CN104854125A - 在不存在全能核酸酶的情况下分离synagis*的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明针对一种从组合物中分离抗体的方法。在一些实施例中，该方法包括从包含的组合物中分离该方法包括：(i)对该组合物进行一个离子交换色谱过程；(ii)对该组合物进行一个亲和纯化过程；以及(iii)对该组合物进行一个过滤过程，其中一种终产物包括获得自(i)、(ii)、和(iii)的其中该终产物适合于向人类给予并且具有≤0.5pg/mg的DNA浓度，并且其中该方法不包括向该组合物中添加全能核酸酶。

Description

在不存在全能核酸酶的情况下分离synagis*的方法
本申请包含一个经由EFS-Web向美国专利及商标局电子地提交为ASCII文本的序列表，提交名称为“RSVAB-300P1_序列表_ST25.txt”，具有10千字节的大小并且创建日期为2013年11月4日。该电子地提交的序列表充当37CFR§1.821(c)要求的纸质复印件以及§1.821(e)要求的CRF两者。该序列表中所含的信息通过引用结合在此。
发明领域
本发明针对一种从组合物中分离抗体的方法。在一些实施例中，该方法包括从包含的组合物中分离(帕利珠单抗)，该方法包括：(i)对该组合物进行一个离子交换色谱过程；(ii)对该组合物进行一个亲和纯化过程；以及(iii)对该组合物进行一个过滤过程，其中一种终产物包括获得自(i)、(ii)、和(iii)的其中该终产物适合于向人类给予并且具有≤0.5pg/mg的DNA浓度，并且其中该方法不包括向该组合物中添加全能核酸酶(benzonase)。
发明背景
抗体已经用于各种疾病与病症的治疗并且总体上衍生自使用真核或原核细胞系的细胞培养物。然而，在药物应用领域使用的抗体必须具有高纯度，尤其是对于来自细胞培养物的污染物而言，该细胞培养物包括细胞蛋白污染物、细胞DNA污染物、病毒以及其他可传染的药剂。参见“WHO关于在生物制品生产中作为体外基质的动物细胞的应用要求：关于生物活性物质No.50的要求”(“WHO Requirements for the use of animalcells as in vitro substrates for the production of biologicals:Requirements for Biological Substances No.50.”)878号，附录1，1998。
响应于关于污染物的关注点，世界卫生组织(WHO)对多种污染物水平进行设限。例如，WHO建议对于蛋白产品而言每个剂量的DNA限值小于10ng。同样地，美国食品与药品管理局(FDA)设定DNA限值为小于或等于0.5pg/mg蛋白。
为了实现药学上可接受的抗体要求的所需纯度水平，已经报道了用于分离抗体的多种方法。这些方法典型地涉及多个步骤以及除了其他细胞产物和污染物外，宿主细胞DNA清除的报告，以达到与政府监管的指导方针一致的纯度水平。这些分离步骤取决于不同因子而变化，包括进行分离的抗体的特征、要产生的量、表达系统、以及生长培养基。然而，一般而言该分离过程涉及用于表达抗体的细胞的初步裂解、DNA降解步骤、一个或多个色谱步骤、病毒去除步骤、以及一个过滤步骤，仅举几例。
确保必要纯度的过程可以是昂贵且耗时的。因此，经济有效纯化方法的发展对于制药和生物技术工业越来越重要。
发明概述
本发明针对一种从组合物中分离的方法。在一些实施例中，该方法包括从包含的组合物中分离该方法包括：(i)对该组合物进行一个离子交换色谱过程；(ii)对该组合物进行一个亲和纯化过程；并且(iii)对该组合物进行一个过滤过程，其中一种终产物包括获得自(i)、(ii)、和(iii)的其中该终产物适合于向人类给予并且具有≤0.5pg/mg的DNA浓度，并且其中该方法不包括向该组合物中添加全能核酸酶。
在一些实施例中，该方法不包括添加一种外源核酸酶到该组合物中。
在一些实施例中，本发明的方法进一步包括进行一个病毒灭活过程。例如，在一些实施例中，该病毒灭活过程包括在pH小于4.0下孵育该组合物。
在一些实施例中，该亲和纯化过程包括一个蛋白A纯化过程。在一些实施例中，该离子交换色谱过程是一个阳离子交换色谱过程。在一些实施例中，该阳离子交换过程包括使该抗体穿过选自下组的一种阳离子树脂，该组由以下各项组成：卡普托S(Capto S)、S-交联琼脂糖FF(S-Sepharose FF)、以及波罗斯50HS(Poros 50HS)。
在一些实施例中，该方法进一步包括一个第二离子交换过程。在一些实施例中，该第二离子交换过程是一个阴离子交换色谱过程。
在一些实施例中，该阴离子交换过程包括使该抗体穿过选自下组的一种阴离子膜，该组由以下各项组成：超级Q(Super Q)、那翠丝Q(Natrix Q)、科罗马索布Q(Chromasorb Q)以及木斯塘Q(Mustang Q)。
在一些实施例中，该终产物具有>80％(mol/mol)的抗体得率。在一些实施例中，该终产物的DNA浓度≤200ng/mg。
在一些实施例中，该组合物选自下组，该组由以下各项组成：免疫动物血清、腹水液、杂交瘤或骨髓瘤上清液、衍生自重组细胞系培养的条件培养基、以及产免疫球蛋白细胞的细胞提取物。
在一些实施例中，该组合物来自一个生物反应器。在一些实施例中，该组合物具有大于100升的体积。在一些实施例中，该组合物具有大于1000升的体积。
在一些实施例中，该亲和纯化过程发生在该离子交换过程后。在一些实施例中，该过滤过程发生在该亲和过程后。
在一些实施例中，该方法包括从包含的组合物中分离该方法包括：(i)对该组合物进行一个阳离子交换色谱过程以形成一种包含该抗体的第一产物；(ii)添加一种缓冲液到该第一产物中以形成一种缓冲产物；(iii)对该缓冲产物进行一个亲和纯化过程以形成一种包含该抗体的第二产物；(iv)对该第二产物进行一个过滤过程以形成一种包含该抗体的第三产物；(v)对该第三产物进行一个病毒灭活过程；并且(vi)配制该第三产物以形成一种终产物，其中该终产物包含适合于向人类给予并且具有≤0.5pg/mg的DNA浓度；其中该方法不包括向该组合物中添加全能核酸酶。
在一些实施例中，该方法包括从包含的组合物中分离该方法包括下列(i)-(v)中的至少三个：(i)对该组合物进行一个阳离子交换色谱过程；(ii)对该组合物进行一个亲和纯化过程；(iii)对该组合物进行一个超滤过程；(iv)对该组合物进行一个病毒灭活过程；以及(v)对该组合物进行一个阴离子交换色谱过程；其中获得自(i)-(v)中的至少三个的产物包含适合于向人类给予并且具有≤0.5pg/mg的DNA浓度；并且其中该方法不包括向该组合物中添加全能核酸酶。
附图简要说明
图1是实例1中描述的“全能核酸酶”以及“无全能核酸酶”(benzonase-free)过程的示意图。该过程包括阳离子交换色谱过程、三/氯化镁缓冲液添加、蛋白A色谱过程、纳米过滤、低pH处理、以及阴离子交换色谱过程。
图2是实例2中描述的过程的示意图。左栏表示其中在阳离子色谱过程后加或“添加”(spike)了DNA的分离过程。右栏表示其中在低pH处理过程之后添加了DNA的分离过程。
发明详细说明
本发明在部分上是基于在不存在全能核酸酶的情况下，对分离抗体或其片段的方法的开发。在一些实施例中，本发明的方法提供分离的抗体，该方法包括：(i)对该组合物进行一个离子交换色谱过程；(ii)对该组合物进行一个亲和纯化过程；以及(iii)对该组合物进行一个过滤过程，其中一种终产物获得自(i)、(ii)、和(iii)，其中该终产物适合于向人类给予并且具有≤0.5pg/mg的DNA浓度，并且其中该方法不包括向该组合物中添加全能核酸酶。在一些实施例中，该抗体具有大于8.0的等电点。在一些实施例中，该抗体具有大于9.0的等电点。
