CN116217709A - 一种人静注免疫球蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人静注免疫球蛋白(IVIG)的制备方法，其目的在于解决低温乙醇分离工艺所存在的IgA残留量高，难以进一步采用纳米膜过滤除病毒的技术瓶颈，提高了静注人免疫球蛋白的质量和安全性。本发明的方法包括：S1.将血浆蛋白组分Ⅱ沉淀溶解于注射用水或缓冲液中，调节溶液的pH范围为4.00‑6.50，电导率为0.10‑2.50mS/cm，优选的pH为5.20±0.20，电导率为1.00±0.50mS/cm；S2.取上清液，进行穿透式阴离子交换层析，并收集流穿液；穿透式阴离子交换层析的填料优选DEAE；S3.调节流穿液的pH为3.50‑5.50，优选为4.10±0.30，浓度为10‑100mg/mL，接着先采用微孔滤膜过滤，再采用纳米膜过滤，收集滤液；S4.将滤液进行超滤浓缩，调节浓度后进行低pH孵放，即得人静注免疫球蛋白成品。
Description
技术领域
本发明涉及血液制品技术领域，具体涉及一种人静注免疫球蛋白的制备方法。
背景技术
静注人免疫球蛋白(简称IVIG)是从健康人血浆中分离提取得到的免疫球蛋白。IVIG具有免疫替代和免疫调节的双重治疗作用，临床使用广泛，在原发性或获得性免疫球蛋白缺陷症、细菌感染、病毒感染、血液系统疾病等的治疗中具有良好的应用效果。目前，IVIG的分离方法主要是低温乙醇工艺。1940s，美国哈佛大学的E.J.Cohn教授发明了低温乙醇分离血浆蛋白的工艺，逐级沉淀血浆中的蛋白质。我国的IVIG产品，主要采用低温乙醇法制备，将低温乙醇沉淀获得的血浆蛋白组分II沉淀进一步溶解、澄清、超滤脱醇、低pH孵放(病毒灭活)等处理后得到IVIG成品。但该方法也存在明显的不足，IVIG产品中IgA含量相对较高(200-400μg/ml)，先天性选择性IgA缺乏症患者输注后易发生不良反应。此外，传统工艺只采用低pH孵育一步病毒灭活操作，也存在一定的安全风险。基于2020年新版药典所提出的2种不同方式病毒灭活的要求，有必要对现有冷乙醇沉淀生产IVIG的工艺进行改进和产品质量提升。
离子交换层析技术是迄今为止应用最为广泛的蛋白质层析技术。以多糖或聚合物微球为基球偶联DEAE、Q、CM和SP等离子交换基团，获得离子交换介质，以该类介质为填料装柱，对蛋白、核酸、病毒等进行离子交换层析，具有处理量大、操作简单且耗时短、易于自动化等特点，得到的生物制品纯度高、产率大、活性高、污染小。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单，适合于规模化生产的方法，该方法能够快速从血浆蛋白组分II沉淀中获得品质好、安全性高的IVIG产品。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明第一方面提供了一种人静注免疫球蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S1.将血浆蛋白组分Ⅱ沉淀溶解于水或缓冲液中，调节溶液的pH为4.00-6.50，电导率为0.10-2.50mS/cm；优选的pH为5.20±0.20，电导率为1.00±0.50mS/cm；
S2.取步骤S1所得溶液的上清液，进行穿透式阴离子交换层析，并收集流穿液；所述穿透式阴离子交换层析的填料为DEAE介质或者Q介质，优选DEAE介质；
S3.调节步骤S2所得流穿液的pH为3.50-5.50，优选为4.10±0.30；浓度为10-100mg/mL，接着先采用微滤膜过滤，再采用纳米膜过滤，收集滤液；
S4.将步骤S3所得滤液进行超滤浓缩，调节浓度后进行低pH孵放，即得人静注免疫球蛋白成品。
