KR20200135371A - 재조합 단백질의 정제를 위한 완전 관통 공정 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 연속식 모드로: 적어도 1종의 킬레이트화제의 사용을 수반하는 1개의 여과 단계, 적어도 1개의 투석여과 막의 사용을 수반하는 교환 단계, 및 막 흡착제의 조합물의 사용을 수반하는 폴리싱 단계를 포함하는 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 조합물의 2개의 막 흡착제는 작용 메카니즘 측면에서 직교한다.
Description
본 발명은 단백질, 구체적으로 모노클로날 항체의 소규모 및 대규모 정제를 위한 완전 관통 정제 공정에 관한 것이다.
항체 정제는 생물생산의 가장 고가의 측면 중 하나일 수 있다. 모노클로날 항체 (mAb)는 일반적으로 각 단계에서 적어도 특정 완충제 시스템을 사용하는 3-단계, 3개의 수지 크로마토그래피 공정을 사용하여 정제된다. 이러한 통상적인 정제 공정은 포획 단계에 이어서 중간 정제 단계를 포괄하고, 폴리싱 단계로 마치며, 통상적으로 3 내지 5일의 작업일 (저장 및 개방 단계 포함)이 걸린다. 이러한 통상적인 공정에서, 이들 3개의 단계는 별개의 유닛 작동의 순서로 수행되고, 이는 pH, 몰농도 및 단백질 농도의 조정이 각 단계 사이에서 필수적이기 때문에 연속식 모드로 작동될 수 없다. 따라서, 통상적인 정제 공정은 일반적으로 다수의 상이한 완충제 뿐만 아니라 각각의 불연속 단계 사이에 다수의 저장 유닛, 및 여러 시스템을 필요로 한다. 따라서, 이들 통상적인 정제 공정은 오염, 기술 결함 및 인적 오류가 발생하기 쉽다. 추가적으로, 용리액을 농축시키고 pH 및 전도성을 조정하고 후속 단계 이전에 용리액을 저장하기 위해 각 단계 사이에 중단이 필요하기 때문에, 그리고 단계가 이전 단계의 완결 전에 시작될 수 없기 때문에, 이러한 통상적인 정제 공정은 특히 길고 고가이다.
통상적인 공정의 고비용은 또한 제1 정제 단계로서 단백질 A 매트릭스의 일반적인 사용으로 인한 것이다. 사실상, 과거부터 가장 선택적인 수지는 일반적으로, 가능한 한 많은 불순물을 제거하기 위해, 단백질 A의 경우 공정의 초기에 놓였다. 그러나, 단백질 A가 모노클로날 항체 정제를 위한 가장 선택적인 매체인 경우에도, 공정에 남아있는 오염물은 여전히 존재한다. 이 단계는 또한 많은 양의 오염물과 접촉되는 제1 단계로서 사용되기 때문에, 또한 전체 공정 중 가장 고가이다. 추가적으로, 남아있는 오염물은 제약 사양에 부합하도록 제거하는 것이 매우 어렵다.
증가하는 세포 배양 역가 및 보다 큰 세포 배양 부피가 생산을 위해 사용되면서, 하류 가공이 산업 장애로서 생각된다. 이는 특히 모노클로날 항체 생산과 관련되며, 여기서 포커스는 배치 부피에서 하류 가공 용량으로 옮겨졌다. 게다가, 초기 전-임상 및 임상 단계 연구는 보다 신속하게 생산될 수 있는 보다 많은 양의 항체를 필요로 한다. 따라서, 단백질 정제를 위해, 특히 항체 정제를 위해, 그리고 배치를 수득하는데 걸리는 시간의 감소, 오염, 기술 결함 및 인적 오류의 위험성의 감소, 및 공정 규모-확대 요건의 감소 모두를 위해, 산업에서 연속식 모드로 수행될 수 있는 보다 저렴한 공정에 대한 필요가 존재한다.
본 발명자들은 연속식 완전 관통 모드의 오직 3개의 단계만을 포함하며, 이들 단계 중 어떠한 것도 단백질 A를 수반하지 않고, 유리하게는 오직 1종의 완충제만을 사용하지만, 여전히 탁월한 정도의 순도로 정제된 단백질의 높은 수율을 수득가능하게 하는, 단백질, 특히 항체를 정제하는 신규한 방법을 발견하였다. 따라서, 정제된 단백질은 의학적 적용에 적합하다. 따라서, 상기 방법은 임상 시험을 위해 및/또는 단백질을 포함하는 제약 조성물의 제조를 위해 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다. 추가적으로, 이러한 방법은 임의의 단계간 조정이 필요하지 않으며, 따라서 정제될 단백질의 수거물에서 최종 생성물까지 폐쇄 시스템으로 수행될 수 있다.
간략하게, 본 방법은 오직 3개의 연속 단계만을 포함하고, 다량의 오염물을 제거하기 위한 목적으로 제1 단계로서 사용되는 보다 저렴한 기술이며, 나머지 소량의 오염물을 제거하기 위한 보다 더 선택적이고 따라서 통상적인 공정에서의 그의 사용과 비교하여 보다 작은 크기로 사용되는 제2 및 제3 단계를 위해 사용되는 기술이다.
따라서, 본 발명의 방법은 연속식 모드로: 적어도 1개의 킬레이트화제의 사용을 수반하는 1개의 여과 단계, 적어도 1개의 투석여과 막의 사용을 수반하는 교환 단계, 및 막 흡착제의 조합물의 사용을 수반하는 폴리싱 단계를 포함하며, 여기서 상기 막 흡착제의 조합물에서 2개의 막 흡착제는 작용 메카니즘 측면에서 직교한다. 본 발명의 방법을 도 1에 개략화한다. 이들 3개의 정제 단계는 유리하게는 이러한 특정 순서로 구현된다. 또한, 전체 공정에 걸쳐서 교환 단계에 사용되는 오직 1종의 완충제만이 사용될 필요가 있는 것으로 확인되었다. 다시 말해서, 폴리싱 단계 동안 임의로 사용되는 평형 완충제는 유리하게는 교환 단계에 사용되는 완충제와 동일하다. 이 완충제는 유리하게는 비스 트리스, 트리스, 트리스-HCl, 포스페이트 및/또는 시트르산을, 예를 들어 NaCl, 아세트산 및 물과 조합하여 포함한다. 보다 특히, 전체 공정에 오직 1종의 완충제만을 사용하는 것이 가능하며, 이는 모든 단계 사이의 상용성을 보장하고, 공급 사슬 제조 및 품질 관리 절감 및 감소된 저장 필요성을 가능하게 한다.
본 발명의 방법은 추가로, 개방 단계 (즉, 신규 완충제를 위한 크로마토그래피 칼럼을 제조하거나, 샘플을 희석하거나, 또는 그의 pH를 조정하는 것과 같이 수동 작동을 수행하기 위해 정제 시스템이 개방되는 단계)를 없애는 것을 가능하게 하여, 그에 의해 오염의 위험을 감소시키고, 덜 분류된 환경에서의 작업 가능성을 제공한다. 추가적으로, 본 발명의 방법은 유리하게는 임의의 칼럼의 사용을 수반하지 않고 주로 일회용이고 즉시 사용가능한 막 흡착제를 사용하기 때문에, 저장 또는 재사용 검증, 칼럼 제조 또는 패킹 또는 연관 제어, 세정 검증 및 제한된 하드웨어를 필요로 하지 않는다. 따라서 공정 사이클 시간은 단축되고, 공정 규모-확대 요건은 최소화되고, 작동 및 저장 비용을 감소시키는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 방법은 배치를 신속하게 비용 효과적으로 생산하는 것 및 정제 시스템의 점유 시간을 감소시키는 것 둘 다를 가능하게 한다. 따라서, 이는 벤치에서 산업적 규모로의 재조합 단백질의 규모-확대 및 정제에 적합하다.
특정 프로토콜이 2종의 상이한 항체에 대해 설정되고 구현되었다. 이러한 프로토콜에서, 제1 여과 단계의 말미에 수득된 여과된 단백질 용액은 적어도 1개의 투석여과 막 상에 바로, 즉 pH 조정, 완충제 교환 또는 희석과 같은 임의의 처리를 거치지 않고 통과되고, 교환 단계의 말미에 수득된 보유물은 또한 적어도 2개의 막 흡착제의 조합물 상에 바로, 즉 pH 조정, 완충제 교환 또는 희석과 같은 임의의 처리를 거치지 않고 통과된다. 이러한 프로토콜은 매우 신속하다는 이점을 갖고 (수 시간), 높은 수율 (70% 초과), 제약 산업 표준과 상용성인 순도를 발생시키며, 사용되는 완충제 및 저장 설비 둘 다를 감소시킬 수 있다. 또한, 이 공정은 일반적으로 통상적인 공정의 가장 고가의 요소인 단백질 A 매트릭스의 사용을 수반하지 않기 때문에, 매우 유연하고 비용 절감적인 이점을 갖는다. 또한, 이는 완전히 자동화된, 연속식 모드의 실행일 수 있으며, 임의의 개방 단계를 포함하지 않는다. 또한, 이는 2종의 상이한 항체에 대해 성공적으로 수행되었다.
본 발명은 따라서
(a)
- 용액을 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스 상에 관통 모드로 통과시키는 단계,
- 상기 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스의 관통으로부터 여과된 단백질 용액을 회수하는 단계
를 포함하는 여과 단계;
(b)
- 단계 (a)의 말미에 수득된 여과된 단백질 용액을, 교환을 위해 오직 1종의 완충제만을 사용하여 적어도 1개의 투석여과 막 상에 통과시키는 단계,
- 상기 적어도 1개의 투석여과 막의 부분적으로 정제된 단백질-함유 보유물을 회수하는 단계
를 포함하는 교환 단계;
(c)
- 단계 (b)의 말미에 수득된 보유물을 막 흡착제의 조합물 상에 관통 모드로 통과시키는 단계이며, 여기서 상기 막 흡착제의 조합물의 2개의 막 흡착제는 작용 메카니즘 측면에서 직교하고, 상기 막 흡착제의 조합물은 단계 (b)에서 교환을 위해 사용된 1종의 완충제와 동일한 평형 완충제로 사전에 평형화된 것인 단계,
- 상기 막 흡착제의 조합물의 관통으로부터 정제된 단백질을 회수하는 단계
를 포함하는 폴리싱 단계
를 포함하는, 용액으로부터 단백질을 정제하는 방법을 제공하며;
여기서 상기 정제 방법은 단백질 A 크로마토그래피 단계는 포함하지 않는다.
