CN114375307A - 产生抗α4β7抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于从液体溶液，例如从哺乳动物细胞培养物澄清收获物中纯化抗α4β7整联蛋白抗体诸如维多珠单抗的方法。本发明尤其涉及用于控制存在于抗α4β7整联蛋白抗体或其抗原结合片段(例如，维多珠单抗)的纯化制剂中的产物相关物质和/或过程相关杂质的量的纯化方法。还提供了包含抗α4β7抗体的组合物及其治疗病症的用途。

Description

产生抗α4β7抗体的方法
技术领域
本发明涉及用于纯化抗α4β7抗体或其片段的方法。
相关申请
本申请要求于2019年6月10日提交的美国临时申请62/859,494的优先权。前述申请的全部内容以引用的方式并入本文。
序列表
本申请含有以ASCII格式以电子方式提交并且由此以引用的方式整体并入的序列表。所述ASCII副本创建于2020年6月5日，命名为T103022_1090WO_SL.txt，大小为10,009字节。
背景技术
蛋白质的大规模、经济纯化是生物技术工业中越来越重要的问题。通常，生物药物是使用原核(例如，细菌)或真核(例如，哺乳动物或真菌)细胞系通过细胞培养生产的，这些细胞系已被工程改造以产生大量的所关注的治疗性蛋白质。由于所使用的细胞系是活的生物体，它们必须被补给包含糖、氨基酸和生长因子的复杂细胞培养基(有时由动物血清制剂供应)。将所需重组治疗性蛋白质与过程相关杂质(包括例如细胞培养基组分、宿主细胞蛋白(HCP)、宿主核酸、和/或色谱材料)以及产物相关杂质(如聚集体、错误折叠的种类或所关注蛋白质的片段)分离至足以用作人治疗剂的纯度是一项艰巨的挑战。
产物相关杂质和过程相关杂质(包括聚集体)有可能干扰纯化过程，影响储存过程中的蛋白质，和/或可能是在向受试者施用抗体时引起不良反应的原因(Shukla等人,J.Chromatogr.B.Analyt.Technol.Biomed.Life Sci.,848(1),28-39)。
因此，本领域仍然需要纯化治疗性蛋白质(例如抗体)，同时有效去除杂质、改进蛋白质的回收率并维持治疗需求的改进的方法。
发明内容
本发明至少部分基于对产生抗α4β7抗体或其抗原结合部分的过程的开发。在一些实施方案中，抗α4β7抗体或其抗原结合部分是人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分。在以下任一方面和实施方案中，人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分可包含含有SEQ ID NO:2所示的CDR1、SEQ ID NO:3所示的CDR2和SEQ ID NO:4所示的CDR3的重链可变区，和/或含有SEQ ID NO:6所示的CDR1、SEQ ID NO:7所示的CDR2和SEQ ID NO:8所示的CDR3的轻链可变区。在一些实施方案中，人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:1的重链可变区和/或含有SEQ ID NO:2的轻链可变区。在一些实施方案中，人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:9的重链和/或含有SEQ ID NO:10的轻链。在示例性实施方案中，抗α4β7抗体是维多珠单抗或其抗原结合部分。
因此，在一方面，本发明提供了一种产生包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物的方法，所述方法包括：提供包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的pH大于6.5的组合物；并且将包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物孵育至少20分钟至10小时的时间段；从而产生包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物。
在另一方面，本发明提供了一种产生具有降低的碱性同种型种类水平的包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物的方法，所述方法包括：提供包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的pH大于6.5的组合物；并且将包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物孵育足以降低组合物中抗α4β7抗体或其抗原结合部分的碱性同种型种类的水平的时间段；从而产生具有降低的碱性同种型种类水平的包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物。
在前述方面的一些实施方案中，人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:2所示的CDR1、SEQ ID NO:3所示的CDR2和SEQ ID NO:4所示的CDR3的重链可变区，和/或含有SEQ ID NO:6所示的CDR1、SEQ ID NO:7所示的CDR2和SEQ ID NO:8所示的CDR3的轻链可变区。在一些实施方案中，人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分包含含有SEQID NO:1的重链可变区和/或含有SEQ ID NO:2的轻链可变区。在一些实施方案中，人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:9的重链和/或含有SEQ ID NO:10的轻链。在示例性实施方案中，抗α4β7抗体是维多珠单抗或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，所述方法产生具有<16％、<15％、<14％、<13％、<12％、<11％或<10％碱性同种型种类的包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物。
在一些实施方案中，所述孵育在人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分纯化期间进行，并且其中所述孵育在(a)超滤/渗滤(UF/DF)所述抗体之前或(b)在将所述抗体配制在药学上可接受的缓冲液中之前进行。
在一些实施方案中，孵育在环境温度下进行。在一些实施方案中，孵育在15℃-30℃下进行。在一些实施方案中，孵育在20℃-25℃下进行。
在一些实施方案中，包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物以约6.5-8.5的pH提供。在一些实施方案中，包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物以约7.0-8.0的pH提供。在一些实施方案中，包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物以约7.0-7.5的pH提供。在其他实施方案中，包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物以约6.6-7.3的pH提供。在一些实施方案中，包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物以约pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9、pH 8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4或pH8.5的pH提供。
在一些实施方案中，将包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物孵育约10至120小时的时间段。在一些实施方案中，将包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物孵育约12至120小时的时间段。在一些实施方案中，将包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物孵育约12至96小时的时间段。在一些实施方案中，将包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物孵育约12至72小时的时间段。在一些实施方案中，将包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物孵育约12至48小时的时间段。在一些实施方案中，将包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物孵育至少12小时的时间段。在一些实施方案中，将包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物孵育至少15至36小时的时间段。在一些实施方案中，将包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物孵育约24至120小时的时间段。在一些实施方案中，将包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物孵育约24至96小时的时间段。在一些实施方案中，将包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物孵育约24至72小时的时间段。在一些实施方案中，将包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物孵育约24至48小时的时间段。在一些实施方案中，将包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物孵育约10小时、约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约96小时或约120小时的时间段。
在另一方面，本文提供从澄清的细胞培养收获物中纯化人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括(i)提供从表达所述抗α4β7抗体或其抗原结合部分的重组宿主细胞的培养物中获得的澄清的细胞培养收获物，以及(ii)从所述细胞培养收获物中纯化所述抗α4β7抗体或其抗原结合部分，其中将所述抗体暴露于4.0的pH或低于4.0的pH不超过24小时，其中所述抗α4β7抗体或其抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗α4β7抗体或其抗原结合部分与对照相比具有降低的碱性同种型种类水平(由CEX确定)，其中所述对照是包含通过相同方法产生的抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物，其中所述抗体暴露于4.0的pH或低于4.0的pH(例如，pH 3.6至4.0)持续更长的时间，即大于24小时。
在一些实施方案中，抗α4β7抗体或其抗原结合部分是维多珠单抗或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分(例如，维多珠单抗或其抗原结合部分)的组合物包含第一碱性同种型峰(BP1)和第二碱性同种型峰(BP2)，并且其中所述方法产生具有降低的BP2水平的包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物。在某些实施方案中，所述方法产生具有少于2％、少于1.5％、少于1％,或少于0.7％BP2的包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物。
在一些实施方案中，包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物源自表达人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的哺乳动物细胞培养物。在某些实施方案中，哺乳动物细胞培养物是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物。在某些实施方案中，CHO细胞培养物包含缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)表达的CHO细胞。在某些实施方案中，CHO细胞培养物包含缺乏谷氨酰胺合成酶(GS)表达的CHO细胞。
在一些实施方案中，该方法进一步包括使用一个或多个选自由亲和色谱、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、混合模式色谱、陶瓷羟基磷灰石(CHT)色谱和疏水相互作用色谱(HIC)组成的组的色谱分离步骤从哺乳动物宿主细胞蛋白(HCP)中纯化包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物。
在某些实施方案中，使用包含蛋白A的亲和色谱树脂纯化包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物。
在某些实施方案中，在孵育之前使用亲和色谱纯化包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物以减少碱性同种型。在某些实施方案中，在孵育之后使用亲和色谱纯化包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物。
在某些实施方案中，使用阳离子交换色谱纯化包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物。在某些实施方案中，在孵育之前使用阳离子交换色谱纯化包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物。在某些实施方案中，在孵育之后使用阳离子交换色谱纯化包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物。
在某些实施方案中，使用阴离子交换色谱纯化包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物。在某些实施方案中，在孵育之前使用阴离子交换色谱纯化包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物。在某些实施方案中，在孵育之后使用阴离子交换色谱纯化包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物。
在某些实施方案中，使用CHT色谱纯化包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物。在某些实施方案中，在孵育之前使用CHT色谱纯化包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物。在某些实施方案中，在孵育之后使用CHT色谱纯化包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物。
在一些实施方案中，所述方法包括将所述组合物掺入药物配制品中。
在某些实施方案中，药物配制品是冻干药物配制品。在特定实施方案中，冻干药物配制品是干燥的冻干药物配制品。在一些这样的实施方案中，所述方法进一步包括用液体复原所述干燥的冻干药物配制品以使其适于施用的步骤。
在替代实施方案中，药物配制品是液体药物配制品。在一些这样的实施方案中，液体药物配制品适于向人皮下施用。
在另一个实施方案中，本发明提供了纯化具有降低的碱性同种型种类水平的人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的方法，其中人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分保持在pH 6.5或高于pH 6.5，持续通过超滤/渗滤(UF/DF)从细胞培养收获物中初次回收人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分到将人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分配制在药学上可接受的载剂中之间的总时间的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、或至少99％。通过在大部分纯化过程中将人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的pH维持在pH 6.5或高于pH 6.5，可以相对于其中人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分在低于pH 6.5的pH下持续大量时间(例如，通过超滤/渗滤(UF/DF)从细胞培养收获物中初次回收人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分到将抗α4β7抗体或其抗原结合部分配制在药学上可接受的载剂中之间的总时间的大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、或大于40％)的等效纯化过程减少人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的碱性同种型种类。
在另一方面，本发明提供了具有降低的碱性同种型种类水平的包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分(例如，维多珠单抗)的组合物。在一些实施方案中，人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的碱性同种型种类组成存在于组合物中的人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、或少于1％。在一些实施方案中，使用本文所述的方法产生具有降低的碱性同种型种类水平的包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物。在一些实施方案中，通过本发明方法的组合产生包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物。
在另一方面，本文提供了一种产生包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分(例如，维多珠单抗)的组合物的方法，所述方法包括：(a)使含有人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分和宿主细胞蛋白(HCP)的样品在装载缓冲液的存在下与阴离子交换树脂接触，其中装载缓冲液具有11mS/cm或更少的电导率，使得HCP与阴离子交换树脂结合；(b)从阴离子交换树脂中收集流过材料(flow through material)，其中流过材料包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分。
在另一方面，本发明提供了一种产生包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分(例如，维多珠单抗)的组合物的方法，所述方法包括：(a)使含有人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分和宿主细胞蛋白(HCP)的样品在装载缓冲液的存在下与阴离子交换树脂接触，其中装载缓冲液具有11mS/cm或更少(例如，约11mS/cm或更少、约10mS/cm或更少、约9mS/cm或更少、约8mS/cm或更少、约7mS/cm或更少、约6mS/cm或更少、约5mS/cm或更少、约4mS/cm或更少、约3mS/cm或更少、或约2mS/cm或更少)的电导率，使得HCP与阴离子交换树脂结合；(b)使阴离子交换树脂与洗脱缓冲液接触；以及(c)从阴离子交换树脂中收集流过物，其中流过物包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分。
在以上方面的一些实施方案中，所述方法是产生具有减少量的HCP的包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分(例如，维多珠单抗)的组合物的方法，并且所述流过物包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分(例如，维多珠单抗)和减少量的HCP。
在一些实施方案中，装载缓冲液具有9mS/cm至11mS/cm(例如，约9mS/cm至约11mS/cm或约10mS/cm至约11mS/cm)的电导率。
在一些实施方案中，装载缓冲液具有小于11mS/cm(例如，小于11mS/cm、小于10mS/cm、小于9mS/cm、小于8mS/cm、小于7mS/cm、小于6mS/cm、小于5mS/cm、小于4mS/cm、小于3mS/cm、或小于2mS/cm)的电导率。
在一些实施方案中，装载缓冲液具有约9mS/cm、9.5mS/cm、10mS/cm、10.5mS/cm或11mS/cm的电导率。
在一些实施方案中，HCP是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞蛋白。在某些实施方案中，HCP源自缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)表达的CHO细胞。在某些实施方案中，HCP源自缺乏谷氨酰胺合成酶(GS)表达的CHO细胞。
在一些实施方案中，阴离子交换树脂用洗涤缓冲液洗涤。在一些实施方案中，洗涤缓冲液具有11mS/cm或更小的电导率。在一些实施方案中，洗涤缓冲液具有9mS/cm至11mS/cm的电导率。在一些实施方案中，洗涤缓冲液具有小于11mS/cm的电导率。在一些实施方案中，洗涤缓冲液具有约9mS/cm、9.5mS/cm、10mS/cm、10.5mS/cm或11mS/cm的电导率。在一些实施方案中，洗涤缓冲液具有与装载缓冲液相同的电导率。
在一些实施方案中，装载缓冲液包含氯化钠和/或磷酸钠。
在一些实施方案中，装载缓冲液包含20-150mM盐、50-125mM盐或75-100mM盐。在一个实施方案中，盐包括氯化钠和/或磷酸钠。例如，缓冲液可包含约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、或约150mM氯化钠。另外，或可选地，缓冲液可包含约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、或约150mM磷酸钠。
在一些实施方案中，洗涤缓冲液包含氯化钠和/或磷酸钠。
在一些实施方案中，洗涤缓冲液包含20-150mM盐、50-125mM盐或75-100mM盐。在一个实施方案中，盐包括氯化钠和/或磷酸钠。例如，缓冲液可包含约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、或约150mM氯化钠。另外，或可选地，缓冲液可包含约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、或约150mM磷酸钠。
在一些实施方案中，洗涤缓冲液的电导率等于或低于装载缓冲液的电导率。在一些实施方案中，洗涤缓冲液具有与装载缓冲液相同的电导率。
在一些实施方案中，阴离子交换树脂被格式化为阴离子交换柱或阴离子交换膜。
在一些实施方案中，阴离子交换树脂包含季胺官能团。
在一些实施方案中，含有人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分(例如，维多珠单抗)和HCP的样品源自在一个或多个色谱分离步骤后的哺乳动物细胞培养物。在某些实施方案中，一个或多个色谱分离步骤包括一个或多个选自由亲和色谱、阳离子交换色谱、混合模式色谱、疏水相互作用色谱(HIC)和陶瓷羟基磷灰石(CHT)色谱组成的组的步骤。
在一些实施方案中，流过物中HCP的量为8ppm或更少、7.5ppm或更少、7ppm或更少、6.5ppm或更少、6ppm或更少、5.5ppm或更少、5ppm或更少、4.5ppm或更少、4ppm或更少、3.5ppm或更少、3ppm或更少、2.5ppm或更少、或2ppm或更少。
在一些实施方案中，相对于当用电导率大于12mS/cm的装载缓冲液使用相同样品进行所述方法时产生的流过物中的HCP的量，流过物中HCP的量减少至少50(例如，至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约98％或大于约98％)。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过包括超滤和/或渗滤的过程处理所述流过材料，以将所述缓冲液交换为包含一种或多种药学上可接受的载剂或赋形剂的缓冲液。
在一些实施方案中，所述方法包括将所述组合物掺入药物配制品中。
在某些实施方案中，药物配制品是冻干药物配制品。在特定实施方案中，冻干药物配制品是干燥的冻干药物配制品。在一些这样的实施方案中，所述方法进一步包括用液体复原所述干燥的冻干药物配制品以使其适于施用的步骤。
在替代实施方案中，药物配制品是液体药物配制品。在一些这样的实施方案中，液体药物配制品适于向人皮下施用。