在一些实施例中，本发明的方法使得制造商能够以更有效的方式生产适用于向人类给予的抗体药物产品，该方式为通过降低成本、减少方法步骤、降低错误机会、降低不安全或不适当添加剂引入的机会等等，通过省去全能核酸酶或在一些实施例中任何外源核酸酶的添加。在本发明中，抗体可以在不添加全能核酸酶的情况下来分离，以前该全能核酸酶已在适合于向人类给予的抗体的分离过程中被添加。全能核酸酶是指全能 核酸酶(默克公司(Merck KGaA)，英国)，一种来自粘质沙雷菌的基因工程化的2亚基(各自30kDa)核酸内切酶，它降解所有形式的DNA和RNA(单链、双链、线性和环状的)。参见，例如，全能核酸酶产品表和美国专利号5,173,418，将两者以其全文特此结合。
在一些实施例中，本发明的方法不包括在分离过程中将一种外源核酸酶添加到该组合物中。外源核酸酶是指衍生自或从外部源自包含被分离抗体的组合物的任何核酸酶的添加。由此，术语外源核酸酶包括以蛋白质形式添加至包含该抗体的组合物中的任何核酸酶。外源核酸酶还包括从衍生自或外部源自该组合物(例如基因修饰有机体)的遗传物质表达的任何核酸酶，其中该基因修饰包括编码并能够表达核酸酶的遗传物质的插入。在一些实施例中，在此描述的方法不包括添加一种核酸内切酶。在一些实施例中，在此描述的方法不包括添加一种核酸外切酶。
在此描述的方法提供了用于从一种组合物分离一种抗体例如的方法，其中该组合物包括该抗体以及一种或多种杂质。术语“分离(isolate，isolating和isolation)”是指将该抗体与组合物中的杂质或其他污染物分开。在一些实施例中，将至少50％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、或99.9％(w/w)的杂质纯化离开抗体。例如，在一些实施例中，一种抗体例如的纯化包括将该抗体与最初存在于该组合物中的99％(w/w)的宿主细胞蛋白分开。
在一些实施例中，术语“分离(isolate，isolating和isolation)”指的是将一种抗体(例如)与组合物中的杂质或其他污染物在一定程度上分开以与政府组织(例如世界卫生组织或美国食品与药物管理局)的准则一致。例如，“分离(isolating)”可以指代DNA从该组合物的一定程度的去除，其中终产物包括≤0.5pg DNA/mg蛋白质。
如在此使用的术语“组合物”是指一种抗体例如与一种或多种化合物、生物材料、和或任何其他不同于该感兴趣抗体的分子的混合物。出于便利目的，该组合物的除该感兴趣抗体之外的所有元素(例如，化合物、生物材料、和或任何其他不同于该感兴趣抗体的分子)将称为“杂质”。在一些实施例中，该组合物包括生物物质、细胞宿主有机体(例如，哺乳动物细胞)、以及足以使宿主有机体繁殖并允许该抗体的表达或生产的生长培养基。在一些实施例中，该杂质可以包括感兴趣抗体的多聚体(例如，二聚体、三聚体，等)。在一些实施例中，该杂质可以包括不希望的截短形式的抗体，或凝聚形式(例如，错误折叠或变性形式)的抗体。
如在此使用的术语“组合物”可以在本发明的方法中经历不同的转化。例如，在该方法开始时，该组合物可以包括相对低浓度的抗体和高浓度的杂质。随着该方法的进展，在该组合物中一种或多种杂质的浓度可以降低和/或该抗体的浓度可以升高。
在一些实施例中，该杂质可以包括完整的哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)或鼠类骨髓瘤细胞(NSO细胞))、或部分细胞(例如细胞碎片)。在一些实施例中，该杂质包括蛋白质(例如，可溶或不溶性蛋白质、或蛋白质片段，如来自宿主细胞蛋白)、脂类(例如，细胞壁材料)、核酸(例如染色体或染色体外的DNA)、核糖核酸(t-RNA或mRNA)、或其组合，或不同于感兴趣抗体的任何其他细胞碎片。在一些实施例中，该杂质可以源自产生或包含感兴趣抗体例如的宿主有机体。例如，杂质可以是表达感兴趣蛋白质的原核或真核细胞的细胞组分(例如，细胞壁、细胞蛋白、DNA或RNA等)。在一些实施例中，该杂质不是来自宿主有机体，例如杂质可以来自细胞培养基或生长培养基、缓冲液、或培养基添加剂。如在此使用的杂质可以包括单一不希望的组分、或一些不希望的组分的组合。
在一些实施例中，该组合物选自下组，该组由以下各项组成：免疫动物血清、腹水液、杂交瘤或骨髓瘤上清液、衍生自重组细胞系培养的条件培养基、以及产免疫球蛋白细胞的细胞提取物。本发明的抗体可以分离自包含生长培养基和各种真核细胞如哺乳动物细胞的组合物。本领域技术人员可以依据感兴趣抗体的详情选择一种适当的细胞系。本发明的哺乳动物细胞，包括用于本发明的方法中的哺乳动物细胞的，是能够在培养中生长的任何哺乳动物细胞。示例性哺乳动物细胞包括例如CHO、VERO、BHK、海拉(HeLa)、CV1、MDCK、293、3T3、C127、PC12、HEK-293、PER C6、Sp2/0、NSO、W138细胞以及骨髓瘤细胞系(尤其是鼠类的)。还可以使用衍生自前述细胞的任一种的哺乳动物细胞。
在一些实施例中，该组合物包括培养基、或源自培养基的浓缩的细胞。培养基的选择与使用对于本领域技术人员而言是已知的。在一些实施例中，该培养基是一种细胞培养基。根据被繁殖的细胞培养物的类型，细胞培养基可变化。在一些实施例中，该细胞培养基是可商购的培养基。在一些实施例中，该组合物包括这样的培养基，该培养基包括例如，无机盐、碳水化合物(例如，糖类，如葡萄糖、半乳糖、麦芽糖或果糖)、氨基酸、维生素(例如，B族维生素(例如，B12)、维生素A、维生素E、核黄素、硫胺素和生物素)、脂肪酸和脂类(例如，胆固醇和类固醇)、蛋白质和肽(例如，白蛋白、转铁蛋白、纤连蛋白和胎球蛋白)、血清(例如，包含白蛋白、生长因子和生长抑制剂的组合物，如胎牛血清、新生小牛血清以及马血清)、痕量元素(例如，锌、铜、硒以及三羧酸中间体)及其组合。生长培养基的实例包括但不限于基础培养基(例如MEM、DMEM、GMEM)、复合培养基(RPMI 1640、Iscoves DMEM、Leibovitz L-15、LeibovitzL-15、TC 100)、无血清培养基(例如CHO、Ham F10和衍生物、Ham F12、DMEM/F12)。在培养基中发现的一般缓冲液包括PBS、汉克斯(Hanks)BSS、厄尔斯(Earles)盐、DPBS、HBSS、和EBSS。用于培养哺乳动物细胞的培养基在本领域中是熟知的，并且可获得自例如西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Corporation)(圣路易斯，密苏里州)、HyClone(洛根，犹他州)、英杰公司(Invitrogen Corporation)(卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、Cambrex公司(E.拉塞福(Rutherford)，新泽西州)、JRH生物科学公司(莱内克萨，堪萨斯州)、欧文科学公司(Irvine Scientific)(圣安娜，加利福尼亚州)等。在培养基中发现的其他组分可以包括抗坏血酸盐、柠檬酸盐、半胱氨酸/胱氨酸、谷氨酰胺、叶酸、谷胱甘肽、亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、油酸、棕榈酸、吡哆醛/吡哆醇、核黄素、硒、硫胺素、转铁蛋白。本领域的技术人员将会认识到有对培养基的多种修改，这些修改落入本发明的范围内。在一些实施例中，该培养基可以包括牛的产物，例如血清白蛋白、转铁蛋白、脂蛋白部分、或其组合。在一些实施例中，通过从被美国农业部和欧洲共同体认为是无BSE的来源获得牛的产物降低了传播牛海绵状脑病(BSE)的风险。