본 발명은 또한
(a)
- 용액을 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스 상에 관통 모드로 통과시키는 단계,
- 상기 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스의 관통으로부터 여과된 단백질 용액을 회수하는 단계
를 포함하는 여과 단계;
(b)
- 단계 (a)의 말미에 수득된 여과된 단백질 용액을, 교환을 위해 오직 1종의 완충제만을 사용하여 적어도 1개의 투석여과 막 상에 통과시키는 단계이며, 상기 오직 1종의 완충제는 폴리싱 단계 (c) 동안 사용된 평형 완충제와 동일한 것인 단계;
- 상기 적어도 1개의 투석여과 막의 부분적으로 정제된 단백질-함유 보유물을 회수하는 단계
를 포함하는 교환 단계;
(c)
- 단계 (b)의 말미에 수득된 보유물을 막 흡착제의 조합물 상에 관통 모드로 통과시키는 단계이며, 여기서 상기 막 흡착제의 조합물의 2개의 막 흡착제는 작용 메카니즘 측면에서 직교하고, 상기 막 흡착제의 조합물은 평형 완충제로 사전에 평형화된 것인 단계,
- 상기 막 흡착제의 조합물의 관통으로부터 정제된 단백질을 회수하는 단계
를 포함하는 폴리싱 단계
를 포함하는, 용액으로부터 단백질을 정제하는 방법을 제공하며;
여기서 상기 정제 방법은 단백질 A 크로마토그래피 단계는 포함하지 않는다.
본 발명은 특히
(a)
(i) 용액을 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스 상에 관통 모드로 통과시키는 단계,
(ii) 상기 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스의 관통으로부터 여과된 단백질 용액을 회수하는 단계
를 포함하는 여과 단계,
(b)
(i) 단계 (a)의 말미에 수득된 여과된 단백질 용액을, 교환을 위해 오직 1종의 완충제만을 사용하여 적어도 1개의 투석여과 막 상에 통과시키는 단계,
(ii) 상기 적어도 1개의 투석여과 막의 부분적으로 정제된 단백질-함유 보유물을 회수하는 단계
를 포함하는 교환 단계;
및
(c)
(i) 평형 완충제를 막 흡착제의 조합물 상에 통과시키는 단계이며, 여기서 상기 평형 완충제는 단계 (b)에서 교환을 위해 사용된 1종의 완충제와 동일한 것인 단계,
(ii) 단계 (b)로부터 수득된 보유물을 막 흡착제의 조합물 상에 관통 모드로 통과시키는 단계,
(iii) 상기 막 흡착제의 조합물의 관통으로부터 정제된 단백질을 회수하는 단계
를 포함하는 폴리싱 단계
를 포함하는, 용액으로부터 단백질을 정제하는 방법을 제공하며;
여기서 상기 정제 방법은 단백질 A 크로마토그래피 단계는 포함하지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 전체 정제 방법에 걸쳐 오직 1종의 완충제만이 사용된다. 특정한 실시양태에서, 1종의 완충제는 트리스, 트리스-HCl, 비스 트리스, 포스페이트 및/또는 시트르산을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 1종의 완충제는 (i) 비스 트리스, 트리스 또는 트리스-HCl, (ii) 아세트산, (iii) 물 및 (iv) 임의로 염을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
한 실시양태에서, 여과 단계의 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스는 활성탄, 규조토, 유리 양이온 교환 수지, 유리 음이온 교환 수지, 및 유리 혼합 모드 수지로부터 선택된다. 특정한 실시양태에서, 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스는 2개의 상이한 킬레이트화제 매트릭스의 조합물이다. 보다 특정한 실시양태에서, 2개의 상이한 킬레이트화제 매트릭스의 조합물은 활성탄 및 유리 음이온 교환 수지의 조합물이다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스는 2개 초과의 상이한 킬레이트화제 매트릭스, 즉 3, 4, 5개 또는 5개 초과의 조합물이다.
한 실시양태에서, 교환 단계의 적어도 1개의 투석여과 막은 단일 경로 접선 흐름 여과 (SPTFF) 모듈 또는 접선 흐름 여과 (TFF) 모듈이다. 특정한 실시양태에서, 교환 단계의 적어도 1개의 투석여과 막은 카세트, 중공 섬유 또는 나선형 권취 형태이다. 특정한 실시양태에서, 여과된 단백질 용액은 교환 단계 동안 농축된다.
한 실시양태에서, 폴리싱 단계의 막 흡착제의 조합물은 2개의 막 흡착제의 조합물 또는 적어도 2개의 막 흡착제, 예를 들어 3, 4개 또는 적어도 4개의 막 흡착제의 조합물이다.
한 실시양태에서, 막 흡착제의 조합물의 막 흡착제는 양이온 교환 막 흡착제, 음이온 교환 막 흡착제, 다중 모드 막 흡착제, 소수성 상호작용 막 흡착제 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시양태에서, 폴리싱 단계의 막 흡착제의 조합물은 양이온 교환 막 흡착제 및 음이온 교환 막 흡착제의 조합물이다.
한 실시양태에서, 폴리싱 단계의 막 흡착제의 조합물은 양이온 교환 막 흡착제, 음이온 교환 막 흡착제, 다중 모드 막 흡착제 및 소수성 상호작용 막 흡착제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 막 흡착제의 조합물이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 방법은 단계 (c) 후에 나노여과 단계 및 나노여과 단계 후에 임의로 최종 한외여과 및/또는 투석여과 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 단계 (c) 후에, 나노여과 단계 후에 및/또는 최종 한외여과 및/또는 투석여과 단계 후에 낮은 pH 불활성화 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 방법은 단백질을 함유하는 액체 배양 배지를 제공하기 위해, 단계 (a) 전에, 액체 배양 배지, 바람직하게는 생물반응기에서의 세포 배양 단계를 포함한다. 배양된 세포는 포유동물, 박테리아 또는 효모 세포일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 배양된 세포는 포유동물 세포주 (예를 들어, Vero 세포, CHO 세포, 3T3 세포, COS 세포, HEK293 세포 등, 이들 세포주의 상이한 하위유형 포함) 뿐만 아니라 1차 또는 확립된 포유동물 세포 배양물 (예를 들어, 림프모구, 섬유모세포, 배아 세포, 상피 세포, 신경 세포, 지방세포 등으로부터 생산된 것)일 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 정제될 단백질은 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다.
따라서, 본 발명은 또한 액체 배양 배지로부터 정제된 단백질의 생성을 위한 통합 공정을 제공한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 1종의 완충제는 아세트산에 의해 pH 6 내지 9 (특히 7.5)로 조정된, 5 내지 40 mM (특히 20 mM) 비스 트리스, 15 내지 150 mM (특히 75 mM) NaCl을 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 1종의 완충제는 아세트산에 의해 pH 6 내지 9 (특히 7.5)로 조정된, 5 내지 40 mM (특히 20 mM) 트리스 또는 트리스-HCl, 15 내지 150 mM (특히 75 mM) NaCl을 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 1종의 완충제는 시트르산에 의해 pH 6 내지 9 (특히 7.5)로 조정된, 5 내지 40 mM (특히 20 mM) 트리스 또는 트리스-HCl, 15 내지 150 mM (특히 75 mM) NaCl을 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 1종의 완충제는 Na2HPO4/NaH2PO4 (바람직하게는 10 mM / 90 mM Na2HPO4/NaH2PO4에서 90 mM / 10 mM Na2HPO4/NaH2PO4까지)에 의해 pH 6 내지 9 (특히 7.5)로 조정된, 15 내지 150 mM (특히 75 mM) NaCl을 포함한다.
본 발명은 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스, 적어도 1개의 투석여과 막 및 막 흡착제의 조합물 (여기서 상기 막 흡착제의 조합물의 2개의 막 흡착제는 작용 메카니즘 측면에서 직교함); 및 트리스, 트리스-HCl, 비스 트리스, 포스페이트 및/또는 시트르산을 포함하는, 특히 (i) 비스 트리스, 트리스 또는 트리스-HCl, (ii) 아세트산, (iii) 물, 및 (iv) 임의로 NaCl을 포함하거나 또는 이로 이루어진 1종의 완충제를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 본 발명의 방법을 사용하여 용액으로부터 단백질을 정제하는데 사용된다.
본 발명은 또한 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스, 적어도 1개의 투석여과 막 및 막 흡착제의 조합물 (여기서 상기 막 흡착제의 조합물의 2개의 막 흡착제는 작용 메카니즘 측면에서 직교함); 및 트리스, 트리스-HCl, 비스 트리스, 포스페이트 및/또는 시트르산을 포함하는, 특히 (i) 비스 트리스, 트리스 또는 트리스-HCl, (ii) 아세트산, (iii) 물, 및 (iv) 임의로 NaCl을 포함하거나 또는 이로 이루어진 1종의 완충제를 제조하는 것에 대한 지침서를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 본 발명의 방법을 사용하여 용액으로부터 단백질을 정제하는데 사용된다.
또한, 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 수득된 단리된 단백질, 제약 작용제 및 제약 조성물이 본원에 제공된다.
개시된 정제 방법의 이들 및 다른 특색 및 이점은 첨부된 청구범위와 함께 하기의 상세한 설명으로부터 보다 완전히 이해될 것이다. 청구범위의 범주는 그 안에서의 언급에 의해 규정되며, 명세서에 제시된 특색 및 이점의 구체적 논의에 의해 규정되는 것이 아님에 주목한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "포함하는", "갖는", "비롯한" 및 "함유하는"은, 달리 나타내지 않는 한, 개방형 용어 (즉, "포함하나 이에 제한되지는 않음"을 의미함)로서 해석되어야 한다. 추가적으로, 용어 "포함하는"은 "이루어진"을 포괄한다 (예를 들어 X를 "포함하는" 조성물은 X로 독점적으로 이루어질 수 있거나, 또는 추가의 다른 것, 예를 들어, X+Y를 포함할 수 있음).
측면 및 실시양태의 상세한 설명
단백질 정제 공정을 단순화하고 이를 보다 저렴하게 하기 위해, 본 발명자들은 연속식의 완전 관통이며 단백질 A 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는 새로운 정제 공정을 개발하였다.
