CN101450967A

CN101450967A - 高纯度狂犬病人免疫球蛋白及其原料生产方法

Info

Publication number: CN101450967A
Application number: CNA2007101148398A
Authority: CN
Inventors: 庞广礼; 李西河; 马山; 仲立军; 赵军; 刘欣晏; 林锋; 李庆英
Original assignee: Shandong Taibang Biological Product Co Ltd
Current assignee: Shandong Taibang Biological Product Co Ltd
Priority date: 2007-11-29
Filing date: 2007-11-29
Publication date: 2009-06-10

Abstract

本发明涉及一种生物制品药物及原料制备方法，特别是涉及一种高纯度狂犬病人免疫球蛋白及其原料生产方法。本发明所述方法获得的高纯度狂犬病人免疫球蛋白，含有高效价的狂犬病抗体，纯度超过98％，IgG单体和二聚体含量大于99％，狂犬病抗体效价大于等于150IU/ml，蛋白质含量小于120g/L。可以使患者得到有效保护，并可减少产品的用量及患者的痛苦和负担。

Description

高纯度狂犬病人免疫球蛋白及其原料生产方法

技术领域

本发明涉及一种生物制品药物及原料制备方法，特别是涉及一种高纯度狂犬病人免疫球蛋白及其原料生产方法。

背景技术

近年来，我国狂犬病疫情一直呈上升趋势，病死数量和病死率都高居我国37种法定报告传染病首位。狂犬病是一种侵害中枢神经系统的急性病毒性传染病，所有温血动物包括人类，都可能被感染。其患者通常被带有狂犬病毒的动物咬伤而感染发病。狂犬病的潜伏期为十天至一年，有的潜伏期为几年甚至一、二十年，一旦发病，死亡率几乎达100％。临床上，当人被带狂犬病病毒的动物咬伤时，以注射狂犬病疫苗使被咬伤者体内产生抗体来预防发病。但自注射疫苗至伤者产生抗体需要14—40天时间(称窗口期)，一旦在产生抗体前发病，将使患者处于极其危险的境地；针对此种情形，现有技术中采用注射免疫的马抗狂犬病血清，使患者在缺口期内受到保护，但马抗狂犬病血清属异种血清，在人体中存留时间较短，只有7—14天，且容易引起血清病，发病率为15—25％，注射马抗狂犬病血清还容易引起副反应，一般反应率为12.3—46.2％，有时出现过敏性休克，重者造成死亡。由于马抗狂犬病血清的副反应大，病人不易接受，使用风险较高，医生也不愿意应用。对于严重狂犬咬伤患者，如果没有合并同时使用抗血清(免疫球蛋白)，即使疫苗的效价很高也难免患狂犬病死亡，因此世界卫生组织WHO推荐III度重伤病人必须使用狂犬病疫苗与免疫球蛋白肌肉注射合并使用，能较好保护病人。

但医疗实践证明，尽管使用疫苗加免疫球蛋白治疗狂犬病可以大幅度降低死亡率，但仍有20％左右的患者，使用了疫苗加狂犬病免疫球蛋白仍未避免死亡，究其原因是患者存在主动免疫缺陷所致。特别是对于距中枢神经较近的严重多处咬伤及免疫缺陷病人，免疫机能低下的肿瘤病人、结核病人，年老体弱，儿童及由于治疗其它疾病使用免疫抑制剂的病人和距中枢神经较近的严重咬伤者。当前对上述特殊患者使用狂犬病疫苗和同时肌肉注射免疫球蛋白进行狂犬病治疗，由于上述特殊患者不能产生足够抗体，被动免疫抗体的使用量又不足，两者相加的抗体总量达不到世界卫生组织规定的大于0.5IU/ml，故造成免疫失败。对上述特殊病人如能及时提供足量的人狂犬病免疫球蛋白，使其患者血清中抗体达到0.5IU/ml以上，才能使患者得到有效保护，但加大肌肉注射人狂犬病免疫球蛋白的剂量，无法达到上面要求，必须改为静脉注射方式，所以研制静脉注射用人狂犬病免疫球蛋白具有重要实际意义。