术语抗体是指多克隆、单克隆、多特异性、人类、人源化或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab')2片段、通过Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗-Id)抗体、以及上述任一个的表位结合片段。在一些实施例中，术语“抗体”是指单克隆抗体。术语“抗体”还指代免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免疫特异性地结合抗原的抗原结合位点的分子。可以通过本发明的方法纯化的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA以及IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、以及IgG4)或子类。在一个优选实施例中，该抗体是IgG或IgA，最优选是IgG。
在一些实施例中，该有待分离的抗体是(Synagis，医学免疫公司(MedImmune))是一种重组人源化(嵌合鼠类-人类)IgG1κ单克隆抗体糖蛋白，具有针对呼吸道合胞体病毒(RSV)的F(融合)蛋白的A抗原性位点中的表位的特异性。帕利珠单抗可以从稳定的鼠类(小鼠)骨髓瘤细胞系(NSO)表达。在一些商业实施例中，是由两个重链(各50.6kDa)和两个轻链(各27.6kDa)组成，包含按重量计1％-2％的碳水化合物，并且具有的分子量(MALDI-TOF)。
在一些实施例中，抗体含有具有氨基酸序列SEQ IDNO:1的重链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:6的的轻链。在一些实施例中，抗体包括重链氨基酸序列SEQ ID NO:1或重链FAB氨基酸序列SEQ ID NO:2的重链可变区，以及轻链氨基酸序列SEQ ID NO:6的轻链可变区。在一些实施例中，抗体包括具有氨基酸序列TSGMSVG(SEQ ID NO:3)的重链H1互补决定区(CDR)，具有氨基酸序列DIWWDDKKDYNPSLKS(SEQ ID NO:4)的重链H2CDR，具有氨基酸序列SMITNWYFDV(SEQ ID NO:5)的重链H3CDR；具有氨基酸序列KCQLSVGYMH(SEQ ID NO:7)的轻链L1CDR、具有氨基酸序列DTSKLAS(SEQ ID NO:8)的轻链L2CDR、以及具有氨基酸序列FQGSGYPFT(SEQ ID NO:9)的轻链L3CDR。该抗体及其氨基酸序列披露于例如约翰逊(Johnson)等人，1997，《感染疾病杂志》(J.Infec.Dis)76:1215-1224以及美国专利5,824,307。
在一些实施例中，有待分离的抗体是一种不同的可商购的抗体，选自下组，该组由以下各项组成：阿达木单抗(雅培公司(Abbott Laboratories))、依库珠单抗(亚力兄制药(AlexionPharmaceuticals))、利妥昔单抗(罗氏/百健艾迪公司/中外制药(Roche/Biogen Idec/Chugai))、英利昔单抗(类克强生公司/先灵葆雅公司/塔纳贝公司(Johnson&Johnson/Schering-Plough/Tanabe))、曲妥珠单抗(赫赛汀 罗氏/中外制药)，贝伐单抗(阿瓦斯丁中外制药/罗氏)、帕利珠单抗(医学免疫公司/雅培(MedImmune/Abbott))、阿仑单抗(坎帕斯健赞公司(Genzyme))、以及莫他珠单抗(医学免疫公司)。
在一些实施例中，有待分离的抗体具有大于8.0的等电点。在一些实施例中，具有高等电点的抗体可以易于与酸性核酸共纯化。由于DNA与感兴趣抗体共纯化的倾向，并且为了清除终产物中的痕量DNA，传统上使用酶降解作为DNA减少步骤。诸位发明人已经发现在此所述的方法足以将抗体组合物中的DNA去除到与政府规定一致的一定水平，同时省去全能核酸酶或在一些实施例中任何核酸酶的使用。在一些实施例中，该抗体具有大于8.5、大于9.0、大于9.5或大于10.0的等电点。在一些实施例中，该抗体具有8.0-13.0、8.5-12.0、8.7-11.0、或9.0-10.0的等电点。在一些实施例中，该抗体具有大于约9.0的等电点。在一些实施例中，该抗体具有大于9.0的等电点。由此，在一些实施例中，该方法包括从包含该抗体的组合物分离具有大于9.0的等电点的抗体，该方法包括：(i)对该组合物进行一个离子交换色谱过程；(ii)对该组合物进行一个亲和纯化过程；以及(iii)对该组合物进行一个过滤过程，其中一种终产物获得自(i)、(ii)、和(iii)，其中该终产物适合于向人类给予并且具有≤0.5pg/mg的DNA浓度，并且其中该方法不包括向该组合物中添加全能核酸酶。
在一些实施例中，除了之外的抗体是使用本发明的方法分离的。抗体还可以包括嵌合、单链、和人源化抗体。抗体的实例可以包括商业化抗体，例如那他珠单抗(人源化抗-a4整合素单克隆抗体)、人源化抗-αVβ6单克隆抗体、人源化抗-VLA1IgG1κ单克隆抗体；huB3F6(人源化IgG1/κ单克隆抗体)。在一些实施例中，该抗体是针对CD-3、CD-4、CD-8、CD-19、CD-20、CD-34、CD-52、HER-4、HER-3、HER-2、TNF、和/或VLA-4的重组单克隆抗体。在一些实施例中，该抗体是针对RSV的F蛋白的A抗原性位点中的表位的重组单克隆抗体。
通过本发明的方法产生的抗体可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。在一些实施例中，通过本发明的方法纯化的抗体是人类、鼠类(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡的。如在此使用的，“人类”抗体包括具有人类免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人类免疫球蛋白文库分离的抗体或来自针对一种或多种人类免疫球蛋白的转基因的且不表达内源性免疫球蛋白的动物。参见例如库彻拉帕廷(Kucherlapati)等人的美国专利号5,939,598。
根据本发明产生和使用的抗体可以包括例如天然的抗体、完整单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、抗体片段(例如结合至和/或识别一种或多种抗原的抗体片段)、人源化抗体、人类抗体(雅克布维茨(Jakobovits)等人，《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:2551(1993)；雅克布维茨(Jakobovits)等人，《自然》(Nature)362:255-258(1993)；布鲁格曼(Bruggermann)等人，免疫学之年(Year in Immunol.)7:33(1993)；美国专利号5,591,669和5,545,807)、抗体以及从抗体时期文库中分离的抗体片段(麦卡菲蒂(McCafferty)等人，《自然》(Nature)348:552-554(1990)；克拉克森(Clackson)等人，《自然》(Nature)352:624-628(1991)；玛尔柯斯(Marks)等人，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)222:581-597(1991)；玛尔柯斯(Marks)等人，《生物技术》(Bio/Technology)10:779-783(1992)；沃特豪斯(Waterhouse)等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)21:2265-2266(1993))。通过本发明的方法纯化的抗体可以重组地融合至异源多肽的N-或C-末端或用化学方法轭合(包括共价地和非共价地轭合)至多肽或其他组合物上。例如，通过本发明的方法纯化的抗体可以重组地融合或轭合至在检测测定中可用作标签的分子和效应分子(诸如异源多肽、药物或毒素)上。参见例如PCT公开案WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利号5,314,995；以及EP 396,387。