본 발명은
(a)
- 용액을 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스 상에 관통 모드로 통과시키는 단계,
- 상기 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스의 관통으로부터 여과된 단백질 용액을 회수하는 단계
를 포함하는 여과 단계;
(b)
- 단계 (a)의 말미에 수득된 여과된 단백질 용액을, 교환을 위해 오직 1종의 완충제만을 사용하여 적어도 1개의 투석여과 막 상에 통과시키는 단계,
- 상기 적어도 1개의 투석여과 막의 부분적으로 정제된 단백질-함유 보유물을 회수하는 단계
를 포함하는 교환 단계;
(c)
- 단계 (b)의 말미에 수득된 보유물을 막 흡착제의 조합물 상에 관통 모드로 통과시키는 단계이며, 여기서 상기 막 흡착제의 조합물의 2개의 막 흡착제는 작용 메카니즘 측면에서 직교하고, 상기 막 흡착제의 조합물은 단계 (b)에서 교환을 위해 사용된 1종의 완충제와 동일한 평형 완충제로 사전에 평형화된 것인 단계,
- 상기 막 흡착제의 조합물의 관통으로부터 정제된 단백질을 회수하는 단계
를 포함하는 폴리싱 단계
를 포함하는, 용액으로부터 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이며;
여기서 상기 정제 방법은 단백질 A 크로마토그래피 단계는 포함하지 않는다.
교환 단계 (b)에서, 표현 "단계 (a)의 말미에 수득된 여과된 단백질 용액을, 교환을 위해 오직 1종의 완충제만을 사용하여 적어도 1개의 투석여과 막 상에 통과시키는 것"은 상기 여과된 단백질 용액 및 1종의 완충제가 적어도 1개의 투석여과 막을 통과한다는 것을 의미한다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 방법은
(a)
(i) 용액을 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스 상에 관통 모드로 통과시키는 단계,
(ii) 상기 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스의 관통으로부터 여과된 단백질 용액을 회수하는 단계
를 포함하는 여과 단계,
(b)
(i) 단계 (a)로부터 수득된 여과된 단백질 용액을, 오직 1종의 완충제만을 사용하여 적어도 1개의 투석여과 막 상에 통과시키는 단계,
(ii) 상기 적어도 1개의 투석여과 막의 부분적으로 정제된 단백질-함유 보유물을 회수하는 단계
를 포함하는 교환 단계;
및
(c)
(i) 평형 완충제를 막 흡착제의 조합물 상에 통과시키는 단계이며, 여기서 상기 평형 완충제는 단계 (b)에서 교환을 위해 사용된 1종의 완충제와 동일한 것인 단계,
(ii) 단계 (b)로부터 수득된 보유물을 막 흡착제의 조합물 상에 관통 모드로 통과시키는 단계,
(iii) 상기 막 흡착제의 조합물의 관통으로부터 정제된 단백질을 회수하는 단계
를 포함하는 폴리싱 단계
를 포함하며,
여기서 상기 정제 방법은 단백질 A 크로마토그래피 단계는 포함하지 않는다.
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명의 상기 방법은 오직 3개의 단계만을 포함하고, 이들 중 어떠한 것도 단백질 A 크로마토그래피 단계는 포함하지 않는다. 본 발명에 따른 방법이 오직 3개의 단계만을 포함하고 단백질 A 크로마토그래피 단계를 포함하지 않더라도, 이는 제약 목적에, 특히 인간에게 투여하는데 적합한 정제된 단백질을 수득하는 것을 가능하게 한다.
정제 공정에서의 인간의 취급의 부재 (및 그 결과 정제 공정을 완료하는데 필요한 전체 시간의 감소)에 더하여, 개시된 방법은 정제를 위해 사용되는 완충제의 양을 감소시키고, 단백질 A 크로마토그래피 단계의 부재는 비용을 감소시킨다. 개시된 정제 방법은 또한, 다양한 mAb의 정제를 가능하게 하는 것에 더하여, mAb 정제를 단순화하고, 전체 수율을 개선시키고, 원료, 저장 시설, 상품의 비용 및 공정 시간을 감소시킨다.
통상적인 단백질 정제 방법과 대조적으로, 상기 언급된 바와 같이, 본원에 개시된 방법은 1종의 특유한 완충제를 사용하며, 이러한 특유한 완충제는 교환 단계에서 사용되고 폴리싱 단계에서 막 흡착제를 평형화시키는데 사용된다.
본원에 사용된 "본 발명에 따른 완충제"는 비스 트리스, 트리스, 트리스-HCl, 포스페이트 및/또는 시트르산을 포함하는 완충제를 지칭한다. 비스 트리스, 트리스 또는 트리스-HCl은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있는 화합물이다:
- 비스 트리스에 대한 그의 IUPAC 명칭은 2-[비스(2-히드록시에틸)아미노]-2-(히드록시메틸)프로판-1,3-디올이고, CAS 번호는 6976-37-0임,
- 트리스에 대해서는 2-아미노-2-(히드록시메틸)프로판-1,3-디올 및 CAS 번호 77-86-1, 및
- 트리스-HCl에 대해서는 2-아미노-2-(히드록시메틸)프로판-1,3-디올 히드로클로라이드 및 CAS 번호 1185-53-1.
본 발명에 따른 이러한 완충제는 교환 완충제, 및 평형 완충제에 상응할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 이러한 완충제는 다양한 농도의 동일한 화학물질 (이들 중 하나는 비스 트리스, 트리스, 트리스-HCl, 포스페이트 및/또는 시트르산임)을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 특정한 실시양태에서, 완충제는 비스 트리스, 트리스, 트리스-HCl, 포스페이트 및/또는 시트르산을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 완충제는 (i) 비스 트리스, 트리스, 또는 트리스-HCl, (ii) 아세트산 및 (iii) 물을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 보다 구체적인 실시양태에서, 완충제는 (i) 비스 트리스, 트리스 또는 트리스-HCl, (ii) 아세트산, (iii) NaCl 및 (iv) 물을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 다른 측면에서, 이러한 완충제는 다양한 농도의 (i) 비스 트리스, 트리스 또는 트리스-HCl, (ii) 아세트산, (iii) NaCl 및 (iv) 물을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
교환 완충제는 예를 들어 아세트산에 의해 pH 6 내지 9 (예를 들어 7.5)로 조정된, 5 내지 40 mM (예를 들어 20 mM) 비스 트리스 및 15 내지 150 mM (예를 들어 75 mM) NaCl을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
대안적으로, 교환 완충제는 아세트산에 의해 pH 6 내지 9 (특히 7.5)로 조정된, 5 내지 40 mM (특히 20 mM) 트리스 또는 트리스-HCl, 15 내지 150 mM (특히 75 mM) NaCl을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
대안적으로, 교환 완충제는 시트르산에 의해 pH 6 내지 9 (특히 7.5)로 조정된, 5 내지 40 mM (특히 20 mM) 트리스 또는 트리스-HCl, 15 내지 150 mM (특히 75 mM) NaCl을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
대안적으로, 교환 완충제는 Na2HPO4/NaH2PO4 (바람직하게는 10 mM / 90 mM Na2HPO4/NaH2PO4에서 90 mM / 10 mM Na2HPO4/NaH2PO4까지)에 의해 pH 6 내지 9 (특히 7.5)로 조정된, 15 내지 150 mM (특히 75 mM) NaCl을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
이러한 교환 완충제는 특히, 교환 단계, 특히 TFF 카세트와 함께 사용하기에 적합하지만, 또한 막 흡착제의 평형화, 특히 양이온 교환 막 흡착제 및 음이온 교환 막 흡착제의 조합물의 평형화에 적합하다.
상기 완충제 제제의 이점은 전통적인 정제 방법에 비해 바람직하지 않은 상호작용을 최소화하고, pH 및 전도성 저하를 제한하고, 증가된 수율을 촉진하면서, 보다 큰 상용성과 함께, mAb 생성물이 방법의 3개의 단계, 특히 교환 단계 및 폴리싱 단계를 통과하게 하는 능력을 포함한다. 이러한 완충제 제제의 사용은 3개의 단계 (a), (b) 및 (c) 사이에 임의의 중간 저장 없이 방법을 구현하는 것을 가능하게 한다.
따라서, 특정한 실시양태에서, 방법은 3개의 단계 (a), (b) 및 (c) 사이에 임의의 중간 저장을 포함하지 않는다.
폴리싱 단계의 막 흡착제가 재사용될 때, 소독 완충제가 임의로 사용될 수 있다. 이러한 소독 완충제는 적어도 NaOH, 보다 바람직하게는 0.05 N 내지 1 N (예를 들어 0.5 N) NaOH를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 하기를 지칭한다:
1) a) 자연-발생 및 구체적으로 비-재조합 세포, 또는 b) 유전자-조작 또는 재조합 세포에 의해 생산된 단백질인 천연 단백질의 서열을 갖는 분자, 또는
2) 1개 이상의 아미노산의 결실, 부가, 및/또는 치환에 의해 및/또는 적어도 1개의 번역후 변형 (예를 들어 글리코실화)에 의해 천연 단백질의 서열과 상이한 분자.
상기 단락 1)에서 언급된 분자는 천연 단백질을 지칭할 수 있다.
상기 단락 2)에서 언급된 분자는 비-천연 단백질이다.
특정 측면에서, 정제될 단백질은 항체이다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 무손상 항체, 또는 특이적 결합에 대해 무손상 항체와 경쟁하는 그의 결합 단편을 지칭한다. 결합 단편은 F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv, 단일-도메인 항체 예컨대 VHH 항체 (나노바디) 및 단일쇄 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 용어 "중쇄"는 항원에 대한 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 임의의 이뮤노글로불린 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "중쇄"는 전장 중쇄 및 그의 단편을 포함한다. 전장 중쇄는 가변 영역 도메인, VH, 및 3개의 불변 영역 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. VH 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 위치하고, CH3 도메인은 카르복실-말단에 위치한다.
본원에 사용된 용어 "경쇄"는 전장 경쇄 및 그의 단편을 포괄한다. 전장 경쇄는 가변 영역 도메인, VL, 및 불변 영역 도메인, CL을 포함한다. 중쇄와 마찬가지로, 경쇄의 가변 영역 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 위치한다. 본원에 사용된 용어 "경쇄"는 항원에 대한 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 임의의 이뮤노글로불린 폴리펩티드를 포함한다.