在另一方面，本文提供通过本发明的任何方法产生的包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分(例如，维多珠单抗)的组合物。本文还提供包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分(例如，维多珠单抗)的组合物，其中所述组合物可通过本发明的任何方法获得。在一些实施方案中，组合物中HCP的量为8ppm或更少、7.5ppm或更少、7ppm或更少、6.5ppm或更少、6ppm或更少、5.5ppm或更少、5ppm或更少、4.5ppm或更少、4ppm或更少、3.5ppm或更少、3ppm或更少、2.5ppm或更少、或2ppm或更少。在另一个实施方案中，人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分(例如，维多珠单抗)的碱性同种型种类组成存在于组合物中的抗体种类的少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、少于9％、少于8％、少于7％、少于6％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、或少于1％。
在一些实施方案中，通过本发明方法的组合产生包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分(例如，维多珠单抗)的组合物。
在另一方面，本发明涉及一种增加从混合模式色谱树脂洗脱后回收的人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分(例如，维多珠单抗)的产率的方法，所述方法包括用平衡缓冲液平衡所述混合模式色谱树脂，将包含抗α4β7抗体或其抗原结合部分和装载缓冲液的溶液装载到所述混合模式色谱树脂上，使得抗α4β7抗体或其抗原结合部分结合所述混合模式色谱树脂，用洗涤缓冲液洗涤所述混合模式色谱树脂，并用洗脱缓冲液从所述混合模式色谱树脂洗脱抗α4β7抗体或其抗原结合部分，其中所述平衡缓冲液、装载缓冲液和/或洗涤缓冲液具有7.0或低于7.0的pH。
在一个实施方案中，平衡缓冲液、装载缓冲液、和/或洗涤缓冲液具有6.0-7.0的pH。在另一个实施方案中，平衡缓冲液、装载缓冲液、和/或洗涤缓冲液具有6.5-7.0的pH。在另一个实施方案中，平衡缓冲液、装载缓冲液、和/或洗涤缓冲液具有6.6-6.8的pH。
在另一个实施方案中，平衡缓冲液、装载缓冲液和/或洗涤缓冲液具有30mM至70mM的盐浓度。在另一个实施方案中，平衡缓冲液、装载缓冲液和/或洗涤缓冲液具有40mM至70mM的盐浓度。在另一个实施方案中，平衡缓冲液、装载缓冲液和/或洗涤缓冲液具有50mM至65mM的盐浓度。在另一个实施方案中，装载缓冲液和/或洗涤缓冲液具有55mM-65mM的盐浓度。在另一个实施方案中，盐包括氯化钠和/或磷酸钠。
在另一个实施方案中，平衡缓冲液、装载缓冲液和/或洗涤缓冲液具有30mM至70mM的氯化钠浓度。在另一个实施方案中，装载缓冲液和/或洗涤缓冲液具有40mM至70mM的氯化钠浓度。在另一个实施方案中，平衡缓冲液、装载缓冲液和/或洗涤缓冲液具有40mM至60mM的氯化钠浓度。在另一个实施方案中，平衡缓冲液、装载缓冲液和/或洗涤缓冲液具有45mM-55mM的氯化钠浓度。在另一个实施方案中，平衡缓冲液、装载缓冲液和/或洗涤缓冲液具有约50mM的氯化钠浓度。在另一个实施方案中，平衡缓冲液、装载缓冲液、和/或洗涤缓冲液进一步包含磷酸钠。
在一些实施方案中，平衡缓冲液、装载缓冲液、和/或洗涤缓冲液具有相同的pH值。在一些实施方案中，平衡缓冲液、装载缓冲液、和/或洗涤缓冲液具有相同的盐浓度。在一些实施方案中，平衡缓冲液、装载缓冲液、和/或洗涤缓冲液可以是相同的缓冲液。在前述方面的一些实施方案中，混合模式树脂可以是陶瓷羟基磷灰石树脂，例如CHT树脂。
在另一方面，本文提供包含抗α4β7抗体的低碱性种类组合物，其中所述组合物包含所述抗α4β7抗体的总碱性同种型种类的少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％或少于10％，其中所述碱性同种型种类相对于所述抗α4β7抗体的主要同种型具有净正电荷，并且其中所述抗α4β7抗体包含含有SEQ ID NO:1的重链可变区域和含有SEQ ID NO:2的轻链可变区。在一些实施方案中，可以通过阳离子交换(CEX)色谱来量化碱性同种型种类。例如，在一些实施方案中，可以通过确定比与主要同种型对应的峰更慢从阳离子交换(CEX)树脂洗脱的峰的相对面积来量化碱性同种型种类。
因此，在另一方面，本文提供一种包含抗α4β7抗体的低碱性种类组合物，其中所述组合物包含所述抗α4β7抗体的总碱性同种型种类的少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％或少于10％，其中所述碱性同种型种类相对于所述抗α4β7抗体的主要同种型具有净正电荷，并且能够通过确定比与主要同种型对应的峰更慢从阳离子交换(CEX)树脂洗脱的峰的相对面积来量化，并且其中所述抗α4β7抗体包含含有SEQ ID NO:1的重链可变区和含有SEQ ID NO:2的轻链可变区。
在一些实施方案中，组合物包含第一碱性同种型峰(BP1)和第二碱性同种型峰(BP2)。在一些实施方案中，组合物包含少于2％BP2。在一些实施方案中，组合物包含少于1.5％BP2。在一些实施方案中，组合物包含少于1％BP2。在一些实施方案中，组合物包含少于0.7％BP2。
在一些实施方案中，BP1与BP2的比率为至少3。在一些实施方案中，BP1与BP2的比率为至少5。在一些实施方案中，BP1与BP2的比率为至少7。在一些实施方案中，BP1与BP2的比率为至少10。
在一些实施方案中，组合物包含抗α4β7抗体的总碱性同种型种类的少于8％。在一些实施方案中，组合物包含抗α4β7抗体的总碱性同种型种类的少于7％。在一些实施方案中，组合物包含抗α4β7抗体的总碱性同种型种类的少于6％。在一些实施方案中，组合物包含抗α4β7抗体的总碱性同种型种类的少于5％。
在另一方面，本文提供了药物组合物，其包含本文提供的组合物和药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物的pH在6.0-7.0之间。在一些实施方案中，药物组合物的pH为约pH 6.3。在其他实施方案中，药物组合物的pH为pH 6.3至pH 6.5。
在一些实施方案中，药物组合物进一步包含氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是精氨酸或组氨酸。
在一些实施方案中，药物组合物进一步包含糖。在某些实施方案中，糖是蔗糖或海藻糖。
在一些实施方案中，药物组合物包含精氨酸、组氨酸和蔗糖。在一些实施方案中，药物组合物包含精氨酸、组氨酸、蔗糖和聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，药物组合物包含至少200mg、至少250mg或至少300mg的抗α4β7抗体。在一些实施方案中，药物组合物包含约300mg的抗α4β7抗体。
在一些实施方案中，抗α4β7抗体是维多珠单抗或其抗原结合部分。
在另一方面，本文提供了一种产生具有总碱性同种型种类的少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、或少于10％的包含抗α4β7抗体的低碱性种类组合物的方法，所述方法包括提供pH大于pH6.3的包含抗α4β7抗体的组合物；以及将包含抗α4β7抗体的组合物孵育大于10小时的时间段；从而产生具有总碱性同种型种类的少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、或少于10％的包含抗α4β7抗体的低碱性种类组合物。在一些实施方案中，抗α4β7抗体包含含有SEQ ID NO:1的重链可变区和含有SEQ ID NO:2的轻链可变区。
在另一方面，本文提供了一种产生具有总碱性同种型种类的少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、或少于10％的包含抗α4β7抗体的低碱性种类组合物的方法，所述方法包括提供pH大于pH6.3的包含维多珠单抗的组合物；以及将包含维多珠单抗的组合物孵育足以降低组合物中碱性维多珠单抗同种型种类的水平的时间段；从而产生具有总碱性同种型种类的少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、或少于10％的包含抗α4β7抗体的低碱性种类组合物。在一些实施方案中，抗α4β7抗体包含含有SEQ ID NO:1的重链可变区和含有SEQ ID NO:2的轻链可变区。
通常，碱性同种型种类相对于抗α4β7抗体的主要同种型具有净正电荷。在一些实施方案中，碱性同种型种类的水平可以使用阳离子交换色谱(CEX)来量化。在一些实施方案中，可以通过确定比与主要同种型对应的峰更慢从阳离子交换(CEX)树脂洗脱的峰的相对面积来量化碱性同种型种类的水平。在一些实施方案中，组合物包含第一碱性同种型峰(BP1)和第二碱性同种型峰(BP2)。在一些实施方案中，组合物包含少于2％BP2。在一些实施方案中，组合物包含少于1.5％BP2。在一些实施方案中，组合物包含少于1％BP2。在一些实施方案中，组合物包含少于0.7％BP2。
在一些实施方案中，BP1与BP2的比率为至少3。在一些实施方案中，BP1与BP2的比率为至少5。在一些实施方案中，BP1与BP2的比率为至少7。在一些实施方案中，BP1与BP2的比率为至少10。
在一些实施方案中，组合物包含抗α4β7抗体的总碱性同种型种类的少于8％。在一些实施方案中，组合物包含抗α4β7抗体的总碱性同种型种类的少于7％。在一些实施方案中，组合物包含抗α4β7抗体的总碱性同种型种类的少于6％。在一些实施方案中，组合物包含抗α4β7抗体的总碱性同种型种类的少于5％。
在一些实施方案中，本文提供包含可通过前述方法获得的抗α4β7抗体的组合物。在一些实施方案中，抗体是维多珠单抗或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，本文提供包含通过前述方法获得的抗α4β7抗体的组合物。在一些实施方案中，抗体是维多珠单抗或其抗原结合部分。
在另一方面，本文提供用于治疗人受试者的疾病或病症的方法，其中所述方法包括向受试者施用有效治疗人受试者的疾病或病症的量的包含抗α4β7抗体(例如，维多珠单抗)本文提供的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包括如本文所提供的和/或如根据本文提供的方法产生的具有降低的碱性维多珠单抗同种型种类水平和/或具有降低的宿主细胞蛋白水平的维多珠单抗组合物。在一些实施方案中，抗α4β7抗体包含含有SEQ IDNO:1的重链可变区和含有SEQ ID NO:2的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述疾病或病症是炎症性肠病(IBD)。在一些实施方案中，IBD是溃疡性结肠炎、克罗恩病、回肠炎、乳糜泻、非热带性口炎性腹泻、与血清阴性关节病相关的肠病、显微镜结肠炎或产胶原性结肠炎、嗜酸性胃肠炎、或直肠结肠切除术和回肠肛管吻合术后产生的结肠袋炎。在一些实施方案中，炎症性肠病是克罗恩病或溃疡性结肠炎。可以治疗的其他疾病包括例如原发性硬化性胆管炎(PSC)和移植物抗宿主病(GVHD)。
另外，本发明还包括以下实施方案：
1.一种产生具有降低的碱性维多珠单抗同种型种类水平的包含维多珠单抗的组合物的方法，所述方法包括：
提供pH大于pH 6.5的包含维多珠单抗的组合物；以及
将所述包含维多珠单抗的组合物孵育大于10小时的时间段；
从而产生具有降低的碱性维多珠单抗同种型种类水平的包含维多珠单抗的组合物。
2.如条目1所述的方法，其中所述孵育在环境温度下进行。
3.如条目1所述的方法，其中所述孵育在15℃-30℃下进行。
4.如条目1所述的方法，其中所述孵育在20℃-25℃下进行。
5.如前述条目中任一项所述的方法，其中所述包含维多珠单抗的组合物以约6.5-8.5的pH提供。
6.如前述条目中任一项所述的方法，其中所述包含维多珠单抗的组合物以约7.0-8.0的pH提供。
7.如前述条目中任一项所述的方法，其中所述包含维多珠单抗的组合物以约7.0-7.5的pH提供。
8.如前述条目中任一项所述的方法，其中所述包含维多珠单抗的组合物以约pH6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9、pH 8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4或pH 8.5的pH提供。
9.如前述条目中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育约10至120小时的时间段。
10.如前述条目中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育约12至120小时的时间段。
11.如前述条目中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育约12至96小时的时间段。
12.如前述条目中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育约12至72小时的时间段。
13.如前述条目中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育约12至48小时的时间段。
14.如前述条目中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育至少12小时的时间段。
15.如前述条目中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育约24至120小时的时间段。
16.如前述条目中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育约24至96小时的时间段。
17.如前述条目中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育约24至72小时的时间段。
18.如前述条目中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育约24至48小时的时间段。
19.如前述条目中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约96小时或约120小时的时间段。
20.如前述条目中任一项所述的方法，其中所述包含维多珠单抗的组合物源自表达维多珠单抗的哺乳动物细胞培养物。
21.如条目20所述的方法，其中所述哺乳动物细胞培养物是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物。
22.如条目21所述的方法，其中所述CHO细胞培养物包含缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)表达的CHO细胞。
23.如条目21所述的方法，其中所述CHO细胞培养物包含缺乏谷氨酰胺合成酶(GS)表达的CHO细胞。
24.如前述条目中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使用一个或多个选自由亲和色谱、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱和陶瓷羟基磷灰石(CHT)色谱组成的组的色谱分离步骤从哺乳动物宿主细胞蛋白(HCP)中纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
25.如条目24所述的方法，其中使用包含蛋白A的亲和色谱树脂纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
26.如条目25所述的方法，其中在所述孵育之前使用亲和色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
27.如条目25所述的方法，其中在所述孵育之后使用亲和色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
28.如条目24所述的方法，其中使用阳离子交换色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
29.如条目28所述的方法，其中在所述孵育之前使用阳离子交换色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
30.如条目28所述的方法，其中在所述孵育之后使用阳离子交换色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
31.如条目24所述的方法，其中使用阴离子交换色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
32.如条目31所述的方法，其中在所述孵育之前使用阴离子交换色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
33.如条目31所述的方法，其中在所述孵育之后使用阴离子交换色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
34.如条目24所述的方法，其中使用CHT色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
35.如条目34所述的方法，其中在所述孵育之前使用CHT色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
36.如条目34所述的方法，其中在所述孵育之后使用CHT色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
37.一种包含维多珠单抗的组合物，其中所述组合物通过条目1-36中任一项所述的方法产生。
38.如条目37所述的组合物，其中所述碱性维多珠单抗同种型种类组成存在于所述组合物中的维多珠单抗种类的少于10％。
39.一种产生具有减少量的宿主细胞蛋白(HCP)的包含维多珠单抗的组合物的方法，所述方法包括：
(a)在装载缓冲液的存在下使含有维多珠单抗和HCP的样品与阴离子交换树脂接触，其中所述装载缓冲液的电导率为11mS/cm或更少，使得HCP与阴离子交换树脂结合；以及
(b)收集来自所述阴离子交换树脂的流过材料，
其中所述流过材料包含维多珠单抗和减少量的HCP。
40.如条目39所述的方法，其中所述装载缓冲液具有9mS/cm至11mS/cm的电导率。
41.如条目39所述的方法，其中所述装载缓冲液具有10mS/cm或更少的电导率。
42.如条目39所述的方法，其中所述装载缓冲液具有9mS/cm或更少的电导率。
43.如条目39所述的方法，其中所述装载缓冲液具有约9mS/cm、9.5mS/cm、10mS/cm、10.5mS/cm或11mS/cm的电导率。
44.如条目39-42中任一项所述的方法，其中所述HCP是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞蛋白。
45.如条目44所述的方法，其中所述HCP源自缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)表达的CHO细胞。
46.如条目44所述的方法，其中所述HCP源自缺乏谷氨酰胺合成酶(GS)表达的CHO细胞。
47.如条目39-46中任一项所述的方法，所述方法进一步包括使所述阴离子交换树脂与洗涤缓冲液接触。
48.如条目47所述的方法，其中所述洗涤缓冲液具有小于11mS/cm的电导率。
49.如条目47所述的方法，其中所述洗涤缓冲液具有9mS/cm至11mS/cm的电导率。
50.如条目47所述的方法，其中所述洗涤缓冲液具有与所述装载缓冲液相同的电导率。
51.如条目39-50中任一项所述的方法，其中所述装载缓冲液包含氯化钠和/或磷酸钠。
52.如条目39-50中任一项所述的方法，其中所述洗涤缓冲液包含氯化钠和/或磷酸钠。
53.如条目39-52中任一项所述的方法，其中所述阴离子交换树脂被格式化为阴离子交换柱或阴离子交换膜。
54.如条目39-53中任一项所述的方法，其中所述阴离子交换树脂包含季胺官能团。
55.如条目39-54中任一项所述的方法，其中所述含有维多珠单抗和HCP的样品源自在一个或多个色谱分离步骤之后的哺乳动物细胞培养物。
56.如条目55所述的方法，其中所述一个或多个色谱分离步骤包括选自由亲和色谱、阳离子交换色谱和陶瓷羟基磷灰石(CHT)色谱组成的组的一个或多个步骤。
57.如条目39-56中任一项所述的方法，其中所述洗脱物中HCP的量为8ppm或更少、7.5ppm或更少、7ppm或更少、6.5ppm或更少、6ppm或更少、5.5ppm或更少、5ppm或更少、4.5ppm或更少、4ppm或更少、3.5ppm或更少、3ppm或更少、2.5ppm或更少、或2ppm或更少。
58.如条目39-57中任一项所述的方法，其中相对于当用电导率大于12mS/cm的装载缓冲液使用相同样品进行所述方法时产生的流过材料中HCP的量，所述流过材料中HCP的量减少至少50％。
59.如条目39-58中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括通过包括超滤和/或渗滤的过程处理所述流过材料，以将所述洗脱缓冲液交换为包含一种或多种药学上可接受的载剂或赋形剂的缓冲液。
60.一种包含维多珠单抗的组合物，所述组合物通过条目39-59中任一项所述的方法产生。
61.如条目60所述的组合物，其中所述组合物中HCP的量为8ppm或更少、7.5ppm或更少、7ppm或更少、6.5ppm或更少、6ppm或更少、5.5ppm或更少、5ppm或更少、4.5ppm或更少、4ppm或更少、3.5ppm或更少、3ppm或更少、2.5ppm或更少、或2ppm或更少。
62.一种增加从混合模式色谱树脂洗脱后回收的维多珠单抗的产率的方法，所述方法包括用平衡缓冲液平衡所述混合模式色谱树脂，将包含维多珠单抗和装载缓冲液的溶液装载到所述混合模式色谱树脂上，使得维多珠单抗结合所述混合模式色谱树脂，用洗涤缓冲液洗涤所述混合模式色谱树脂，并用洗脱缓冲液从所述混合模式色谱树脂洗脱维多珠单抗，其中所述平衡缓冲液、装载缓冲液和/或洗涤缓冲液具有7.0或低于7.0的pH。
63.如条目62所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有6.0-7.0的pH。
64.如条目62所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有6.5-7.0的pH。
65.如条目62所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有6.6-6.8的pH。
66.如条目62-65中任一项所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有30mM至70mM的盐浓度。
67.如条目66所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有40mM至70mM的盐浓度。
68.如条目66所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有50mM至65mM的盐浓度。
69.如条目66所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有55mM-65mM的盐浓度。
70.如条目66-69中任一项所述的方法，其中所述盐包括氯化钠和/或磷酸钠。
71.如条目62-65中任一项所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有30mM至70mM的氯化钠浓度。
72.如条目71所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有40mM至70mM的氯化钠浓度。
73.如条目71所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有40mM至60mM的氯化钠浓度。
74.如条目71所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有45mM-55mM的氯化钠浓度。
75.如条目71所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有约50mM的氯化钠浓度。
76.如条目71-75中任一项所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液进一步包含磷酸钠。
77.如条目62-76中任一项所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有相同的pH。
78.如条目62-77中任一项所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有相同的盐浓度。
79.如条目62-76中任一项所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液是相同的缓冲液。
80.如条目62-79中任一项所述的方法，其中所述混合模式树脂是陶瓷羟基磷灰石树脂。
附图说明
图1描绘了维多珠单抗的阳离子交换(CEX)-高效液相色谱(HPLC)曲线，指示出的峰代表酸性种类、碱性种类和维多珠单抗的主要同种型。
图2描绘了在CHT柱上装载27mg/ml蛋白质或35mg/ml蛋白质后，使用标准陶瓷羟基磷灰石(CHT)平衡和洗涤缓冲液纯化的维多珠单抗的洗脱曲线。
图3描绘了在CHT柱上装载38mg/ml蛋白质后，使用标准CHT平衡和洗涤缓冲液或降低的PH缓冲液纯化的维多珠单抗的洗脱曲线。