发明内容

本发明针对现有技术所存在的不足，而提供了一种高纯度狂犬病人免疫球蛋白及其原料的生产方法。

本发明提供的一种高纯度狂犬病人免疫球蛋白，含有高效价的狂犬病抗体，纯度超过98％，Ig G单体和二聚体含量大于99％，狂犬病抗体效价大于等于150IU/ml，蛋白质含量小于120g/L。

所述免疫球蛋白的使用量为每公斤体重用量20IU/kg。

高纯度狂犬病人免疫球蛋白的生产方法，包括以下步骤：

(1)制备用于生产狂犬病人免疫球蛋白的抗体效价大于10IU/ml的原料血浆；

(2)低温乙醇分级分离。

(A)将冷冻血浆在不高于35℃的水槽中融化，破袋混匀，制备条件控制：pH5.95±0.05、乙醇浓度18-20％、离子强度0.09-0.14、温度-5±0.5℃，加入助滤剂，压滤，得组分I+II+III。

(B)沉淀组分III：将组分I+II+III溶解，溶解温度0～5℃，溶解时间≥2小时，条件控制：乙醇浓度12～16％，离子强度0.014-0.016，pH5.20±0.05，沉淀过程中温度控制在-4±1℃。压滤条件控制：进液压力≤0.24Mpa，出液温度-4±1℃，得上清；上清调至pH6.8-7.4，控制乙醇浓度20-26％，温度-8±1℃，压滤得组分III。

(C)组分III沉淀溶解纯化：溶解用水须符合注射用水标准，溶解温度1～8℃，溶解时间大于等于2小时。然后过滤、澄清，溶液须澄清透亮。超滤结束制品温度小于等于15℃，残余乙醇量小于等于0.025％。超滤液采用0.2μm微孔滤芯过滤。

(3)离子交换层析法纯化。

(A)强阴离子交换树脂柱，选Q-Sepharose FF凝胶。先用pH6.2-7.7的0.04-0.08mol/L的醋酸盐缓冲平衡液平衡柱子至少5倍柱体积，至pH、紫外吸收值稳定。将过滤除菌液上强阴离子交换树脂柱(选Q-Sepharose FF凝胶)，用以吸附大部分的白蛋白、大多数的IgA及IgM；

(B)弱阴离子交换树脂柱，DEAE-Sepharose FF)。先用pH6.2-7.7，电导0.8-1.8mS/cm的醋酸盐缓冲平衡液平衡柱子至少5倍柱体积，至pH、紫外吸收值稳定。流穿液调整至pH6.2-7.7，用醋酸盐缓冲液调整电导至0.8-1.8mS/cm，再上已经平衡完毕的弱阴离子交换树脂柱(DEAE-Sepharose FF)，用来吸附微量IgM和其它杂蛋白等。得到IgG纯化液。