자연 발생 항체 구조 단위는 전형적으로 사량체를 포함한다. 각각의 이러한 사량체는 전형적으로 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성되고, 각각의 쌍은 1개의 전장 경쇄 (전형적으로 약 25 kDa의 분자량을 가짐) 및 1개의 전장 중쇄 (전형적으로 약 50-70 kDa의 분자량을 가짐)를 갖는다. 각각의 경쇄 및 중쇄의 아미노-말단 부분은 전형적으로, 항원 인식을 전형적으로 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 쇄의 카르복시-말단 부분은 전형적으로, 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 규정한다. 인간 경쇄는 전형적으로 카파 및 람다 경쇄로서 분류된다. 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로서 규정한다. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하나 이에 제한되지는 않는 여러 하위부류를 갖는다. IgM은 IgM1 및 IgM2를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하위부류를 갖는다. IgA는 유사하게는 IgA1 및 IgA2를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하위부류로 세분된다. 전장 경쇄 및 중쇄 내에서, 전형적으로 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다.
각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 전형적으로 항원-결합 부위를 형성한다. 가변 영역은 전형적으로, 상보성 결정 영역 또는 CDR로도 지칭되는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 비교적 보존된 프레임워크 영역 (FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각각의 쌍의 2개의 쇄로부터의 CDR은 전형적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되고, 이는 특이적 에피토프에 결합하는 것을 가능하게 할 수 있다. N-말단에서 C-말단으로, 경쇄 및 중쇄 가변 영역 둘 다는 전형적으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4를 포함한다. 각각의 도메인에의 아미노산의 배정은 전형적으로 문헌 [Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]의 정의에 따른다. 이중특이적 또는 이중기능적 항체는 전형적으로 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다.
F(ab) 단편은 1개의 경쇄, 및 1개의 중쇄의 CH1 및 가변 영역으로 구성된다. F(ab) 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 디술피드 결합을 형성할 수 없다. F(ab') 단편은 쇄간 디술피드 결합이 2개의 중쇄 사이에 형성되어 F(ab')2 분자를 형성할 수 있도록 CH1 및 CH2 도메인 사이에 보다 많은 불변 영역을 함유하는 1개의 경쇄 및 1개의 중쇄를 함유한다. Fv 영역은 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역은 결여되어 있다. 단일쇄 항체는 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 가요성 링커에 의해 연결되어 항원-결합 영역을 형성하는 단일 폴리펩티드 쇄를 형성한 Fv 분자이다. 특정 실시양태에서, "다중특이적" 또는 "다중기능적" 항체 이외의 2가 항체는 동일한 항원 특이성을 갖는 결합 부위를 포함하는 것으로 이해된다.
개시된 방법에 의해 정제될 수 있는 모노클로날 항체 (mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 체세포 혼성화 기술을 비롯한 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다. 체세포 혼성화 절차가 바람직할지라도, 원칙적으로, 모노클로날 항체를 생산하는 다른 기술, 예를 들어 B-림프구의 바이러스 또는 종양원성 형질전환이 사용될 수 있다. 모노클로날 항체는, 예를 들어 뮤린, 키메라, 인간화 또는 완전 인간 항체에 상응할 수 있다.
또한 본 발명의 방법에 의해 정제될 수 있는 항체의 비제한적 예는 파니투무맙, 오말리주맙, 아바고보맙, 압식시맙, 악톡수맙, 아달리무맙, 아데카투무맙, 아펠리모맙, 아푸투주맙, 알라치주맙, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 알투모맙, 아마툭시맙, 아나투모맙, 아폴리주맙, 아티누맙, 토실리주맙, 바실릭시맙, 벡투모맙, 벨리무맙, 베바시주맙, 비시로맙, 카나키누맙, 세툭시맙, 다클리주맙, 데노수맙, 에쿨리주맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에펀구맙, 에르투막소맙, 에타라시주맙, 에타네르셉트, 골리무맙, 인플릭시맙, 나탈리주맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 페르투주맙, 라니비주맙, 리툭시맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 두필루맙, 사릴루맙 또는 프레솔리무맙을 포함한다.
특정 측면에서, 정제될 단백질은 효소이다.
본 발명의 방법에 의해 정제될 수 있는 효소의 비제한적 예는 산 α-글루코시다제, α-L-이두로니다제, 이두로네이트 술파타제, 헤파란 N-술파타제, 갈락토스-6-술파타제, 산 β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제, α-N-아세틸갈락토사미니다제 (α-갈락토시다제 B), 산 리파제, 리소솜 산 세라미다제, 산 스핑고미엘리나제, β-글루코시다제, 갈락토실세라미다제, α-갈락토시다제 A, 산 β-갈락토시다제, β- 갈락토시다제, 뉴라미니다제, 헥소사미니다제 A 또는 헥소사미니다제 B를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 정제될 수 있는 단백질의 다른 비제한적 예는 인간 에리트로포이에틴, 종양 괴사 인자 (예를 들어 TNF-α, TNF-β 또는 TNF-K), 인터페론 알파 또는 인터페론 베타를 포함한다.
정제될 단백질을 함유하는 용액은 배양 배지, 바람직하게는 정화된 배양 배지일 수 있다. 정제될 단백질을 함유하는 용액은 예를 들어 관류 생물반응기 또는 유가식 생물반응기에서 수득된 배양 배지이다.
관류 생물반응기 또는 유가식 생물반응기의 예는 미국 특허 출원 US 2014/255994, US 2015/232505, US 2015/183821 및 US 2017/218012 및 국제 출원 WO2014/137903에 개시되어 있다 (그 전문은 본원에 참조로 포함됨).
용어 "정화된 배양 배지"는, 포유동물, 박테리아 또는 효모 세포가 실질적으로 부재하는 (예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 99% 부재하는) 포유동물, 박테리아 또는 효모 세포 배양물로부터 수득된 액체 배양 배지를 의미한다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 방법의 제1 여과 단계는 세포 배양물 회수 동안 정화된 배양 배지를 수득하기 위해 사용되는 정화 단계에 통합될 수 있고, 그에 의해 상기 여과 단계는 정화 단계의 일부가 된다.
본원에 사용된 어구 "단백질을 회수하는 것"은 개시된 정제 방법을 사용한 후 단백질을 수집하는 것을 지칭한다.
본 발명의 문맥에서, 표현 "킬레이트화제"는 정제 공정에서 혼합물에 존재하는 오염물 분자를 정제될 표적 분자로부터 분리하기 위한 흡수제로서 작용하는, 임의의 종류의 미립자 흡착제 매체 또는 고정된 리간드, 예컨대 활성탄, 규조토, 비드 수지를 지칭한다. 표현 "킬레이트화제 매트릭스"는 단백질 A 매트릭스를 포함하지 않는다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스는 미립자 흡착제 매체이다.
적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스는 칼럼, 필터의 형태일 수 있거나, 또는 정제될 생성물 내에 분말로서 첨가될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 문맥에서 사용되는 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스는 정제될 생성물 내에 분말로서 첨가된다.
개시된 방법의 특정한 실시양태에서, 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스는 활성탄 필터이다. 개시된 방법의 다른 특정한 실시양태에서, 적어도 1개의 킬레이트화제는 수지이다.
적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스, 특히 활성탄 필터 또는 수지 매체는 오염물과 상호작용하여 높은 불순물 제거 효율을 발생시킨다. 킬레이트화제 매트릭스를 사용하는 것, 특히 활성탄 또는 수지를 사용하는 것의 또 다른 이점은 모노클로날 항체에 대한 낮은 친화도이다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 여과 단계의 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스는 활성탄, 규조토, 유리 양이온 교환 수지, 유리 음이온 교환 수지, 및 유리 혼합 모드 수지로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시양태에서, 적어도 1종의 킬레이트화제 매트릭스는 2개의 상이한 킬레이트화제 매트릭스의 조합물이다. 보다 특정한 실시양태에서, 2개의 상이한 킬레이트화제 매트릭스의 조합물은 활성탄, 특히 활성탄 필터, 및 유리 음이온 교환 수지의 조합물이다.
개시된 방법의 특정한 실시양태에서, 활성탄 필터는 제타 플러스(Zeta Plus) 35SP (3M에 의해 시판됨), 제타 플러스 53SP (3M에 의해 시판됨), 밀리스타크(Millistak) CR40 (밀리포어(Millipore)에 의해 시판됨) 또는 제타 플러스 55SP 등급 (3M에 의해 시판됨)이다.
개시된 방법의 또 다른 특정한 실시양태에서, 유리 음이온 교환 수지는 NH2-750F (도소(Tosoh)에 의해 시판됨) 또는 엠파제(Emphaze) AEX (3M에 의해 시판됨)이다. 수지 NH2-750F의 특징이 하기 요약된다.
본 발명의 문맥에서, 표현 "투석여과"는 용액으로부터 염 또는 용매를 완전히 제거하거나, 대체하거나, 또는 그의 농도를 낮추기 위해 한외여과 막을 사용하는 기술을 지칭한다.
본원에 사용된 "한외여과" 또는 "UF"는 입자 크기 및 UF 막의 세공 크기에 기초하여 용액으로부터 입자 및/또는 이온을 물리적으로 및 선택적으로 제거하기 위해 반투과성 막을 사용하는 여과 기술을 지칭한다.
한 실시양태에서, 교환 단계의 적어도 1개의 투석여과 막은 단일 경로 접선 흐름 여과 (SPTFF) 모듈 또는 접선 흐름 여과 (TFF) 모듈이다. 특정한 실시양태에서, 교환 단계의 적어도 1개의 투석여과 막은 카세트, 중공 섬유 또는 나선형 권취 형태이다.
개시된 방법의 특정한 실시양태에서, 교환 단계의 적어도 1개의 투석여과 막은 레디 투 프로세스(Ready To Process) 중공 섬유 카트리지 30kDa (GE에 의해 시판됨)이다.
개시된 방법의 특정한 실시양태에서, 교환 단계의 적어도 1개의 투석여과 막은 카덴스 인라인 디아필트레이션(Cadence Inline Diafiltration) (폴(Pall)에 의해 시판됨)이다.
한 실시양태에서, 카덴스 인라인 콘센트레이터(Cadence Inline Concentrator) (폴에 의해 시판됨)가 교환 단계의 적어도 1개의 투석여과 막에 선행하거나 후속한다.