具体实施方式
本文提供了用于从液体溶液，例如从哺乳动物细胞培养物的澄清收获物中纯化抗α4β7整联蛋白抗体诸如维多珠单抗的方法。本发明尤其涉及用于控制存在于抗α4β7整联蛋白抗体或其抗原结合片段(例如，维多珠单抗)的纯化制剂中的产物相关物质(例如，碱性和/或酸性同种型种类)和/或过程相关杂质(例如，宿主细胞蛋白(HCP)、宿主细胞核酸、病毒、色谱材料、和/或培养基组分)的量的纯化方法。维多珠单抗是一种相对疏水的抗体，这对纯化提出了挑战，特别是当以治疗用途所需的纯度水平大量生产抗体时。
I.定义
为了更容易理解本发明，首先限定了某些术语。
细胞表面分子“α4β7整联蛋白”或“α4β7”(自始至终可互换使用)是α4链(CD49D、ITGA4)和β7链(ITGB7)的异源二聚体。人α4-整联蛋白和β7-整联蛋白基因(GenBank(National Center for Biotechnology Information,Bethesda,Md.)RefSeq登录号分别为NM_000885和NM_000889)由B和T淋巴细胞表达，特别是记忆CD4+淋巴细胞。作为许多整联蛋白的典型特征，α4β7可以以静止或激活状态存在。α4β7的配体包括血管细胞粘附分子(VCAM)、纤连蛋白和粘膜地址素(MAdCAM(例如，MAdCAM-1))。结合α4β7整联蛋白的抗体在本文中被称为“抗α4β7抗体”。
如本文所用，具有“对α4β7复合物的结合特异性”的抗体或其抗原结合片段结合α4β7，但不结合α4β1或αEB7。维多珠单抗是对α4β7复合物具有结合特异性的抗体的一个实例。
术语“约”表示其后的以下值不是精确值而是值的+/-5％范围的中心点。如果所述值是以百分比给出的相对值，则术语“约”还表示其后的以下值不是精确值，而是值的+/-5％范围的中心点，由此范围的上限不能超过值100％。
如本文所用，术语一种或多种“聚集体”是指两个或更多个抗体或抗体片段的缔合。例如，聚集体可以是抗体和/或抗体片段的二聚体、三聚体、四聚体或大于四聚体的多聚体。抗体聚集体可以是可溶的或不可溶的。聚集分子之间的缔合可以是共价的或非共价的，而不考虑它们相缔合的机制。所述缔合可以是聚集分子之间的直接缔合，或是通过将它们连接在一起的其他分子的间接缔合。后者的实例包括但不限于与其他蛋白质的二硫键合、与脂质的疏水性缔合、与DNA的电荷缔合、与浸出的蛋白A的亲和缔合、或与多种组分的混合缔合。在细胞培养中的蛋白质表达期间、在下游处理中的蛋白质纯化期间或在储存期间，可能不可逆地形成聚集体。可以使用例如尺寸排阻色谱(SEC)(例如，带UV检测的SEC、带光散射检测的SEC(SEC-LSD))、场流分级分离、分析超速离心沉降速度、或毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(CE-SDS，还原和非还原)，来确定溶液中聚集体的存在。
如本文所用，术语“抗体”旨在指由通过二硫键相互连接的四条多肽链即两条重(H)链和两条轻(L)链组成的免疫球蛋白分子。每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为具有高变性的区域，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在一些实施方案中，抗体具有片段可结晶(Fc)区。在某些实施方案中，抗体是IgG1同种型并且具有κ轻链。
如本文所用，术语“碱性种类”或“碱性同种型种类”是指抗体或其抗原结合部分(例如，维多珠单抗)的变体，其特征在于总体碱性电荷。抗体或其抗原结合部分的碱性种类可以通过本领域已知的各种方法检测，如阳离子交换-高效液相色谱(CEX-HPLC)、CEX-质谱或等电聚焦。抗体的碱性种类可以包括但不限于电荷变体、结构变体、和/或碎片变体。在一些实施方案中，包含抗体或其抗原结合部分的组合物可包含多于一个类型的碱性同种型种类。在一些实施方案中，可基于CEX-HPLC分离期间保留时间的差异来鉴定多个碱性同种型种类。例如，当使用CEX-HPLC分析包含抗体(例如，维多珠单抗)的组合物时，可以鉴定一个或多个碱性同种型峰，每个峰代表抗体的一个或多个碱性同种型种类，如图1所示。例如，在一些实施方案中，碱性同种型种类是其中天冬氨酸残基已经历异构化为琥珀酰亚胺的抗体的同种型。宿主细胞杂质或与抗体或其抗原结合部分不相关的其他杂质，按一级序列，不被视为抗体或其抗原结合部分的“碱性种类”或“碱性同种型种类”。
如本文所用，术语“缓冲液”是指通过其酸碱缀合组分的作用抵抗pH变化的水溶液。缓冲液用于建立一组特定的条件，例如生化条件，以介导处理步骤或色谱支持物(如色谱树脂或膜)的控制。
“CDR”或“互补决定区”是散布在更保守的区域，称为“框架区”(FR)内的高变区。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”是指Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、单链抗体、功能性重链抗体(纳米抗体)、以及对至少一个所需表位具有特异性的抗体的任何部分，其与完整抗体竞争特异性结合(例如，具有足够框架序列以特异性结合表位的互补决定区的分离部分)。抗原结合片段可以通过重组技术产生，或者通过抗体的酶促或化学裂解产生。
如本文所用，“色谱支持物”是指具有特定化学组成或特定三维结构或其中特定化学基团或大分子可以被固定在上面以进行色谱的固体或多孔基质，包括亲和色谱、凝胶过滤(尺寸排阻色谱)或离子交换色谱。色谱支持物的实例包括但不限于树脂(例如，琼脂糖)或膜。如本文所用，“色谱壳体”是指含有色谱支持物的结构。色谱壳体的实例包括柱或筒，或其他容器。
如本文所用，术语“澄清收获物”是指在经历用以从材料中去除固体颗粒(如细胞碎片和微粒杂质)的一个或多个过程步骤后从细胞培养物(例如，发酵生物反应器)中提取的含有所关注蛋白质(例如，抗α4β7抗体)的液体材料。在细胞培养后，典型地使用诸如离心和过滤等分离技术对收获物进行纯化，以去除细胞和细胞碎片。初始澄清、微粒去除步骤产生可用于例如后续色谱步骤(下游处理)的“澄清收获物”。澄清收获物通常是下游处理的起始材料，如本文所述的下游处理步骤。
如本文所用，术语“培养”和“细胞培养”通常是指细胞在受控条件下，通常在其自然环境之外生长的(上游)过程。“培养”细胞是指在适合细胞存活和/或生长和/或增殖的条件下使细胞与细胞培养基接触。在某些实施方案中，细胞培养是指用于产生和维持能够产生所关注重组蛋白(例如，抗α4β7抗体)的宿主细胞群的方法，以及用于产生和收集所关注蛋白质的方法和技术。例如，一旦将表达载体掺入合适的宿主(例如，培养中的宿主细胞)中，就可以将宿主维持在适合表达相关核苷酸编码序列以及收集和纯化所需重组蛋白的条件下。“细胞培养物”也可以指含有细胞的溶液。
如本文所用，术语“下游过程”是指在上游过程之后用以纯化所关注蛋白质(例如，抗体)的一种或多种技术。例如，下游过程技术包括使用例如亲和色谱(包括蛋白A亲和色谱)、离子交换色谱(如阴离子或阳离子交换色谱)、尺寸排阻色谱、混合模式色谱、疏水相互作用色谱(HIC)或置换色谱来纯化蛋白质产物。
如本文所用，术语“洗脱溶液”或“洗脱液”是指配制用于置换所关注蛋白质，例如来自色谱支持物(例如，树脂或膜)的抗体的水性液体。在一个实施方案中，洗脱溶液具有不同于平衡和/或洗涤溶液的生化特性，使得所关注蛋白质(例如，抗体)优选缔合洗脱溶液，而不是色谱支持物(例如，树脂或膜)。
如本文所用，术语“平衡溶液”是指配制成为处理步骤或色谱支持物(如色谱操作)建立初始操作条件的水性液体。平衡溶液用以制备例如固相，例如色谱支持物(例如，树脂或膜)，其用于装载所关注蛋白质(例如，抗体)。
如本文所用，例如与色谱步骤相关的“流过操作”是指在装载和洗涤期间蛋白质洗脱而杂质结合并保持与色谱支持物相缔合的过程。
术语“高分子量”或“HMW”用于表示分子量大于单体抗体的抗体复合物。在一个实施方案中，HMW聚集体具有大于约147kDa的分子量。高分子量聚集体的存在可以通过本领域已知的标准方法确定，例如尺寸排阻色谱(SEC)。
“人源化”形式的非人(例如，啮齿动物)抗体为含有源自非人抗体的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是其中来自受体高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的具有期望特异性、亲和力和能力的高变区的残基替换的人免疫球蛋白(受体抗体)。在一些情况下，人抗体的框架区(FR)残基被对应的非人残基替换。另外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有见到的残基。进行这些修饰以便使抗体性能进一步改进。通常，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个且典型地两个可变结构域，其中所有的或者基本上所有的高变环对应于非人抗体的高变CDR环，并且所有的或者基本上所有的FR为人抗体序列的FR。人源化抗体任选地还将包含抗体恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人抗体的恒定区的至少一部分。对于进一步的细节，参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
如本文所用，关于包含待纯化抗体的溶液中所含杂质的术语“杂质”包括过程相关杂质和产物相关杂质两者。如本文所用，术语“过程相关杂质”是指存在于包含蛋白质的组合物(例如，溶液)中但并非源自蛋白质本身的一种杂质(或多种杂质)。例如，过程相关杂质包括但不限于细胞培养基组分、宿主细胞组分(如蛋白质(HCP)、宿主细胞核酸或含脂质的亚细胞结构或其片段)、病毒、来自缓冲液的痕量金属或离子、来自材料处理容器或色谱支持物的可浸出材料。在制备期间可形成蛋白质(例如，抗体)的过程相关杂质(上游和/或下游处理)。如本文所用，术语“宿主细胞杂质”是指由宿主细胞系、细胞培养液或细胞培养物引入的任何蛋白质、核酸污染物、脂质污染物或副产物。术语“宿主细胞蛋白”是指由宿主细胞系、细胞培养液或细胞培养物引入的蛋白质副产物。杂质的实例包括但不限于中国仓鼠卵巢蛋白(CHOP)、大肠杆菌蛋白、酵母蛋白、猿猴COS蛋白或骨髓瘤细胞蛋白(例如，NS0蛋白(源自BALB/c小鼠的小鼠浆细胞瘤细胞))。宿主细胞蛋白不包括在宿主细胞表达系统中产生的所关注蛋白质。例如，当使用CHO细胞来产生重组抗体或其片段时，术语“宿主细胞蛋白”涵盖源自CHO细胞的蛋白质，而不是重组抗体或其片段。如本文所用，术语“产物相关杂质”包括源自所关注蛋白质(例如，抗体)本身的杂质。例如，产物相关杂质包括但不限于所关注抗体的聚集体、错误折叠的种类、氧化或脱酰胺的种类或低分子量片段。
如本文所用，术语“重组抗体”是指作为转录和翻译在已被引入宿主细胞(例如，哺乳动物细胞)中的一个或多个重组表达载体上携带的一个或多个基因的结果产生的抗体。在某些实施方案中，重组蛋白是属于选自由IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE组成的组的同种型的抗体。在某些实施方案中，重组抗体是IgG1。
术语“重组宿主细胞”(在本文中与术语“宿主细胞”可互换使用)包括已引入重组表达载体的细胞。应理解，此类术语不仅意指特定的主题细胞，而且意指此类细胞的后代。因为某些修饰可在后代中由于突变或环境影响而发生，这种子代可能事实上与亲代细胞不同，但是仍然包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。此外，应当理解，除非另有说明，否则在使用术语“细胞”时，例如宿主细胞或哺乳动物细胞或哺乳动物宿主细胞，旨在包括细胞群。
关于所需蛋白质的“基本上纯化的”意指包含所述蛋白质的纯化样品包含至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少97.5％、至少98％、至少98.5％、或至少99％的所需重组蛋白与少于3％、少于2.5％、少于2％、少于1.5％、少于1％、或少于0.5％的杂质。
如本文所用，在蛋白质(例如，抗体)制备的上下文中，术语“上游过程”是指涉及从宿主细胞产生和收集蛋白质(例如，抗体)的活动(例如，在培养细胞以产生所关注蛋白质(例如，抗体)时)。
如本文所用，术语“载体”是指能够使与其连接的另一核酸增殖的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入该载体的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够引导与其可操作性连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所用，术语“洗涤液”或“洗涤溶液”是指配制用于从色谱支持物(如树脂或膜)置换未结合的污染物的水性液体。在一些实施方案中，在装载蛋白质(例如，所关注抗体)之后并且在洗脱所关注蛋白质(例如，抗体)之前，使洗涤液在固体支持物(例如，树脂或膜)上通过。在一个实施方案中，洗涤液具有与平衡溶液相似的生化特性。
II.抗α4β7整联蛋白抗体
本文公开的方法可用于产生大量的包含抗α4β7整联蛋白抗体的高度纯化组合物。显而易见的是，用于产生本文所述的抗α4β7整联蛋白抗体的任何方法都可以单独使用或组合使用。在示例性实施方案中，抗体是维多珠单抗，或具有维多珠单抗的一个或多个抗原结合区的抗体。维多珠单抗也以其商品名
Figure BDA0003459037070000291
(Takeda Pharmaceuticals,Inc.)为人所知。维多珠单抗是一种人源化抗体，其包含人IgGl框架和恒定区以及来自鼠抗体Act-1的抗原结合CDR。维多珠单抗CDR、可变区和突变Fc区(突变以消除Fc效应功能)在美国专利第7,147,851号中描述，该专利通过引用整体并入本文。
维多珠单抗是一种人源化单克隆抗体，其与α4β7整联蛋白(例如，α4β7复合物)特异性结合。维多珠单抗阻断α4β7整联蛋白与粘膜地址素细胞粘附分子-1(MAdCAM-1)的相互作用，并抑制记忆T淋巴细胞穿过内皮迁移到发炎的胃肠实质组织中。维多珠单抗不结合或抑制整联蛋白α4β1或αEβ7的功能，也不拮抗α4整联蛋白与血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的相互作用。
α4β7整联蛋白在优先迁移到胃肠道中的记忆T淋巴细胞的离散亚群的表面上表达。MAdCAM-1主要在肠道内皮细胞上表达，并在T淋巴细胞归巢至肠道淋巴组织方面起关键作用。α4β7整联蛋白与MAdCAM-1的相互作用被认为是粘膜炎症的重要促成因素，如作为溃疡性结肠炎和克罗恩病的标志的慢性炎症。维多珠单抗可用于治疗炎症性肠病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎、结肠袋炎(包括慢性结肠袋炎)、移植物抗宿主病和HIV。
维多珠单抗的重链可变区在本文中提供为SEQ ID NO:1，并且维多珠单抗的轻链可变区在本文中提供为SEQ ID NO:5。维多珠单抗包含含有SEQ ID NO:2的CDR1、SEQ IDNO:3的CDR2和SEQ ID NO:4的CDR3的重链可变区。维多珠单抗包含含有SEQ ID NO:6的CDR1、SEQ ID NO:7的CDR2和SEQ ID NO:8的CDR3的轻链可变区。在一个实施方案中，所述抗体包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链。维多珠单抗和维多珠单抗的序列也在美国专利公开第2014/0341885号和美国专利公开第2014-0377251号中描述，其各自的全部内容明确通过引用整体并入本文。本文公开的方法可以使用包含上文阐述的结合区(例如，CDR)或可变区的抗体进行。
本发明的方法可用于在哺乳动物细胞中产生抗α4β7抗体，特别是维多珠单抗或具有维多珠单抗的结合区(即CDR)或可变区的抗体。
抗体产生的示例性策略
在某些实施方案中，本文所述的方法可以结合一个或多个另外的步骤进行以促进维多珠单抗的产生和/或纯化，包括以下描述的一个或多个步骤。为了长期、高产地产生诸如维多珠单抗等重组蛋白，可以将哺乳动物宿主细胞工程改造以稳定表达抗α4β7抗体(例如，维多珠单抗)。以下中描述了示例性的细胞培养过程以及产生诸如维多珠单抗等的单克隆抗体的注意事项：Li等人(2010)mAbs 2:5,466-477以及Birch和Racher(2006)Adv.DrugDelivery Rev.58:671-685，其全部内容通过引用并入本文。
在某些实施方案中，初次回收可通过依次采用降低pH、离心和过滤步骤以从产生生物反应器收获物中去除细胞和细胞碎片(包括HCP)来进行。在某些实施方案中，本发明涉及使来自所述初次回收的样品混合物经受亲和色谱、阴离子交换(AEX)、阳离子交换(CEX)、疏水相互作用色谱(HIC)、陶瓷羟基磷灰石色谱(CHT)和/或混合模式(MM)纯化步骤中的一项或多项。在一些实施方案中，通过调节聚集体、杂质或同种型的水平，步骤的顺序可以影响抗体组合物的所得质量。
在一个示例性实施方案中，包含维多珠单抗的组合物可以使用包括以下顺序的步骤的过程进行纯化：亲和色谱(例如，蛋白A)、混合模式、阳离子交换、阴离子交换。
在另一个示例性实施方案中，包含维多珠单抗的组合物可以使用包括以下顺序的步骤的过程进行纯化：亲和色谱(例如，蛋白A)、混合模式、阴离子交换、阳离子交换。
在另一个示例性实施方案中，包含维多珠单抗的组合物可以使用包括以下顺序的步骤的过程进行纯化：亲和色谱(例如，蛋白A)、阳离子交换、混合模式、阴离子交换。
在另一个示例性实施方案中，包含维多珠单抗的组合物可以使用包括以下顺序的步骤的过程进行纯化：亲和色谱(例如，蛋白A)、阴离子交换、混合模式、阳离子交换。
在另一个示例性实施方案中，包含维多珠单抗的组合物可以使用包括以下顺序的步骤的过程进行纯化：混合模式、亲和色谱(例如，蛋白A)、阴离子交换、阳离子交换。
在另一个示例性实施方案中，包含维多珠单抗的组合物可以使用包括以下顺序的步骤的过程进行纯化：亲和色谱(例如，蛋白A)、CHT色谱、阳离子交换、阴离子交换。
在另一个示例性实施方案中，包含维多珠单抗的组合物可以使用包括以下顺序的步骤的过程进行纯化：亲和色谱(例如，蛋白A)、CHT色谱、阴离子交换、阳离子交换。
在另一个示例性实施方案中，包含维多珠单抗的组合物可以使用包括以下顺序的步骤的过程进行纯化：亲和色谱(例如，蛋白A)、阳离子交换、CHT色谱、阴离子交换。
在另一个示例性实施方案中，包含维多珠单抗的组合物可以使用包括以下顺序的步骤的过程进行纯化：亲和色谱(例如，蛋白A)、疏水相互作用色谱、阳离子交换、阴离子交换。
在另一个示例性实施方案中，包含维多珠单抗的组合物可以使用包括以下顺序的步骤的过程进行纯化：亲和色谱(例如，蛋白A)、疏水相互作用色谱、阴离子交换、阳离子交换。
在另一个示例性实施方案中，包含维多珠单抗的组合物可以使用包括以下顺序的步骤的过程进行纯化：亲和色谱(例如，蛋白A)、阴离子交换、疏水相互作用色谱、阳离子交换。
在另一个示例性实施方案中，包含维多珠单抗的组合物可以使用包括以下顺序的步骤的过程进行纯化：亲和色谱(例如，蛋白A)、阳离子交换、疏水相互作用色谱、阴离子交换。
在另一个示例性实施方案中，包含维多珠单抗的组合物可以使用包括以下顺序的步骤的过程进行纯化：亲和色谱(例如，蛋白A)、阳离子交换、阴离子交换、疏水相互作用色谱。
在另一个示例性实施方案中，包含维多珠单抗的组合物可以使用包括以下顺序的步骤的过程进行纯化：亲和色谱(例如，蛋白A)、阴离子交换、阳离子交换、疏水相互作用色谱。
在另一个示例性实施方案中，包含维多珠单抗的组合物可以使用包括以下顺序的步骤的过程进行纯化：疏水相互作用色谱、亲和色谱(例如，蛋白A)、阴离子交换、阳离子交换。
应当理解的是，纯化步骤不一定彼此紧邻；可以在色谱步骤之间插入各个其他过程步骤(如过滤或病毒减少步骤)，而不干扰色谱步骤顺序对电荷曲线的影响。
为了调节存在于维多珠单抗组合物中的碱性同种型种类的水平，可以在如本文所述的任何前述纯化步骤之间并入孵育步骤。另外或可选地，如本文所述，纯化过程可适于使抗体暴露于低pH条件的持续时间最小化。
为了调节存在于维多珠单抗组合物中的宿主细胞蛋白水平，可以在采用阴离子交换色谱的维多珠单抗纯化过程的任何阶段使用如本文所述的低电导率缓冲液进行AEX。
为了调节包括CHT的纯化过程中的维多珠单抗的产率，可以在采用陶瓷羟基磷灰石色谱的维多珠单抗纯化过程的任何阶段使用本文所述的CHT条件。
本发明的某些实施方案将包括进一步的纯化步骤。可以在离子交换色谱法之前、期间或之后进行的另外的纯化程序的实例包括乙醇沉淀、等电聚焦、反相HPLC、硅胶色谱、肝素色谱SepharoseTM、进一步的阴离子交换色谱和/或进一步的阳离子交换色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱(例如，使用蛋白G、抗体、特定底物、配体或抗原作为捕获试剂)。
在某些实施方案中，可以进一步分级分离未结合的流过物和洗涤级分，并且可以将提供目标产物纯度的级分的组合合并。
在某些实施方案中，可以调节蛋白质浓度以实现抗体产物和产物相关物质之间的差异分配行为，使得纯度和/或产量可以进一步改进。在某些实施方案中，装载可以在装载操作期间以不同的蛋白质浓度进行，以改进任何特定的纯化步骤的产物质量/产率。
在某些实施方案中，柱温可以独立变化，以改进任何特定纯化步骤的分离效率和/或产率。
在某些实施方案中，装载和洗涤溶液基质可以是不同的或由化学品的混合物组成，同时实现类似的“树脂相互作用”行为，使得可以实现上述新的分离。例如，但不作为限制，装载和洗涤溶液在离子强度或pH方面可以不同，而在洗涤步骤期间实现的产物冲洗方面保持基本相似的功能。在某些实施方案中，可以向装载或洗涤步骤添加诸如氨基酸、糖、PEG等添加剂，以调节分配行为，从而实现分离效率和/或产率。
在某些实施方案中，装载和洗涤步骤可以通过线内、在线或离线测量柱流出物或收集池或两者中的产物相关杂质/物质水平来控制，以实现目标产物质量和/或产率。在某些实施方案中，装载浓度可以通过用溶液或其他溶液线内或者分批或连续稀释来动态控制以实现改进分离效率和/或产率所需的分配。
本发明的某些实施方案采用超滤和渗滤步骤来进一步浓缩和配制所关注蛋白质，例如抗体产物。以下中详细描述了超滤：Microfiltration and Ultrafiltration:Principles and Applications,L.Zeman和A.Zydney(Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1996)；以及Ultrafiltration Handbook,Munir Cheryan(Technomic Publishing,1986；ISBN号87762-456-9)。一种过滤工艺是切向流过滤，如标题为“PharmaceuticalProcess Filtration Catalogue”第177-202页(Bedford,Mass.,1995/96)的Millipore目录中描述的。超滤通常被认为意指使用孔径小于0.1μm的过滤器进行过滤。通过采用具有这种小孔径的过滤器，可以通过使样品溶液渗透通过过滤膜孔而减少样品的体积，同时将蛋白质(如抗体)保留在膜表面上方。
渗滤是使用膜过滤器去除和交换盐、糖和非水性溶剂，从结合种类中分离出来，以去除低分子量种类和/或引起离子和/或pH环境快速变化的方法。通过以大约等于渗透流速的速率向被渗滤的溶液中添加溶剂，可以最有效地去除微溶质。这会以恒定体积从溶液中洗去微种类，有效地纯化保留的所关注蛋白质。在本发明的某些实施方案中，任选地在进一步的色谱或其他纯化步骤之前，采用渗滤步骤来交换与本发明结合使用的各种溶液，以及从蛋白质制剂中去除杂质。
超滤/渗滤(UF/DF)维多珠单抗可以在选择的装置和膜中进行，例如聚醚砜或再生纤维素，例如
Figure BDA0003459037070000341
或
Figure BDA0003459037070000342
膜，在
Figure BDA0003459037070000343
盒(MilliporeSigma,Burlington MA)中。在一个实施方案中，使用在具有30kDa的截留分子量的微孔聚乙烯膜上浇铸的纤维素膜进行UF。
III.含有改变的碱性同种型种类水平的维多珠单抗组合物的制备
除了维多珠单抗的主要(major或main)同种型之外，来自哺乳动物宿主细胞的维多珠单抗的制剂典型地还含有少量的酸性和/或碱性同种型种类。酸性和碱性同种型种类可以通过本领域已知的方法量化，包括例如阳离子交换-高压液相色谱(CEX-HPLC)。根据在CEX树脂上的保留时间差异，酸性和碱性维多珠单抗同种型可以从主要同种型中拆分出来。通常，如图1所描绘，维多珠单抗液体制剂中存在的酸性维多珠单抗同种型种类相对于主要同种型具有较短的保留时间，而碱性维多珠单抗同种型种类相对于主要同种型具有较长的保留时间。维多珠单抗制剂可包含多于一种酸性种类和/或多于一种碱性种类，其电荷略有变化，因此以不同的保留时间从CEX树脂上洗脱。在本文中关于其在CEX树脂上的保留时间提及了多个碱性峰，借此在主要同种型峰之后从CEX树脂中洗脱的第一碱性同种型峰在本文中称为“碱性峰1”，在主要同种型峰之后从CEX树脂中洗脱的第二碱性同种型峰在本文中称为“碱性峰2”，在主要同种型峰之后从CEX树脂中洗脱的第三碱性同种型峰在本文中称为“碱性峰3”，等等。
在药物抗体制剂中，可能需要使作为主要同种型存在的抗体的百分比最大化，同时使碱性和/或酸性同种型的百分比最小化。在一方面，本发明提供了一种调节包含维多珠单抗的组合物中碱性维多珠单抗同种型的百分比的方法。该方法基于令人惊讶的发现，即可以通过pH的变化调节维多珠单抗同种型的分布。维多珠单抗的碱性同种型对pH波动特别敏感。如本文所述，同种型分布的这种pH依赖性调节至少部分地由碱性峰2的水平的波动以及伴随的维多珠单抗主要同种型的水平的波动驱动。