根据本发明，在一些实施例中，该抗体可以由例如在细胞培养物中生长的活细胞产生或表达。如在此使用的术语“表达”(“express”或“expression”)是指基因产生生物化学物质例如多肽(如抗体)的过程。该表达可以包括基因在细胞内的功能性存在的任何表现，包括但不限于基因敲除和瞬时表达与稳定表达两者。它可以包括而不限于将基因转录成信使RNA(mRNA)，和将这种mRNA翻译成多肽。由此，表达可以包括抗体和任何前体的产生。基因的表达可以产生“基因产物”，其中该基因产物可以是核酸，例如通过基因转录产生的信使RNA，或从转录物翻译的多肽。在此描述的基因产物进一步包括具有转录后修饰(例如多聚腺苷酸化)的核酸，或具有翻译后修饰(例如甲基化、糖基化、添加脂质、与其他蛋白质亚单位相关联、蛋白裂解等)的多肽。该抗体还可以由细胞产生，例如通过细胞的代谢作用产生的代谢物，例如小分子。术语“产生”包括如上所述的“表达”以及其中细胞产生感兴趣生物物质的其他方法。
分离抗体的方法可以包括各种本领域中已知的方式，例如离心、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、亲和色谱、过滤、以及上述组合，仅举几例。纯化方法大体上是基于抗体的特征来选择的，该纯化方法使抗体区分于组合物中的与该抗体共存的一种或多种杂质。然而，根据在此提供的方法，在分离过程中在任何点不添加或表达全能核酸酶。
如在此所述的方法可以使用离子交换色谱过程，以从该组合物中的一种或多种杂质分离抗体，例如离子交换色谱是指阳离子交换色谱和阴离子交换色谱两者。出于在此的目的，“阳离子交换色谱”是指包含该抗体和一种或多种杂质的组合物可以基于电荷差采用阳离子交换基质来分离的任何方法。阳离子交换基质大体上包括共价结合的负电荷基团。可以使用弱的或强的阳离子交换树脂。通常，强阳离子交换树脂包括含有磺酸或磺酸酯基团(取决于pH)的被负载的有机基团。弱阳离子交换树脂通常包括含有羧酸或羧酸酯基团(取决于pH)的被负载的有机基团。在某些实施例中，可以使用多峰阳离子交换树脂，其结合了另外的结合机制以及离子相互作用，例如氢键相互作用和疏水相互作用中的一者或多者。适合的阳离子交换树脂的实例是本领域中熟知的，并且可以包括但不限于Fractogel、羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸盐(P)以及磺酸盐(S)、PROPAC WCX-10TM(戴安公司(Dionex)、卡普托S、S-交联琼脂糖FF、Fractogel EMD SO3M、Toyopearl Megacap II SP 550C、波罗斯50HS、以及SP-交联琼脂糖基质。在优选实施例中，该阳离子树脂选自卡普托S、S-交联琼脂糖FF、Fractogel EMD SO3M、Toyopearl MegacapII SP 550C、波罗斯50HS，最优选波罗斯50HS。在一些实施例中，可以对该组合物使用多于一个阳离子交换色谱过程。在一些实施例中，该阳离子交换色谱过程是以相对于抗体的结合模式来使用，即，使用所述过程而使得该感兴趣抗体被吸附到阳离子交换基质上，同时一种或多种杂质不被吸附，由此将抗体从杂质分离。在一些实施例中，将该阳离子交换基质用缓冲液洗涤一次或多次，以去除额外的杂质，之后将吸附的抗体从阳离子交换基质去除。在已经使用阳离子交换色谱以结合模式将一种或多种杂质从一种组合物去除之后，可以将吸附的抗体从阳离子交换基质洗脱。从阳离子交换洗脱抗体的方法取决于基质，并且对于本领域技术人员来说是已知的。
可替代地，在一些实施例中，该阳离子交换过程可以按照流经模式(flow-thru mode)来使用，即，使用所述过程而使得该感兴趣抗体不被吸附到阳离子交换基质上，同时一种或多种杂质被吸附到基质上，由此将抗体从杂质分离。在流经模式中，一种或多种杂质被吸附到(或被阻止到)阳离子交换基质上，并且抗体穿过基质进入流经溶液中。
在一些实施例中，该阳离子交换色谱过程的产物，例如从波罗斯50HS色谱基质的洗脱物，可以产生具有表1中的特征的产物。
表1.阳离子交换色谱过程产生的产物的特征
在一些实施例中，该离子交换色谱过程是一种阴离子交换色谱过程。出于在此的目的，“阴离子交换色谱”是指包含该抗体和一种或多种杂质的组合物可以基于电荷差采用阴离子交换基质来分离的任何方法。阴离子交换基质大体上包括共价结合的正电荷基团。可以使用强的或弱的阴离子交换基质。强阴离子交换基质的实例包括例如具有季铵离子的那些。弱阴离子交换基质的实例包括例如具有叔胺或仲胺官能团例如DEAE(二乙氨乙基)的那些。在某些实施例中，可以使用多峰阴离子交换基质，其结合了另外的结合机制以及离子相互作用，例如氢键相互作用和疏水相互作用中的一者或多者。适合的阴离子交换基质的实例在本领域中是已知的，并且可以包括但不限于超级Q、沙多本Q(Sartobind Q)、那翠丝Q、科罗马索布Q以及木斯塘Q。在一些实施例中，可以对该组合物使用多于一个阴离子交换过程。
在一些实施例中，该阴离子交换色谱过程是以相对于抗体的结合模式来使用，即，使用所述过程而使得该感兴趣抗体被吸附到阴离子交换基质上，同时一种或多种杂质不结合，由此将抗体从杂质分离。在一些实施例中，将该阴离子交换基质用缓冲液洗涤一次或多次，以去除额外的杂质，之后将吸附的抗体从阴离子交换基质去除。在已经使用阴离子交换色谱以结合模式将一种或多种杂质从一种组合物去除之后，可以将吸附的抗体从阴离子交换基质去除。
在一些实施例中，该阴离子交换过程可以按照流经模式(flow-thru mode)来使用，即，使用所述过程而使得该感兴趣抗体不被大量吸附到阴离子交换基质上，同时一种或多种杂质被吸附(或被阻止到)基质上，由此将抗体从杂质分离。在已经使用阴离子交换色谱以流经模式将一种或多种杂质从一种组合物去除之后，可以从阴离子交换基质的流经物中获得吸附的抗体。
在一些实施例中，本发明的方法可以包括多于一个离子交换过程，例如第二离子交换过程。在一些实施例中，该第一离子交换过程是一个阳离子交换过程，并且该第二离子交换过程是一个阴离子交换过程。在一些实施例中，使用了三个离子交换色谱过程。
在此所述的方法可以使用亲和纯化过程，以从该组合物中的一种或多种杂质分离该抗体。如在此使用的，“亲和纯化过程”或“亲和色谱”是指将抗体借助其对于抗体的亲和配体的特异性结合特性来进行纯化的分离方法。在一些实施例中，功能性亲和配体可以固定在固体或半固体支持体上，从而使得当包含该抗体的组合物经过配体和固体支持体时，具有针对该配体的特异性结合亲和力的抗体吸附到该配体上，并且该组合物的一种或多种其他组分不被吸附或以较低的亲和力结合，并且可以与抗体分开。在一些实施例中，将包含该配体的固体支持体用缓冲液洗涤一次或多次，以去除额外的杂质，之后将吸附的抗体从配体和支持体去除。在已经将一种或多种杂质去除之后，可以将吸附的抗体从配体和支持体去除，导致抗体与原初组合物的分离。
从配体和支持体去除抗体的方法取决于配体，并且对于本领域的技术人员来说是已知的，并且可以包括例如环境方面(例如，pH)的改变、离液剂或变性剂的添加、或可商购的洗脱缓冲液的添加。在一些实施例中，可以对包含该抗体的该组合物使用多于一个亲和纯化过程。
各种亲和纯化过程是本领域中已知的，并且包括而不限于蛋白A、蛋白G、或其组合作为配体的使用。配体可以固定在各种支持体例如树脂上。在一些实施例中，该亲和纯化过程包括一个蛋白A纯化过程，例如其中该抗体被吸附到蛋白A上，并且蛋白A与固定化支持体例如树脂偶联。各种蛋白A亲和系统是可商购的，并且包括MabSelect、MabSelect SuRe、MabSelect Xtra、Sepaharose CL-4B、ProSep vA、ProSep vA Ultra、CeramicHyperD、以及Poros MabSelect。在一些实施例中，该亲和纯化过程包括一个蛋白G纯化过程，例如其中该抗体被吸附到蛋白G上，并且蛋白G与固定化支持体例如树脂偶联。即用型树脂和纯化试剂盒对于本领域技术人员来说是已知的。
在一些实施例中，该配体是偶联到固定化支持体上的抗原，例如肽或半抗原，其中该抗体被选择性地吸附到该抗原上。用于经由各种化学品制备固定化抗原的活化树脂和完整的试剂盒对本领域技术人员来说是已知的。