(4)IgG纯化液经低pH孵放灭活病毒处理。

每批制品必须经pH4.1±0.3，温度23℃～25℃孵育放置21天以灭活病毒。

(5)DV50nm膜过滤除病毒，增加安全性。

(6)配液、除菌、分装，制得狂犬病人免疫球蛋白。

上述步骤(1)中高效价原料血浆的制造方法为：

(i)选择身体健康，符合国家《原料血浆采集规程》供浆标准的供血浆者；

(ii)第0、7、14、28天，每次注射一剂人用纯化狂犬病疫苗，所使用的人用纯化狂犬病疫苗效价大于等于4IU/支；

(iii)检查供血者血浆的抗狂犬病抗体，当供浆者的血浆狂犬病抗体效价达到10IU/ml时，采集为合格血浆，封装保存，每次每人份采浆小于等于600g；

(iv)当血浆抗体效价降至2IU/ml时，在注射1剂狂犬病疫苗。

本发明的有益效果可根据对上述方案的叙述得知，本发明所述狂犬病人免疫球蛋白以高效价狂犬病抗体血浆为起始原料，采用低温乙醇分级分离和阴离子柱层析纯化，大大提高了产品纯度和稳定性，有效减少患者的副反应和潜在的不良反应；用世界上公认的效果可靠的低pH孵放法灭活经血液途径传播的病毒，再加纳米膜滤除病毒，确保产品的安全性。狂犬病免疫球蛋白纯度超过98％、Ig G单体和二聚体含量大于99％，狂犬病抗体效价大于等于150IU/ml，蛋白质含量小于120g/L。为了保护被带狂犬病病毒的动物伤害的人，对于III度咬伤(距中枢神经较近的咬伤、多处严重咬伤)者、免疫缺陷者(先天性和后天性免疫缺陷症)、免疫机能低下的肿瘤病人、结核病人，年老体弱者、儿童及由于治疗其它疾病使用免疫抑制剂的病人，即使不进行静脉注射，只使用我们生产的狂犬病免疫球蛋白进行局部浸润注射(1/2量)和肌肉注射(1/2量)(总剂量按20IU/kg体重)，联合肌注狂犬病疫苗，被带狂犬病病毒的动物伤害的人血清中狂犬病抗体仍可达0.5IU/ml以上，使患者得到有效保护。并可减少产品的用量及患者的痛苦和负担。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明。

实施例1

(1)制备用于生产狂犬病人免疫球蛋白的抗体效价大于10IU/ml的原料血浆。

(iv)当血浆抗体效价降至2IU/ml时，在注射1剂狂犬病疫苗。

(2)低温乙醇分级分离。

(A)制备组分I+II+III：将将冷冻血浆在不高于33℃的水槽中融化，破袋混匀，调pH5.95、乙醇浓度19％、离子强度0.11、温度-5℃，搅拌反应30分钟以上，静置10小时，压滤，得组分I+II+III。

(B)沉淀组分III，制备组分II：将组分I+II+III溶解，溶解温度3℃，溶解时2小时，条件控制：乙醇浓度14％，离子强度0.015，pH5.20，沉淀过程中温度控制在-4℃，放置10小时。上清液加0.3％硅藻土及0.3％珍珠岩，压滤澄清，压滤条件控制：进液压力0.24Mpa，出液温度-4℃，得上清；上清调pH至7，控制乙醇浓度23％，温度-8℃，压滤得组分III。

(C)组分III沉淀溶解纯化：溶解用水须符合注射用水标准，溶解温度2℃，溶解2小时。然后过滤、澄清，溶液须澄清透亮。超滤结束制品温度13℃，残余乙醇量0.01％。超滤液采用0.2μm微孔滤芯过滤。

(3)柱层析纯化：

(A)强阴离子交换树脂柱(选Q-Sepharose FF凝胶)先用pH6.8的0.05mol/L的醋酸盐缓冲平衡液平衡柱子至少5倍柱体积，至pH、紫外吸收值稳定。将过滤除菌液上强阴离子交换树脂柱(选Q-Sepharose FF凝胶)，用以吸附大部分的白蛋白、大多数的IgA及IgM；的醋酸盐缓冲平衡液平衡柱子5倍柱体积，至pH、紫外吸收值稳定。将(A)步骤中的流穿液调整至pH7.0，用醋酸盐缓冲液调整电导至1.5mS/cm，再上已经平衡完毕的弱阴离子交换树脂柱(DEAE-Sepharose FF)，用来吸附微量IgM和其它杂蛋白等。得到IgG纯化液。

