원 발명은 본원 발명을 예시하는 것으로 의도되는 하기 실시예에 의해 더 명확해질 것이다.
실시예 1: 2개의 중쇄 폴리펩티드 및 3개의 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 삼가 이중특이적 항체를 정제할 때 NAPRI에서 감소
본 실시예에서, 심층 여과를 이용하여 첫 번째 삼가 이중특이적 항체를 정제할 때 NAPRI의 감소가 관찰되었다.
재료
Millistak POD 1.1㎡:MX0SP10FS1
Millistak POD 파일럿홀더: MP0DPIL0T;
Millistak+ HC POD Millistak+® HC Pro X0SP 1.1m2 플랫 씰;
MP0DADPTF Adapterkit
Figure pct00001
ktaAvant 150
연동 펌프
분획물 용기
아세트산
아세트산나트륨*3H2O
150 mM 아세트산나트륨 pH 5.0 - 6.0 여과 완충액 (TRIS로 조정된 pH)
방법
1.1 m2 심층 필터가 Millistak+HC POD (공정 규모 홀더) 홀더 내로 넣어졌다. 일회용 어댑터가 연결되었고 (3x 관류 & 3x 블라인드 플러그 어댑터), 그리고 POD가 크로마토그래피 시스템에 연결되었다. 유압 밸브가 열리도록 세팅되었고, 유압이 1000 PSI로 증가되었고, 그 후 유압 밸브가 다시 한 번 닫혔다. 이러한 실험은 +15℃ 내지 +20℃의 온도 범위에서 실행되었다.
압력 및 흐름을 위한 연결기가 연결되었고, 그리고 주입구 밸브 및 벤트 밸브를 열고 출구 밸브를 닫음으로써 필터가 씻어내졌다. 액체가 벤트 밸브를 통해 빠져나올 때, 벤트 밸브가 닫히고 출구 밸브가 열렸다.
상기 시스템은 pH 및 전도도가 일정할 때까지, 필터 지체 용적의 3배의 완충액 (150 mM 아세트산나트륨 pH 5.0-6.0)으로 씻어내졌다.
첫 번째 삼가 이중특이적 항체를 내포하는 단백질 A 풀 (150 mM 아세트산나트륨 pH 2.8에서)이 TRIS를 이용하여 pH 5.0-6.0으로 조건화되었고, 그리고 이후 심층 필터에 적용되었다. 질량 부하가 4.3 L/분*㎡의 부하 흐름에서 887g/㎡에 세팅되었다.
전체 관류가 수집되었고, 그리고 적합한 분석 기법 예컨대 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 미소유체 모세관 전기이동 (Labchip), 질량 분광분석, 그리고 cobas e 411 (COBAS) 또는 ELISA 면역검정을 이용하여 HCP 함량, 숙주 세포 DNA 함량, 제품 관련 불순물에 관한 분석이 수행되었다.
결과
전술된 방법을 이용하여, 첫 번째 삼가 이중특이적 항체가 X0SP MX0SP10FS1 1.1㎡ 심층 필터를 이용하여 정제되었고, 그리고 심층 여과가 없는 정제 (MabSelect SuRe pH 5.0)와 비교하여, NAPRI뿐만 아니라 다른 불순물에서 감소가 크기 배제 크로마토그래피 (도 1a 및 아래의 표 1) 및 LabChip (SDS-PAGE 등가물) (도 1b 및 아래의 표 2)에 의한 공정 중 제어를 통해 결정되었다.
[표 1]
Figure pct00002
표 1 - SEC에 의해 결정된 바와 같은, NAPRI 및 정제된 첫 번째 삼가 이중특이적 항체에 대한 피크 면적.
[표 2]
Figure pct00003
표 2 - LabChip에 의해 결정된 바와 같은, NAPRI 및 정제된 첫 번째 삼가 이중특이적 항체에 대한 피크 면적
표 1 및 2에서 볼 수 있듯이, 제품 품질의 증가가 SEC 및 LabChip 추적에서 피크의 면적 %에 의해 계측될 때 NAPRI (HMW1 및 LMW)의 감소와 함께 관찰되었다.