不希望受理论束缚，并且至少部分基于本文提供的发现，据信在一些维多珠单抗制剂中存在至少两个碱性同种型种类。第一个种类，从CEX树脂中洗脱为“碱性峰1”，归因于IgG重链羧基端存在赖氨酸残基。第二个种类，从CEX树脂中洗脱为“碱性峰2”，归因于抗体中一个或多个天冬氨酸残基异构化以形成琥珀酰亚胺中间体。在某些实施方案中，一个或多个天冬氨酸残基曾经历异构化以形成琥珀酰亚胺中间体。在“n+1位置”与天冬氨酸相邻的甘氨酸或丝氨酸残基(相邻且靠近羧基端的一个氨基酸)可以有利于天冬氨酸残基异构化为琥珀酰亚胺。在一些实施方案中，鉴定维多珠单抗的在SEQ ID NO:1的残基102处包含琥珀酰亚胺代替天冬氨酸的这种变体允许在维多珠单抗制剂中减少、最少化或去除这种碱性同种型变体。在一些实施方案中，该碱性同种型变体可以通过包括例如分级分离含有维多珠单抗的制剂(例如，在CEX树脂上)和去除(或未能收集)含有在SEQ ID NO:1的残基102处的琥珀酰亚胺代替天冬氨酸的那些级分的方法去除，其也可鉴定为从CEX树脂中洗脱为“碱性峰2”的维多珠单抗的级分。在一些实施方案中，在维多珠单抗产生和纯化过程中，通过控制抗体的pH暴露，可以最小化该碱性同种型变体(在本文中称为“琥珀酰亚胺变体”或可选地称为“碱性同种型峰2”或“BP2”变体)的水平。在一些实施方案中，包含降低水平的这种碱性同种型变体的组合物可包含维多珠单抗主要同种型的相对比例的对应增加。因此，在一些实施方案中，相对于包含增加水平的该碱性同种型变体的组合物，包含降低水平的该碱性同种型变体的组合物可具有增加的效力。
在一个实施方案中，本文提供了纯化具有降低的碱性同种型种类水平的维多珠单抗的方法，其中将维多珠单抗维持在pH 5.5或高于pH 5.5、pH 5.6或高于pH 5.6、pH 5.7或高于pH 5.7、pH 5.8或高于pH 5.8、pH 5.9或高于pH 5.9、pH 6.0或高于pH 6.0、pH 6.1或高于pH 6.1、pH 6.2或高于pH 6.2、pH 6.3或高于pH 6.3、pH 6.4或高于pH 6.4、或pH 6.5或高于pH 6.5，持续通过超滤/渗滤(UF/DF)从细胞培养收获物中初次回收维多珠单抗到将维多珠单抗配制在药学上可接受的载剂中之间的总时间的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、或至少99％。通过在大部分纯化过程中将维多珠单抗维持在pH 5.5、pH 5.6、pH 5.7、pH 5.8、pH 5.9、pH6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4或pH6.5或者高于pH 5.5、pH 5.6、pH 5.7、pH 5.8、pH5.9、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4或pH 6.5，可以相对于其中将维多珠单抗在低于pH 5.5-6.5的pH下持续大量时间，例如通过超滤/渗滤(UF/DF)从细胞培养收获物中初次回收维多珠单抗到将维多珠单抗配制在药学上可接受的载剂中之间的总时间的大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、或大于40％，减少碱性维多珠单抗同种型种类。在一些实施方案中，所述方法以商业制造规模进行，例如使用源自以1000L规模、2000L规模、3000L规模、4000L规模或5000L规模(例如，至少3000L规模)产生的细胞培养收获物的维多珠单抗制剂。
因此，在一方面，本发明提供了一种产生抗α4β7抗体或其抗原结合部分的低碱性种类组合物的方法，所述方法包括(i)提供从表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的重组宿主细胞的培养物中获得的澄清的细胞培养物收获物，(ii)并且从细胞培养收获物中纯化抗α4β7抗体或其抗原结合部分，其中抗体暴露于3.5的pH或低于3.5的pH(例如，pH 2.5-3.5、低于3.0的pH或低于3.5的pH)不超过20分钟、不超过30分钟、不超过45分钟、不超过1小时、不超过3小时、不超过5小时、不超过7小时、不超过10小时或不超过12小时，其中抗α4β7抗体或其抗原结合部分与对照相比具有降低的碱性同种型种类水平(由CEX确定)，其中对照是包含通过相同方法产生的抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物，其中抗体暴露于3.5的pH或低于3.5的pH(例如，pH 2.5-3.5、低于3.0的pH或低于3.5的pH)持续更长的时间，即大于20分钟、大于30分钟、大于45分钟、大于1小时、大于3小时、大于5小时、大于7小时、大于10小时或大于12小时。在一些实施方案中，相对于对照，低碱性种类组合物包含较低BP2水平。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分是维多珠单抗或其抗原结合部分。在一些实施方案中，纯化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的步骤包括蛋白A色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、混合模式色谱、疏水相互作用色谱及其组合中的一项或多项。在一些实施方案中，表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的宿主细胞是GS-CHO细胞。在其他实施方案中，宿主细胞是DHFR-CHO细胞。在一些实施方案中，低碱性种类组合物包含少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、或少于9％碱性同种型种类。在一些实施方案中，低碱性种类组合物包含少于4％、少于3％、少于2％、或少于1％碱性同种型峰2。
在另一方面，本发明提供了一种产生抗α4β7抗体或其抗原结合部分的低碱性种类组合物的方法，所述方法包括(i)提供从表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的重组宿主细胞的培养物中获得的澄清的细胞培养物收获物，(ii)并且从细胞培养收获物中纯化抗α4β7抗体或其抗原结合部分，其中抗体暴露于4.0的pH或低于4.0的pH(例如，pH 3.6至4.0)不超过20分钟、不超过30分钟、不超过45分钟、不超过1小时、不超过3小时、不超过5小时、不超过10小时、不超过12小时、不超过15小时、不超过18小时或不超过24小时，其中抗α4β7抗体或其抗原结合部分与对照相比具有降低的碱性同种型种类水平(由CEX确定)，其中对照是包含通过相同方法产生的抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物，其中抗体暴露于4.0的pH或低于4.0的pH(例如，pH 3.6至4.0)持续更长的时间，即大于20分钟、大于30分钟、大于45分钟、大于1小时、大于3小时、大于5小时、大于10小时、大于12小时、大于15小时、大于18小时或大于24小时。在一些实施方案中，相对于对照，低碱性种类组合物包含较低BP2水平。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分是维多珠单抗或其抗原结合部分。在一些实施方案中，纯化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的步骤包括蛋白A色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、混合模式色谱、疏水相互作用色谱及其组合中的一项或多项。在一些实施方案中，表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的宿主细胞是GS-CHO细胞。在其他实施方案中，宿主细胞是DHFR-CHO细胞。在一些实施方案中，低碱性种类组合物包含少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、或少于9％碱性同种型种类。在一些实施方案中，低碱性种类组合物包含少于4％、少于3％、少于2％、或少于1％碱性同种型峰2。
在另一方面，本发明提供了一种产生抗α4β7抗体或其抗原结合部分的低碱性种类组合物的方法，所述方法包括(i)提供从表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的重组宿主细胞的培养物中获得的澄清的细胞培养物收获物，(ii)并且从细胞培养收获物中纯化抗α4β7抗体或其抗原结合部分，其中抗体暴露于4.5的pH或低于4.5的pH(例如，pH 4.1至4.5)不超过3小时、不超过5小时、不超过10小时、或不超过12小时、不超过18小时、不超过24小时、不超过36小时、不超过48小时、不超过72小时或不超过96小时，其中抗α4β7抗体或其抗原结合部分与对照相比具有降低的碱性同种型种类水平(由CEX确定)，其中对照是包含通过相同方法产生的抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物，其中抗体暴露于4.5的pH或低于4.5的pH(例如，pH 4.1至4.5)持续更长的时间，即大于3小时、大于5小时、大于10小时、大于12小时、大于18小时、大于24小时、大于36小时、大于48小时、大于72小时或大于96小时。在一些实施方案中，相对于对照，低碱性种类组合物包含较低BP2水平。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分是维多珠单抗或其抗原结合部分。在一些实施方案中，纯化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的步骤包括蛋白A色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、混合模式色谱、疏水相互作用色谱及其组合中的一项或多项。在一些实施方案中，表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的宿主细胞是GS-CHO细胞。在其他实施方案中，宿主细胞是DHFR-CHO细胞。在一些实施方案中，低碱性种类组合物包含少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、或少于9％碱性同种型种类。在一些实施方案中，低碱性种类组合物包含少于4％、少于3％、少于2％、或少于1％碱性同种型峰2。
在另一方面，本发明提供了一种产生抗α4β7抗体或其抗原结合部分的低碱性种类组合物的方法，所述方法包括(i)提供从表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的重组宿主细胞的培养物中获得的澄清的细胞培养物收获物，(ii)并且从细胞培养收获物中纯化抗α4β7抗体或其抗原结合部分，其中抗体暴露于5.0的pH或低于5.0的pH(例如，pH 4.6至5.0)不超过3小时、不超过5小时、不超过10小时、或不超过12小时、不超过18小时、不超过24小时、不超过36小时、不超过48小时、不超过72小时或不超过96小时，其中抗α4β7抗体或其抗原结合部分与对照相比具有降低的碱性同种型种类水平(由CEX确定)，其中对照是包含通过相同方法产生的抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物，其中抗体暴露于5.0的pH或低于5.0的pH(例如，pH 4.6至5.0)持续更长的时间，即大于3小时、大于5小时、大于10小时、大于12小时、大于18小时、大于24小时、大于36小时、大于48小时、大于72小时或大于96小时。在一些实施方案中，相对于对照，低碱性种类组合物包含较低BP2水平。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分是维多珠单抗或其抗原结合部分。在一些实施方案中，纯化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的步骤包括蛋白A色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、混合模式色谱、疏水相互作用色谱及其组合中的一项或多项。在一些实施方案中，表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的宿主细胞是GS-CHO细胞。在其他实施方案中，宿主细胞是DHFR-CHO细胞。在一些实施方案中，低碱性种类组合物包含少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、或少于9％碱性同种型种类。在一些实施方案中，低碱性种类组合物包含少于4％、少于3％、少于2％、或少于1％碱性同种型峰2。
在另一方面，本发明提供了一种产生抗α4β7抗体或其抗原结合部分的低碱性种类组合物的方法，所述方法包括(i)提供从表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的重组宿主细胞的培养物中获得的澄清的细胞培养物收获物，(ii)并且从细胞培养收获物中纯化抗α4β7抗体或其抗原结合部分，其中抗体暴露于5.5的pH或低于5.5的pH(例如，pH 5.1至5.5)不超过3小时、不超过5小时、不超过10小时、或不超过12小时、不超过18小时、不超过24小时、不超过36小时、不超过48小时、不超过72小时或不超过96小时，其中抗α4β7抗体或其抗原结合部分与对照相比具有降低的碱性同种型种类水平(由CEX确定)，其中对照是包含通过相同方法产生的抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物，其中抗体暴露于5.5的pH或低于5.5的pH(例如，pH 5.1至5.5)持续更长的时间，即大于3小时、大于5小时、大于10小时、大于12小时、大于18小时、大于24小时、大于36小时、大于48小时、大于72小时或大于96小时。在一些实施方案中，相对于对照，低碱性种类组合物包含较低BP2水平。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分是维多珠单抗或其抗原结合部分。在一些实施方案中，纯化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的步骤包括蛋白A色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、混合模式色谱、疏水相互作用色谱及其组合中的一项或多项。在一些实施方案中，表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的宿主细胞是GS-CHO细胞。在其他实施方案中，宿主细胞是DHFR-CHO细胞。在一些实施方案中，低碱性种类组合物包含少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、或少于9％碱性同种型种类。在一些实施方案中，低碱性种类组合物包含少于4％、少于3％、少于2％、或少于1％碱性同种型峰2。
在一些实施方案中，本文提供的方法以商业制造规模进行，例如使用源自以1000L规模、2000L规模、3000L规模、4000L规模或5000L规模(例如，至少3000L规模)产生的细胞培养收获物的维多珠单抗制剂。
在一些方面，本文所述的方法可用于调节包含维多珠单抗的组合物(例如，液体组合物)中碱性维多珠单抗同种型的水平。在一些实施方案中，所述方法可用于产生具有低水平的碱性维多珠单抗种类的维多珠单抗组合物。
在一方面，本发明提供了通过在大于pH 6.5的pH下孵育组合物持续足以降低碱性维多珠单抗同种型种类的水平的时间段，降低包含维多珠单抗的组合物中碱性维多珠单抗同种型种类的水平的方法。在一个实施方案中，所述方法在环境温度，例如20℃-25℃下进行。在其他实施方案中，所述方法在2℃-8℃下进行。
在另一方面，本发明提供了一种产生具有降低的碱性维多珠单抗同种型种类水平的包含维多珠单抗的组合物的方法。所述方法可包括提供pH为pH6.5或高于pH 6.5的包含维多珠单抗的组合物，并将包含维多珠单抗的组合物孵育足以降低碱性维多珠单抗同种型种类的水平的时间段，从而产生具有降低的碱性维多珠单抗同种型种类水平的包含维多珠单抗的组合物。
为了有效地降低维多珠单抗组合物中碱性维多珠单抗同种型种类的水平，优选在pH 6.5或高于pH 6.5的pH下进行孵育。
在示例性实施方案中，维多珠单抗组合物的pH为约pH 6.5-9.0。例如，维多珠单抗组合物的pH可以在约pH 6.5-9.0、pH 6.5-8.5、pH 6.5-8.0、pH 6.5-7.5或pH 6.5-7.0的范围内。可选地，维多珠单抗组合物的pH可以在约pH 7.0-9.0、pH 7.5-9.0、pH 8.0-9.0或pH8.5-9.0的范围内。在其他实施方案中，维多珠单抗组合物的pH可以在约pH 6.5-7.5的范围内，例如pH 6.6-7.3、pH 6.6-7.5、pH 6.7-7.5、pH 6.8-7.5、pH 6.9-7.5、pH 7.0-7.5、pH7.1-7.5、pH 7.2-7.5、pH 7.3-7.5或pH7.4-7.5。在其他实施方案中，维多珠单抗组合物的pH可以在约pH 6.5-7.5、pH 6.5-7.4、pH 6.5-7.3、pH 6.5-7.2、pH 6.5-7.1、pH 6.5-7.0、pH 6.5-6.9、pH 6.5-6.8、pH 6.5-6.75或pH 6.5-6.6的范围内。在其他实施方案中，维多珠单抗组合物的pH可以在约7.0-7.5的范围内。在其他实施方案中，维多珠单抗组合物的pH可以在约7.5-8.0的范围内。在其他实施方案中，维多珠单抗组合物的pH可以在约8.0-8.5的范围内。在示例性实施方案中，维多珠单抗组合物的pH可以为约pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH7.9、pH 8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4、pH 8.5、pH 8.6、pH 8.7、pH 8.8、pH 8.9或pH9.0。
可以将处于上述pH(例如，6.5或高于6.5的pH)下的包含维多珠单抗的组合物孵育足以使维多珠单抗组合物中碱性维多珠单抗同种型种类的百分比降低的时间段。在示例性实施方案中，孵育发生20分钟或更长、30分钟或更长、45分钟或更长、1小时或更长、1.5小时或更长、2小时或更长、3小时或更长、4小时或更长、5小时或更长、8小时或更长、10小时或更长、12小时或更长、15小时或更长、18小时或更长、24小时或更长、48小时或更长、72小时或更长、96小时或更长、120小时或更长、144小时或更长、或168小时或更长的时间段。在一些实施方案中，孵育发生约0.5天或更长、1天或更长、2天或更长、3天或更长、4天或更长、5天或更长、6天或更长、或7天或更长的时间段。在一些实施方案中，孵育可发生约20分钟至约1小时、约20分钟至约1小时、约20分钟至约2小时、约20分钟至约3小时、约1小时至约3小时、约1小时至约5小时、或约5小时至约8小时。在一些实施方案中，孵育可发生约8小时至约168小时(7天)或更长时间。在一些实施方案中，孵育可发生约8-168小时，例如约8-144小时(6天)、约8-120小时(5天)、约8-96小时(4天)、约8-72小时(3天)、约8-48小时(2天)、约8-36小时、约8-24小时(1天)、约8-18小时、约8-12小时、约15-36小时、或约8-10小时。在其他实施方案中，孵育可发生约10小时至约168小时或更长时间，例如约10-168小时、约12-168小时、约18-168小时、约24-168小时、约36-168小时、约48-168小时、约72-168小时、约96-168小时、约120-168小时或约144-168小时。在一些实施方案中，孵育可发生约0.5-7天，例如约0.5-5天、约0.5-4天、约0.5-3天、约0.5-2天或约0.5-1天。在一些实施方案中，孵育可发生约1-5天、约1-3天或约1-2天。在示例性实施方案中，在pH 6.5或pH 6.5以上的孵育发生1-2天、1-3天或1-5天的时间段。在其他示例性实施方案中，在pH 6.5或以上孵育的时间为总纯化时间的≥25％，例如，从提供澄清的细胞培养收获物开始到以纯化的抗体UF/DF结束的持续时间。
在其他实施方案中，孵育发生足以将组合物中碱性维多珠单抗同种型的百分比降低1％或更多，例如1.5％或更多、2％或更多、2.5％或更多、3％或更多、3.5％或更多、4％或更多、4.5％或更多、5％或更多、6％或更多、7％或更多、8％或更多、9％或更多、10％或更多、11％或更多、12％或更多、13％或更多、14％或更多、15％或更多、20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、99％或更多、或100％或更多的时间段。在示例性实施方案中，孵育发生足以将组合物中碱性维多珠单抗同种型种类的百分比降低1％-5％的时间段。在其他实施方案中，孵育发生足以将组合物中碱性维多珠单抗同种型种类的百分比降低1-10％的时间段。在其他实施方案中，孵育发生足以将组合物中碱性维多珠单抗同种型种类的百分比降低2-10％的时间段。在其他实施方案中，孵育发生足以将组合物中碱性维多珠单抗同种型种类的百分比降低5-10％的时间段。在其他实施方案中，孵育发生足以将组合物中碱性维多珠单抗同种型种类的百分比降低2-20％的时间段。在其他实施方案中，孵育发生足以将组合物中碱性维多珠单抗同种型种类的百分比降低5-20％的时间段。
在其他实施方案中，孵育发生足以产生包含抗α4β7抗体(例如，维多珠单抗)的低碱性种类组合物的时间段，其中所述组合物具有总碱性同种型种类的少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、或少于9％。在一些实施方案中，所述方法包括在大于pH 6.3的pH下将组合物孵育足以使碱性同种型峰2的水平达到少于4％、少于3％、少于2％或少于1％的时间段。在一些实施方案中，所述方法包括将包含维多珠单抗的组合物在大于pH 6.3(例如，pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9、pH 8.0、pH 8.1、pH8.2、pH 8.3、pH 8.4、pH 8.5、pH 8.6、pH 8.7、pH 8.8、pH 8.9或pH 9.0)的pH下进行孵育；以及将包含抗α4β7抗体(例如，维多珠单抗)的组合物孵育20分钟或更长，例如30分钟或更长、1小时或更长、2小时或更长、3小时或更长、4小时或更长、5小时或更长、6小时或更长、7小时或更长、8小时或更长、10小时或更长、12小时或更长、15小时或更长、18小时或更长、24小时或更长、48小时或更长、72小时或更长、96小时或更长、120小时或更长、144小时或更长、或168小时或更长的时间段。
在一些实施方案中，在孵育期间，维多珠单抗组合物的pH可以维持在pH 6.3或高于pH 6.3。在其他实施方案中，在孵育期间，维多珠单抗组合物的pH可以维持在pH 6.5或高于pH 6.5。在一些实施方案中，维多珠单抗组合物在孵育时间段的持续时间内维持在大约相同的pH下。
孵育可以在任何合适的温度下进行。例如，孵育可以在约0℃-40℃范围内的温度下进行。在另一个实施方案中，孵育可以在约1℃-37℃范围内的温度下进行。在一些实施方案中，孵育在约0℃-4℃范围内或4℃-8℃范围内的温度下进行。在其他实施方案中，孵育在环境温度下进行。例如，孵育可以在约20℃-25℃的范围内的温度下进行。在其他实施方案中，孵育在37℃或约37℃下进行。在一些实施方案中，孵育在约1℃-25℃范围内的温度下进行。在一些实施方案中，孵育在约5℃-18℃范围内的温度下进行。在一些实施方案中，孵育在约15℃-30℃范围内的温度下进行。在一些实施方案中，孵育在约33℃-37℃范围内的温度下进行。在示例性实施方案中，孵育在0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃下进行。
前述方法可任选地包括调节维多珠单抗组合物的pH的另外的步骤。例如，如果需要降低包含维多珠单抗的组合物中碱性维多珠单抗种类的百分比，则所述方法可包括在孵育之前升高组合物的pH的步骤。例如，如果包含维多珠单抗的组合物处于低于6.5的pH下，则所述方法可包括将组合物的pH升高至6.5或高于6.5的pH的步骤。相反，如果需要增加包含维多珠单抗的组合物中碱性维多珠单抗种类的百分比，则所述方法可包括在孵育之前降低组合物的pH的步骤。例如，如果包含维多珠单抗的组合物的pH在6.5或高于6.5下，则所述方法可包括将组合物的pH降低至低于6.5的pH的步骤。
包含维多珠单抗的组合物可以是液体溶液。在一些实施方案中，包含维多珠单抗的组合物源自用于产生维多珠单抗或其抗原结合部分的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，例如缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)表达的CHO细胞或缺乏谷氨酰胺合成酶(GS)表达的CHO细胞。
在从细胞培养物中分离抗体之后，可以将前述方法并入维多珠单抗纯化的小规模或大规模过程中。在某些实施方案中，从宿主细胞培养物(例如，生物反应器收获物)中初次回收维多珠单抗可以采用离心和过滤的步骤。可以在离心之前或之后和/或在过滤之前或之后，对维多珠单抗组合物进行本文所述的方法，以在对应的纯化阶段降低组合物中碱性同种型种类的水平。在初次回收之后，可用于从过程相关杂质和/或产物相关杂质中纯化维多珠单抗的下游过程步骤包括但不限于亲和色谱(如蛋白A色谱)、深度过滤、阳离子交换(CEX)、阴离子交换(AEX)、混合模式色谱(MM)、陶瓷羟基磷灰石色谱(CHT)、疏水相互作用色谱(HIC)、超滤、和/或渗滤。可以在任何下游过程步骤之前或之后，对维多珠单抗组合物进行本文所述的方法，以在对应的纯化阶段降低组合物中碱性同种型种类的水平。