개시된 방법의 또 다른 특정한 실시양태에서, 교환 단계의 적어도 1개의 투석여과 막은 펠리콘(Pellicon) 카세트 (밀리포어에 의해 시판됨) 또는 사르토콘(Sartocon) 카세트 (사르토리우스(Sartorius)에 의해 시판됨)이다.
교환 단계는 유리하게는 여과된 단백질 용액을 정제하는 것 및 농축시키는 것 둘 다를 가능하게 한다. 표현 "여과된 단백질 용액을 농축시키는 것"은, 본원에서, 부분적으로 정제된 보유물 내의 단백질의 농도가 여과된 단백질 용액 내의 그의 농도에 비해 증가되는 것을 의미한다.
본 발명의 문맥에서, "막 흡착제"는 친화성 기 및 이온 교환 기와 같은 관능기를 보유하는 중합체, 특히 아크릴 중합체, 또는 섬유 또는 부직 매체의 편평한 시트를 지칭한다. 수지와 막 사이의 차이 중 하나는 유동 분포로: 수지의 경우는 확산에 의하고, 막에서는 대류에 의한다.
폴리싱 단계에 사용되는 막 흡착제의 조합물은 작용 메카니즘 측면에서 직교하는 적어도 2가지 종류의 막 흡착제의 사용을 수반한다.
본 발명의 문맥에서, 표현 "작용 메카니즘 측면에서 직교하는 막 흡착제"는 사용되는 막 흡착제가 반대되거나 별개의 작용 메카니즘, 예컨대 양이온 교환 및 음이온 교환 상호작용, 다중 모드 및 음이온 교환 상호작용, 양이온 교환 및 소수성 상호작용, 또는 음이온 교환 및 소수성 상호작용을 갖고, 단독 통합 단계로서 작용하는 것, 즉 단일 여과 단계인 것처럼 함께 가공되는 것을 의미한다.
실제로, 본 발명자들은 이러한 막 흡착제의 조합물의 사용이 관심 생성물의 흡착은 최소화하면서 불순물을 포획할 수 있다는 것을 관찰하였다.
바람직한 실시양태에서 폴리싱 단계의 막 흡착제의 조합물 내에 2개 초과의 막 흡착제, 즉 총 3, 4개 또는 4개 초과의 막 흡착제에 대해 적어도 1개의 추가의 막 흡착제가 사용되는 경우에, 상기 적어도 1개의 추가의 막 흡착제는 작용 메카니즘 측면에서 직교하는 2개의 막 흡착제와 비교하여 상이한 작용 메카니즘을 갖는 막이고; 이러한 총 2개 초과의 막 흡착제는 여전히 단독의 통합된 단일 단계로서 간주된다.
비제한적 예로서, 상기 적어도 1개의 추가의 막 흡착제는, 작용 메카니즘 측면에서 직교하는 2개의 막 흡착제가 각각 양이온 교환 및 음이온 교환 상호작용을 갖는 경우에, 소수성 상호작용 또는 다중 모드 상호작용을 갖는다.
본 발명의 문맥에서, 막 흡착제는 특히 단독 통합 단계로서 조합된다. 따라서, 단계 및 완충제의 수는 대폭 감소된다. 조정 및 조작이 또한 제거되어, 전체 공정이 단순화된다. 특히, 막 흡착제의 조합물의 하나의 막 흡착제와 막 흡착제의 이러한 조합물의 다른 막 흡착제(들) 사이에 용리, 조정 또는 저장 단계가 존재하지 않는다.
특정한 실시양태에서, 폴리싱 단계의 막 흡착제의 특정 조합 및 작동 조건 (특히 pH, 전도성 및/또는 완충제)은 정제될 단백질의 물리화학적 특성 (예를 들어, pI, 분자량, …)에 따라 결정된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해할 바와 같이, 폴리싱 단계의 최적의 조건은 관심 단백질의 최대 수율을 수득하는 것을 가능하게 해야하고, 즉 막 흡착제의 조합물의 막 흡착제 사이에 어떠한 조정 또는 용리 단계 없이, 오염물은 최대로 제거되게 하면서, 즉 오염물과 막 흡착제의 조합물의 상호작용은 최대가 되게 하면서 관심 단백질과 막 흡착제의 조합물의 상호작용은 최소가 되게 해야한다.
폴리싱 단계를 위한 2개의 막 흡착제의 최적 조합의 결정의 예를 도 3에 예시한다. 이 실시예에서, 사토바인드(Sartobind) S 및 사토바인드 STIC 막 흡착제의 조합물을 사용하여 최상의 정제 성능을 수득하였고, 이는 항체 수율은 최대화하면서 보다 높은 오염물 클리어런스 (보다 낮은 HCP 및 HMW)를 가졌다. 수율 및 오염물 제거에 대한 로딩 용량의 영향이 또한 이 도면에 제시된다.
본 발명의 문맥에서, 이들 최적 조건을 결정하기 위해, 막 흡착제의 조합물의 막 흡착제는 단일 개체 또는 단독 통합 단계로서 간주되어야 하며, 즉 이들은 그것이 단일 여과 단계인 것처럼 함께 가공된다. 예를 들어, 2개의 막 흡착제의 경우에, 2개의 막 흡착제를 사용하는 경우 최적 조건을 결정하는 통상적인 방법은 제1 막 흡착제에 대해 최상의 조건을 결정하는 것, 이어서 제2 막 흡착제에 대해 최상의 조건을 결정하는 것, 및 이어서 둘 다의 최상의 조건 사이에서 생성물을 조정하는 것 (예컨대, pH 조정, 전도성 조정 또는 완충제 조정)을 수반하는 반면에, 본 발명의 문맥에서 2개의 막 흡착제는 단지 1개로서 간주되고, 여전히 우수한 정제를 수득할 수 있으면서 2개의 막 흡착제의 분리 거동에 대한 절충안이 결정되어야 한다.
전형적으로, 주어진 단백질의 정제를 위해 사용될 최적화된 완충제를 결정할 때, 교환 단계는 중성 완충제를 사용하여 수행될 수 있고, 보유물을 포함하는 용액의 pH 및 전도성은 폴리싱 단계 동안의 최적의 정제 조건을 결정하기 위해 수동으로 조정될 수 있다. 최적 조건이 결정되면, 공정은 교환 단계에 적절한 완충제를 사용하여 다시 수행될 수 있고, 이는 폴리싱 단계에 사용되는 평형 완충제에 상응할 것이다.
폴리싱 단계에 사용되는 2개의 막 흡착제의 조합물에 따른 최적의 완충제 (예컨대 완충제의 전도성 또는 pH) 및 관심 단백질의 pI의 결정의 예가 도 4에 예시된다. 이러한 실시예에서, 유리한 정제를 수득할 수 있는 pH 및 전도성 조건 (50 내지 500 ng/ml를 포함하는 HCP 수준에 상응함)은 각각의 플롯의 흑색 면적에 상응한다.
본 발명의 문맥에서, 적어도 2개의 막 흡착제의 평형을 위해 사용되는 1종의 완충제는 교환 단계에 사용되는 완충제와 동일하다. 이는 대부분의 오염물을 보유하면서 수율을 최대화하기 위해 정제될 단백질이 바로 관통되는 것을 가능하게 한다.
특정한 실시양태에서, 폴리싱 단계는 교환 단계 동안 단백질을 조건화하는데 사용되는 완충제의 pH 및 전도성을 변동시키는 것에 의해 최적화된다.
특정한 실시양태에서, 폴리싱 단계는 음이온 교환 막 흡착제 매트릭스와 조합된 양이온 교환 막 흡착제 매트릭스의 사용을 포함한다. 다른 실시양태에서, 폴리싱 단계는 음이온 교환 막 흡착제 매트릭스와 조합된 다중 모드 (혼합 모드) 막 흡착제 매트릭스의 사용을 포함한다.
막 흡착제 매트릭스의 조합물, 특히 양이온 교환 막 흡착제 및 음이온 교환 막 흡착제의 조합물은 막 흡착제와 오염물 사이의 상호작용을 통해 기능하여, 불순물의 높은 효율적인 제거를 발생시킨다. 오염물과의 상호작용은 여러 메카니즘: 이온성, 소수성, 반 데르 발스 및 수소 결합 상호작용에 기인한다.
특정한 실시양태에서, 양이온 교환 막 흡착제는 사토바인드 S 막 흡착제 (사르토리우스), HD-C 막 흡착제 (나트릭스(Natrix))이다. 구체적 실시양태에서, 양이온 교환 막 흡착제는 사토바인드 S 막 흡착제 (사르토리우스)이다. 특정한 실시양태에서, 음이온 교환 막 흡착제는 사토바인드 STIC 막 흡착제 (사르토리우스), 사토바인드 Q 막 흡착제 (사르토리우스), 또는 HD-Q 막 흡착제 (나트릭스)이다. 구체적 실시양태에서, 음이온 교환 막 흡착제는 사토바인드 STIC 막 흡착제 (사르토리우스) 또는 사토바인드 Q 막 흡착제 (사르토리우스)이다. 다른 실시양태에서, 다중 모드 막 흡착제는 HD-Sb 막 흡착제 (나트릭스)이다. 다른 실시양태에서, 소수성 상호작용 막 흡착제는 사토바인드 페닐 막 흡착제 (사르토리우스)이다.
특정한 실시양태에서, 막 흡착제의 조합물은 사토바인드 S 막 흡착제 (사르토리우스) 및 사토바인드 STIC 막 흡착제 (사르토리우스)의 조합물이다.
본 발명의 방법의 폴리싱 단계에서 칼럼보다 막 흡착제를 사용하는 것의 주요 이점을 하기 요약한다:
- 대등한 규모에서, 막 흡착제는 칼럼보다 10배 더 높은 유량으로 사용될 수 있고, 이에 의해 공정의 지속기간이 대폭 감소될 수 있다. 예를 들어, 수지로 패킹된 5 mL-칼럼은 1 ml/분의 유량으로 사용될 것인 반면에, 상응하는 5 mL-막 흡착제는 10 ml/분의 최소 유속으로 사용될 것이다. 따라서, 폴리싱을 위한 2개의 크로마토그래피 단계를 사용하는 전통적인 공정이 수지로 패킹된 2개의 칼럼을 사용하여 2시간 30분으로 수행될 경우에, 막 흡착제를 사용한 것은 15분 미만 내에 완료될 수 있다.