도 2는 추가 SEC 추적을 도시하는데, 여기서 표 1로부터 HMW1은 주된 제품 플러스 경쇄로서 확인되었고 표 1로부터 HMW는 이합체 및 다합체 (비-NAPRI)로서 확인되었다. 표 1로부터 LMW는 또한, LMW B (홀-홀 NAPRI) 및 LMW 3 (한 가지 구성요소의 일부를 상실한 분리된 단량체)으로서 확인되었다.
실시예 2: 2개의 중쇄 폴리펩티드 및 3개의 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 두 번째 삼가 이중특이적 항체를 정제할 때 NAPRI에서 감소
본 실시예에서, 심층 여과를 이용하여 두 번째 삼가 이중특이적 항체를 정제할 때 NAPRI의 감소가 관찰되었다.
재료
Millistak POD 1.1㎡:MX0SP10FS1
Millistak POD 파일럿홀더: MP0DPIL0T;
Millistak+ HC POD Millistak+® HC Pro X0SP 1.1m2 플랫 씰;
MP0DADPTF Adapterkit
Figure pct00004
ktaAvant 150
연동 펌프
분획물 용기
아세트산
아세트산나트륨*3H2O
150 mM 아세트산나트륨 pH 5.0 - 6.0 여과 완충액 (TRIS로 조정된 pH)
방법
1.1 m2 심층 필터가 Millistak+HC POD (공정 규모 홀더) 홀더 내로 넣어졌다. 일회용 어댑터가 연결되었고 (3x 관류 & 3x 블라인드 플러그 어댑터), 그리고 POD가 크로마토그래피 시스템에 연결되었다. 유압 밸브가 열리도록 세팅되었고, 유압이 1000 PSI로 증가되었고, 그 후 유압 밸브가 다시 한 번 닫혔다. 이러한 실험은 +15℃ 내지 최대 +20℃의 온도 범위에서 실행되었다. 질량 부하가 4.3 L/분*㎡의 부하 흐름에서 897.6g/㎡에 세팅되었다.
압력 및 흐름을 위한 연결기가 연결되었고, 그리고 주입구 밸브 및 벤트 밸브를 열고 출구 밸브를 닫음으로써 필터가 씻어내졌다. 액체가 벤트 밸브를 통해 빠져나올 때, 벤트 밸브가 닫히고 출구 밸브가 열렸다.
상기 시스템은 pH 및 전도도가 일정할 때까지, 필터 지체 용적의 3배의 완충액 (150 mM 아세트산나트륨 pH 5.0-6.0)으로 씻어내졌다.
두 번째 삼가 이중특이적 항체를 내포하는 단백질 A 풀 (150 mM 아세트산나트륨 pH 2.8에서)이 TRIS를 이용하여 pH 5.0-6.0으로 조건화되었고, 그리고 이후 심층 필터에 적용되었다.
전체 관류가 수집되었고, 그리고 적합한 분석 기법 예컨대 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 미소유체 모세관 전기이동 (Labchip), 질량 분광분석, 그리고 cobas e 411 또는 ELISA 면역검정을 이용하여 HCP 함량, 숙주 세포 DNA 함량, 제품 관련 불순물에 관한 분석이 수행되었다.
결과
전술된 방법을 이용하여, 두 번째 삼가 이중특이적 항체가 X0SP MX0SP10FS1 1.1㎡ 심층 필터를 이용하여 정제되었고, 그리고 심층 여과가 없는 정제 (MabSelect SuRe pH 5.0)와 비교하여, NAPRI뿐만 아니라 다른 불순물에서 감소가 크기 배제 크로마토그래피 (도 3a 및 아래의 표 3) 및 LabChip (SDS-PAGE 등가물) (도 3b 및 아래의 표 4)에 의한 공정 중 제어를 통해 결정되었다.
[표 3]
Figure pct00005
표 3 - SEC에 의해 결정된 바와 같은, NAPRI 및 정제된 두 번째 삼가 이중특이적 항체에 대한 피크 면적. 전체로서, HMW는 총면적의 4.59%의 감소를 보여준다. 전체로서, LMW는 총면적의 10.59%의 감소를 보여준다.
[표 4]
Figure pct00006
표 4- LabChip에 의해 결정된 바와 같은, NAPRI 및 정제된 두 번째 삼가 이중특이적 항체에 대한 피크 면적.