例如，可以在亲和色谱之前或之后如本文所述孵育维多珠单抗组合物。在一个实施方案中，所述方法可以包括将维多珠单抗组合物(例如，亲和色谱装载材料或亲和色谱洗脱物)的pH调节至pH 6.5或高于pH 6.5的pH。
在另一个实施方案中，可以在深度过滤之前或之后如本文所述孵育维多珠单抗组合物。在一个实施方案中，所述方法可以包括在深度过滤之前或之后将维多珠单抗组合物的pH调节至pH 6.5或高于pH 6.5的pH下。
在另一个实施方案中，可以在阳离子交换(CEX)之前或之后如本文所述孵育维多珠单抗组合物。在一个实施方案中，所述方法可以包括将维多珠单抗组合物(例如，CEX装载材料或CEX洗脱物)的pH调节至pH 6.5或高于pH 6.5的pH。
在另一个实施方案中，可以在阴离子交换(AEX)之前或之后如本文所述孵育维多珠单抗组合物。在一个实施方案中，所述方法可以包括将维多珠单抗组合物(例如，AEX装载材料或AEX流过物)的pH调节至pH 6.5或高于pH 6.5的pH。
在另一个实施方案中，可以在混合模式色谱(MM)之前或之后如本文所述孵育维多珠单抗组合物。在一个实施方案中，所述方法可以包括将维多珠单抗组合物(例如，MM装载材料或MM洗脱物)的pH调节至pH 6.5或高于pH 6.5的pH。
在另一个实施方案中，可以在陶瓷羟基磷灰石色谱(CHT)之前或之后如本文所述孵育维多珠单抗组合物。在一个实施方案中，所述方法可以包括将维多珠单抗组合物(例如，CHT装载材料或CHT洗脱物)的pH调节至pH 6.5或高于pH 6.5的pH。
在另一个实施方案中，可以在疏水相互作用色谱(HIC)之前或之后如本文所述孵育维多珠单抗组合物。在一个实施方案中，所述方法可以包括将维多珠单抗组合物(例如，HIC装载材料或HIC洗脱物)的pH调节至pH 6.5或高于pH 6.5的pH。
在另一个实施方案中，可以在超滤和/或渗滤(UF/DF)之前或之后如本文所述孵育维多珠单抗组合物。在一个实施方案中，所述方法可以包括在UF/DF之前或之后将维多珠单抗组合物的pH调节至pH 6.5或高于pH 6.5的pH。
IV.含有降低的碱性同种型种类的维多珠单抗组合物
在一些方面，本发明提供了包含降低的碱性维多珠单抗同种型种类水平的维多珠单抗组合物。在一些实施方案中，可通过本文提供的方法获得具有降低的碱性同种型种类水平的组合物(例如，参见部分III和实施例)。在一些实施方案中，通过本文提供的方法产生具有降低的碱性同种型种类水平的组合物(例如，参见部分III)。因此，在一个方面，本文提供了包含维多珠单抗的组合物，其中所述组合物是通过尤其包括以下的方法产生的：将包含维多珠单抗的组合物在大于pH 6.5的pH下孵育足以降低组合物中碱性同种型种类的水平的时间。在孵育之后，可以任选地使包含维多珠单抗的组合物经受进一步的纯化步骤，所述纯化步骤被设计为例如降低组合物中过程来源的杂质和/或产物来源的杂质的水平。
在另一方面，本文提供了包含维多珠单抗或其抗原结合部分的组合物，其中所述组合物可通过上述方法获得，例如通过限制抗体在纯化过程中暴露于低pH条件的持续时间。
在一些实施方案中，本文提供包含维多珠单抗或其抗原结合部分的组合物，其中所述组合物可通过尤其包括以下的方法获得：(i)提供从表达维多珠单抗或其抗原结合部分的重组宿主细胞的培养物中获得的澄清的细胞培养物收获物，(ii)并且从细胞培养收获物中纯化维多珠单抗或其抗原结合部分，其中抗体或其抗原结合部分暴露于3.5的pH或低于3.5的pH(例如，pH 2.5-3.5、低于3.0的pH或低于3.5的pH)不超过20分钟、不超过30分钟、不超过45分钟、不超过1小时、不超过3小时、不超过5小时、不超过7小时、不超过10小时或不超过12小时，其中抗α4β7抗体或其抗原结合部分与对照相比具有降低的碱性同种型种类水平(由CEX确定)，其中对照是包含通过相同方法产生的抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物，其中抗体暴露于3.5的pH或低于3.5的pH(例如，pH 2.5-3.5、低于3.0的pH或低于3.5的pH)持续更长的时间，即大于20分钟、大于30分钟、大于45分钟、大于1小时、大于3小时、大于5小时、大于7小时、大于10小时或大于12小时。
在一些实施方案中，本文提供包含维多珠单抗或其抗原结合部分的组合物，其中所述组合物可通过尤其包括以下的方法获得：(i)提供从表达维多珠单抗或其抗原结合部分的重组宿主细胞的培养物中获得的澄清的细胞培养物收获物，(ii)并且从细胞培养收获物中纯化维多珠单抗或其抗原结合部分，其中抗体或其抗原结合部分暴露于4.0的pH或低于4.0的pH(例如，pH 3.6至4.0)不超过20分钟、不超过30分钟、不超过45分钟、不超过1小时、不超过3小时、不超过5小时、不超过10小时、不超过12小时、不超过15小时、不超过18小时或不超过24小时，其中抗α4β7抗体或其抗原结合部分与对照相比具有降低的碱性同种型种类水平(由CEX确定)，其中对照是包含通过相同方法产生的抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物，其中抗体暴露于4.0的pH或低于4.0的pH(例如，pH 3.6至4.0)持续更长的时间，即大于20分钟、大于30分钟、大于45分钟、大于1小时、大于3小时、大于5小时、大于10小时、大于12小时、大于15小时、大于18小时或大于24小时。
在另一方面，本文提供包含维多珠单抗或其抗原结合部分的组合物，其中所述组合物可通过尤其包括以下的方法获得：(i)提供从表达维多珠单抗或其抗原结合部分的重组宿主细胞的培养物中获得的澄清的细胞培养物收获物，(ii)并且从细胞培养收获物中纯化维多珠单抗或其抗原结合部分，其中抗体或其抗原结合部分暴露于4.5的pH或低于4.5的pH(例如，pH 4.1至4.5)不超过3小时、不超过5小时、不超过10小时、或不超过12小时、不超过18小时、不超过24小时、不超过36小时、不超过48小时、不超过72小时或不超过96小时，其中抗α4β7抗体或其抗原结合部分与对照相比具有降低的碱性同种型种类水平(由CEX确定)，其中对照是包含通过相同方法产生的抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物，其中抗体暴露于4.5的pH或低于4.5的pH(例如，pH 4.1至4.5)持续更长的时间，即大于3小时、大于5小时、大于10小时、大于12小时、大于18小时、大于24小时、大于36小时、大于48小时、大于72小时或大于96小时。
在另一方面，本文提供包含维多珠单抗或其抗原结合部分的组合物，其中所述组合物可通过尤其包括以下的方法获得：(i)提供从表达维多珠单抗或其抗原结合部分的重组宿主细胞的培养物中获得的澄清的细胞培养物收获物，(ii)并且从细胞培养收获物中纯化维多珠单抗或其抗原结合部分，其中抗体或其抗原结合部分暴露于5.0的pH或低于5.0的pH(例如，pH 4.6至5.0)不超过3小时、不超过5小时、不超过10小时、或不超过12小时、不超过18小时、不超过24小时、不超过36小时、不超过48小时、不超过72小时或不超过96小时，其中抗α4β7抗体或其抗原结合部分与对照相比具有降低的碱性同种型种类水平(由CEX确定)，其中对照是包含通过相同方法产生的抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物，其中抗体暴露于5.0的pH或低于5.0的pH(例如，pH 4.6至5.0)持续更长的时间，即大于3小时、大于5小时、大于10小时、大于12小时、大于18小时、大于24小时、大于36小时、大于48小时、大于72小时或大于96小时。
在另一方面，本文提供包含维多珠单抗或其抗原结合部分的组合物，其中所述组合物可通过尤其包括以下的方法获得：(i)提供从表达维多珠单抗或其抗原结合部分的重组宿主细胞的培养物中获得的澄清的细胞培养物收获物，(ii)并且从细胞培养收获物中纯化维多珠单抗或其抗原结合部分，其中抗体或其抗原结合部分暴露于5.5的pH或低于5.5的pH(例如，pH 5.1至5.5)不超过3小时、不超过5小时、不超过10小时、或不超过12小时、不超过18小时、不超过24小时、不超过36小时、不超过48小时、不超过72小时或不超过96小时，其中抗α4β7抗体或其抗原结合部分与对照相比具有降低的碱性同种型种类水平(由CEX确定)，其中对照是包含通过相同方法产生的抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物，其中抗体暴露于5.5的pH或低于5.5的pH(例如，pH 5.1至5.5)持续更长的时间，即大于3小时、大于5小时、大于10小时、大于12小时、大于18小时、大于24小时、大于36小时、大于48小时、大于72小时或大于96小时。
在前述方面的一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在前述方面的一些实施方案中，纯化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的步骤包括蛋白A色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、混合模式色谱、疏水相互作用色谱及其组合中的一项或多项。
在前述方面的一些实施方案中，表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的宿主细胞是GS-CHO细胞。在其他实施方案中，宿主细胞是DHFR-CHO细胞。
在前述方面的一些实施方案中，组合物包含少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％、或少于9％碱性同种型种类。
在前述方面的一些实施方案中，组合物包含少于4％、少于3％、少于2％、或少于1％碱性同种型峰2。
在一些实施方案中，本文提供了一种维多珠单抗组合物，其中维多珠单抗的碱性种类占组合物中维多珠单抗同种型的15％或更少。例如，在一些实施方案中，本文提供了一种维多珠单抗组合物，其包含约14％或更少、13％或更少、12％或更少、11％或更少、10％或更少、9％或更少、8％或更少、7％或更少、6％或更少、5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、或1％或更少的水平的碱性同种型种类。
在一些实施方案中，维多珠单抗组合物中碱性同种型种类的水平为约1％至15％、1％至14％、1％至13％、1％至12％、1％至11％、1％至10％、1％至9％、1％至8％、1％至7％、1％至6％、1％至5％、1％至4％、1％至3％、或1％至2％。在其他实施方案中，维多珠单抗组合物中碱性同种型种类的水平为约2％至11％、3％至11％、4％至11％、5％至11％、6％至11％、7％至11％、8％至11％、9％至11％、或10％至11％。在其他实施方案中，维多珠单抗组合物中碱性同种型种类的水平为约1％至10％、2％至10％、3％至10％、4％至10％、5％至10％、6％至10％、7％至10％、8％至10％、或9％至10％。在其他实施方案中，维多珠单抗组合物中碱性同种型种类的水平为约1％至9％、2％至9％、3％至9％、4％至9％、5％至9％、6％至9％、7％至9％、或8％至9％。在其他实施方案中，维多珠单抗组合物中碱性同种型种类的水平为约1％至8％、2％至8％、3％至8％、4％至8％、5％至8％、6％至8％、或7％至8％。在其他实施方案中，维多珠单抗组合物中碱性同种型种类的水平为约1％至7％、2％至7％、3％至7％、4％至7％、5％至7％、或6％至7％。在其他实施方案中，维多珠单抗组合物中碱性同种型种类的水平为约1％至6％、2％至6％、3％至6％、4％至6％、或5％至6％。在其他实施方案中，维多珠单抗组合物中碱性同种型种类的水平为约1％至5％、2％至5％、3％至5％、或4％至5％。在示例性实施方案中，维多珠单抗组合物中碱性同种型种类的水平是约5％或更少。
在一些实施方案中，维多珠单抗组合物中碱性同种型种类的百分比相对于如本文所述的通过相同方法产生的没有在大于pH 6.5的pH下孵育的维多珠单抗组合物中碱性同种型种类的百分比降低约1％或更多，例如，1.5％或更多、2％或更多、2.5％或更多、3％或更多、3.5％或更多、4％或更多、4.5％或更多、5％或更多、6％或更多、7％或更多、8％或更多、9％或更多、10％或更多、11％或更多、12％或更多、13％或更多、14％或更多、15％或更多、20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、99％或更多、或100％或更多。
包含维多珠单抗的组合物中碱性同种型种类的百分比可以通过任何合适的方法确定，包括但不限于CEX-HPLC。在一些实施方案中，本文提供包含抗α4β7抗体或其抗原结合部分(例如，维多珠单抗)的低碱性种类组合物，其中所述组合物包含所述抗α4β7抗体或其抗原结合部分的总碱性同种型种类的少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、少于10％或少于9％，其中如通过CEX确定的，所述碱性同种型种类相对于所述抗α4β7抗体或其抗原结合部分的主要同种型具有净正电荷，其中所述抗α4β7抗体或其抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:1的重链可变区域和含有SEQ ID NO:5的轻链可变区。在一些实施方案中，组合物包含第一碱性同种型峰(BP1)和第二碱性同种型峰(BP2)。在一些这样的实施方案中，组合物包含少于2％BP2、少于1.5％BP2、少于1％BP2、或少于0.7％BP2。在一些实施方案中，组合物包含1.5％至2.5％BP2、1.2％至2.2％、1％至2％BP2、1％至1.8％BP2、1％至1.6％BP2、1％至1.5％BP2、0.8％至1.8％BP2、0.8％至1.6％BP2、0.8％至1.4％BP2、0.8％至1.2％BP2、0.8％至1％BP2、0.7％至1.7％BP2、0.7％至1.5％BP2、0.7％至1.3％BP2、0.7％至1％BP2、0.6％至1.6％BP2、0.6％至1.4％BP2、0.6％至1.2％BP2、0.6％至1％BP2、0.6％至0.8％BP2、0.5％至1.5％BP2、0.5％至1.3％BP2、0.5％至1％BP2、或0.5％至0.8％BP2。
在一些实施方案中，组合物中BP1与BP2的比率为至少3(例如，至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10)。在一些实施方案中，BP1与BP2的比率为2比12、2比10、2比8、2比6、2比4、3比12、3比11、3比9、3比6、3比5、3比4、4比12、4比11、4比10、4比8、4比6、4比5、5比12、5比11、5比10、5比9、5比8、5比6、6比12、6比11、6比10、6比8、6比7、7比12、7比11、7比10、7比9、7比8、8比12、8比11、8比10、8比9、9比12、9比11或9比10。
在一些实施方案中，低碱性种类组合物包含少于8％(例如，少于7％、少于6％、或少于5％)的抗α4β7抗体(例如，维多珠单抗)的总碱性同种型种类。在一些实施方案中，低碱性种类组合物包含4％至8％、4％至7.5％4％至7％、4％至6.5％、4％至6％、4％至5.5％、4％至5％、5％至8％、5％至7.5％5％至7％、5％至6.5％、5％至6％、6％至8％、6％至7.5％、或6％至7％的抗α4β7抗体(例如，维多珠单抗)的总碱性同种型种类。
在一些实施方案中，前述组合物可被掺入包含抗α4β7抗体或其抗原结合部分(例如，维多珠单抗)和药学上可接受的载剂或赋形剂的药物组合物中。因此，在一些实施方案中，本文提供包含低碱性种类抗α4β7抗体或其抗原结合部分(例如，维多珠单抗)和药学上可接受的载剂的药物组合物。抗体配制品可保持为液体或冻干成干燥的抗体配制品。在一方面，干燥、冻干的抗体配制品在包含150mg、180mg、240mg、300mg、360mg、450mg或600mg抗α4β7抗体的单剂量小瓶中提供，并且可以用液体(如无菌水)复原以进行施用。在另一方面，抗α4β7抗体(例如，维多珠单抗)处于在约2℃-8℃下储存在容器(例如，小瓶、注射器或药筒)中的稳定液体药物组合物中，直到将其施用给有需要的受试者。在一些实施方案中，注射器或药筒可提供54mg、108mg、160mg或216mg的单剂量的抗体。在一些实施方案中，抗α4β7抗体的复原冻干配制品或稳定液体药物组合物可包含一种或多种赋形剂，包括但不限于氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸、和/或组氨酸单盐酸盐)、糖(例如，蔗糖)、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80)、和/或缓冲剂(例如，柠檬酸盐、磷酸盐等)。在一个实施方案中，抗α4β7抗体的复原冻干配制品或稳定液体药物组合物包含L-精氨酸、L-组氨酸、L-组氨酸单盐酸盐、蔗糖、和/或聚山梨醇酯80。在另一个实施方案中，抗α4β7抗体的复原冻干配制品或稳定液体药物组合物包含柠檬酸盐、精氨酸、组氨酸、和/或聚山梨醇酯80。抗α4β7抗体的其他配制品和用途描述于例如美国专利第9,764,033号和美国专利第10,040,855号中。每个前述专利的全部内容通过引用并入本文。
V.含有降低的宿主细胞蛋白水平的维多珠单抗组合物的制备
在一些方面，本发明提供了产生具有减少量的宿主细胞蛋白的包含维多珠单抗的组合物的方法。该方法基于令人惊讶的发现，即使用相对于标准操作条件具有降低的电导率的AEX缓冲液(例如，装载缓冲液)产生了相对于标准操作条件下产生的维多珠单抗组合物具有降低的宿主细胞蛋白(HCP)水平的维多珠单抗组合物。
因此，在一方面，本发明提供了一种产生具有减少量的宿主细胞蛋白(HCP)的包含维多珠单抗的组合物的方法，其中该方法涉及在装载缓冲液的存在下使含有维多珠单抗和HCP的样品与阴离子交换树脂接触，其中装载缓冲液相对于标准缓冲液条件具有降低的电导率，并且从阴离子交换树脂收集流过材料，其中流过物包含维多珠单抗和减少量的HCP。在示例性实施方案中，AEX以流通模式进行，其中维多珠单抗不结合AEX树脂，并且在没有单独洗脱步骤的情况下被收集在流过材料中。
阴离子交换(AEX)(例如，通过阴离子交换Q膜吸附剂)的缓冲液电导率的标准操作范围为大约11-15mS/cm(平均值大约13.6mS/cm)。因此，在一些实施方案中，标准AEX缓冲液条件包括具有约11mS/cm或更大、约12mS/cm或更大、约13mS/cm或更大、约14mS/cm或更大、或约15mS/cm或更大的电导率的装载缓冲液。在一些实施方案中，标准缓冲液电导率为约11mS/cm至约12mS/cm、约11mS/cm至约13mS/cm、约11mS/cm至约14mS/cm、或约11mS/cm至约15mS/cm。在一些实施方案中，标准缓冲液电导率为约14mS/cm至约15mS/cm、约13mS/cm至约15mS/cm、约12mS/cm至约15mS/cm、或约11mS/cm至约15mS/cm。在一些实施方案中，标准缓冲液电导率为约11mS/cm、约12mS/cm、约13mS/cm、约14mS/cm、或约15mS/cm。
相对于标准AEX缓冲液条件，本文所述方法中使用的电导率降低的AEX缓冲液(例如，AEX装载缓冲液)具有降低的电导率。例如，在某些实施方案中，具有降低的电导率的装载缓冲液具有约15mS/cm或更小、约14mS/cm或更小、约13mS/cm或更小、约12mS/cm或更小、约11mS/cm或更小、约10mS/cm或更小、约9mS/cm或更小、约8mS/cm或更小、约7mS/cm或更小、约6mS/cm或更小、约5mS/cm或更小、约4mS/cm或更小、约3mS/cm或更小、或约2mS/cm或更小的电导率。在一些实施方案中，具有降低的电导率的装载缓冲液具有约11mS/cm或更小的电导率。
在某些实施方案中，具有降低的电导率的装载缓冲液具有约1mS/cm至约11mS/cm、约2mS/cm至约11mS/cm、约3mS/cm至约11mS/cm、约4mS/cm至约11mS/cm、约5mS/cm至约11mS/cm、约6mS/cm至约11mS/cm、约7mS/cm至约11mS/cm、约8mS/cm至约11mS/cm、约9mS/cm至约11mS/cm、或约10mS/cm至约11mS/cm(包括上述一项或多项内的范围)的电导率。在一些实施方案中，具有降低的电导率的装载缓冲液具有约11mS/cm至约12mS/cm、约11mS/cm至约13mS/cm、约11mS/cm至约14mS/cm、或约11mS/cm至约14.5mS/cm(包括上述一项或多项内的范围)的电导率。在某些实施方案中，具有降低的电导率的装载缓冲液具有约1mS/cm至约2mS/cm、约1mS/cm至约3mS/cm、约1mS/cm至约4mS/cm、约1mS/cm至约5mS/cm、约1mS/cm至约6mS/cm、约1mS/cm至约7mS/cm、约1mS/cm至约8mS/cm、约1mS/cm至约9mS/cm、约1mS/cm至约10mS/cm、或约1mS/cm至约11mS/cm(包括上述一项或多项内的范围)的电导率。
在某些实施方案中，具有降低的电导率的装载缓冲液具有约1mS/cm、约1.5mS/cm、约2mS/cm、约2.5mS/cm、约3mS/cm、约3.5mS/cm、约4mS/cm、约4.5mS/cm、约5mS/cm、约5.5mS/cm、约6mS/cm、约6.5mS/cm、约7mS/cm、约7.5mS/cm、约8mS/cm、约8.5mS/cm,9mS/cm、9.5mS/cm、10mS/cm、10.5mS/cm、11mS/cm、11.5mS/cm、12mS/cm、12.5mS/cm、13mS/cm、13.5mS/cm、14mS/cm、14.5mS/cm、或15mS/cm的电导率。
在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括在施加含有维多珠单抗的装载缓冲液之后将洗涤缓冲液施加至AEX树脂。在一些实施方案中，洗涤缓冲液具有与装载缓冲液相同的电导率。在其他实施方案中，洗涤缓冲液相对于装载缓冲液具有增加的电导率。在其他实施方案中，洗涤缓冲液相对于装载缓冲液具有降低的电导率。
在一些实施方案中，装载缓冲液包含氯化钠和/或磷酸钠。在示例性实施方案中，装载缓冲液含有40-70mM NaCl(例如，40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM或70mM NaCl)。在一些实施方案中，装载缓冲液包含55-65mM NaCl。另外或可选地，装载缓冲液可包含磷酸钠。在示例性实施方案中，装载缓冲液含有20-50mM磷酸钠(例如，20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM磷酸钠)。在一些实施方案中，装载缓冲液包含35-45mM磷酸钠。在一些实施方案中，装载缓冲液的pH为pH6.5或高于pH 6.5，例如，pH 6.5-8.5、pH 7.0-7.5、pH 6.8-7.4等。在一些实施方案中，装载缓冲液的pH为约6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、或8.5。
在一些实施方案中，本文提供纯化α4β7抗体(例如，维多珠单抗)的方法，所述方法包括使包含所述抗体的溶液与在低电导率缓冲液中平衡的AEX树脂以流通模式接触，并收集流过材料。在一个实施方案中，低电导率溶液包含NaCl和pH为6.5-8.5的缓冲液的混合物。在一些实施方案中，低电导率溶液具有5至15mS/cm、5至11mS/cm、7至10mS/cm或约10mS/cm的电导率。
在一些实施方案中，阴离子交换树脂被格式化为阴离子交换膜。在一些实施方案中，阴离子交换树脂被格式化为阴离子交换色谱柱。在一些实施方案中，阴离子交换树脂包含季胺官能团。示例性的AEX树脂包括但不限于Mustang Q(Pall Corporation,PortWashington,NY)、Sartobind Q(Sartorius GmbH,Goettingen,Germany)。其他示例性的AEX树脂包括例如Eshmuno Q树脂(EMD Millipore,Burlington,MA)和Nuvia Q树脂(Bio-Rad,Hercules,CA)。
HCP可以源自用于产生维多珠单抗或其抗原结合部分的宿主细胞。例如，在一些实施方案中，维多珠单抗在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生，并且HCP是CHO细胞蛋白。在某些实施方案中，HCP源于缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)表达的CHO细胞。在某些实施方案中，HCP源于缺乏谷氨酰胺合成酶(GS)表达的CHO细胞。
在某些实施方案中，流过物中HCP的量为约8ppm或更少、约7.5ppm或更少、约7ppm或更少、约6.5ppm或更少、约6ppm或更少、约5.5ppm或更少、约5ppm或更少、约4.5ppm或更少、约4ppm或更少、约3.5ppm或更少、约3ppm或更少、约2.5ppm或更少、约2ppm或更少、约1.5ppm或更少、或约1ppm或更少。
在一些实施方案中，流过物中HCP的量为1ppm至8ppm、2ppm至8ppm、3ppm至8ppm、4ppm至8ppm、5ppm至8ppm、6ppm至8ppm、或7ppm至8ppm，包括上述一项或多项内的范围。在一些实施方案中，流过物中HCP的量为1ppm至2ppm、1ppm至3ppm、1ppm至4ppm、1ppm至5ppm、1ppm至6ppm、1ppm至7ppm、或1ppm至8ppm，包括上述一项或多项内的范围。在一些实施方案中，流过物中HCP的量为1ppm至3ppm、3ppm至5ppm、或5ppm至7ppm。