在一些实施例中，其他配体可以使用，并且在本领域中是已知的。参见，例如，参考文本《亲和分离：实践方法》(Affinity Separations:A Practical Approach)(实践方法系列(Practical Approach Series))，保罗马泰舒克(Paul Matejtschuk)(编辑)，Irl Pr(1997)；以及《亲和色谱》(Affinity Chromatography)，赫伯特斯科特(Herbert Schott)，马塞尔德克尔(Marcel Dekker)，纽约(1997)。例如，亲和配体可以包括抗体和抗体片段、天然配体或配体类似物(例如，针对特定受体)、以及天然结合配偶体或其类似物(例如，多亚基复合物)。
在一些实施例中，该组合物经历多个循环的亲和纯化过程。在一些实施例中，亲和纯化过程的产物，例如从蛋白A亲和基质的流经物，可以产生具有表2中的特征的产物：
表2.亲和纯化过程产生的产物的特征
本发明的方法可以使用过滤过程，以从该组合物中的一种或多种杂质分离该抗体。术语“过滤过程”以及“过滤”是指通过使组合物穿过一个或多个具有指定孔大小直径的半渗透性过滤器(或膜或介质)从组合物去除悬浮颗粒的过程，其中较大的分子(通常>103-106Da)被保留在过滤器上，而水和较低分子量的分子穿过过滤器。
在一些实施例中，在过滤之后，本发明的抗体基本上处于渗透物流中(即，它穿过过滤孔并且被收集)，而杂质(例如，细胞碎片、DNA、和/或宿主细胞蛋白)基本上处于滞留物流中。在一些实施例中，在过滤之后，本发明的抗体基本上处于滞留物流中，而杂质基本上处于渗透物流中。当提及过滤时，术语“渗透物流”是指在过滤期间穿过过滤器孔的该组合物的部分。当提及过滤时，术语“滞留物流”是指在过滤期间保留在过滤器上或不穿过过滤器孔的该组合物的部分。
适合类型的过滤装备对本领域技术人员来说是已知的，并且可以基于各种因素来选择，例如，有待过滤的抗体的分子量、有待过滤的组合物的组分的量和大小、有待过滤的组合物的体积、以及细胞密度和有待过滤的组合物的生存力。在一些实施例中，可以使用过滤器，例如膜式超滤器、板式超滤器、筒式超滤器、袋式超滤器、或真空超滤器。可使用的可商购超滤器是由不同的供应商生产的，例如密理博公司(比勒利卡，马萨诸塞州)、颇尔公司(Pall Corporation)(东山(East Hills)，纽约州(N.Y.))、GE医疗科学(皮斯卡塔韦，新泽西州)、以及赛多利斯公司(Sartorius Corporation)(哥廷根(Goettingen)，德国)。
在一些实施例中，该方法进一步包括病毒灭活过程。如在此使用的，“病毒灭活过程”是指(1)病毒的灭活，(2)病毒的物理去除，或(3)其组合。当提及病毒的灭活时，病毒可以保留在终产物中，但是处于非感染性形式。在一些实施例中，该病毒灭活过程包括将该组合物在例如足以将病毒灭活(例如，变性)的低pH下进行孵育。在一些实施例中，该病毒灭活过程包括将该组合物的pH调节至大约5.0或更低、大约4.5或更低、大约4.0或更低、或大约3.5或更低的pH。在一些实施例中，该组合物的pH被调节至大约1.0至大约5.0、大约1.5至大约4.5、大约2.0至大约4.0、或大约2.5至大约3.5的pH。在一些实施例中，该病毒灭活过程包括将该组合物在低于大约4.0、大约2.8至大约3.2、或大约3.0的pH进行孵育。在一些实施例中，该病毒灭活过程包括将包含该抗体的该组合物在低于4.0的pH下进行孵育。
该组合物的pH可以被降低持续不同的足以用于发生病毒灭活的时间长度，例如，1分钟至2小时、或10分钟至90分钟，优选20分钟至80分钟，更优选25分钟至35分钟，甚至更优选大约30分钟。改变pH的方法对于本领域的技术人员来说是已知的。
在一些实施例中，该病毒灭活过程可以包括用溶剂或洗涤剂进行处理、辐照、和/或短暂暴露于足以灭活病毒的高温中。通过这些方式进行病毒灭活的方法对于本领域技术人员来说是已知的，并且本领域技术人员可以选择有待在根据本发明的抗体分离过程中使用的适当处理。
在一些实施例中，该病毒灭活过程可以包括通过纳米过滤的方式将病毒从组合物进行物理去除。术语“纳米过滤”是指组合物经由基质例如过滤器、膜等的物理通过，使得该组合物中的抗体与一种或多种病毒分离。在一些实施例中，纳米过滤包括使该组合物通过具有小于75nm、50nm、40nm、35nm、30nm、25nm、20nm或15nm的孔径的基质。各种纳米过滤器是可商购的并且在本领域中是已知的。
在一些实施例中，使用了两个单独的病毒灭活过程，例如(1)包括将该组合物在低于4.0的pH下进行孵育的病毒灭活过程，以及(2)包括使该组合物经历纳米过滤过程的病毒灭活过程。在一些实施例中，使用三个或更多个单独的病毒去除过程。
在一些实施例中，在此描述的方法可以产生包含抗体例如的终产物，其中该终产物适合于向人类给予。如在此使用的，术语“适合于向人类给予”包括如世界卫生组织“关于在生物制品生产中作为体外基质的动物细胞的应用要求(关于生物活性物质No.50的要求)”(“Requirements for the Use of Animal Cells as in vitro Substratesfor the Production of Biologicals,(Requirements for BiologicalSubstances No.50”)(世界卫生组织，WHO技术报告系列，878号，1998)确立的小于10ng DNA/剂抗体产物的限值。在一些实施例中，该术语“适合于向人类给予”可以包括一个更严格的限制，这取决于抗体产品。例如，在一些实施例中，“适合于向人类给予”可以包括小于52.5pg/剂，假定基于15mg抗体/kg体重的剂量而言105mg蛋白质为最大剂量。在一些实施例中，该术语“适合于向人类给予”可以包括小于或等于0.5pg DNA/mg蛋白质，如通过杂交方法所确定的。在一些实施例中，该术语“适合于向人类给予”可以包括小于或等于0.4pg DNA/mg蛋白质，小于或等于0.3pgDNA/mg蛋白质，小于或等于0.2pg DNA/mg蛋白质，小于或等于0.1pgDNA/mg蛋白质，如通过杂交方法所确定的。
在一些实施例中，该术语“适合于向人类给予”可以包括小于或等于25ng DNA/mg蛋白质，如通过PicoGreen方法所确定的。在一些实施例中，该术语“适合于向人类给予”可以包括小于或等于0.2pg DNA/mg蛋白质，如通过杂交方法所确定的。
在此所述的抗体分离方法导致终产物的形成，其中该终产物适合于向人类给予并且具有≤0.5pg/mg的DNA浓度。在一些实施例中，终产物符合表3中描述的参数。
表3.终产物的可能参数
在一些实施例中，终产物符合表4中描述的参数：
表4.终产物的其他可能的参数
参数 优选限值 更优选的限值
总蛋白浓度 97-108mg/mL 97-103mg/mL
胰岛素 ≤6μIU/mg蛋白质 ≤2μIU/mg蛋白质
牛转铁蛋白 ≤1.5ng/mg蛋白质 ≤0.3ng/mg蛋白质
酚红 ≤6ng/mg蛋白质 ≤3ng/mg蛋白质
牛脂蛋白 ≤816ng/mg蛋白质 ≤210ng/mg蛋白质
r蛋白A ELISA ≤20ng/mg蛋白质 ≤2ng/mg蛋白质
全能核酸酶 ≤0.0U/mg蛋白质 ≤0.0U/mg蛋白质
由本发明的方法得到的在终产物中的抗体的浓度可以不同。在一些实施例中，本发明的方法导致一种终产物，其中该抗体浓度是大约10mg/ml至大约500mg/mL、大约20mg/mL至大约250mg/mL、大约50mg/mL至大约200mg/mL、或大约75mg/mL至大约150mg/mL。在一些实施例中，本发明的方法导致一种终产物，其中该抗体浓度是大约90mg/ml至大约120mg/mL、或大约100mg/mL。