HMW1은 노브/노브 NAPRI로서 확인되었고, HMW2는 비-NAPRI 이합체로서 확인되었고, HMW3은 대부분 비-NAPRI 응집체로서 확인되었고, LMW1은 홀/홀 NAPRI로서 확인되었고, LMW2는 홀 NAPRI로서 확인되었고, 그리고 LMW3은 경쇄 NAPRI로서 확인되었다.
표 3 및 4에서 볼 수 있듯이, 제품 품질의 증가가 SEC 및 LabChip 추적에서 피크의 면적 %에 의해 계측될 때 NAPRI (HMW1 및 LMW1/2/3)의 감소와 함께 관찰되었다. 첫 번째 삼가 이중특이적 항체와 비교하여, 제품 품질이 훨씬 높은 정도까지 향상될 수 있었다.
실시예 3: 항원 결합 부위 및 조작된 사이토킨 변이체를 포함하는 첫 번째 항체 융합 단백질을 정제할 때 NAPRI에서 감소
본 실시예에서, 심층 여과를 이용하여 첫 번째 항체 융합 단백질을 정제할 때 NAPRI의 감소가 관찰되었다.
재료
Millistak® HC Pro X0 시리즈 μPod 23 cm2: MX0SP23CL3
Figure pct00007
ktaAvant 150
연동 펌프
분획물 용기
아세트산
아세트산나트륨*3H2O
150 mM 아세트산나트륨 pH 5.0 - 6.0 여과 완충액 (TRIS로 조정된 pH)
방법
23 cm2 심층 필터가 4.4 L/분*㎡의 유동률에서, 30 mL의 150 mM 아세트산나트륨 pH 5.0-6.0 완충액으로 미리 씻어내졌다. 첫 번째 항체 융합 단백질을 내포하는 단백질 A 풀 (150 mM 아세트산나트륨 pH 2.8에서)이 TRIS를 이용하여 pH 5.0-6.0으로 조건화되었고, 그리고 이후 4.4 L/분*㎡의 유동률로 심층 필터에 적용되었다. 이러한 실험은 +15℃ 내지 최대 +20℃의 온도 범위에서 실행되었다. 질량 부하가 1.9 L/분*㎡의 부하 흐름에서 2173g/㎡에 세팅되었다.
적합한 분별 설계방식을 이용한 분획물 관류가 하기 시점: 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 30 및 40 분에서 4.4 L/분*㎡의 유동률로 수행되었다.
적합한 분석 기법 예컨대 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 미소유체 모세관 전기이동 (Labchip), 질량 분광분석, 그리고 cobas e 411 또는 ELISA 면역검정을 이용하여 HCP 함량, 숙주 세포 DNA 함량, 제품 관련 불순물에 관한 분석이 수행되었다.
결과
전술된 방법을 이용하여, 첫 번째 항체 융합 단백질이 X0SP MX0SP23CL3 23 cm2 심층 필터를 이용하여 정제되었고, 그리고 심층 여과가 없는 정제 (MabSelect SuRe pH 5.0)와 비교하여, NAPRI뿐만 아니라 다른 불순물에서 감소가 크기 배제 크로마토그래피 및 LabChip (SDS-PAGE 등가물) (도 4 및 아래의 표 5)에 의한 공정 중 제어를 통해 결정되었다.
[표 5]
Figure pct00008
표 5 - SEC 및 LabChip에 의해 결정된 바와 같은, NAPRI 및 정제된 첫 번째 항체 융합 단백질에 대한 피크 면적.
표 5에서 볼 수 있듯이, 제품 품질의 증가가 SEC 및 LabChip 추적에서 피크의 면적 %에 의해 계측될 때 NAPRI (HMW 및 LMW)의 감소와 함께 관찰되었다. LMW는 가성-대합된 홀-홀이다. HMW는 가성-대합된 노브-노브이다.