在某些实施方案中，相对于当用具有标准电导率(例如，电导率为11-15mS/cm或高于11-15mS/cm)的装载缓冲液使用相同样品进行所述方法时产生的流过材料中的HCP的量，流过物中HCP的量减少至少约0.5％、至少约1％、至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约98％或大于约98％。
在某些实施方案中，流过物中HCP的量减少约0.5％至约50％、约1％至约50％、约2％至约50％、约5％至约50％、约10％至约50％、约15％至约50％、约20％至约50％、约25％至约50％、约30％至约50％、约35％至约50％、约40％至约50％、或约45％至约50％。在某些实施方案中，相对于当用具有标准电导率(例如，大约11-15mS/cm)的装载缓冲液使用相同样品进行所述方法时产生的流过物中的HCP的量，流过物中HCP的量减少约50％至约55％、约50％至约60％、约50％至约65％、约50％至约70％、约50％至约75％、约50％至约80％、约50％至约85％、约50％至约90％、约50％至约95％、或约50％至约98％。
在某些实施方案中，流过物中HCP的量减少约1％至约10％、约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、或约90％至约98％。在某些实施方案中，相对于当用具有标准电导率(例如，大约11-15mS/cm)的装载缓冲液使用相同样品进行所述方法时产生的流过物中的HCP的量，流过物中HCP的量减少约0.5％至约1％、约1％至约2％、约2％至约5％、约5％至约10％、约10％至约15％、约15％至约20％、约20％至约25％、约25％至约30％、约30％至约35％、约35％至约40％、约40％至约45％、约45％至约50％、约50％至约55％、约55％至约60％、约60％至约65％、约65％至约70％、约70％至约75％、约75％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％、或约95％至约98％。
含有维多珠单抗和HCP的样品源自哺乳动物细胞培养物，任选地在一个或多个另外的纯化步骤(包括例如亲和色谱、阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱、陶瓷羟基磷灰石(CHT)色谱和混合模式色谱或其组合)之后。另外，在本文所述的AEX方法之后，含有维多珠单抗的样品中的HCP水平可以任选地被一个或多个另外的纯化步骤(包括例如亲和色谱、阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱、陶瓷羟基磷灰石(CHT)色谱和混合模式色谱或其组合)进一步降低。
因此，在一些实施方案中，本文所述的方法可包括一个或多个另外的纯化步骤，以进一步降低含有维多珠单抗的样品中的HCP水平。在一个实施方案中，本发明提供使用本文所述的AEX方法降低包含维多珠单抗的组合物中HCP水平的方法，并且所述方法进一步包括一个或多个另外的纯化步骤。所述一个或多个另外的纯化步骤可以在本文所述的AEX方法之前或之后进行。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的纯化步骤包括一次或多次色谱分离。在示例性实施方案中，所述一个或多个另外的纯化步骤包括亲和色谱(例如，蛋白A色谱)、阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱、陶瓷羟基磷灰石(CHT)色谱或混合模式色谱或其组合。
在示例性实施方案中，本发明提供了降低包含维多珠单抗的组合物中的HCP水平的方法，所述方法包括提供包含维多珠单抗和HCP的组合物，通过进行亲和色谱、混合模式色谱、和/或阳离子交换色谱从HCP中纯化维多珠单抗，并通过执行本文所述的AEX方法从HCP中进一步纯化维多珠单抗。在一个实施方案中，用于本文描述的AEX方法的装载材料包括阳离子交换洗脱物。前述方法可用于使用电导率为11-15mS/cm或高于11-15mS/cm的阴离子交换缓冲液产生包含维多珠单抗的组合物，该组合物相对于由执行相同方法产生的组合物中存在的HCP水平具有降低的HCP水平。
在另一个示例性实施方案中，本发明提供了降低包含维多珠单抗的组合物中的HCP水平的方法，所述方法包括提供包含维多珠单抗和HCP的组合物，通过进行亲和色谱、阳离子交换色谱和/或羟基磷灰石色谱(例如，陶瓷羟基磷灰石(CHT)色谱)从HCP中纯化维多珠单抗，并通过执行本文所述的AEX方法从HCP中进一步纯化维多珠单抗。在一个实施方案中，用于本文描述的AEX方法的装载材料包括羟基磷灰石色谱洗脱物。前述方法可用于使用电导率为11-15mS/cm或高于11-15mS/cm的阴离子交换缓冲液产生包含维多珠单抗的组合物，该组合物相对于由执行相同方法产生的组合物中存在的HCP水平具有降低的HCP水平。
维多珠单抗含量和/或宿主细胞蛋白含量可以通过本领域已知的任何方法测量，包括但不限于HCP ELISA、色谱(例如，SEC)、分析超速离心、光散射(DLS或MALLS)、质谱(例如，MALDI-TOF MS)、或纳米尺度测量(如纳米粒子轨迹分析NTA，NanoSight Ltd,Wiltshire,UK)。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过包括超滤和/或渗滤的过程处理所述AEX流过材料，以将所述洗脱缓冲液交换为包含一种或多种药学上可接受的载剂或赋形剂的缓冲液。
VI.含有降低的宿主细胞蛋白的维多珠单抗组合物
在一些方面，本发明提供了包含减少的宿主细胞蛋白的维多珠单抗组合物。在一些实施方案中，具有减少的宿主细胞蛋白的组合物通过本文提供的方法产生(例如，参见部分V)。因此，在一方面，本文提供了包含维多珠单抗的组合物，其中所述组合物是通过以下方式产生的：在装载缓冲液的存在下使含有维多珠单抗和HCP的样品与阴离子交换树脂接触，其中装载缓冲液相对于标准缓冲液条件具有降低的电导率；并且从阴离子交换树脂收集流过材料，其中流过材料包含维多珠单抗和减少量的HCP。在从AEX树脂洗脱后，可任选地处理流过材料以将洗脱缓冲液交换为包含一种或多种药学上可接受的载剂或赋形剂的缓冲液，从而形成具有减少量的HCP的药物组合物。该缓冲液交换步骤可以使用标准方法进行，包括例如超滤和/或渗滤。
HCP可以源自用于产生维多珠单抗或其抗原结合部分的宿主细胞。例如，在一些实施方案中，维多珠单抗在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生，并且HCP是CHO细胞蛋白。在某些实施方案中，HCP源于缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)表达的CHO细胞。在某些实施方案中，HCP源于缺乏谷氨酰胺合成酶(GS)表达的CHO细胞。
在某些实施方案中，组合物中HCP的量为约8ppm或更少、约7.5ppm或更少、约7ppm或更少、约6.5ppm或更少、约6ppm或更少、约5.5ppm或更少、约5ppm或更少、约4.5ppm或更少、约4ppm或更少、约3.5ppm或更少、约3ppm或更少、约2.5ppm或更少、约2ppm或更少、约1.5ppm或更少、或约1ppm或更少。
在一些实施方案中，组合物中HCP的量为1ppm至8ppm、2ppm至8ppm、3ppm至8ppm、4ppm至8ppm、5ppm至8ppm、6ppm至8ppm、或7ppm至8ppm，包括上述一项或多项内的范围。在一些实施方案中，组合物中HCP的量为1ppm至2ppm、1ppm至3ppm、1ppm至4ppm、1ppm至5ppm、1ppm至6ppm、1ppm至7ppm、或1ppm至8ppm，包括上述一项或多项内的范围。在一些实施方案中，组合物中HCP的量为1ppm至3ppm、3ppm至5ppm、或5ppm至7ppm。
在某些实施方案中，相对于通过用具有标准电导率(例如，电导率为11-15mS/cm或高于11-15mS/cm)的装载缓冲液使用相同样品进行的方法产生的组合物中的HCP的量，组合物中HCP的量减少至少约0.5％、至少约1％、至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约98％或大于约98％。
在某些实施方案中，组合物中HCP的量减少约0.5％至约50％、约1％至约50％、约2％至约50％、约5％至约50％、约10％至约50％、约15％至约50％、约20％至约50％、约25％至约50％、约30％至约50％、约35％至约50％、约40％至约50％、或约45％至约50％。在某些实施方案中，相对于通过用具有标准电导率(例如，电导率为11-15mS/cm或高于11-15mS/cm)的装载缓冲液使用相同样品进行的方法产生的组合物中的HCP的量，流过材料中HCP的量减少约50％至约55％、约50％至约60％、约50％至约65％、约50％至约70％、约50％至约75％、约50％至约80％、约50％至约85％、约50％至约90％、约50％至约95％、或约50％至约98％。
在某些实施方案中，组合物中HCP的量减少约1％至约10％、约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、或约90％至约98％。在某些实施方案中，相对于通过用具有标准电导率(例如，11-15mS/cm或高于11-15mS/cm的电导率)的装载缓冲液使用相同样品进行所述方法时产生的组合物中的HCP的量，流过材料中HCP的量减少约0.5％至约1％、约1％至约2％、约2％至约5％、约5％至约10％、约10％至约15％、约15％至约20％、约20％至约25％、约25％至约30％、约30％至约35％、约35％至约40％、约40％至约45％、约45％至约50％、约50％至约55％、约55％至约60％、约60％至约65％、约65％至约70％、约70％至约75％、约75％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％、或约95％至约98％。
维多珠单抗含量和/或宿主细胞蛋白含量可以通过本领域已知的任何方法测量，包括但不限于HCP ELISA、色谱(例如，SEC)、分析超速离心、光散射(DLS或MALLS)、质谱(例如，MALDI-TOF MS)、或纳米尺度测量(如纳米粒子轨迹分析NTA，NanoSight Ltd,Wiltshire,UK)。
VII.使用混合模式色谱制备维多珠单抗
本文描述了在从混合模式色谱树脂洗脱后最大化维多珠单抗产率的缓冲液。在高浓度装载条件下(例如，装载浓度为至少14g/L、15g/L、17g/L、10g/L、25g/L、30g/L、35g/L或更多)，在使用例如陶瓷羟基磷灰石树脂的混合模式纯化的洗涤过程中会发生蛋白质流失。为了增加混合模式树脂(例如，陶瓷羟基磷灰石树脂)的装载能力，并改进维多珠单抗的产量，可以优化平衡缓冲液、装载缓冲液和洗涤缓冲液，以减少洗涤柱时的抗体损失。令人惊讶的是，本文所述的方法允许在混合模式树脂上施加更大的装载浓度，并且相对于标准混合模式缓冲液将产率增加2％-3％，而不会改变最终洗脱物中的产物质量(例如，聚集物百分比)。
因此，在一方面，本发明提供了增加从混合模式色谱树脂洗脱后回收的维多珠单抗的产率的方法，所述方法包括用平衡缓冲液平衡所述混合模式色谱树脂，将包含维多珠单抗和装载缓冲液的溶液装载到所述混合模式色谱树脂上，使得维多珠单抗结合所述混合模式色谱树脂，用洗涤缓冲液洗涤所述混合模式色谱树脂，并用洗脱缓冲液从所述混合模式色谱树脂洗脱维多珠单抗，其中所述平衡缓冲液、装载缓冲液和/或洗涤缓冲液具有7.0或低于7.0的pH。用于混合模式色谱的标准缓冲液的pH可以更高，即pH为7.2或更高。在本发明的一些实施方案中，使用pH为7.0或低于7.0的平衡缓冲液。在一些实施方案中，使用具有pH为7.0或低于7.0的装载缓冲液。在一些实施方案中，使用具有pH为7.0或低于7.0的洗涤缓冲液。
可使用低于7.0的缓冲液pH范围来防止在混合模式纯化的洗涤步骤过程中的维多珠单抗的损失。例如，在一些实施方案中，平衡缓冲液、装载缓冲液、和/或洗涤缓冲液可具有小于7.0、小于6.9、小于6.8、小于6.7、小于6.6、小于6.5、小于6.4、小于6.3、小于6.2、小于6.1、小于6.0、小于5.9、小于5.8、小于5.7、小于5.6、或小于5.5的pH。例如，缓冲液可具有约7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6或5.5的pH。在一些实施方案中，缓冲液的pH在约7.0-5.5的范围内。在其他实施方案中，缓冲液的pH在约7.0-6.0范围内。在其他实施方案中，缓冲液的pH在约7.0-6.5的范围内。在其他实施方案中，缓冲液的pH在约6.8-5.8范围内。在其他实施方案中，缓冲液的pH在约6.8-6.0范围内。在其他实施方案中，缓冲液的pH在约6.8-6.5的范围内。在其他实施方案中，缓冲液的pH为约6.6-6.8。
另外或可选地，用于平衡、装载、和/或洗涤用以纯化维多珠单抗的混合模式色谱树脂的缓冲液可以具有小于70mM的总盐浓度。例如，缓冲液可以具有小于70mM、小于65mM、小于60mM、小于55mM、小于50mM、小于45mM、小于40mM、小于35mM、或小于30mM的盐浓度。在一些实施方案中，缓冲液具有约70mM、约65mM、约60mM、约55mM、约50mM、约45mM、约40mM、约35mM、或约30mM的盐浓度。在其他实施方案中，缓冲液具有30-70mM范围内的盐浓度。在一些实施方案中，缓冲液具有40-65mM范围内的盐浓度。在一些实施方案中，缓冲液具有45-65mM范围内的盐浓度。在一些实施方案中，缓冲液具有50-60mM范围内的盐浓度。在一些实施方案中，缓冲液具有40-50mM范围内的盐浓度。在一些实施方案中，缓冲液具有45-55mM范围内的盐浓度。在一些实施方案中，用于平衡、装载、和/或洗涤用以纯化维多珠单抗的CHT色谱树脂的缓冲液中存在的盐包括氯化钠和/或磷酸钠。
在一些实施方案中，用于平衡、装载、和/或洗涤用以纯化维多珠单抗的混合模式色谱树脂的缓冲液可以具有小于70mM的氯化钠浓度。例如，缓冲液可以具有小于70mM、小于65mM、小于60mM、小于55mM、小于50mM、小于45mM、小于40mM、小于35mM、或小于30mM的氯化钠浓度。在一些实施方案中，缓冲液具有约70mM、约65mM、约60mM、约55mM、约50mM、约45mM、约40mM、约35mM、或约30mM的氯化钠浓度。在其他实施方案中，缓冲液具有30-70mM范围内的氯化钠浓度。在一些实施方案中，缓冲液具有40-65mM范围内的氯化钠浓度。在一些实施方案中，缓冲液具有45-65mM范围内的氯化钠浓度。在一些实施方案中，缓冲液具有50-60mM范围内的氯化钠浓度。在一些实施方案中，缓冲液具有40-50mM范围内的氯化钠浓度。在一些实施方案中，缓冲液具有45-55mM范围内的氯化钠浓度。在一些实施方案中，前述氯化钠缓冲液可进一步包含磷酸钠。在一些实施方案中，前述氯化钠缓冲液可以进一步包含1-30mM磷酸钠，例如，5-20mM磷酸钠、10-20mM磷酸钠等。在示例性实施方案中，氯化钠缓冲液可以进一步包含浓度为1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、15mM、20mM、25mM、或30mM的磷酸钠。
上述缓冲液可用于平衡、装载和/或洗涤维多珠单抗纯化过程中的混合模式色谱树脂。在示例性实施方案中，混合模式树脂可以是陶瓷羟基磷灰石树脂。
在一些实施方案中，平衡缓冲液、装载缓冲液和洗涤缓冲液中的两种具有相同的pH。在一些实施方案中，平衡缓冲液、装载缓冲液和洗涤缓冲液中的两种具有相同的盐浓度。在一些实施方案中，平衡缓冲液、装载缓冲液和洗涤缓冲液中的两种具有相同的pH和相同的盐浓度。在一些实施方案中，平衡缓冲液、装载缓冲液和洗涤缓冲液都具有相同的pH。在一些实施方案中，平衡缓冲液、装载缓冲液和洗涤缓冲液都具有相同的盐浓度。在一些实施方案中，平衡缓冲液、装载缓冲液和洗涤缓冲液都具有相同的pH和相同的盐浓度。
在一些实施方案中，增加在装载混合模式色谱树脂后回收的维多珠单抗的产率的方法包括在小于7的pH即pH 5.5至6.9或pH 6.5至6.8和40至60mM或45至55mM的盐(例如NaCl)浓度下洗脱柱。所述方法可进一步包括在小于7的pH即pH 5.5至6.9或pH 6.5至6.8下洗涤柱。
相对于当使用具有大于7.0的pH和/或大于70mM的盐浓度和/或大于70mM的氯化钠浓度的缓冲液进行平衡、装载、和/或洗涤步骤时得到的产率，本文所述的缓冲液和方法可提高从混合模式色谱柱洗脱的维多珠单抗的产率。在一些实施方案中，产率提高了至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、18％、20％或更多。在一些实施方案中，相对于pH大于7.0的缓冲液，产率提高了超过2％。在一些实施方案中，相对于pH大于7.0的缓冲液，产率提高了超过3％。在一些实施方案中，相对于pH大于7.0的缓冲液，产率提高了超过4％。在一些实施方案中，相对于pH大于7.0的缓冲液，产率提高了超过5％。
VIII.评估含有抗α4β7抗体的组合物的纯度的方法
包含抗体(例如，维多珠单抗)的组合物的纯度可以通过任何合适的方法评估，包括但不限于本文所述的方法。
(a)评估碱性同种型种类
本发明提供了调节(例如，降低)包含维多珠单抗或其抗原结合部分的组合物中碱性同种型种类的水平的方法，以及调节(例如，增加)包含维多珠单抗的组合物中主要同种型的水平的方法。维多珠单抗组合物中存在的碱性维多珠单抗同种型种类的相对量和主要维多珠单抗同种型的相对量可以使用阳离子交换色谱(CEX)测量，如实施例部分中详细描述的。CEX方法根据整体表面电荷对抗体种类进行分级分离。使用流动相稀释至低离子强度后，可将测试样品注到CEX色谱柱上，诸如像Dionex Pro-PacTM WCX-10柱(Thermo FisherScientific,Waltham,MA(USA))，其在合适的缓冲液(例如，10mM磷酸钠，pH 6.6)中平衡。可以使用在相同缓冲液中的氯化钠梯度洗脱抗体。可以在280nm处监测蛋白质洗脱，并将峰指定为酸性、碱性或主要同种型类别。酸性峰以比主要同种型峰短的保留时间从柱洗脱，并且碱性峰以比主要同种型峰长的保留时间从柱洗脱。报告了主要同种型百分比、酸性种类百分比总和以及碱性种类百分比总和。将样品的主要同种型保留时间与参考标准品的保留时间进行比较以确定一致性。在某些实施方案中，使用CEX-HPLC方法。例如，包含维多珠单抗及其酸性和/或碱性种类的组合物可以使用如上所述的阳离子交换色谱进行拆分，随后使用HPLC分析洗脱的峰。在一个实施方案中，可以使用Agilent 1200HPLC系统(Agilent,Santa Clara,CA)进行HPLC。量化基于检测到的峰的相对面积百分比。图1中提供了示例性维多珠单抗制剂的CEX-HPLC曲线。
在一个实施方案中，CEX测定方法包括将测试样品稀释至低离子强度，注到在10mM磷酸钠(pH 6.6)中平衡的CEX柱上，用该缓冲液中的NaCl梯度洗脱柱，监测在280nm处的峰并将峰指定为酸性峰、主峰或碱性峰，其中酸性峰以最短保留时间首先洗脱，主峰第二洗脱，并且碱性峰以最长保留时间洗脱，并对峰面积进行量化，并且其量计算为所有峰面积的百分比。
(b)评估宿主细胞蛋白水平
本发明提供了调节(例如，降低)包含维多珠单抗或其抗原结合部分的组合物中残留宿主细胞蛋白的水平的方法。在一些实施方案中，可以使用酶联免疫吸附测定(ELISA)，使用标准技术测量维多珠单抗组合物中存在的宿主细胞蛋白的量。许多为此目的而设计的许多ELISA试剂盒是可商购的，如来自Cygnus Technologies(Southport,NC(USA))的CHOHCP ELISA试剂盒3G。可以使用固定的多克隆抗CHO HCP抗体捕获测试样品中的宿主细胞蛋白。然后可以使用合适的检测剂检测捕获的蛋白质，例如，相同抗体的辣根过氧化物酶标记形式。在该示例性实施方案中，可使用过氧化物酶底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)在450nm处比色测量捕获的过氧化物酶的量，其与CHO HCP的浓度成正比。HCP浓度可以通过与CHO HCP标准曲线(如包含在测试试剂盒中)进行比较来确定，并报告为抗体制剂中蛋白质总水平的百分比。在另一个实施方案中，可以使用本文举例说明的兔-兔(“RaRa”)方法来确定HCP。多克隆抗CHO HCP抗体是通过用与维多珠单抗相似的制造条件用裸细胞(nullcell)制造的收获材料免疫兔来产生的，并且该抗体被亲和纯化。维多珠单抗样品中的宿主CHO细胞蛋白使用固定的多克隆抗CHO HCP抗体进行捕获，然后使用相同抗体的生物素标记形式，随后使用辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素进行检测。使用过氧化物酶底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)在450nm处比色测量捕获的过氧化物酶的量，其与CHO HCP的浓度成正比。HCP浓度是通过与测试试剂盒中包含的CHO HCP标准曲线进行比较来确定，并报告为总蛋白质的百分比。在另一个实施方案中，可以使用本文举例说明的兔-山羊(“RaGo”)方法来确定HCP。多克隆抗CHO HCP抗体是通过使用与维多珠单抗类似的制造过程，用裸细胞制造的收获材料对兔和山羊进行免疫来产生的。抗体集合被独立地亲和纯化。MLN0002测试样品中的宿主细胞蛋白使用固定的多克隆兔抗CHO HCP抗体进行捕获，然后通过依次添加山羊抗CHO亲和纯化抗体和驴抗山羊IgG试剂(用辣根过氧化物酶标记)进行检测。使用过氧化物酶底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)在450nm处比色测量捕获的过氧化物酶的量，其与CHO HCP的浓度成正比。HCP浓度是通过与测试试剂盒中包含的CHO HCP标准曲线进行比较来确定，并报告为相对于总维多珠单抗的(ng/mg)浓度。
适合与本文提供的各个实施方案结合使用的CHO HCP测定包括使用多克隆抗CHOHCP抗体捕获HCP，在结合辣根过氧化物酶标记形式的多克隆抗CHO HCP抗体后对HCP进行检测，该多克隆抗CHO HCP抗体将过氧化物酶底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)转化为在450nm处比色量化的底物。在一个实施方案中，适合与本文提供的各个实施方案结合使用的HCP ELISA是使用固定的多克隆抗CHO HCP抗体捕获HCP的ELISA方法，优选为随来自CygnusTechnologies(Southport,NC(USA))提供的CHO HCP ELISA试剂盒3G，借此通过辣根过氧化物酶标记形式的相同抗体检测捕获的蛋白质，并使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)在450nm处比色测量捕获的过氧化物酶的量，随后通过与CHO HCP标准曲线比较来确定HCP浓度。
(c)评估尺寸变体
在某些实施方案中，分析使用本文所述技术产生的色谱样品中的聚集体、单体和片段的水平。在本文所阐述的各个实施方案中，尺寸排阻色谱(SEC)可用于确定抗体或其抗原结合部分(例如，维多珠单抗)的群体中存在的单体、高分子量(HMW)聚集体和低分子量(LMW)降解产物的相对水平。SEC方法提供基于尺寸将抗体单体与HMW种类和LMW降解产物分离。可以使用可商购的SEC柱，使用适当的缓冲液分析测试样品和参考标准品。例如，在一些实施方案中，可以使用G3000 SWxl柱(Tosoh Bioscience,King of Prussia,PA(USA))或串联连接的两个G3000 SWxl柱以及等度磷酸盐-氯化钠缓冲系统(pH 6.8)进行SEC分析。在280nm处监测蛋白质种类的洗脱。评估主峰(单体)和总峰面积以确定纯度。报告了样品纯度(％)(计算为单体％)、HMW聚集体％、和/或LMW降解产物％。
在一个实施方案中，SEC分析包括将样品注到串联连接的两个G3000SWxl柱上，并在等度磷酸盐-氯化钠缓冲系统(pH 6.8)中运行，其中在280nm处监测蛋白质种类的洗脱，并且测量主峰(单体)和总峰面积。
IX.药物组合物及其用途
本文提供的包含维多珠单抗的组合物例如，具有降低的碱性同种型种类水平的包含维多珠单抗的组合物和/或具有降低的宿主细胞蛋白水平的包含维多珠单抗的组合物可以被掺入药物配制品中以用于治疗用途。包含维多珠单抗的药物配制品可以通过任何合适的方法制备。
在一方面，包含本文所述组合物的药物配制品是冻干的药物配制品。在一方面，冻干配制品可以作为单一剂量储存在一个容器(例如，小瓶)中。将容器(例如，小瓶)冷藏储存，例如在约2℃-8℃或在室温下，例如约20℃至35℃、约25℃或约30℃，直到将其施用给有需要的受试者。小瓶可以是例如10、20或50cc小瓶。容器(例如，小瓶)可以含有约90至115mg、约95至105mg、至少约100mg、约135至160mg、约145至155mg、至少约150mg、约180至220mg、约190至210mg、约195至205mg、至少约200mg、约280mg至320mg、约290mg至310mg、至少约300mg、约380至420mg、约390至410mg、至少约400mg、约580至620mg、约590至610mg、或至少约600mg的抗α4β7抗体。在一方面，小瓶含有约200mg的抗α4β7抗体。小瓶可含有足够的抗α4β7抗体(例如，维多珠单抗)，以允许递送(例如，进行制造以递送)约100mg、约108mg、约150mg、约200mg、约300mg、约400mg、或约600mg的抗α4β7抗体。例如，小瓶可含有比所述剂量量多约15％、约12％、约10％或约8％的抗α4β7抗体。