(4)IgG纯化液经低pH孵放灭活病毒处理：制品经pH4.1，温度23℃孵育放置21天以灭活病毒。

(5)DV₅₀nm膜过滤去除可能残留的病毒。

(6)配液及除菌分装：蛋白浓度调整至12％以下，狂犬病抗体效价控制在150IU/ml，经0.2μm的除菌滤器除菌分装。

经过柱层析纯化的免疫球蛋白其白蛋白、IgA、IgM、PKA、血凝素、ACA含量极低，均达到美国药典要求，与未进行纯化的免疫球蛋白比较见下表。

本方法所获得的产品与柱层析纯化前产品比较分析结果

未纯化纯化后(本发明) 国内某厂产品

纯度 96.1％ 99.8％ 96.5％

白蛋白少量未检出少量

单体和二聚体含量 96.8％ 99.4％ 96.2％

聚合物和聚集体 2.6％ <0.1％ 2.8％

ACA(抗补体活性)％ 30％ 5.2％ 28％

PKA <21IU/ml <1.8IU/ml 23IU/ml

抗-A 1:32 1:4 1:16

抗-B 1:32 1:8 1:16

Fc功能 121％ 178％ 116％

亚类分布

IgG1 61.2％ 63.5％ 62.1％

IgG2 27.3％ 26.4％ 27.6％

IgG3 9.1％ 6.6％ 7.5％

IgG4 2.4％ 3..5％ 3.8％

IgA 54.7mg/l 1.36mg/l 87.6mg/l

IgM 39.1mg/l 0.16mg/l 49.2mg/l

总蛋白浓度 115g/l 112g/l 174g/l

狂犬病抗体效价(IU/ml) 171 166 100

抗HBS(乙肝抗体) 37 32 16

(IU/ml)

由上表可知，白蛋白由于纯度高，未检出。IgG单体和二聚体的含量大于等于99％，聚合物和聚集体的含量小于等于1％。

Claims

1.一种高纯度狂犬病人免疫球蛋白，其特征在于：免疫球蛋白含量大于总蛋白含量的98％，狂犬病抗体效价大于等于150IU/ml，蛋白质含量小于120g/L。

2.根据权利要求1所述的狂犬病人免疫球蛋白，其特征在于：免疫球蛋白中Ig G单体和二聚体含量大于99％。

3.如权利要求1所述的狂犬病人免疫球蛋白的生产方法，其特征在于包括以下步骤：

(2)低温乙醇分级分离；

(3)离子交换层析法纯化；

(4)低pH孵放灭活病毒处理；

(5)DV₅₀nm膜过滤除病毒；

(6)超滤、配液、除菌。

4.如权利要求3所述的狂犬病人免疫球蛋白的生产方法，其特征在于：所说的离子交换层析纯化是将低温乙醇分离后的过滤液先后通过串联的强阴离子层析柱Q-Sepharose FF和弱阴离子层析柱DEAE-Sepharose FF进行纯化。

5.如权利要求3或4所述的狂犬病人免疫球蛋白的生产方法，其特征在于：所说的离子交换层析纯化的操作条件如下：

(A)强阴离子交换树脂柱操作条件：选Q-Sepharose FF凝胶，先用pH6.2-7.7的0.04-0.08mol/L的醋酸盐缓冲平衡液平衡柱子至少5倍柱体积，至pH、紫外吸收值稳定。将过滤除菌液上强阴离子交换树脂柱(选Q-SepharoseFF凝胶)，用以吸附大部分的白蛋白、大多数的IgA及IgM；

(B)弱阴离子交换树脂柱操作条件：选DEAE-Sepharose FF凝胶，先用pH6.2-7.7，电导0.8-1.8mS/cm的醋酸盐缓冲平衡液平衡柱子至少5倍柱体积，至pH、紫外吸收值稳定。流穿液调整至pH6.2-7.7，用醋酸盐缓冲液调整电导至0.8-1.8mS/cm，再上已经平衡完毕的弱阴离子交换树脂柱(DEAE-SepharoseFF)，用来吸附微量IgM和其它杂蛋白等。得到IgG纯化液。