- 심지어 재사용가능하더라도, 막 흡착제는 일회용 장치이고, 따라서 배치 후 폐기될 수 있고 장기간에 걸쳐 저장될 필요가 없다. 따라서, 장기간 안정성을 보장하기 위해 이것을 시험할 필요가 없다.
- 막 흡착제를 사용하는 것은 칼럼 비용, 칼럼 패킹 및 칼럼 저장을 피함으로써 저렴하다.
특정한 실시양태에서, 막 흡착제의 조합물이 사토바인드 S 막 흡착제 (사르토리우스) 및 사토바인드 STIC 막 흡착제 (사르토리우스)의 조합물인 경우에, 1종의 완충제는 도 4의 상부 패널의 흑색 영역에 개시된 범위의 pH 및 전도성을 갖는다.
또 다른 특정한 실시양태에서, 막 흡착제의 조합물이 사토바인드 S 막 흡착제 (사르토리우스) 및 사토바인드 Q 막 흡착제 (사르토리우스)의 조합물인 경우에, 1종의 완충제는 도 4의 하부 패널의 흑색 영역에 개시된 범위의 pH 및 전도성을 갖는다.
본 발명에 따른 정제 방법은 완전 관통 정제 방법이다.
"완전 관통 정제 방법"은 본원에서, 방법의 상이한 정제 단계가 모두 오직 불순물의 결합만을 수반하고, 관심 단백질은 정제 단계를 통과하게 둔다는 것을 의미한다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 여과 단계의 말미의 여과된 단백질 용액의 pH 및/또는 교환 단계의 말미의 보유물의 pH를 조정하는 것은 포함하지 않는다.
특정한 실시양태에서, 여과 단계의 말미에 수득된 여과된 단백질 용액은 투석여과 막을 바로 통과한다. 보다 구체적으로, 2개의 단계 사이에 어떠한 처리 (예컨대 pH 조정, 완충제 교환 또는 희석)도 이어서 수행되지 않는다. 이러한 방법에서, 투석여과 막은 예를 들어 레디 투 프로세스 30 kD 중공 섬유 모듈 또는 카덴스 인라인 디아필트레이션 모듈에 상응할 수 있고, 이는 예를 들어 카덴스 인라인 콘센트레이터에 선행하거나 후속할 수 있다. 추가적으로, 특정한 실시양태에서, 교환 단계의 말미에 수득된 보유물은 폴리싱 단계의 막 흡착제의 조합물을 바로 통과한다. 보다 구체적으로, 2개의 단계 사이에 어떠한 처리 (예컨대 pH 조정, 완충제 교환 또는 희석)도 이어서 수행되지 않는다. 이러한 방법에서, 투석여과 막은 예를 들어 레디 투 프로세스 30 kD 중공 섬유 모듈에 상응할 수 있고/거나 막 흡착제의 조합물은 예를 들어 사토바인드 S 막 흡착제 및 사토바인드 STIC 막 흡착제의 조합물에 상응할 수 있다.
이러한 방법에서, 수동 개입 및 정제 시스템의 개방을 필요로 하는 단계간 처리 (예를 들어, 희석, 전도성 조정 및 pH 조정)는 완전히 부재한다.
따라서, 본 발명의 방법은 다중 펌프 및 상호접속 센서 및 3개의 정제 단계의 순차적 또는 연속적 작동을 위한 스위칭 밸브를 포함하는, 가요성 자동화 크로마토그래피 시스템으로 수행될 수 있다.
다중-작동 시스템의 비제한적 예는 적절하게 적합화된 다중-칼럼 크로마토그래피 시스템 MCCS이다.
본 발명의 방법은 연속식 모드로 실행될 수 있다. 다시 말해서, 본 발명의 방법은 용액으로부터 단백질을 정제하기 위한 연속식 방법일 수 있다.
용어 "연속식 방법" 또는 "연속식 모드의 방법"은 시스템의 적어도 하나의 부분을 통해 유체를 연속적으로 공급하는 방법을 의미한다.
용어 "유체"는 본원에서, 임의의 액체, 예컨대 정제될 단백질을 함유하는 용액, 완충제 또는 바이러스 불활성화를 위한 낮은 또는 산성 pH 용액을 의미한다.
특정한 실시양태에서, 제1, 제2 및 제3 정제 단계를 통해 유체가 연속적으로 공급된다.
용어 "통합 공정"은 특정 결과 (예를 들어, 액체 배양 배지로부터 정제된 단백질의 생성)를 달성하기 위해 협동하여 기능하는 구조적 요소를 사용하여 수행되는 공정을 의미한다.
또한, 본 발명의 방법은 방법의 제1 단계로부터 마지막 단계까지 폐쇄된 시스템 내에서 실행될 수 있다. 다시 말해서, 본 발명의 방법은 바람직하게는 기능적으로 폐쇄된 유동경로를 갖는다. 특히, 3개의 정제 단계 및 임의적인 여과 단계(들) (예를 들어, 나노여과 단계 및/또는 최종 한외여과 및/또는 투석여과 단계)는 폐쇄된 시스템 내에서 실행될 수 있다. 본 발명의 방법의 구체적 실시양태에서, 단백질을 포함하는 용액은 3개의 정제 단계에 걸쳐 일부씩 통과하고, 용액의 일부의 각각의 통과는 실행에 상응한다. 이어서, 각각의 실행의 말미에 회수된 단백질을 수집하고 풀링한다. 이러한 방법에서, 정제 단계의 막 흡착제는 수회 사용되고, 임의로 예를 들어 상기 규정된 바와 같은 소독 완충제를 사용하여 소독되며, 그에 의해 막 흡착제 장치의 부피 및 필요한 완충제가 감소될 수 있다. 예를 들어, 일련의 3 내지 50회 실행 (예를 들어 3 내지 30회 실행, 5 내지 25회 실행, 10 내지 20회 실행, 또는 15회 실행)은 연속적으로 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8회의 실행을 연속식 모드로 수행한 후, 막 흡착제를 (예를 들어, 소독 완충제를 사용하여) 소독할 수 있다. 이는 도 2에 예시된 바와 같이 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 초과로 반복될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 정제된 단백질을 회수하는데 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "정제된"은 단백질의 시험관내, 생체외, 또는 생체내에서의 효과적인 사용을 가능하게 하는 순도를 지칭한다. 단백질이 시험관내, 생체외, 또는 생체내 적용에 유용하기 위해서는 이러한 적용에 그러한 단백질을 사용하는 것을 방해할 수 있거나, 또는 적어도 관심 단백질과 함께 포함되는데 바람직하지 않을 오염물, 다른 단백질, 및/또는 화학물질이 실질적으로 없어야 한다. 이러한 적용은 치료 조성물의 제조, 치료 조성물 중의 단백질의 투여, 및 본원에 개시된 다른 방법을 포함한다. 바람직하게는, 본원에 언급된 바와 같은 "정제된" 단백질은 임의의 방법에 의해 (즉, 천연 공급원으로부터의 직접 정제에 의해, 재조합적으로, 또는 합성적으로) 생산될 수 있고, 다른 단백질 성분으로부터 정제된 단백질로, 단백질은 적어도 약 70% 중량/주어진 조성물 중 총 단백질의 중량, 및 보다 바람직하게는, 적어도 약 80% 또는 적어도 약 85%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 90%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 91%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 92%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 93%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 94%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 96%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 97%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 98%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 99% 중량/주어진 조성물 중 총 단백질의 중량을 구성한다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 방법은
(a)
(i) 용액을 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스 상에 관통 모드로 통과시키는 단계,
(ii) 상기 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스의 관통으로부터 여과된 단백질 용액을 회수하는 단계
를 포함하는 여과 단계,
(b)
(i) 단계 (a)로부터 수득된 여과된 단백질 용액 및 1종의 완충제를 적어도 1개의 투석여과 막 상에 통과시키는 단계,
(ii) 상기 적어도 1개의 투석여과 막의 부분적으로 정제된 단백질-함유 보유물을 회수하는 단계
를 포함하는 교환 단계;
및
(c)
(i) 평형 완충제를 막 흡착제의 조합물 상에 통과시키는 단계이며, 여기서 상기 평형 완충제는 단계 (b)에서 교환을 위해 사용된 1종의 완충제와 동일한 것인 단계,
(ii) 단계 (b)로부터 수득된 보유물을 막 흡착제의 조합물 상에 관통 모드로 통과시키는 단계,
(iii) 상기 막 흡착제의 조합물의 관통으로부터 정제된 단백질을 회수하는 단계
를 포함하는 폴리싱 단계
를 포함하며,
여기서 상기 정제 방법은 단백질 A 크로마토그래피 단계는 포함하지 않고,
여기서 1종의 완충제는
- 아세트산에 의해 pH 6 내지 9 (예를 들어 7.5)로 조정된, 5 내지 40 mM (예를 들어 20 mM) 비스 트리스 및 15 내지 150 mM (예를 들어 75 mM) NaCl,
- 아세트산에 의해 pH 6 내지 9 (예를 들어 7.5)로 조정된, 5 내지 40 mM (예를 들어 20 mM) 트리스 또는 트리스-HCl, 15 내지 150 mM (예를 들어 75 mM) NaCl,
- 시트르산에 의해 pH 6 내지 9 (예를 들어 7.5)로 조정된, 5 내지 40 mM (예를 들어 20 mM) 트리스 또는 트리스-HCl, 15 내지 150 mM (예를 들어 75 mM) NaCl, 또는
- Na2HPO4/NaH2PO4 (바람직하게는 10 mM / 90 mM Na2HPO4/NaH2PO4에서 90 mM / 10 mM Na2HPO4/NaH2PO4까지)에 의해 pH 6 내지 9 (예를 들어 7.5)로 조정된, 15 내지 150 mM (예를 들어 75 mM) NaCl
을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
단백질을 용액으로부터 정제하는 방법은, 폴리싱 단계 후에, 적어도 추가의 최종 여과 단계, 예컨대 나노여과 단계, 한외여과 단계 및/또는 투석여과 단계를 포함할 수 있다. 제약 목적을 위한 재조합 단백질을 정제하는 경우에, 폴리싱 단계에 후속하여 전형적으로 추가의 최종 여과 단계가 이어진다. 따라서, 본 발명의 방법은 단계 (c) 후에 나노여과 단계를 추가로 포함할 수 있다. 한외여과 및 투석여과 단계가 나노여과 단계 후에 추가로 수행될 수 있다. 본원에 사용된 "한외여과" 또는 "UF"는 입자 크기 및 UF 막의 세공 크기에 기초하여 용액으로부터 입자 및/또는 이온을 물리적으로 및 선택적으로 제거하기 위해 반투과성 막을 사용하는 여과 기술을 지칭한다. 본원에 사용된 "나노여과"는, 예를 들어 바이러스 입자를 제거하는데 사용되는 나노필터를 통한 용액의 여과를 지칭한다. 본원에 사용된 "투석여과"는 용액으로부터 염 또는 용매를 완전히 제거하거나, 대체하거나, 또는 그의 농도를 낮추기 위해 한외여과 막을 사용하는 기술을 지칭한다.