在一些实施方案中，本文所述的组合物被配制成可用液体(如无菌水)复原以进行施用的干燥、冻干的药物配制品。复原配制品的施用可以通过上述途径之一通过肠胃外注射进行。静脉内注射可以通过输注进行，如通过用无菌等渗盐水、缓冲液(例如，磷酸盐缓冲盐水)或林格氏(乳酸或葡萄糖)溶液进一步稀释。
在一些实施方案中，本文所述的组合物被配制成适于向人皮下施用的液体药物配制品。在一些实施方案中，抗α4β7抗体通过皮下注射，例如，在疗法开始后或在第三次后续剂量后约每两周、三周或四周以约54mg、108mg或约165mg或约216mg的剂量施用。
在另一方面，本文所述的包含抗α4β7抗体(例如，维多珠单抗)的组合物处于在约2℃-8℃下储存在容器(例如，小瓶、注射器或药筒)中的稳定液体药物组合物中，直将其施用给有需要的受试者。在一些实施方案中，抗α4β7抗体的稳定液体药物组合物包含约0％至5.0％、0％至2％、≤2％、≤1％、≤0.6％或≤0.5％聚集体。注射器或药筒可以是1mL或2mL容器(例如对于160mg/mL剂量)或超过2ml(例如，对于更高的剂量(至少320mg或400mg或更高))。注射器或药筒可含有至少约20mg、至少约50mg、至少约70mg、至少约80mg、至少约100mg、至少约108mg、至少约120mg、至少约155mg、至少约180mg、至少约200mg、至少约240mg、至少约300mg、至少约360mg、至少约400mg、或至少约500mg的抗α4β7抗体。在一些实施方案中，容器(例如，注射器或药筒)可制造成递送约20至120mg、约40mg至70mg、约45至65mg、约50至57mg或约54mg的抗α4β7抗体(例如，维多珠单抗)。在其他实施方案中，注射器或药筒可制造成递送约90至120mg、约95至115mg、约100至112mg或约108mg的抗α4β7抗体(例如，维多珠单抗)。在其他实施方案中，注射器或药筒可制造成递送约140至250mg、约150至200mg、约160至170mg、约160至250mg、约175mg至210mg或者约160mg、约165mg、约180mg或约200mg的抗α4β7抗体(例如，维多珠单抗)。
可用于储存和冷冻本文所述的纯化组合物的容器包括聚碳酸酯瓶(用于IV配制品)或PETG瓶(用于皮下配制品)。在将配制品等分到瓶中后，可进行冷冻(例如，在-60摄氏度或更低)。
药物组合物可包含本文提供的任何维多珠单抗组合物，例如具有降低的碱性同种型种类水平的包含维多珠单抗的组合物，和/或具有降低的宿主细胞蛋白水平的包含维多珠单抗和药学上可接受的载剂或赋形剂的组合物。在一些实施方案中，药物组合物的pH在6.0-7.0之间，例如pH 6.0-6.2、pH 6.0-6.4、pH 6.0-6.6、pH 6.0-6.8、pH 6.1-6.3、pH6.1-6.5、pH 6.1-6.7、pH 6.1-6.9、pH 6.2-6.4、pH 6.2-6.6、pH 6.2-6.8、pH 6.2-7.0、pH6.3-6.5、pH 6.3-6.7、pH 6.3-6.9、pH 6.4-6.6、pH 6.4-6.8、pH 6.4-7.0、pH 6.5-6.7、pH6.5-6.9、pH p 6.6-pH 6.8、pH 6.6-7.0、pH 6.7-6.9、或pH 6.8-7.0。在一些实施方案中，药物组合物的pH为约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9或约7.0。
药物组合物可以另外补充有氨基酸或糖。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含氨基酸，如精氨酸或组氨酸。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含糖，如蔗糖或海藻糖。在一些实施方案中，本文提供的抗α4β7抗体的药物组合物包含精氨酸、组氨酸、和/或聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，本文提供的抗α4β7抗体的药物组合物包含柠檬酸盐、精氨酸、组氨酸和/或聚山梨醇酯80。
本文提供的包含维多珠单抗的组合物(例如，具有降低的碱性同种型种类水平的包含维多珠单抗的组合物)和/或具有降低的宿主细胞蛋白水平的包含维多珠单抗的组合物可用于体外或体内抑制整联蛋白α4β7活性的方法中。
在一方面，本文所述的组合物可用于治疗受试者的疾病或病症，包括向受试者施用有效治疗人的疾病或病症的量的包含抗α4β7抗体的组合物。人受试者可以是成年人(例如，18岁或以上)、青少年或儿童。人受试者可以是65岁或以上的人。
在一个实施方案中，本文所述的组合物用于治疗可能曾对用免疫调节剂、TNF-α拮抗剂或其组合的治疗缺乏足够反应、反应丧失或不耐受的受试者。受试者可能之前接受过用至少一种皮质类固醇(例如，泼尼松)的治疗，并且对皮质类固醇治疗(例如，炎症性肠病)的反应不充分、不耐受或表现出依赖皮质类固醇。对皮质类固醇的反应不充分是指尽管有包括相当于每天口服泼尼松30mg持续2周或静脉内注射持续1周的剂量的至少一种4周诱导方案的病史，仍有持续活动性疾病的体征和症状。对皮质类固醇的反应丧失是指两次尝试将皮质类固醇逐渐减少至相当于每日口服泼尼松10mg的剂量以下均失败。不耐受皮质类固醇包括库欣综合征、骨质减少/骨质疏松症、高血糖症、失眠和/或感染的病史。
免疫调节剂可以是例如口服硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤或甲氨蝶呤。对免疫调节剂的反应不充分是指尽管有至少一种8周方案或口服硫唑嘌呤(大于或等于1.5mg/kg)、6-巯基嘌呤(大于或等于0.75mg/kg)、或甲氨蝶呤(大于或等于12.5mg/周)的病史，仍有持续活动性疾病的体征和症状。不耐受免疫调节剂包括但不限于恶心/呕吐、腹痛、胰腺炎、LFT异常、淋巴细胞减少症、TPMT基因突变和/或感染。
TNFα拮抗剂是例如抑制TNFα的生物活性并优选结合TNFα的剂，如单克隆抗体，例如REMICADE(英夫利昔单抗)、HUMIRA(阿达木单抗)、CIMZIA(塞妥珠单抗)、SIMPONI(高利单抗)；或循环受体融合蛋白，如ENBREL(依那西普)。对TNF-α拮抗剂的反应不充分是指尽管有英夫利昔单抗5mg/kg IV，至少间隔2周2个剂量；阿达木单抗一次80mg皮下剂量，随后至少间隔两周一次40mg；或400mg皮下塞妥珠单抗，至少间隔2周2个剂量中的至少一种4周诱导方案的病史，仍有持续活动性疾病的体征和症状。对TNF-α拮抗剂的反应丧失是指在先前临床益处后维持给药期间症状的复发。不耐受TNFα拮抗剂包括但不限于输注相关反应、脱髓鞘、充血性心力衰竭、和/或感染。
如本文针对溃疡性结肠炎受试者所使用的，维持缓解的丧失是指Mayo评分增加至少3分和改良Baron评分增加至少2。
在一个实施方案中，可相应治疗的疾病包括但不限于炎症性肠病(IBD)，如溃疡性结肠炎、克罗恩病、回肠炎、乳糜泻、非热带性口炎性腹泻、与血清阴性关节病相关的肠病、显微镜结肠炎或产胶原性结肠炎、嗜酸性胃肠炎、或直肠结肠切除术和回肠肛管吻合术后产生的结肠袋炎。在一些实施方案中，炎症性肠病是克罗恩病或溃疡性结肠炎。可以治疗的其他疾病包括例如原发性硬化性胆管炎(PSC)和移植物抗宿主病(GVHD)。
溃疡性结肠炎可能是中度至重度活动性溃疡性结肠炎(例如，Mayo评分为6至12，内窥镜分项评分为2或3)。在患有中度至重度活动性溃疡性结肠炎的患者中，治疗可导致临床反应的诱导和维持、临床缓解的诱导和维持、或粘膜愈合。治疗也可导致患者减少、消除或者减少和消除对皮质类固醇的使用(例如，无皮质类固醇的情况下的缓解)。
克罗恩病可以是中度至重度活动性克罗恩病(例如，克罗恩病活动指数(CDAI)评分为220至450)。治疗可在患有中度至重度活动性克罗恩病的患者中实现临床反应或实现临床缓解。治疗也可导致患者减少、消除或者减少和消除对皮质类固醇的使用(例如，无皮质类固醇的情况下的缓解)。
胰腺炎和胰岛素依赖型糖尿病是可以使用本发明的组合物治疗的其他疾病。据报道，MAdCAM(例如，MAdCAM-1)由来自NOD(非肥胖糖尿病)小鼠以及来自BALB/c和SJL小鼠的外分泌胰腺中的一些血管表达。据报道，在NOD小鼠的胰腺的发炎胰岛中的内皮上诱导了MAdCAM(例如，MAdCAM-1)的表达，并且MAdCAM(例如，MAdCAM-1)是在胰岛炎早期由NOD胰岛内皮表达的主要地址素(Hanninen,A.等人,J.Clin.Invest.,92:2509-2515(1993))。用抗MAdCAM或抗β7抗体治疗NOD小鼠可预防糖尿病的发展(Yang等人,Diabetes,46:1542-1547(1997))。此外，观察到表达α4β7的淋巴细胞在胰岛内积聚，并且MAdCAM-1与淋巴瘤细胞通过α4β7与来自发炎胰岛的血管(Hanninen,A.等人,J.Clin.Invest.,92:2509-2515(1993))或套细胞淋巴瘤中胃肠道(Geissmann等人,Am.J.Pathol.,153:1701-1705(1998))的结合有关。
可以使用本发明的组合物治疗的与粘膜组织相关的炎症性疾病的实例包括胆囊炎；胆管炎(Adams和Eksteen Nature Reviews 6:244-251(2006)Grant等人,Hepatology33:1065-1072(2001))，例如原发性硬化性胆管炎；白塞病，例如，肠道或胆管周围炎(胆道和肝脏周围组织)的白塞病；以及移植物抗宿主病(例如，胃肠道中的移植物抗宿主病(例如，在骨髓移植后)(Petrovic等人Blood 103:1542-1547(2004))。如在克罗恩病中所见，炎症常常延伸到粘膜表面之外，因此慢性炎症疾病(如结节病、慢性胃炎，例如自身免疫性胃炎(Katakai等人,Int.Immunol.,14:167-175(2002)))和其他特发性病症可以接受治疗。
本发明还涉及抑制粘膜组织的白细胞浸润的方法。本发明还涉及用于治疗癌症(例如，α4β7阳性肿瘤，如淋巴瘤)的方法。可以使用本发明的配制品治疗的与粘膜组织相关的炎症性疾病的其他实例包括乳腺炎(乳腺)和肠易激综合征。
病因利用MAdCAM(例如，MAdCAM-1)与α4β7的相互作用的疾病或病原体可用本文所述的配制品中的抗α4β7抗体治疗。此类疾病的实例包括免疫缺陷病症，如由人免疫缺陷病毒引起的(参见，例如，WO2008140602)。
本发明的组合物以抑制α4β7整联蛋白与其配体结合的有效量的抗α4β7抗体施用。对于疗法，有效量将足以实现所需的治疗(包括预防)作用(如足以减少或防止α4β7整联蛋白介导的结合和/或信号传导，从而抑制白细胞粘附和浸润和/或相关的细胞反应的量)。有效量的抗α4β7抗体，例如足以维持α4β7整联蛋白的饱和(例如，中和)的有效滴度，可以诱导炎症性肠病的临床反应或缓解。有效量的抗α4β7抗体可导致溃疡性结肠炎或克罗恩病的粘膜愈合。本发明的配制品可以以单位剂量或多剂量施用。剂量可以通过本领域已知的方法确定并且可以取决于例如个体的年龄、敏感性、耐受性和整体健康状况。施用方式的实例包括局部途径，如鼻或吸入或透皮施用；肠内途径，如通过饲管或栓剂；以及肠胃外途径，如静脉内、肌肉内、皮下、动脉内、腹膜内或玻璃体内施用。在一个实施方案中，总剂量为165mg。在另一个实施方案中，总剂量为108mg。在另一个实施方案中，总剂量为216mg。在另一个实施方案中，总剂量为300mg。
在一些方面，用于治疗本文所述疾病(例如，UC或克罗恩病)的给药方案具有两个阶段，诱导阶段和维持阶段。在诱导阶段，抗体或其抗原结合片段以快速提供适合某些目的的有效量的抗体或其抗原结合片段的方式施用，如诱导对抗体或其抗原结合片段的免疫耐受或诱导临床反应和改善炎症性肠病症状。当患者首次进行抗α4β7抗体治疗时，当在很久没有接受疗法之后(例如，自抗α4β7抗体疗法后超过三个月、超过四个月、超过六个月、超过九个月、超过一年、超过十八个月或超过两年)进行治疗时，或在炎症性肠病症状重新出现(例如，疾病缓解后复发)的情况下在抗α4β7抗体治疗的维持阶段期间，可以向患者施用诱导阶段治疗。在一些实施方案中，诱导期方案导致比维持方案期间维持的平均稳态谷血清浓度更高的平均谷血清浓度(例如，恰好在下一次给药之前的浓度)。
在维持阶段，抗体或其抗原结合片段以持续通过用稳定水平的抗体或其抗原结合片段的诱导疗法实现的反应的方式施用。维持方案可以预防炎症性肠病的症状重新出现或复发。维持方案可为患者提供便利(例如，简单的给药方案)或需要不频繁的疗程。在一些实施方案中，维持方案可以包括通过选自由以下组成的组的策略施用抗α4β7抗体或其抗原结合片段(例如，在本文所述的配制品中)：低剂量、不频繁施用、自我施用和前述任何项的组合。
在一个实施方案中，例如，在疗法的诱导阶段，给药方案提供有效量的在本文所述的配制品中的抗α4β7抗体或抗原结合片段，用于诱导人患者中炎症性肠病的缓解。诱导期的持续时间可以是治疗的约四周、约五周、约六周、约七周或约八周。在一些实施方案中，诱导方案可以利用选自由以下组成的组的策略：高剂量抗α4β7抗体或其抗原结合片段、频繁施用抗α4β7抗体或其抗原结合片段、以及高剂量抗α4β7抗体或其抗原结合片段和频繁施用抗α4β7抗体或其抗原结合片段的组合(例如，在本文所述的配制品中)。诱导给药可以是一次或多次超过一剂，例如至少两剂。在诱导阶段，可以每天一次、每隔一天、每周两次、每周一次、每十天一次、每两周一次或每三周一次施用一个剂量。在一些实施方案中，诱导剂量在用抗α4β7抗体进行的疗法的前两周内施用。在一个实施方案中，诱导给药可以在治疗开始时(第0天)进行一次，并且在治疗开始后约两周进行一次。在另一个实施方案中，诱导阶段持续时间为六周。在另一个实施方案中，诱导阶段持续时间为六周，并且在前两周期间施用多个诱导剂量。
在一些实施方案中，例如，当开始治疗患有严重炎症性肠病的患者(例如，在抗TNFα疗法失败的患者中)时，诱导期需要比患有轻度或中度疾病的患者更长的持续时间。在一些实施方案中，患有严重疾病的患者的诱导期可具有至少6周、至少8周、至少10周、至少12周或至少14周的持续时间。在一个实施方案中，用于患有严重疾病的患者的诱导给药方案可以包括第0周(治疗开始)的剂量、第2周的剂量和第6周的剂量。在另一个实施方案中，用于患有严重疾病的患者的诱导给药方案可以包括第0周(治疗开始)的剂量、第2周的剂量、第6周的剂量和第10周的剂量。
所述剂量可以每周一次、每2周一次、每3周一次、每4周一次、每6周一次、每8周一次或每10周一次施用。更高或更频繁的剂量，例如每隔一天、每周一次、每2周一次、每3周一次或每4周一次，可用于诱导活动性疾病的缓解或用于治疗新患者，例如诱导对抗α4β7抗体的耐受。每2周一次、每3周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每8周一次或每10周一次的剂量可用于预防性疗法，例如以维持慢性疾病患者的缓解。在一方面，治疗方案是在第0天、约第2周、约第6周和其后每1或2周进行治疗。在某些方面，治疗方案是在第0天、约第2周、约第6周和其后每8周进行治疗。在另一方面，诱导治疗方案是每隔一天进行治疗，总共进行6次治疗。
在一些方面，用优化的给药方案可以实现持久的临床缓解，例如，在开始治疗后的六个月或一年时间段内，持续到护理医师访视至少两次、至少三次、至少四次的临床缓解。
在一些方面，可以用有效的给药方案实现持久的临床反应，例如，在治疗开始后持续至少6个月、至少9个月、至少一年的临床反应。
通过以下实施例进一步说明本公开。提供的实施例仅仅出于说明性目的，并且不应解释为以任何方式限制本公开的范围或内容。
实施例
以下实施例描述了用于从CHO细胞培养物中纯化维多珠单抗的示例性过程中的各个步骤。
实施例1.控制维多珠单抗的带电同种型
维多珠单抗具有三种带电同种型：酸性、主要和碱性。基于代表酸性种类、主要种类和碱性种类的色谱图的相对面积，阳离子交换(CEX)-HPLC可用于量化维多珠单抗的同种型分布。图1中示出了描绘这三个维多珠单抗种类的示例性CEX-HPLC曲线。
使用CEX-HPLC，在各种条件下储存后评估维多珠单抗的带电同种型分布。如表1所概述，制造维多珠单抗期间的过程中保留影响了带电同种型种类的分布，其中碱性同种型受保留条件的影响最大。
表1.过程中间体中碱性同种型的定性变化
Figure BDA0003459037070000731
Figure BDA0003459037070000741
这些结果表明，通过将抗体保持在某些条件下，可以可预测地调节维多珠单抗的不同同种型种类的比例。碱性同种型种类往往随着在小于大约6.5的pH下保留的持续时间而增加。相比之下，碱性同种型种类随着在大于大约6.5的pH下保持的持续时间而减少。用以中试规模(表2)和制造规模(表3)产生的维多珠单抗观察到这些变化。
表2.过程中保留期间的维多珠单抗同种型-中试纯化
Figure BDA0003459037070000742
表3.过程中保留期间的维多珠单抗同种型-制造规模纯化
Figure BDA0003459037070000743
Figure BDA0003459037070000751
进行了另外的实验以评估源自GS-CHO细胞的维多珠单抗的带电同种型分布。在5℃或室温下，在多种pH(即，pH 4.7、5.1、5.3、5.7、5.9、6.1、6.5或6.9)下储存0-7天之后评估维多珠单抗的主要种类、酸性种类和碱性种类的百分比。如表4-11所示，在大于或等于pH5.9的pH下观察到改进的稳定性。在蛋白A捕获和洗脱之后，中和的典型pH范围(pH约4.9至5.2)与碱性种类的形成增加有关。相对于在pH<5.9下储存期间观察到的碱性种类，维多珠单抗在pH 5.9或6.1下储存时碱性种类的增加减慢。如表10和11所示，在pH大于或等于pH6.5时碱性种类的增加被停止甚至逆转。
表4.在pH 4.7下的过程中保留期间的维多珠单抗同种型分布
Figure BDA0003459037070000752
Figure BDA0003459037070000761
表5.在pH 5.1下的过程中保留期间的维多珠单抗同种型分布
储存温度(℃) 保留天数 酸性％ 主要％ 碱性％
T<sub>0</sub> 0 14.37 71.60 14.02
5℃ 1 14.21 71.38 14.42
5℃ 2 14.09 71.39 14.52
5℃ 3 14.25 71.47 14.28
5℃ 5 14.07 71.19 14.74
5℃ 7 14.15 70.51 15.34
室温 1 13.95 71.20 14.85
室温 2 13.65 69.63 16.72
室温 3 13.55 67.97 18.48
室温 5 13.07 66.01 20.92
室温 7 12.63 63.18 24.19
表6.在pH 5.3下的过程中保留期间的维多珠单抗同种型分布
储存温度(℃) 保留天数 酸性％ 主要％ 碱性％
T<sub>0</sub> 0 14.23 72.22 13.55
5℃ 1 14.36 71.61 14.03
5℃ 2 14.36 71.02 14.62
5℃ 3 14.21 71.59 14.20
5℃ 5 13.98 71.06 14.96
5℃ 7 14.00 70.94 15.06
室温 1 14.03 71.04 14.94
室温 2 13.83 70.03 16.15
室温 3 13.48 68.68 17.84
室温 5 13.29 66.88 19.84
室温 7 12.77 64.93 22.30
表7.在pH 5.7下的过程中保留期间的维多珠单抗同种型分布
Figure BDA0003459037070000762
Figure BDA0003459037070000771
表8.在pH 5.9下的过程中保留期间的维多珠单抗同种型分布
储存温度(℃) 保留天数 酸性％ 主要％ 碱性％
T<sub>0</sub> 0 14.62 71.53 13.86
5℃ 1 14.29 71.59 14.13
5℃ 2 14.57 71.57 13.86
5℃ 3 14.44 71.29 14.27
5℃ 5 14.32 71.34 14.34
5℃ 7 14.50 71.29 14.21
室温 1 14.34 71.18 14.48
室温 2 14.31 70.88 14.81
室温 3 14.26 70.46 15.28
室温 5 14.47 68.98 16.55
室温 7 14.09 68.08 17.84
表9.在pH 6.1下的过程中保留期间的维多珠单抗同种型分布
储存温度(℃) 保留天数 酸性％ 主要％ 碱性％
T<sub>0</sub> 0 14.52 71.73 13.75
5℃ 1 14.54 71.51 13.95
5℃ 2 14.39 71.57 14.04
5℃ 3 14.42 71.69 13.89
5℃ 5 14.38 71.80 13.82
5℃ 7 14.58 71.21 14.21
室温 1 14.35 71.61 14.04
室温 2 14.33 71.18 14.49
室温 3 14.55 70.64 14.81
室温 5 14.38 69.88 15.74
室温 7 14.27 69.40 16.33
表10.在pH 6.5下的过程中保留期间的维多珠单抗同种型分布
储存温度(℃) 保留天数 酸性％ 主要％ 碱性％
T<sub>0</sub> 0 14.49 71.70 13.81
5℃ 3 14.30 72.30 13.40
5℃ 7 14.33 72.03 13.65
室温 1 14.52 71.57 13.91
室温 2 14.64 71.47 13.89
室温 3 14.68 71.72 13.60
室温 5 14.71 71.60 13.69
室温 7 14.86 71.00 14.15
表11.在pH 6.9下的过程中保留期间的维多珠单抗同种型分布
储存温度(℃) 保留天数 酸性％ 主要％ 碱性％
T<sub>0</sub> 0 14.42 71.34 14.25
5C 3 14.59 71.58 13.82
5C 7 14.71 71.60 13.69
室温 1 14.96 71.56 13.48
室温 2 15.08 71.87 13.05
室温 3 15.09 72.14 12.77
室温 5 15.58 72.39 12.03
室温 7 15.96 71.88 12.16
该数据表明维多珠单抗制剂中主要同种型的水平和碱性同种型的水平可以通过pH进行调节。特别是，通过将抗体暴露于低pH(<pH 5.9)增加了碱性同种型种类，而主要同种型随之减少。随着暴露于降低的pH，碱性同种型种类的水平增加得更快，并且增加的程度更大。另外，这种趋势可以通过暴露于升高的pH来逆转，例如，>pH 6.5。
实施例2.减少维多珠单抗的碱性同种型
为了进一步评估pH对维多珠单抗碱性同种型形成的影响，将抗体暴露于高pH条件(200mM Tris，pH 9)，并使用阳离子交换(CEX)-HPLC来量化维多珠单抗的同种型分布。对于每种条件，通过确定对应于酸性同种型、主要同种型和碱性同种型的色谱峰下的相对面积来量化每种维多珠单抗同种型的相对量。
如表12所示，对应于维多珠单抗的碱性种类的三个峰出现在pH 6.3(对照)(即“碱性峰1”、“碱性峰2”和“碱性峰3”)。在升高的pH下，观察到碱性峰2显著降低，如表12所示。
表12.碱性峰2对升高的pH的敏感性
对照 暴露于200mM Tris HCl(pH 9)后
名称 面积％ 面积％
碱性峰-1 6.85 6.8
碱性峰-2 3.09 0.85
碱性峰-3 0.83 0.56
收集从CEX树脂洗脱的具有碱性峰2特征保留时间的材料，并进行酶消化，随后使用质谱(MS)进行分析。在来自对照制剂的碱性峰2CEX级分中存在琥珀酰亚胺特征MS峰，但在暴露于pH 9后分析的制剂中不存在。对维多珠单抗的一级氨基酸序列的分析鉴定了维多珠单抗的CDR-H3中位于有利于天冬氨酸异构化为琥珀酰亚胺的残基附近的天冬氨酸残基，即在n+1位置的甘氨酸和丝氨酸(CDR-H3:GGYDGWDYAIDY(SEQ ID NO:4))。这一发现表明，在低pH下观察到的维多珠单抗碱性种类的增加可能归因于该天冬氨酸残基异构化为琥珀酰亚胺。将抗体维持在中性pH或接近中性pH可以减缓或防止碱性峰2的形成，并且用升高的pH处理(>pH 6.9)可以逆转异构化反应，将琥珀酰亚胺转化回天冬氨酸(或异天冬氨酸)。
为了进一步评估pH对碱性峰2的影响，在将抗体暴露于不同的pH条件(pH 6.5、pH7、pH 8、pH 8.5或pH 9)后，通过CEX-HPLC确定相对峰面积。如表13所示，碱性峰2对pH高度敏感，并随着pH的增加而降低，这与实施例1中报告的发现一致。
表13.升高的pH下碱性峰2的损失
pH 峰面积％ 损失％
6.5 3.3 0.0
7 3.26 1.2
8 2.13 35.5
8.5 1.36 58.8
9 0.69 79.1
然后基于源自两种不同CHO细胞系(DHFR-CHO和GS-CHO)的维多珠单抗制剂评估对应于碱性峰2的维多珠单抗同种型的水平。如表14所示，在源自DHFR-CHO和GS-CHO两个细胞系的维多珠单抗制剂中观察到碱性峰2的减少。
表14.源自两种不同CHO细胞系的抗体制剂中碱性峰2的损失
Figure BDA0003459037070000801
实施例3.阴离子交换装载电导率对宿主细胞蛋白清除率的影响
由于通常需要减少治疗性蛋白质组合物中宿主细胞蛋白污染物的量，因此检查了用于产生具有减少的宿主细胞蛋白含量的维多珠单抗组合物的制造方法。
阴离子交换(AEX)(例如，通过阴离子交换Q膜吸附剂)的缓冲液电导率的标准操作范围为大约11-15mS/cm(平均值大约13.6mS/cm)。为了评估超出标准操作范围的条件下的杂质清除率，在使用较低电导率AEX条件获得的组合物中测试杂质清除率。测试了维多珠单抗澄清收获物的两种独立起始制剂(收获物1和收获物2)。在将装载材料的电导率调整到标准电导率(约13.6mS/cm)或低电导率(约11mS/cm)后，对所有样品进行AEX纯化。如表15所示，与标准电导率AEX装载材料相比，低电导率AEX装载材料的HCP水平降低。
表15.使用兔-山羊(RaGo)过程特异性ELISA得到的HCP清除率
Figure BDA0003459037070000802