当分离抗体时，在一些实施例中，例如在商业生产过程中，大体积的组合物可以存在。表达有待分离的抗体的细胞培养物可以在适当地定制尺寸以用于大规模生产的容器(例如生物反应器)中生长。大体积为分离过程提出了一些挑战。例如，当使用大体积时，在通过过滤器的流率方面的小变化对分离抗体的回收的影响被放大。同样，当使用大体积时，单一步骤、过程、或组分由于该步骤、过程或组分的规模比例，放大影响。例如，在实验室规模上的单一组分的添加的经济成本可以是微不足道的，但在大体积时相同组分的添加的经济成本可以是显著的。在此描述的方法由于全能核酸酶或在一些实施例中核酸酶的省略，可以提供用于大体积的优势，可以导致未曾领会到的在实验室规模生产中的经济效率。由此，大体积的组合物将呈现出如下独特问题，这些问题被放大，并且具有相对于使用小体积的更大的波及面。
由此，在一些实施例中，本发明针对分离抗体的方法，其中该组合物是来自一种生物反应器。在一些实施例中，该组合物是以大体积存在的。术语“大体积”是指与抗体的商业和/或工业生产相关联的体积。在一些实施例中，该组合物具有大于100升的体积。在一些实施例中，该组合物具有大于1000升的体积。在一些实施例中，该组合物具有以下体积：至少500升、至少750升、至少1,000升、至少1,250升、至少1,500升、至少2,000升、至少5,000升或至少10,000升。
在一些实施例中，本发明的方法提供了使用不同的有序的步骤对抗体进行的逐步分离，导致终产物的形成。在一些实施例中，该亲和交换过程是在该离子交换过程后进行。在一些实施例中，该过滤过程是在该亲和纯化过程之后进行。在一些实施例中，该离子交换过程是在亲和交换过程之后进行。在一些实施例中，该亲和纯化过程是在该过滤过程之后进行。在一些实施例中，从一种包含抗体的组合物分离该抗体例如的方法包括：(i)对包含该抗体的该组合物进行一个阳离子交换色谱过程以形成一种包含该抗体的第一产物；(ii)添加一种缓冲液到该第一产物中以形成一种缓冲产物；(iii)对该缓冲产物进行一个亲和纯化过程以形成一种包含该抗体的第二产物；(iv)对该第二产物进行一个过滤过程以形成一种包含该抗体的第三产物；(v)对该第三产物进行一个病毒灭活过程；并且(vi)配制该第三产物以形成一种终产物，其中包含该抗体的该终产物适合于向人类给予并且具有≤0.5pg/mg的DNA浓度；其中该方法不包括向该组合物中添加全能核酸酶。
在一些实施例中，从一种包含抗体的组合物分离该抗体例如的方法包括下列(i)-(v)中的至少三个：(i)对该组合物进行一个阳离子交换色谱过程；(ii)对该组合物进行一个亲和纯化过程；(iii)对该组合物进行一个超滤过程；(iv)对该组合物进行一个病毒灭活过程；以及(v)对该组合物进行一个阴离子交换色谱过程；其中获得自(i)-(v)中的至少三个的产物适合于向人类给予并且具有≤0.5pg/mg的DNA浓度；并且其中该方法不包括向该组合物中添加全能核酸酶。
从如在此所述的方法得到的终产物可以具有>80％(mol/mol)的抗体得率。如在此所述的抗体得率是指相对于进行抗体分离之前原初组合物中存在的抗体的量，终产物中的抗体的得率。在一些实施例中，从如在此所述的方法得到的终产物可以具有>85％(mol/mol)、>90％(mol/mol)、或>95％(mol/mol)的抗体得率。
可以在分离过程中使用不同的缓冲液系统。在一些实施例中，该缓冲液选自下组，该组由以下各项组成：MES缓冲液、Tris缓冲液、磷酸钠缓冲液、邻苯二甲酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液及其组合。在一些实施例中，该缓冲液是Tris缓冲液，优选Tris/镁缓冲液。
在一些实施例中，本发明是针对通过在此所述的方法中的任一种制得的抗体，例如
在一些实施例中，通过在此所述的方法中的任一种制得的抗体或包含所述抗体的组合物是药学上可接受的。“药学上可接受的”是指抗体或组合物，其在合理的医学判断力范围内适合用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、或其他与合理益处/风险比相称的并发症。
在一些实施例中，该通过本发明的方法分离的抗体可以用于受试者的治疗中。如在此使用的，“受试者”指的是被分类为哺乳动物的任何动物，包括人类和非人类，例如但不限制于家畜和农畜、动物园动物、体育用动物以及宠物。在一些实施例中，受试者指的是人类。尽管本发明针对分离“适合于向人类给予”的抗体的方法，使用分离的抗体进行的治疗不仅仅限于人类治疗。
术语“治疗”(“treat”和“treatment”)指的是治疗性治疗和预防、保持或防止性措施，其中目标是预防或减慢(减轻)不希望的生理病症、失调或疾病，或者获得有益的或希望的临床结果。出于本发明的目的，有益或希望的临床结果包括但不限于症状或体征的缓和；病症、失调或疾病的程度的降低；病症、失调或疾病的状态的稳定(即，不恶化)；病症、失调或疾病进展的发作延迟或减慢；病症、失调或疾病状态的缓和、缓解(无论部分还是全部)，无论可检测的还是不可检测的；或病症、失调或疾病的增强或改善。治疗包括引发临床上显著的反应，而没有过度水平的副作用。例如，在抗体是的一些实施例中，治疗可以指代与呼吸道合胞体病毒的感染相关联的症状的预防、降低其发生率、治疗、降低、或缓解。
在一些实施例中，将通过在此所述的方法制得的抗体或包括该抗体的终产物以治疗有效量给予至受试者。术语“治疗有效量”是指减少受试者中的疾病或失调的一种或多种症状(即，治疗疾病或失调)的抗体的量。在一些实施例中，术语“治疗有效量”是指足以实现所希望的生理状态的抗体量。抗体呈治疗有效性所需要的准确治疗剂量可以在受试者之间不同(例如，由于年龄、体重、受试者的病症、有待治疗的失调或疾病的性质和严重性等)。在一些实施例中，术语“治疗有效量”是指抗体足以实现所希望的生理状态的量。在一些实施例中，治疗有效量不能事先指定，并且可以由照护者(例如，由医师或其他医疗服务提供者)使用各种方式(例如剂量调整)确定。适当的治疗有效量还可以通过常规实验使用例如动物模型来确定。
本发明的方法的分离抗体产物的给药途径可以例如经由口服、经肠胃外、经吸入或局部给药模式。如在此所用的术语肠胃外包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或经阴道给药。在一些实施例中，该分离的抗体是并且给药途径是肌内注射。虽然所有这些给药形式可清楚地考虑为是在本发明的范围之内，但用于给予的优选形式是用于注射、特别是用于静脉或动脉注射或滴注的溶液。通常，用于注射的适合的药物组合物包括缓冲液(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如聚山梨醇酯)、可任选地稳定剂(例如人类白蛋白)等。
通过本发明的方法制得的包含该抗体的药物组合物可以包括药学上可接受的载体，包括例如离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人类血清白蛋白)、缓冲物质(如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和的植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或者电解质(诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)、硅溶胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、以及聚乙二醇。在一些实施例中，在此描述的方法提供了分离的方法，该方法包括：(i)对该组合物进行一个阳离子交换色谱过程以形成一种包含该抗体的第一产物；(ii)添加一种缓冲液到该第一产物中以形成一种缓冲产物；(iii)对该缓冲产物进行一个亲和纯化过程以形成一种包含该抗体的第二产物；(iv)对该第二产物进行一个过滤过程以形成一种包含该抗体的第三产物；(v)对该第三产物进行一个病毒灭活过程；并且(vi)配制该第三产物以形成一种终产物，其中该终产物包含并且适合于向人类给予并且具有≤0.5pg/mg的DNA浓度；其中该方法不包括向该组合物中添加全能核酸酶。