LabChip 및 SEC에 의해 계측될 때 NAPRI의 감소에서 차이는 Labchip이 조건에 따라서, 더 불량한 분해능을 가질 수 있기 때문일 수 있다. 이것은 응집체, 예컨대 주된 제품 + 경쇄가 주로 샘플 준비 동안 용해되기 때문이다. 샘플 준비는, 경쇄와 중쇄 비율을 구별하는 것이 더 쉬울 수 있는 SEC의 경우에서와 같은 완전히 환원 조건과 비교하여, 매우 약한 환원 조건하에 이루어진다).
실시예 4: 다중방식 크로마토그래피 후 첫 번째 삼가 이중특이적 항체를 정제할 때 NAPRI에서 감소
본 실시예에서, 심층 여과를 이용하여 첫 번째 삼가 이중특이적 항체를 정제할 때 NAPRI의 감소가 관찰되었는데, 여기서 상기 항체는 또한, 다중방식 크로마토그래피를 이용하여 정제되었다.
재료
Millistak® HC Pro X0 시리즈 μPod 23 cm2: MX0SP23CL3
Capto Adhere ImpRes 크로마토그래피 칼럼
Figure pct00009
ktaAvant 150
연동 펌프
분획물 용기
아세트산
아세트산나트륨*3H2O
50mM 구연산나트륨 pH 4.0 여과 완충액
방법
23 cm2 심층 필터가 10 mL/분 (이것은 4.3 L/분*㎡이다)의 유동률에서, 30 mL의 150 mM 아세트산나트륨 pH 5.0-6.0 완충액으로 미리 씻어내졌다. 이러한 방법은 +15℃ 내지 최대 +20℃의 온도 범위에서 실행되었다. 질량 부하가 4.3 L/분*㎡의 부하 흐름에서 759g/㎡에 세팅되었다.
2가지 상이한 정제 방법 단계가 차후에 수행되었다:
(i) 첫 번째 삼가 이중특이적 항체를 내포하는 단백질 A 풀이 이후, 10 mL/분의 유동률로 심층 필터에 적용되었다 (여과 완충액 50 mM 구연산나트륨 pH 4.0). 용출물이 이후, Capto Adhere ImpRes 다중방식 음이온 교환 칼럼 (용리 완충액 50 mM 구연산나트륨 pH 6.0 - 50mM 구연산나트륨 pH 3.0; 구배 25CV)에 통과되었고, 그리고 후속 용출물이 10 mL/분의 유동률로 심층 필터에 적용되었다 (여과 완충액 50 mM 구연산나트륨 pH 4.0); 또는
(ii) 첫 번째 삼가 이중특이적 항체를 내포하는 단백질 A 풀이 Capto Adhere ImpRes 다중방식 음이온 교환 칼럼 (용리 완충액 50mM 구연산나트륨 pH 6.0 - 50mM 구연산나트륨 pH3.0; 구배 25CV)에 통과되었고, 그리고 후속 용출물이 10 mL/분의 유동률로 심층 필터에 적용되었다 (여과 완충액 50mM 구연산나트륨 pH 4.0).
어느 한쪽 방법에 따라서, 적합한 분별 설계방식을 이용한 분획물 관류가 하기 시점: 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 30 및 40 분에서 10 mL/분의 유동률로 수행되었다.
적합한 분석 기법 예컨대 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 미소유체 모세관 전기이동 (Labchip), 질량 분광분석, 그리고 cobas e 411 또는 ELISA 면역검정을 이용하여 HCP 함량, 숙주 세포 DNA 함량, 제품 관련 불순물에 관한 분석이 수행되었다.
결과
첫 번째 삼가 이중특이적 항체가 X0SP MX0SP23CL3 23 cm2 심층 필터를 이용하여 정제되었는데, 여기서 다중방식 음이온 교환 크로마토그래피 (Capto Adhere ImpRes) 단계가 단백질 A 크로마토그래피 후 수행되었고, 그리고 여과가 각 단계 후, 또는 다중방식 음이온 교환 크로마토그래피 단계 후 수행되었다.
NAPRI뿐만 아니라 다른 불순물에서 감소가 크기 배제 크로마토그래피 (아래의 표 6)에 의한 공정 중 제어를 통해 결정되었다.