Figure BDA0003459037070000811
接下来，使用电导率范围低于标准操作条件(即低于13-15mS/cm)的装载缓冲液测试AEX性能(流通模式)。表16总结了装载条件、电导率、宿主细胞蛋白含量以及酸性和碱性同种型的百分比。使用CHO宿主细胞蛋白ELISA进行测试。如表16所示，宿主细胞蛋白的量随着AEX装载缓冲液电导率的降低而减少。
表16.电导率变化研究——Q膜性能
Figure BDA0003459037070000812
然后通过两种不同的HCP ELISA方法评估降低的AEX电导率对HCP清除率的影响。在第一种方法中，将兔一抗和抗兔二抗用于HCP ELISA(RaRa)中。第二种方法在HCP ELISA(RaGo)中利用兔一抗和山羊二抗。表17和18分别总结了使用标准或低电导率AEX装载后这两种HCP ELISA方法的结果。这两种方法都证明，通过降低AEX装载材料的电导率提高了HCP清除率。
表17.标准电导率AEX装载条件(约13.3mS/cm)
Figure BDA0003459037070000813
Figure BDA0003459037070000821
表18.低电导率AEX装载条件(约10.0mS/cm)
Figure BDA0003459037070000822
重组蛋白制剂中HCP的量是可变的。如本文所示，可以通过在使用AEX进行纯化期间降低电导率来改进维多珠单抗制剂的HCP清除率。与起始材料中的HCP浓度无关，与标准的较高电导率AEX条件相比，较低电导率AEX条件实现了HCP的更大降低。
实施例4.平衡和洗涤条件对混合模式树脂装载能力的影响
为了使纯化过程中维多珠单抗的损失最小化，检查了各种纯化条件以鉴定抗体产物产率降低的步骤。观察到在高浓度装载条件下陶瓷羟基磷灰石(CHT)纯化的洗涤步骤期间发生蛋白质损失。例如，图2比较了使用标准洗涤和平衡缓冲液(75mM NaCl、10mM磷酸钠，pH 7.2)，在装载27mg/ml或35mg/ml后，来自CHT柱的维多珠单抗洗脱曲线。如图2所示，在高浓度装载条件(35mg/ml)下，在洗涤步骤期间蛋白质开始排出柱。
为了增加维多珠单抗在CHT柱上的装载能力，并通过降低CHT洗涤步骤中的蛋白质损失量来提高维多珠单抗的产率，评估替代的CHT平衡缓冲液、装载缓冲液和洗涤缓冲液。如与使用升高的pH下的标准CHT缓冲液(75mM NaCl，10mM磷酸钠，pH 7.2)进行的CHT柱操作相比，确定在使用用于CHT平衡和洗涤的较低pH缓冲液(50mM NaCl，10mM磷酸钠，pH 6.7)进行的CHT柱操作后实现的CHT柱上的维多珠单抗装载量(g/l)及所得的产率。如图3所示，在使用标准CHT缓冲液条件(虚线)的洗涤步骤期间有大量蛋白质损失，但使用低pH缓冲液(实线)未观察到蛋白质损失。此外，如表19中总结的，在平衡和洗涤步骤中使用低pH缓冲液允许在CHT柱上有更大的装载体积，并且在最终洗脱物中在不改变产物质量(例如，聚集体百分比)的情况下导致与使用标准CHT缓冲液实现的相比高2％-3％的产率。
表19.分析比较：标准CHT相对于具有低pH缓冲液的CHT
Figure BDA0003459037070000831
等效案
应当理解，虽然已经结合其详细说明描述了本发明，但前述说明旨在说明而非限制由所附权利要求书的范围定义的本发明范围。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用整体并入。此外，材料,方法以及实施例仅仅是说明性的并不旨在是限制性的。除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的意义。尽管可以在本发明的实践或测试中使用与本文所述的那些类似或等同的方法和材料，但本文描述了合适的方法和材料。
序列表
Figure BDA0003459037070000841
Figure BDA0003459037070000851
Figure IDA0003459037110000011
Figure IDA0003459037110000021
Figure IDA0003459037110000031
Figure IDA0003459037110000041
Figure IDA0003459037110000051
Figure IDA0003459037110000061
Figure IDA0003459037110000071
Figure IDA0003459037110000081
Figure IDA0003459037110000091

Claims (112)

1.一种产生包含维多珠单抗的组合物的方法，所述方法包括：
提供pH大于pH 6.5的包含维多珠单抗的组合物；以及
将所述包含维多珠单抗的组合物孵育至少20分钟至10小时的时间段；
从而产生包含维多珠单抗的组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法是产生具有降低的碱性维多珠单抗同种型种类水平的包含维多珠单抗的组合物的方法，并且其中所述方法产生具有降低的碱性维多珠单抗同种型种类水平的包含维多珠单抗的组合物。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述方法产生具有<16％、<15％、<14％、<13％、<12％、<11％或<10％碱性维多珠单抗同种型种类的包含维多珠单抗的组合物。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述孵育在维多珠单抗纯化期间进行，并且其中所述孵育在(a)超滤/渗滤(UF/DF)所述抗体之前或(b)在将所述抗体配制在药学上可接受的缓冲液中之前进行。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述孵育在环境温度下进行。
6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述孵育在15℃-30℃下进行，或其中所述孵育在20℃-25℃下进行。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包含维多珠单抗的组合物以约6.5-8.5的pH提供。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包含维多珠单抗的组合物以约7.0-8.0的pH提供。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包含维多珠单抗的组合物以约7.0-7.5的pH提供。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包含维多珠单抗的组合物以约pH6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9、pH 8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4或pH 8.5的pH提供。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育约10-120小时的时间段。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育约12-120小时的时间段。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育约12-96小时的时间段。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育约12-72小时的时间段。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育约12-48小时的时间段。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育至少12小时的时间段。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育约24-120小时的时间段。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育约24-96小时的时间段。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育约24-72小时的时间段。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育约24-48小时的时间段。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述包含维多珠单抗的组合物孵育约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约96小时或约120小时的时间段。
22.一种从澄清的细胞培养收获物中纯化人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括
(i)提供从表达所述抗α4β7抗体或其抗原结合部分的重组宿主细胞的培养物中获得的澄清的细胞培养收获物，以及
(ii)从所述细胞培养收获物中纯化所述抗α4β7抗体或其抗原结合部分，其中将所述抗体暴露于4.0的pH或低于4.0的pH不超过24小时，
其中所述抗α4β7抗体或其抗原结合部分包含含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述抗α4β7抗体或其抗原结合部分与对照相比具有降低的碱性同种型种类水平(由CEX确定)，其中所述对照是包含通过相同方法产生的抗α4β7抗体或其抗原结合部分的组合物，其中所述抗体暴露于4.0的pH或低于4.0的pH(例如，pH 3.6-4.0)持续更长的时间，即大于24小时。
24.如权利要求22或23所述的方法，其中所述抗α4β7抗体或其抗原结合部分是维多珠单抗或其抗原结合部分。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包含维多珠单抗或其抗原结合部分的组合物包含第一碱性同种型峰(BP1)和第二碱性同种型峰(BP2)，并且其中所述方法产生具有降低的BP2水平的包含维多珠单抗或其抗原结合部分的组合物。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述方法产生具有少于2％、少于1.5％、少于1％、或少于0.7％BP2的包含维多珠单抗或其抗原结合部分的组合物。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包含维多珠单抗的组合物源自表达维多珠单抗的哺乳动物细胞培养物。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述哺乳动物细胞培养物是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养物。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述CHO细胞培养物包含缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)表达的CHO细胞。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述CHO细胞培养物包含缺乏谷氨酰胺合成酶(GS)表达的CHO细胞。
31.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使用一个或多个选自由亲和色谱、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱和陶瓷羟基磷灰石(CHT)色谱组成的组的色谱分离步骤从哺乳动物宿主细胞蛋白(HCP)中纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
32.如权利要求31所述的方法，其中使用包含蛋白A的亲和色谱树脂纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
33.如权利要求32所述的方法，其中在所述孵育之前使用亲和色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
34.如权利要求32所述的方法，其中在所述孵育之后使用亲和色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
35.如权利要求31所述的方法，其中使用阳离子交换色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
36.如权利要求35所述的方法，其中在所述孵育之前使用阳离子交换色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
37.如权利要求35所述的方法，其中在所述孵育之后使用阳离子交换色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
38.如权利要求31所述的方法，其中使用阴离子交换色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
39.如权利要求38所述的方法，其中在所述孵育之前使用阴离子交换色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
40.如权利要求38所述的方法，其中在所述孵育之后使用阴离子交换色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
41.如权利要求31所述的方法，其中使用CHT色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
42.如权利要求41所述的方法，其中在所述孵育之前使用CHT色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
43.如权利要求41所述的方法，其中在所述孵育之后使用CHT色谱纯化所述包含维多珠单抗的组合物。
44.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述组合物掺入药物配制品中。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述药物配制品是冻干药物配制品。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述冻干药物配制品是干燥的冻干药物配制品。
47.如权利要求46所述的方法，所述方法进一步包括用液体复原所述干燥的冻干药物配制品以使其适于施用的步骤。
48.如权利要求44所述的方法，其中所述药物配制品是液体药物配制品。
49.一种包含维多珠单抗的组合物，其中所述组合物通过权利要求1-48中任一项所述的方法产生。
50.一种包含维多珠单抗的组合物，其中所述组合物能够通过权利要求1-48中任一项所述的方法获得。
51.如权利要求49或50所述的组合物，其中所述碱性维多珠单抗同种型种类组成存在于所述组合物中的维多珠单抗种类的少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％、或少于10％。
52.一种包含抗α4β7抗体的低碱性种类组合物，其中所述组合物包含所述抗α4β7抗体的总碱性同种型种类的少于16％、少于15％、少于14％、少于13％、少于12％、少于11％或少于10％，其中所述碱性同种型种类相对于所述抗α4β7抗体的主要同种型具有净正电荷，并且能够通过确定比与主要同种型对应的峰更慢从阳离子交换(CEX)树脂洗脱的峰的相对面积来量化，并且其中所述抗α4β7抗体包含含有SEQ ID NO:1的重链可变区和含有SEQ IDNO:2的轻链可变区。
53.如权利要求52所述的组合物，其中所述组合物包含第一碱性同种型峰(BP1)和第二碱性同种型峰(BP2)。
54.如权利要求53所述的组合物，其中所述组合物包含少于2％BP2。
55.如权利要求53所述的组合物，其中所述组合物包含少于1.5％BP2。
56.如权利要求53所述的组合物，其中所述组合物包含少于1％BP2。
57.如权利要求53所述的组合物，其中所述组合物包含少于0.7％BP2。
58.如权利要求53所述的组合物，其中BP1与BP2的比率为至少3。
59.如权利要求53所述的组合物，其中BP1与BP2的比率为至少5。
60.如权利要求53所述的组合物，其中BP1与BP2的比率为至少7。
61.如权利要求53所述的组合物，其中BP1与BP2的比率为至少10。
62.一种药物组合物，其包含权利要求52-61中任一项所述的组合物和药学上可接受的载剂或赋形剂。
63.一种产生包含维多珠单抗的组合物的方法，所述方法包括：
(a)在装载缓冲液的存在下使含有维多珠单抗和宿主细胞蛋白(HCP)的样品与阴离子交换树脂接触，其中所述装载缓冲液的电导率为11mS/cm或更小，使得HCP与阴离子交换树脂结合；以及
(b)收集来自所述阴离子交换树脂的流过材料，
其中洗脱物包含维多珠单抗。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述方法是产生具有减少量的HCP的包含维多珠单抗的组合物的方法，并且所述流过材料包含维多珠单抗和减少量的HCP。
65.如权利要求63或64所述的方法，其中所述装载缓冲液具有9mS/cm至11mS/cm的电导率。
66.如权利要求63或64所述的方法，其中所述装载缓冲液具有10mS/cm或更少的电导率。
67.如权利要求63或64所述的方法，其中所述装载缓冲液具有9mS/cm或更少的电导率。
68.如权利要求63或64所述的方法，其中所述装载缓冲液具有约9mS/cm、9.5mS/cm、10mS/cm、10.5mS/cm或11mS/cm的电导率。
69.如权利要求63-68中任一项所述的方法，其中所述HCP是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞蛋白。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述HCP源自缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)表达的CHO细胞。
71.如权利要求69所述的方法，其中所述HCP源自缺乏谷氨酰胺合成酶(GS)表达的CHO细胞。
72.如权利要求63-71中任一项所述的方法，其进一步包括使所述阴离子交换树脂与洗涤缓冲液接触。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述洗涤缓冲液具有小于11mS/cm的电导率。
74.如权利要求72所述的方法，其中所述洗涤缓冲液具有9mS/cm至11mS/cm的电导率。
75.如权利要求72所述的方法，其中所述洗涤缓冲液具有与所述装载缓冲液相同的电导率。
76.如权利要求63-75中任一项所述的方法，其中所述装载缓冲液包含氯化钠和/或磷酸钠。
77.如权利要求63-75中任一项所述的方法，其中所述洗涤缓冲液包含氯化钠和/或磷酸钠。
78.如权利要求63-77中任一项所述的方法，其中所述阴离子交换树脂被格式化为阴离子交换柱或阴离子交换膜。
79.如权利要求63-78中任一项所述的方法，其中所述阴离子交换树脂包含季胺官能团。
80.如权利要求63-79中任一项所述的方法，其中所述含有维多珠单抗和HCP的样品源自在一个或多个色谱分离步骤之后的哺乳动物细胞培养物。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述一个或多个色谱分离步骤包括选自由亲和色谱、阳离子交换色谱和陶瓷羟基磷灰石(CHT)色谱组成的组的一个或多个步骤。
82.如权利要求63-81中任一项所述的方法，其中所述流过材料中HCP的量为8ppm或更少、7.5ppm或更少、7ppm或更少、6.5ppm或更少、6ppm或更少、5.5ppm或更少、5ppm或更少、4.5ppm或更少、4ppm或更少、3.5ppm或更少、3ppm或更少、2.5ppm或更少、或2ppm或更少。
83.如权利要求63-82中任一项所述的方法，其中相对于当用电导率大于12mS/cm的装载缓冲液使用相同样品进行所述方法时产生的流过材料中HCP的量，所述流过材料中HCP的量减少至少50％。
84.如权利要求63-83中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括通过包括超滤和/或渗滤的过程处理所述流过材料，以将所述洗脱缓冲液交换为包含一种或多种药学上可接受的载剂或赋形剂的缓冲液。
85.如权利要求63-84中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述组合物掺入药物配制品中。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述药物配制品是冻干药物配制品。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述冻干药物配制品是干燥的冻干药物配制品。
88.如权利要求87所述的方法，所述方法进一步包括用液体复原所述干燥的冻干药物配制品以使其适于施用的步骤。
89.如权利要求85所述的方法，其中所述药物配制品是液体药物配制品。
90.如权利要求89或48所述的方法，其中所述液体药物配制品适于向人皮下施用。
91.一种包含维多珠单抗的组合物，所述组合物通过权利要求63-90中任一项所述的方法产生。
92.一种包含维多珠单抗的组合物，其中所述组合物能够通过权利要求63-90中任一项所述的方法获得。
93.如权利要求91或92所述的组合物，其中所述组合物中HCP的量为8ppm或更少、7.5ppm或更少、7ppm或更少、6.5ppm或更少、6ppm或更少、5.5ppm或更少、5ppm或更少、4.5ppm或更少、4ppm或更少、3.5ppm或更少、3ppm或更少、2.5ppm或更少、或2ppm或更少。
94.一种增加从混合模式色谱树脂洗脱后回收的维多珠单抗的产率的方法，所述方法包括用平衡缓冲液平衡所述混合模式色谱树脂，将包含维多珠单抗和装载缓冲液的溶液装载到所述混合模式色谱树脂上，使得维多珠单抗结合所述混合模式色谱树脂，用洗涤缓冲液洗涤所述混合模式色谱树脂，并用洗脱缓冲液从所述混合模式色谱树脂洗脱维多珠单抗，其中所述平衡缓冲液、装载缓冲液和/或洗涤缓冲液具有7.0或低于7.0的pH。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有6.0-7.0的pH。
96.如权利要求94所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有6.5-7.0的pH。
97.如权利要求94所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有6.6-6.8的pH。
98.如权利要求94-97中任一项所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有30mM至70mM的盐浓度。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有40mM至70mM的盐浓度。
100.如权利要求98所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有50mM至65mM的盐浓度。
101.如权利要求98所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有55mM-65mM的盐浓度。
102.如权利要求98-101中任一项所述的方法，其中所述盐包括氯化钠和/或磷酸钠。
103.如权利要求94-97中任一项所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有30mM至70mM的氯化钠浓度。
104.如权利要求103所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有40mM至70mM的氯化钠浓度。
105.如权利要求103所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有40mM至60mM的氯化钠浓度。
106.如权利要求103所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有45mM-55mM的氯化钠浓度。
107.如权利要求103所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有约50mM的氯化钠浓度。
108.如权利要求103-107中任一项所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液进一步包含磷酸钠。
109.如权利要求94-108中任一项所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有相同的pH。
110.如权利要求94-109中任一项所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液具有相同的盐浓度。
111.如权利要求94-108中任一项所述的方法，其中所述平衡缓冲液、所述装载缓冲液和/或所述洗涤缓冲液是相同的缓冲液。
112.如权利要求94-111中任一项所述的方法，其中所述混合模式树脂是陶瓷羟基磷灰石树脂。
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