本发明包括一种从包含的组合物分离的方法，该方法包括：
i.对该组合物进行一个离子交换色谱过程；
ii.对该组合物进行一个亲和纯化过程；并且
iii.对该组合物进行一个过滤过程；
其中一种终产物包括获得自(i)、(ii)、和(iii)的其中该终产物适合于向人类给予并且具有≤0.5pg/mg的DNA浓度，并且其中该方法不包括向该组合物中添加全能核酸酶。
本发明包括一种从具有的组合物分离的方法，该方法包括：
i.对该组合物进行一个阳离子交换色谱过程以形成一种包含的第一产物；
ii.添加一种缓冲液到该第一产物中以形成一种缓冲产物；
ii.对该缓冲产物进行一个亲和纯化过程以形成一个包含的第二产物；
iv.对该第二产物进行一个过滤过程以形成一个包含的第三产物；
v.对该第三产物进行一个病毒灭活过程；并且
vi.配制该第三产物以形成一种终产物，该终产物包含其中该终产物适合于向人类给予并且具有≤0.5pg/mg的DNA浓度；
其中该方法不包括向该组合物中添加全能核酸酶。
本发明包括一种从具有的组合物分离的方法，该方法包括(i)-(v)中的至少三个：
i.对该组合物进行一个阳离子交换色谱过程；
ii.对该组合物进行一个亲和纯化过程；
iii.对该组合物进行一个超滤过程；
iv.对该组合物进行一个病毒灭活过程；并且
v.对该组合物进行一个阴离子交换色谱过程；
其中获得自(i)-(v)中的至少三个的产物包含并且适合于向人类给予并且具有≤0.5pg/mg的DNA浓度；并且其中该方法不包括向该组合物中添加全能核酸酶。
在本发明的方法的一些实施例中，该方法不包括将一种外源核酸酶添加到该组合物中。
在本发明的方法的一些实施例中，该方法进一步包括一个病毒灭活过程。在一些方面，该病毒灭活过程包括在低于4.0的pH下孵育该组合物。
在本发明的方法的一些实施例中，该抗体是IgG。
在本发明的方法的一些实施例中，该亲和纯化过程包括一个蛋白A纯化过程。
在本发明的方法的一些实施例中，该离子交换色谱过程是一个阳离子交换色谱过程。在一些实施例中，该阳离子交换过程包括将该抗体吸附到选自卡普托S、S-交联琼脂糖FF、和/或波罗斯50HS的一种阳离子树脂上。
在本发明的方法的一些实施例中，该方法进一步包括一个第二离子交换过程。在一些实施例中，该第二离子交换过程是一个阴离子交换色谱过程。在一些实施例中，该阴离子交换过程包括使该抗体穿过选自以下的一种阴离子膜：超级Q、那翠丝Q、科罗马索布Q和/或木斯塘Q。
在本发明的方法的一些实施例中，该终产物具有大约>80％(mol/mol)的抗体得率。
在本发明的方法的一些实施例中，该终产物的DNA浓度≤200ng/mg。
在本发明的方法的一些实施例中，该组合物是免疫动物的血清、腹水液、杂交瘤或骨髓瘤上清液、衍生自重组细胞系培养的条件培养基、以及产免疫球蛋白细胞的细胞提取物。
在本发明的方法的一些实施例中，该组合物包括来自生物反应器的制品。
在本发明的方法的一些实施例中，该组合物具有大于大约100升的体积。
在本发明的方法的一些实施例中，该组合物具有大于大约1000升的体积。
在本发明的方法的一些实施例中，过程(ii)是发生在过程(i)之后。
在本发明的方法的一些实施例中，过程(iii)是发生在过程(ii)之后。
在本发明的方法的一些实施例中，该抗体包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的重链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:6的轻链。
在本发明的方法的一些实施例中，该抗体包括具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的重链可变区以及轻链SEQ ID NO:6的轻链可变区。
在本发明的方法的一些实施例中，该抗体包括具有氨基酸序列TSGMSVG(SEQ ID NO:3)的H1互补决定区(CDR)、具有氨基酸序列DIWWDDKKDYNPSLKS(SEQ ID NO:4)的H2CDR、具有氨基酸序列SMITNWYFDV(SEQ ID NO:5)的H3CDR；具有氨基酸序列KCQLSVGYMH(SEQID NO:7)的L1CDR、具有氨基酸序列DTSKLAS(SEQ ID NO:8)的L2CDR、以及具有氨基酸序列FQGSGYPFT(SEQ ID NO:9)的L3CDR。
贯穿本披露，除非另外指明，所有百分数、比率以及类似物的表达是“按重量计”。如在此使用的，“按重量计”与术语“按质量计”是同义的并且指示在此所定义的比率或百分比是根据重量而不是体积、厚度或一些其他量度来表示的。
如在此使用的，结合百分比或其他数量来使用时，术语“大约”意为该百分比或其他数量的±10％。例如，术语“大约80％”涵盖80％±8％。
实例
实例1
在添加和不添加全能核酸酶的情况下分离
1.细胞培养物上清液的制备
一种人源化单克隆IgG1抗体，靶标于呼吸道合胞体病毒(RSV)蛋白F，使用无血清DMNSO-4培养基表达于NSO细胞中，并且从生产生物反应器在两个单独运行中收获，所述运行称为“全能核酸酶”运行和“无全能核酸酶”运行。来自每个运行的NS0细胞和细胞碎片通过离心和过滤来去除。将针对每一个运行的得到的分类收获材料的pH和电导率进行调节，以实现6.0的负载pH和6.0mS/cm的电导率，并且使该过程流直接行进通过荚状深度过滤器。如以下步骤2-8中所述的，并且如图1所概述的，将从收获的细胞组合物分离。
2.阳离子交换色谱
将步骤1的“全能核酸酶”和“无全能核酸酶”运行两者的收获材料加载到单独的波罗斯50HS柱(180cm)上，进行洗涤，并且从柱进行洗脱。将该加载、洗涤和洗脱过程针对动态结合能力(加载：≤20g/L树脂/循环)以及容积流速(线性流速：≤330cm/hr)进行控制，并且在多重循环中完成以适应整个体积。波罗斯50HS柱的产物的输出参数限定于表5中：
表5.波罗斯50HS色谱的产物的输出参数
3.三/氯化镁(TM)缓冲液添加
使用1M Tris碱溶液将来自步骤2的“全能核酸酶”和“无全能核酸酶”运行两者的阳离子交换色谱产物的pH调节至8.5±0.2。在添加Tris碱溶液之后产物库的pH是8.5。将TM缓冲液(20mM Tris，102mM MgCl2，pH 8.5)添加至经pH-调节的库中以实现最终MgCl2浓度为2±0.2mM(0.018L/L至0.022L/L)。将12,500单位的全能核酸酶添加至“全能核酸酶”部分，并且孵育18-48小时。不向“无全能核酸酶”部分添加全能核酸酶。“全能核酸酶”和“无全能核酸酶”部分两者均经受蛋白A亲和色谱。
4.蛋白A亲和色谱
将来自步骤3的“全能核酸酶”和“无全能核酸酶”运行两者的缓冲部分加载到蛋白A柱上(r蛋白A快速流动树脂(Fast Flowresin)；140cm)，进行洗涤、并且进而从柱洗脱。该加载、洗涤以及洗脱过程是在五个循环中完成的，以适应整个体积的缓冲产物。对该过程针对动态结合能力(加载：≤18g/L树脂/循环)和容积流速(35±4L/min)进行控制。将来自每个运行的洗脱产物收集在两个不同的槽中。洗脱产物具有以下表6中所述的特征。
表6.蛋白A色谱的产物的输出参数
5.纳米过滤
将来自步骤4中蛋白A亲和色谱的“全能核酸酶”和“无全能核酸酶”运行两者的产物使用Asahi Kasei Planova 15N中空过滤器筒(hollow-filter cartridge)(标度：8-10x 4m2；跨膜压：<13psi；加载：≤800g/m3过滤面积)进行过滤。在纳米过滤之后，将过滤器用平衡缓冲液进行冲洗以使回收最大化。在使用后确保纳米过滤器完整性。将纳米过滤的产物通过0.2μm膜式过滤器过滤进储存槽中，以便在室温下储存。得率是94％-99％，除了“无全能核酸酶”运行的一个批次之外，所述批次具有较低的得率，这是因对产物样品的疏忽的误操作造成的。