[표 6]
Figure pct00010
표 6 - SEC에 의해 결정된 바와 같은, NAPRI 및 정제된 첫 번째 삼가 이중특이적 항체에 대한 피크 면적에서 변화 (퍼센트 포인트로 계측됨). (LMW는 가성-대합된 홀-홀이다. HMW는 가성-대합된 노브-노브이다)
표 6에서 볼 수 있듯이, 제품 품질의 증가가 SEC 추적에서 피크의 면적 %에 의해 계측될 때 NAPRI (HMW 및 LMW)의 감소와 함께 관찰되었다. 심층 여과는 따라서, 단백질 A 크로마토그래피, 다중방식 크로마토그래피, 또는 이들 2가지의 조합이 선행할 때 NAPRI를 감소시키는 것처럼 보인다.
실시예 5: 2개의 중쇄 폴리펩티드 및 3개의 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 세 번째 삼가 이중특이적 항체를 정제할 때 NAPRI에서 감소
본 실시예에서, 상이한 pH 값을 갖는 2가지 샘플이 고려되었다. pH 5.5 및 pH 7.2 둘 모두에서 심층 여과를 이용하여 세 번째 삼가 이중특이적 항체를 정제할 때 NAPRI의 감소가 관찰되었다.
재료
Millistak® HC Pro X0 시리즈 μPod 23 cm2: MX0SP23CL3
Figure pct00011
ktaAvant 150
연동 펌프
분획물 용기
아세트산
아세트산나트륨*3H2O
150 mM 아세트산나트륨 pH 5.0 - 6.0 여과 완충액 (TRIS로 조정된 pH)
25 mM 트리스/트리스-HCl, 25mM 염화나트륨, pH 7.2
방법
23 cm2 심층 필터가 10 mL/분의 유동률에서, 30 mL의 150 mM 아세트산나트륨 pH 5.0-6.0 완충액으로 미리 씻어내졌다.
이러한 방법은 +15℃ 내지 최대 +20℃의 온도 범위에서 실행되었다. 질량 부하가 4.3 L/분*㎡의 부하 흐름에서 822g/㎡ @ pH 5.5 및 853 g/㎡ @ pH 7.2에 세팅되었다.
세 번째 삼가 항체 단백질을 내포하는 단백질 A 풀 (150 mM 아세트산나트륨 pH 2.8에서)이 TRIS를 이용하여 pH 5.5 또는 pH 7.2로 조건화되었고, 그리고 이후 10 mL/분의 유동률로 심층 필터에 적용되었다.
적합한 분별 설계방식을 이용한 분획물 관류가 하기 시점: 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 30 및 40 분에서 10 mL/분의 유동률로 수행되었다.
적합한 분석 기법 예컨대 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 이용하여 HCP 함량, 숙주 세포 DNA 함량, 제품 관련 불순물에 관한 분석이 수행되었다.
결과
전술된 방법을 이용하여, 세 번째 삼가 항체 단백질이 X0SP MX0SP23CL3 23 cm2 심층 필터를 이용하여 정제되었고, 그리고 심층 여과가 없는 정제 (MabSelect SuRe pH)와 비교하여, NAPRI뿐만 아니라 다른 불순물에서 감소가 크기 배제 크로마토그래피 (표 6)에 의한 공정 중 제어를 통해 결정되었다.
[표 6]
Figure pct00012
표 6 - SEC에 의해 결정된 바와 같은, NAPRI 및 정제된 세 번째 삼가 항체 단백질에 대한 피크 면적.
표 6에서 볼 수 있듯이, 제품 품질의 증가가 SEC 추적에서 피크의 면적 %에 의해 계측될 때 NAPRI (HMW 및 LMW)의 감소와 함께 관찰되었다. HMW NAPRI는 비공유 노브-노브 종류로서 확인되었다. LMW NAPRI는 경쇄 이합체 및 유리 경쇄로서 확인되었다.
실시예 6: 2개의 중쇄 폴리펩티드 및 3개의 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 네 번째 삼가 이중특이적 항체를 정제할 때 NAPRI에서 감소
본 실시예에서, 상이한 pH 값을 갖는 2가지 샘플이 고려되었다. pH 5.5 및 pH 7.2에서 심층 여과를 이용하여 네 번째 삼가 이중특이적 항체를 정제할 때 NAPRI의 감소가 관찰되었다.