본 발명의 방법은 또한 적어도 1개의 바이러스 불활성화 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 적어도 1개의 바이러스 불활성화 단계는 본 발명의 방법의 임의의 단계에서, 예를 들어 단계 (a) 전에, 단계 (a) 후에, 단계 (b) 후에, 단계 (c) 후에, 나노여과 단계 후에 및/또는 한외여과 및/또는 투석여과 단계 후에 수행될 수 있다. 이러한 바이러스 불활성화 단계는 전형적으로 낮은 또는 산성 pH 불활성화 단계일 수 있다. 본원에 사용된 "낮은 또는 산성 pH 불활성화"는 바이러스, 특히 외피보유 바이러스를 변성시키기 위해 산성 pH를 사용하는 바이러스 불활성화 기술을 지칭한다. 전형적으로, 낮은 또는 산성 pH 불활성화 단계는 회수된 단백질을 약 3.0 내지 5.0 (예를 들어, 약 3.5 내지 약 4.5, 약 3.5 내지 약 4.25, 약 3.5 내지 약 4.0, 예를 들어 4.0)의 pH에서 적어도 15분의 기간 (예를 들어, 15분 내지 1 시간의 기간, 약 30분 내지 2시간의 기간, 또는 약 45분 내지 2시간의 기간) 동안 인큐베이션함으로써 수행된다. 예를 들어, 낮은 또는 산성 pH 불활성화 단계는 회수된 단백질을 pH 4에서 예를 들어 30분 내지 2시간 동안 인큐베이션함으로써 수행된다.
본 발명의 방법은 또한, 단계 (a) 전에, 세포를 제거하기 위해 정화되고 세포를 실질적으로 함유하지 않는, 정제될 단백질을 함유하는 액체 배양 배지를 제공하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 상기 액체 배양 배지는 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스 상에 공급된다.
예를 들어, 용액으로부터 단백질을 정제하기 위한 본 발명의 방법은
(a-전) 세포를 제거하기 위해 정화되고 세포를 실질적으로 함유하지 않는, 정제될 단백질을 함유하는 액체 배양 배지를 제공하는 단계,
(a)
- 단계 (a-전)의 상기 액체 배양 배지를 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스 상에 관통 모드로 통과시키는 단계;
- 상기 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스의 관통으로부터 여과된 단백질 용액을 회수하는 단계
를 포함하는 여과 단계;
(b)
- 단계 (a)의 말미에 수득된 여과된 단백질 용액을, 교환을 위해 오직 1종의 완충제만을 사용하여 적어도 1개의 투석여과 막 상에 통과시키는 단계;
- 상기 적어도 1개의 투석여과 막의 부분적으로 정제된 단백질-함유 보유물을 회수하는 단계
를 포함하는 교환 단계; 및
(c)
- 단계 (b)의 말미에 수득된 보유물을 막 흡착제의 조합물 상에 관통 모드로 통과시키는 단계이며, 여기서 상기 막 흡착제의 조합물의 2개의 막 흡착제는 작용 메카니즘 측면에서 직교하고, 상기 막 흡착제의 조합물은 단계 (b)에서 교환을 위해 사용된 1종의 완충제와 동일한 평형 완충제로 사전에 평형화된 것인 단계;
- 상기 막 흡착제의 조합물의 관통으로부터 정제된 단백질을 회수하는 단계
를 포함하는 폴리싱 단계
를 포함할 수 있으며;
여기서 상기 정제 방법은 단백질 A 크로마토그래피 단계는 포함하지 않는다.
마지막으로, 정제된 단백질은 저장에 적합한 조성물로, 및/또는 특히 동물 및/또는 인간에게 투여하기에 적합한 제약 조성물로 제제화될 수 있다.
개시된 방법의 수많은 이점 중 하나는, 이것이 고도로 순수한 단백질을 우수한 수율로 수득가능하게 한다는 것이다. 본 발명의 방법에 의해 회수된 정제된 단백질은 예를 들어 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.2%, 99.5%, 또는 99.9%의 순도를 나타낼 수 있다. 보다 특히, 개시된 방법의 수많은 이점 중 하나는, 이것이 감소된 양의 오염 DNA를 함유하는 고도로 순수한 단백질의, 고분자량 (HMW) 종의 (이는 단백질 응집체에 상응함) 및/또는 숙주 세포 단백질 (HCP)의 용액을 수득가능하게 한다는 것이다. 본 발명의 방법에 의해 회수된 정제된 단백질을 포함하는 용액은 예를 들어 0.4 ppb 미만, 0.3 ppb 미만, 0.2 ppb 미만 또는 0.1 ppb 미만의 오염 DNA의 양을 나타낼 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 회수된 정제된 단백질을 포함하는 용액은 또한 예를 들어 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만 또는 0.1% 미만의 HMW 종의 농도를 나타낼 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 회수된 정제된 단백질을 포함하는 용액은 또한 예를 들어 500 ng/ml 미만, 100 ng/ml 미만, 90 ng/ml 미만, 85 ng/ml 미만, 80 ng/ml 미만, 75 ng/ml 미만 또는 70 ng/ml 미만의 HCP의 농도를 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 정제된 단백질을 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 수율로 회수하는 것을 가능하게 할 수 있다.
추가로, 본 발명은
(a) 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스, 적어도 1개의 투석여과 막 및 막 흡착제의 조합물 (여기서, 상기 막 흡착제의 조합물의 2개의 막 흡착제는 작용 메카니즘 측면에서 직교함); 및
(b) 트리스, 트리스-HCl, 비스 트리스, 포스페이트 및/또는 시트르산을 포함하는, 특히 (i) 비스 트리스, 트리스, 또는 트리스-HCl, (ii) 아세트산, (iii) 물, 및 (iv) 임의로 NaCl을 포함하거나 또는 이로 이루어진 1종의 완충제; 및/또는 트리스, 트리스-HCl, 비스 트리스, 포스페이트 및/또는 시트르산을 포함하는, 특히 (i) 비스 트리스, 트리스 또는 트리스-HCl, (ii) 아세트산, (iii) 물, 및 (iv) 임의로 NaCl을 포함하거나 또는 이로 이루어진 1종의 완충제를 제조하는 것에 대한 지침서
를 포함하거나 또는 이로 이루어진 키트에 관한 것이다.
본 발명은 하기 도면 및 실시예에 의해 추가로 예시될 것이다.
도 1은 본 발명의 3-단계의 완전 관통 방법을 나타내는 스킴을 보여준다.
도 2는 실시예 4에 사용된 바와 같은, 본 발명의 3-단계의 완전 관통 방법의 연속식 버전을 나타내는 스킴을 보여준다.
도 3은 막의 용량 (mg/ml)에 따른 막 흡착제의 4개의 조합물 (HD-C + HD-Q; HD-Sb + HD-Q; 사토바인드 S + Q; 사토바인드 S+STIC)에 의해 수득된 수율 (%), HMW (%) 및 HCP (ng/ml)의 비교를 나타내는 히스토그램을 보여준다.
도 4는 평형 완충제의 pH 및 전도성 (mS/cm)에 따른 막 흡착제의 2개의 조합물 (상부 패널: 사토바인드 S + STIC; 하부 패널: 사토바인드 S + Q) 및 정제될 단백질의 3가지 pI (6; 7.5 및 9)에 대한 스위트 스팟 플롯을 보여준다. 유리한 정제 (50 내지 500 ng/ml를 포함하는 HCP 수준에 상응함)를 수득할 수 있는 pH 및 전도성 조건은 각각의 플롯의 흑색 영역에 상응한다.
도 5는 연속식 실험실-규모 공정 실험 동안 막 상에서의 정제의 부분 크로마토그램 (U.V. 280 nm)을 보여준다.
도 2는 실시예 4에 사용된 바와 같은, 본 발명의 3-단계의 완전 관통 방법의 연속식 버전을 나타내는 스킴을 보여준다.
도 3은 막의 용량 (mg/ml)에 따른 막 흡착제의 4개의 조합물 (HD-C + HD-Q; HD-Sb + HD-Q; 사토바인드 S + Q; 사토바인드 S+STIC)에 의해 수득된 수율 (%), HMW (%) 및 HCP (ng/ml)의 비교를 나타내는 히스토그램을 보여준다.
도 4는 평형 완충제의 pH 및 전도성 (mS/cm)에 따른 막 흡착제의 2개의 조합물 (상부 패널: 사토바인드 S + STIC; 하부 패널: 사토바인드 S + Q) 및 정제될 단백질의 3가지 pI (6; 7.5 및 9)에 대한 스위트 스팟 플롯을 보여준다. 유리한 정제 (50 내지 500 ng/ml를 포함하는 HCP 수준에 상응함)를 수득할 수 있는 pH 및 전도성 조건은 각각의 플롯의 흑색 영역에 상응한다.
도 5는 연속식 실험실-규모 공정 실험 동안 막 상에서의 정제의 부분 크로마토그램 (U.V. 280 nm)을 보여준다.
실시예
실시예 1: 본 발명에 따른 실험실-규모 공정
본 발명의 방법을 인간화 모노클로날 항체 mAb1의 실험실-규모 배치 정제에 사용하였다.
본 실험은 실험실 규모에서 3개의 단계 후에 수득된 불순물 제거의 결과를 보여준다. 목표는 응집체 (HMW) 및 숙주 세포 단백질 (HCP)을 HMW의 경우 1% 미만 및 HCP의 경우 500ng/ml 미만으로 제거하는 것이었다.
본 발명자들은 2개의 상이한 킬레이트화제, 1개의 교환 단계 및 한 쌍의 막 (사토바인드 S 및 STIC 또는 사토바인드 S 및 Q)을 사용하여 성공하였다.