6.低pH处理
在纳米过滤之后，将来自步骤5的“全能核酸酶”和“无全能核酸酶”运行两者的产物流使用甘氨酸溶液滴定至pH 3±0.1，并且在室温下孵育大约30分钟。然后将产物中和至pH 7.6±0.4。
7.阴离子交换(超级Q)色谱
使来自步骤6的“全能核酸酶”和“无全能核酸酶”运行两者的低pH处理的产物通过超级Q 650M树脂柱(标度：140cm)。对该过程针对柱加载pH、电导率、动态结合能力(加载：≤79g/L树脂/循环)和容积流速(线性流速≤330cm/hr)进行控制。针对每个批次的得率范围是从95％至99％。阴离子交换色谱的产物中污染物DNA水平是通过杂交方法确定的，如表7中呈现的。
表7：超级Q色谱的输出参数
8.超滤/渗滤
在阴离子交换色谱之后，将来自步骤7的“全能核酸酶”和“无全能核酸酶”运行两者的产物通过超滤/渗滤(标度：450-600ft2；加载：≤60g/ft2过滤面积)使用最低5次缓冲液交换来浓缩进一种配制缓冲液中。在完成渗滤之后，将该超滤系统用配制缓冲液进行冲洗以使回收最大化。将产物浓度用配制缓冲液调节至103±6g/L的目标。产物pH是大约6，并且最终的渗透电导率是大约1.1mS/cm。每个批次的得率范围是从100％至103％。使所得的终产物穿过-/2μm过滤器，并且储存在2℃至8℃。
实例2
在添加和不添加全能核酸酶的情况下分离
研究了在此描述的用于从一种添加有过量外源DNA的组合物分离一种抗体的方法的效率和稳定性。如实例1中所述的，对来自无全能核酸酶的组合物的抗体进行生产、收获和分离，除了将外源DNA在两个过程步骤添加之外。(i)在阳离子色谱过程(实例1，步骤2)或(ii)在低pH处理过程(实例1，步骤6)之后，将500ng/mg小鼠基因组DNA(Novagen)添加至无全能核酸酶的样品中。除了添加过量的外源DNA之外，然后如实例1中所述的进行抗体分离。在整个分离过程中对洗脱体积、洗脱滴度和步骤得率进行监测，并且与生产趋势一致。实验示意图呈现于图2中。“添加的(spiked)”样品两者的DNA浓度是通过杂交方法和NSO PCR方法确定的。针对在阳离子色谱过程之后经添加的(spiked)样品的DNA浓度是<0.1pg/mg(杂交方法)和<0.044pg/mg(NSO PCR方法)，并且针对在低pH处理之后经添加的样品的DNA浓度是<0.3pg/mg(杂交方法)和<0.041pg/mg(NSO PCR方法)。该结果指示在此所述的方法是足够高效和稳定的以去除DNA，甚至当将额外量的DNA添加至该组合物中时。
在此说明的所有各个实施方案或任选项可以在任一或所有变体中组合。虽然本发明参考其一些实施例已经进行了具体示出和描述，但本领域普通技术人员应当理解的是，它们仅借助于实例来呈现，并不具有限制性，并且可以在不背离本发明的精神和范围的情况下在其中进行形式和细节上的各种改变。因此，本发明的宽度和范围应当不限于以上描述的示例性实施例中的任一个，而应当仅根据以下权利要求书和它们的等效物来限定。
将在此引用的所有文件(包括期刊文章或摘要、公开的或相应的美国或国外专利申请书、颁布或国外专利、或任何其他文献)各自通过引用(包括在引用的文献中呈现的所有数据、表、图和正文)而完整地结合于此。

Claims (20)

1.一种从包含的组合物分离的方法，该方法包括：
i.对该组合物进行一个离子交换色谱过程；
ii.对该组合物进行一个亲和纯化过程；并且
iii.对该组合物进行一个过滤过程；
其中一种终产物包括获得自(i)、(ii)、和(iii)的其中该终产物适合于向人类给予并且具有≤0.5pg/mg的DNA浓度，并且其中该方法不包括向该组合物中添加全能核酸酶。
2.一种从包含的组合物分离的方法，该方法包括：
i.对该组合物进行一个阳离子交换色谱过程以形成一种包含的第一产物；
ii.添加一种缓冲液到该第一产物中以形成一种缓冲产物；
iii.对该缓冲产物进行一个亲和纯化过程以形成一种包含的第二产物；
iv.对该第二产物进行一个过滤过程以形成一种包含的第三产物；
v.对该第三产物进行一个病毒灭活过程；并且
vi.配制该第三产物以形成一种终产物，该终产物包含其中该终产物适合于向人类给予并且具有≤0.5pg/mg的DNA浓度；
其中该方法不包括向该组合物中添加全能核酸酶。
3.一种从包含的组合物分离的方法，该方法包括(i)-(v)中的至少三个：
i.对该组合物进行一个阳离子交换色谱过程；
ii.对该组合物进行一个亲和纯化过程；
iii.对该组合物进行一个超滤过程；
iv.对该组合物进行一个病毒灭活过程；并且
v.对该组合物进行一个阴离子交换色谱过程；
其中获得自(i)-(v)中的至少三个的产物包含并且适合于向人类给予并且具有≤0.5pg/mg的DNA浓度；并且其中该方法不包括向该组合物中添加全能核酸酶。
4.如权利要求1所述的方法，其中该方法不包括添加一种外源核酸酶到该组合物中。
5.如权利要求1所述的方法，进一步包括一个病毒灭活过程。
6.如权利要求5所述的方法，其中该病毒灭活过程包括在pH小于4.0下孵育该组合物。
7.如权利要求1所述的方法，其中该抗体是IgG。
8.如权利要求1所述的方法，其中该亲和纯化过程包括一个蛋白A纯化过程。
9.如权利要求1所述的方法，其中该离子交换色谱过程是一个阳离子交换色谱过程。
10.如权利要求9所述的方法，其中该阳离子交换过程包括吸附该抗体到选自下组的一种阳离子树脂上，该组由以下各项组成：卡普托S(CaptoS)、S-交联琼脂糖FF(S-Sepharose FF)、以及波罗斯50HS(Poros 50HS)。
11.如权利要求1所述的方法，进一步包括一种第二离子交换过程。
12.如权利要求11所述的方法，其中该第二离子交换过程是一个阴离子交换色谱过程。
13.如权利要求12所述的方法，其中该阴离子交换过程包括使该抗体穿过选自下组的一种阴离子膜，该组由以下各项组成：超级Q(Super Q)、那翠丝Q(Natrix Q)、科罗马索布Q(Chromasorb Q)以及木斯塘Q(MustangQ)。
14.如权利要求1所述的方法，其中该终产物具有>80％(mol/mol)的抗体得率和/或其中该终产物的DNA浓度≤200ng/mg。
15.如权利要求1所述的方法，其中该组合物选自下组，该组由以下各项组成：免疫动物血清、腹水液、杂交瘤或骨髓瘤上清液、衍生自重组细胞系培养的条件培养基、产免疫球蛋白细胞的细胞提取物、以及生物反应器制剂。
16.如权利要求1所述的方法，其中该组合物具有大于100升的体积。
17.如权利要求1所述的方法，其中该组合物具有大于1000升的体积。
18.如权利要求1所述的方法，其中(ii)的过程发生在(i)的过程后。
19.如权利要求1所述的方法，其中(iii)的过程发生在(ii)的过程后。
20.如权利要求1所述的方法，其中包括：
具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链以及具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链；
SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的重链可变区以及轻链SEQ ID NO:6的轻链可变区；或
具有氨基酸序列TSGMSVG(SEQ ID NO:3)的H1互补决定区(CDR)、具有氨基酸序列DIWWDDKKDYNPSLKS(SEQ ID NO:4)的H2CDR、具有氨基酸序列SMITNWYFDV(SEQ ID NO:5)的H3CDR；具有氨基酸序列KCQLSVGYMH(SEQ ID NO:7)的L1CDR、具有氨基酸序列DTSKLAS(SEQ ID NO:8)的L2CDR、以及具有氨基酸序列FQGSGYPFT(SEQ ID NO:9)的L3CDR。
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