재료
Millistak® HC Pro X0 시리즈 μPod 23 cm2: MX0SP23CL3
Figure pct00013
ktaAvant 150
연동 펌프
분획물 용기
아세트산
아세트산나트륨*3H2O
150 mM 아세트산나트륨 pH 5.0 - 6.0 여과 완충액 (TRIS로 조정된 pH)
25 mM 트리스/트리스-HCl, 25mM 염화나트륨, pH 7.2
방법
23 cm2 심층 필터가 10 mL/분의 유동률에서, 30 mL의 150 mM 아세트산나트륨 pH 5.0-6.0 완충액으로 미리 씻어내졌다.
이러한 실험은 +15℃ 내지 최대 +20℃의 온도 범위에서 실행되었다. 질량 부하가 4.3 L/분*㎡의 부하 흐름에서 848g/㎡ pH 5.5 및 838 g/m2 @ pH 7.2에 세팅되었다.
네 번째 삼가 항체 단백질을 내포하는 단백질 A 풀 (150 mM 아세트산나트륨 pH 2.8에서)이 TRIS를 이용하여 pH 5.5 또는 7.2로 조건화되었고, 그리고 이후 10 mL/분의 유동률로 심층 필터에 적용되었다.
적합한 분별 설계방식을 이용한 분획물 관류가 하기 시점: 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 30 및 40 분에서 10 mL/분의 유동률로 수행되었다.
적합한 분석 기법 예컨대 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 이용하여 HCP 함량, 숙주 세포 DNA 함량, 제품 관련 불순물에 관한 분석이 수행되었다.
결과
전술된 방법을 이용하여, 네 번째 삼가 항체 단백질이 X0SP MX0SP23CL3 23 cm2 심층 필터를 이용하여 정제되었고, 그리고 심층 여과가 없는 정제 (MabSelect SuRe pH)와 비교하여, NAPRI뿐만 아니라 다른 불순물에서 감소가 크기 배제 크로마토그래피 (표 7)에 의한 공정 중 제어를 통해 결정되었다.
[표 7]
Figure pct00014
표 7 - SEC에 의해 결정된 바와 같은, NAPRI 및 정제된 네 번째 삼가 항체 단백질에 대한 피크 면적.
표 7에서 볼 수 있듯이, 제품 품질의 증가가 SEC 추적에서 피크의 면적 %에 의해 계측될 때 NAPRI (HMW 및 LMW)의 감소와 함께 관찰되었다. HMW NAPRI는 노브-노브 종류로서 확인되었다. LMW NAPRI는 경쇄 이합체 및 유리 경쇄 종류로서 확인되었다.
***
넘버링된 단락:
1. 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액에서 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)의 양을 감소시키는 방법, 여기서 상기 방법은 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액을, 실리카 및 폴리아크릴 섬유를 포함하는 합성 심층 필터에 통과시켜, NAPRI 중 일부를 완충된 용액으로부터 제거하는 단계를 포함한다.
2. 감소된 양의 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)을 갖는 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액을 생성하는 방법, 여기서 상기 방법은 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액을, 실리카 및 폴리아크릴 섬유를 포함하는 합성 심층 필터에 통과시켜, 감소된 양의 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)을 갖는 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액을 생성하는 단계를 포함한다.
3. 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액에서 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)의 양을 감소시키기 위한 실리카 및 폴리아크릴 섬유를 포함하는 합성 심층 필터의 용도.
4. mAb가 다중특이적 항체인, 선행하는 단락 중 한 가지에 따른 방법, 또는 단락 3에 따른 용도.
5. mAb가 항체 또는 항체 단편 및 다른 생물학적으로 활성 폴리펩티드를 포함하는 항체 융합 단백질인, 선행하는 단락 중 한 가지에 따른 방법, 또는 선행하는 단락 중 한 가지에 따른 용도.
6. NAPRI가 mAb의 불완전하게 또는 부정확하게 조립된 폴리펩티드 사슬로 구성되는 폴리펩티드인, 선행하는 단락 중 한 가지에 따른 방법, 또는 선행하는 단락 중 한 가지에 따른 용도.
7. NAPRI가 mAb의 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 사슬을 결여하는 폴리펩티드인, 선행하는 단락 중 한 가지에 따른 방법, 또는 선행하는 단락 중 한 가지에 따른 용도.