실시예 2: 본 발명에 따른 실험실-규모 공정
본 발명의 방법을 인간화 모노클로날 항체 mAb2의 실험실-규모 배치 정제에 사용하였다.
본 실험은 실험실 규모에서 3개의 단계 후에 수득된 불순물 제거의 결과를 보여준다. 목표는 응집체 (HMW) 및 숙주 세포 단백질 (HCP)을 HMW의 경우 1% 미만 및 HCP의 경우 500 ng/ml 미만으로 제거하는 것이었다. 본 발명자들은 2가지 종류의 킬레이트화제, 1개의 교환 단계 및 한 쌍의 막 (사토바인드 S 및 STIC 또는 사토바인드 S 및 Q)을 사용하여 성공하였다. pH 8.5 및 3 ms/cm로 설정된 로딩 조건을 사용하여 한 쌍의 사토바인드 S+STIC에 의해 최상의 결과를 수득하였다.
실시예 3: 본 발명에 따른 파일럿-규모 공정
본 발명의 방법을 mAb1의 파일럿-규모 배치 정제에 사용하였다.
실시예 2에 개시된 것과 동일한 공정을 파일럿 규모로 규모-확대하였다. 목적은 3개의 단계에 이어 나노여과 단계를 통해 10 g을 정제하는 것이었다.
8L의 정화된 세포 배양물 상청액을 본 발명의 방법의 3개의 단계 및 나노여과를 통해 정제하였다. 8L를 20L 혼합기에 연속적으로 도입하고 (250ml의 도소 NH2-750F 수지), 이어서 13분 교반하고 (160 g의 활성탄 (노리트(Norit) SA2 등급)), 이어서 14분 교반하고 (30 g의 활성탄 (노리트 SA2 등급)), 이어서 10분 교반하였다.
생성물을 여과한 후 (필트로스(Filtrox) 필터), 교환 단계를 시작하였다. 여과 후에 약 9L의 생성물을 회수하였다 (멸균수 1L로 필터의 외부에서 생성물을 밀어냄). UF/DF는 GE 유니플럭스 상에서 중공 섬유 (790 cm2 - 50KD - 스펙트럼랩스)를 사용하여 수행하였다. 중공 섬유를 통해 생성물을 투석여과하는데 사용된 완충제는 20mM 비스 트리스 (Q.S. 아세트산) pH 7.2 완충제였다.
6.9 g/L에서 2.64 kg을 회수하였다 (모노클로날 항체 18.2 g). 이어서 회수된 생성물 2 L (14 g)를 2개의 막 흡착제: 75ml 사토바인드 S 200ml 사토바인드 Q를 통해 밀어내었다. 2개의 막을 연속하여 연결하고, GE 악타프로세스(GE AktaProcess)를 사용하여 관통 모드로 사용하였다.
최종적으로 생성물을 프리필터 (XOHC - 밀리포어) 및 바이어솔브 프로 필터 (밀리포어)를 통해 나노여과하여 최종 품질을 수득하였다.
하기 표는 통상적인 공정 및 본 발명의 방법 사이를 비교한 것을 보여준다.
실시예 4: 본 발명에 따른 완전한 연속식 실험실-규모 공정
본 발명의 방법을 인간화 모노클로날 항체 mAb1의 실험실-규모 배치 정제를 위해 연속식 모드로 사용하였다.
실험의 목적은 연속식 모드를 사용하여, 즉 각각의 단계 사이에 중단, 저장 또는 조정 없이, 정화된 벌크 수거물로부터 mAb1을 정제하기 위한 것이었다. 본 발명자들은 킬레이트화제 (고정된 AEX, 활성탄 CA) 상에서의 여과, 1개의 교환 단계 (단일 통과 투석여과) 및 한 쌍의 막 (사토바인드 S 및 STIC)을 사용하여 성공하였다.
3L의 정화된 세포 배양물 상청액을 본 발명의 방법의 3개의 단계를 통해 정제하였다. 생성물을 고정된 음이온 교환체 (엠파제 AEX BV120)에 이어서 활성탄 필터 (밀리포어 CR40 270cm2)를 통해 여과하였다. 이어서, 농축 및 투석여과 (교환 단계)를 위해 생성물을 바로 단일 통과 투석여과 막 (0.2m2)으로 유동시켰다. 생성물을 투석여과하는데 사용된 완충제는 20mM 비스 트리스, 20mM NaCl (Q.S. 아세트산) pH 7.5 완충제였다.
투석여과된 생성물을 보유측에서 바로 회수하여, 다음 단계와의 유량 차이를 수용하도록 중간 서지 백을 통과시켰다. 이어서, 생성물을 2개의 폴리싱 막 흡착제; 1ml 사토바인드 S 및 1 ml 사토바인드 STIC를 통해 추가로 밀어내었다. 2개의 막을 연속하여 연결하고, GE 악타 퓨어(GE Akta Pure)를 사용하여 관통 모드로 사용하였다. 각각의 유닛 단계는 서로 바로 연결되거나 또는 서지 백을 통해 연결되고, 연속적으로 가공된다.
도 5에 제시된 바와 같이, 생성물의 전체 부피를 가공하기 위해 막 흡착제 상에서 다중 정제 사이클을 수행하였다 (막 상에서 50 사이클의 정제의 추출). 공정의 말미에 멸균 필터를 통해 전체 생성물 풀을 회수하였다. 5분마다 40mg의 mAb가 정제되어, 시간당 막의 리터당 240g의 mAb1의 생산성으로 이어졌다 (240g/L/h).
Claims (21)
- (a) - 용액을 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스 상에 관통 모드로 통과시키는 단계,
- 상기 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스의 관통으로부터 여과된 단백질 용액을 회수하는 단계
를 포함하는 여과 단계;
(b) - 단계 (a)의 말미에 수득된 여과된 단백질 용액을, 교환을 위해 오직 1종의 완충제만을 사용하여 적어도 1개의 투석여과 막 상에 통과시키는 단계,
- 상기 적어도 1개의 투석여과 막의 부분적으로 정제된 단백질-함유 보유물을 회수하는 단계
를 포함하는 교환 단계;
(c) - 단계 (b)의 말미에 수득된 보유물을 막 흡착제의 조합물 상에 관통 모드로 통과시키는 단계이며, 여기서 상기 막 흡착제의 조합물의 2개의 막 흡착제는 작용 메카니즘 측면에서 직교하고, 상기 막 흡착제의 조합물은 단계 (b)에서 교환을 위해 사용된 1종의 완충제와 동일한 평형 완충제로 사전에 평형화된 것인 단계,
- 상기 막 흡착제의 조합물의 관통으로부터 정제된 단백질을 회수하는 단계
를 포함하는 폴리싱 단계
를 포함하는, 용액으로부터 단백질을 정제하는 방법이며,
단백질 A 크로마토그래피 단계는 포함하지 않는 방법. - 제1항에 있어서, 단계 (a)의 말미에 수득된 여과된 단백질 용액이 pH 조정, 완충제 교환 또는 희석과 같은 임의의 처리를 거치지 않고 적어도 1개의 투석여과 막을 바로 통과하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (b)의 말미에 수득된 보유물이 pH 조정, 완충제 교환 또는 희석과 같은 임의의 처리를 거치지 않고 상기 막 흡착제의 조합물을 바로 통과하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 3개의 단계 (a), (b) 및 (c) 사이에 임의의 중간 저장을 포함하지 않는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 기능적으로 폐쇄된 유동경로를 갖는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 전체 정제 방법에 걸쳐 오직 1종의 완충제만이 사용되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 1종의 완충제가 트리스, 트리스-HCl, 비스 트리스, 포스페이트 및/또는 시트르산을 포함하고, 특히 (i) 비스 트리스, 트리스 또는 트리스-HCl, (ii) 아세트산, (iii) 물 및 (iv) 임의로 염을 포함하거나 또는 이로 이루어진 것인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 여과 단계의 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스가 활성탄, 규조토, 유리 양이온 교환 수지, 유리 음이온 교환 수지, 및 유리 혼합 모드 수지로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스가 2개의 상이한 킬레이트화제 매트릭스의 조합물인 방법.
- 제9항에 있어서, 2개의 상이한 킬레이트화제 매트릭스의 조합물이 활성탄 및 유리 음이온 교환 수지의 조합물인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 교환 단계의 적어도 1개의 투석여과 막이 단일 경로 접선 흐름 여과 (SPTFF) 모듈 또는 접선 흐름 여과 (TFF) 모듈인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 교환 단계의 적어도 1개의 투석여과 막이 카세트, 중공 섬유 또는 나선형 권취 형태인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 단백질 용액이 교환 단계 동안 농축되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리싱 단계의 막 흡착제의 조합물이 양이온 교환 막 흡착제, 음이온 교환 막 흡착제, 다중 모드 막 흡착제 및 소수성 상호작용 막 흡착제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 막 흡착제의 조합물인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리싱 단계의 막 흡착제의 조합물이 양이온 교환 막 흡착제 및 음이온 교환 막 흡착제의 조합물인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 후에 나노여과 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제16항에 있어서, 나노여과 단계 후에 최종 한외여과 및/또는 투석여과 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 모노클로날 항체인 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 1종의 완충제가
- 아세트산에 의해 pH 6 내지 9로 조정된, 5 내지 40 mM 비스 트리스, 15 내지 150 mM NaCl,
- 아세트산에 의해 pH 6 내지 9로 조정된, 5 내지 40 mM 트리스 또는 트리스-HCl, 15 내지 150 mM NaCl,
- 시트르산에 의해 pH 6 내지 9로 조정된, 5 내지 40 mM 트리스 또는 트리스-HCl, 15 내지 150 mM NaCl, 또는
- Na2HPO4/NaH2PO4에 의해 pH 6 내지 9로 조정된, 15 내지 150 mM NaCl
을 포함하는 것인 방법. - 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 정제된 단백질을 제약 조성물로 제제화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- (a) 적어도 1개의 킬레이트화제 매트릭스, 적어도 1개의 투석여과 막 및 막 흡착제의 조합물 (여기서, 상기 막 흡착제의 조합물의 2개의 막 흡착제는 작용 메카니즘 측면에서 직교함); 및
(b) 트리스, 트리스-HCl, 비스 트리스, 포스페이트 및/또는 시트르산을 포함하는 1종의 완충제
를 포함하거나 또는 이로 이루어진 키트.
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