8. NAPRI가 mAb와 상이한 폴리펩티드 사슬 배열을 포함하는 폴리펩티드인, 선행하는 단락 중 한 가지에 따른 방법, 또는 선행하는 단락 중 한 가지에 따른 용도.
9. NAPRI가 동일한 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 포함하는, 단락 1-6 중 한 가지에 따른 방법, 또는 단락 3-6 중 한 가지에 따른 용도.
10. mAb의 완충된 용액에 친화성 크로마토그래피가 진행된, 선행하는 단락 중 한 가지에 따른 방법, 또는 선행하는 단락 중 한 가지에 따른 용도.
11. 심층 필터가 다수준의 심층 필터 매질을 포함하는 다중층 심층 필터인, 선행하는 단락 중 한 가지에 따른 방법, 또는 선행하는 단락 중 한 가지에 따른 용도.
12. 심층 필터가 규조토를 내포하지 않는, 선행하는 단락 중 한 가지에 따른 방법, 또는 선행하는 단락 중 한 가지에 따른 용도.
13. mAb의 완충된 용액이 심층 필터를 통과한 후 상기 완충된 용액에서 NAPRI 농도를 계측하는 단계를 더욱 포함하는, 선행하는 단락 중 한 가지에 따른 방법, 또는 선행하는 단락 중 한 가지에 따른 용도.
14. 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액으로서, 여기서 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)의 양이 상기 mAb의 양에 비하여 감소되었고, 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행함으로써, 또는 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 용도에 의해 생성되는, 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액.
15. mAb를 생성하는 방법, 여기서 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) mAb가 NAPRI와 함께 생성되도록, 상기 mAb를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계;
(b) mAb 및 NAPRI의 완충된 용액을 형성하는 단계;
(c) mAb 및 NAPRI의 완충된 용액에서 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행함으로써, 또는 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 용도에 의해, NAPRI의 양을 감소시키는 단계; 및
(d) mAb를 완충된 용액으로부터 단리하는 단계.
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Claims (29)

  1. 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액을, 실리카 및 폴리아크릴 섬유를 포함하는 합성 심층 필터에 통과시켜, 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI) 중 일부를 완충된 용액으로부터 제거함으로써, 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액에서 NAPRI의 양을 감소시키는 방법에 있어서,
    NAPRI는 불완전하게 또는 부정확하게 조립된 mAb 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
  2. 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액을, 실리카 및 폴리아크릴 섬유를 포함하는 합성 심층 필터에 통과시켜, 감소된 양의 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)을 갖는 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액을 생성함으로써, 감소된 양의 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)을 갖는 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액을 생성하는 방법에 있어서,
    NAPRI는 불완전하게 또는 부정확하게 조립된 mAb 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
  3. 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액에서 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)의 양을 감소시키기 위한 실리카 및 폴리아크릴 섬유를 포함하는 합성 심층 필터의 용도에 있어서,
    NAPRI는 불완전하게 또는 부정확하게 조립된 mAb 폴리펩티드를 포함하는, 용도.
  4. mAb가 다중특이적 항체인, 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법, 또는 청구항 제3항에 따른 용도.
  5. mAb가 항체 또는 항체 단편 및 다른 생물학적으로 활성 폴리펩티드를 포함하는 항체 융합 단백질인, 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법, 또는 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 용도.
  6. 단일클론 항체의 완충된 용액이 주위 온도 미만인 온도에서 심층 필터에 통과되는, 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법, 또는 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 용도.
  7. NAPRI가 mAb의 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 사슬을 결여하는 폴리펩티드인, 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법, 또는 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 용도.
  8. NAPRI가 mAb와 상이한 폴리펩티드 사슬 배열을 포함하는 폴리펩티드인, 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법, 또는 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 용도.
  9. NAPRI가 동일한 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 포함하는, 청구항 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 방법, 또는 청구항 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 용도.
  10. mAb의 완충된 용액에 친화성 크로마토그래피가 진행된, 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법, 또는 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 용도.
  11. 심층 필터가 다수준의 심층 필터 매질을 포함하는 다중층 심층 필터인, 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법, 또는 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 용도.
  12. 심층 필터가 규조토를 내포하지 않는, 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법, 또는 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 용도.
  13. mAb의 완충된 용액이 심층 필터를 통과한 후 상기 완충된 용액에서 NAPRI 농도를 계측하는 단계를 더욱 포함하는, 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법, 또는 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 용도.
  14. mAb의 완충된 용액이 합성 심층 필터를 통과하기 전 상기 완충된 용액에 크로마토그래피가 진행된, 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법, 또는 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 용도.
  15. 크로마토그래피가 친화성 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 또는 다중방식 (혼합 방식) 크로마토그래피인, 청구항 제14항에 따른 방법 또는 용도.
  16. 크로마토그래피가 단백질 A 수지, 단백질 L 수지, Fc-선택적 수지, 카파 경쇄-선택적 수지, 또는 람다 경쇄-선택적 수지를 이용한 친화성 크로마토그래피인, 청구항 제15항에 따른 방법 또는 용도.
  17. 크로마토그래피가 이온 교환 크로마토그래피인, 청구항 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 용도.
  18. 이용된 이온 교환 크로마토그래피가 음이온 교환 칼럼, 양이온 교환 칼럼, 또는 다중방식 (혼합 방식) 크로마토그래피인, 청구항 제17항에 따른 방법 또는 용도.
  19. 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액으로서, 여기서 제품 관련 비응집체 불순물 (NAPRI)의 양이 상기 mAb의 양에 비하여 감소되었고, 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행함으로써, 또는 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 용도에 의해 생성되는, 단일클론 항체 (mAb)의 완충된 용액,
  20. mAb를 생성하는 방법에 있어서, 다음 단계를 포함하는, 방법:
    (a) mAb가 NAPRI와 함께 생성되도록, 상기 mAb를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계;
    (b) mAb 및 NAPRI의 완충된 용액을 형성하는 단계;
    (c) mAb 및 NAPRI의 완충된 용액에서 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행함으로써, 또는 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 용도에 의해, NAPRI의 양을 감소시키는 단계; 및
    (d) mAb를 완충된 용액으로부터 단리하는 단계.
  21. mAb의 완충된 용액이 합성 심층 필터를 통과하기 전 상기 완충액 용액에 크로마토그래피가 진행된, 청구항 제20항에 따른 방법.
  22. 크로마토그래피가 친화성 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 또는 다중방식 (혼합 방식) 크로마토그래피인, 청구항 제20항에 따른 방법.
  23. 크로마토그래피가 단백질 A 수지, 단백질 L 수지, Fc-선택적 수지, 카파 경쇄-선택적 수지, 또는 람다 경쇄-선택적 수지를 이용한 친화성 크로마토그래피인, 청구항 제22항에 따른 방법.
  24. 크로마토그래피가 이온 교환 크로마토그래피인, 청구항 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 방법.
  25. 이용된 이온 교환 크로마토그래피가 음이온 교환 칼럼, 양이온 교환 칼럼, 또는 다중방식 (혼합 방식) 크로마토그래피인, 청구항 제24항에 따른 방법.
  26. 단일클론 항체의 완충된 용액이 약 10℃ 내지 약 21℃, 또는 약 15℃ 내지 약 20℃의 온도에서 심층 필터에 통과되는, 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 용도.
  27. 단일클론 항체의 완충된 용액이 약 100 g/m2 내지 약 2500 g/m2, 약 300 g/m2 내지 약 2000 g/m2, 또는 약 500 g/m2 내지 약 1500 g/m2의 범위에서 질량 부하로 심층 필터에 통과되는, 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 용도.
  28. 단일클론 항체의 완충된 용액이 심층 필터를 통과할 때, 약 4.0 내지 약 7.5, 약 4.0 내지 약 7.2, 또는 약 4.0 내지 약 5.5의 범위에서 pH를 갖는, 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 용도.
  29. 단일클론 항체의 완충된 용액이 약 1 L/분*㎡ 내지 약 10 L/분*㎡, 약 1.5 L/분*㎡ 내지 약 8 L/분*㎡의 범위에서 유동률로, 또는 약 4.3 L/분*㎡인 유동률로 심층 필터에 통과되는, 전술한 청구항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 용도.
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