本发明的目的在于解决现有的冷乙醇沉淀工艺所存在的IgA残留量高，难以进一步采用纳米膜过滤除病毒的技术瓶颈，提高了静注人免疫球蛋白的质量和安全性。本发明通过增加一步离子交换层析降低IgA残留量，并进一步增加纳米膜过滤除病毒步骤，与低pH孵育组成了2种不同方式病毒灭活方案，提高了制品的安全性。此外，层析法与冷乙醇沉淀工艺的有机结合，还大大提高了人血浆这种宝贵资源的利用效率，获得更加丰富的血浆制品品种。
进一步地，步骤S1中，所述缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液。
进一步地，步骤S1中，所述溶液的配制方法为：取血浆蛋白组分II沉淀，用5-30倍体积的注射用水或乙酸-乙酸钠缓冲液溶解，在2-8℃下搅拌至其充分溶解，调节溶液的pH为4.00-6.50，电导率为0.10-2.50mS/cm；优选的pH为5.20±0.20，电导率为1.00±0.50mS/cm。
进一步地，步骤S2中，在进行穿透式阴离子交换层析时，预先采用平衡缓冲液对层析柱进行平衡，然后上样，收集流穿液；其中，所述平衡缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液，其pH值范围为4.00-6.50，电导率为0.10-2.50mS/cm；优选的pH为5.20±0.20，电导率为1.00±0.50mS/cm。
进一步地，步骤S2中，上样时，样品中的蛋白浓度优选地不高于50mg/ml，例如可以为10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、45mg/ml、50mg/ml等。
本发明中，上样量优选地不高于2g蛋白/ml介质，例如可以为0.1g蛋白/ml介质、0.4g蛋白/ml介质、0.7g蛋白/ml介质、1.0g蛋白/ml介质、1.4g蛋白/ml介质、1.7g蛋白/ml介质、2.0g蛋白/ml介质等。
进一步地，步骤S2中，在进行穿透式阴离子交换层析后，还包括采用高盐缓冲液洗脱吸附在层析柱上的蛋白的步骤；其中，所述高盐缓冲液为含有氯化钠的乙酸-乙酸钠缓冲液，其pH值为4.00-6.50，电导率为0.10-2.50mS/cm。优选的pH为5.20±0.20，电导率为1.00±0.50mS/cm。
进一步地，步骤S3中，调节步骤S2所得流穿液的pH为3.50-5.50，例如可以为3.8、4.2、4.5、4.8、5.2、5.5等；优选地pH为4.10±0.30。
进一步地，步骤S3中，调节步骤S2所得流穿液的浓度为10-100mg/mL，例如可以为10mg/mL、30mg/mL、50mg/mL、70mg/mL、100mg/mL等。
进一步地，步骤S3中，所述微滤膜选择0.1μm孔径的微滤膜。
进一步地，步骤S3中，所述纳米膜过滤采用的病毒去除过滤器为Planova 20N、Planova BioEX、Virosart HC和FTK SV4中的一种。优选地，所述纳米膜选择FTK SV4，其对于样品具有最高的过滤通量。
进一步地，步骤S4中，经超滤浓缩后，向浓缩液中添加保护剂，并调节至所需的蛋白浓度，然后经低pH孵放以进一步去除病毒。其中，低pH孵放可采用本领域常规的工艺。
本发明第二方面提供了由所述的制备方法制备得到的人静注免疫球蛋白。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明在血浆蛋白组分II沉淀的基础上，引入了穿透式阴离子交换层析步骤，大幅度降低了IgA的含量和不良反应，提高了产品质量，最终产品中的IgG纯度>99.5％，IgA含量<30μg/ml。
2.本发明在阴离子交换层析去除了大量容易堵塞纳米膜的IgA大分子的基础上，引入了和低pH孵放互补的纳米膜过滤除病毒步骤，提高了病毒去除效率，提高了产品安全性。
3.本发明通过离子交换介质筛选和层析条件优化，穿透式阴离子交换层析的处理量达到1g蛋白/ml介质，具有蛋白处理量大、介质用量少的特点；通过对纳米膜的筛选和纳米膜过滤工艺的优化，显著提高了纳米膜通量，IVIG处理量可高达4.5-7.0kg/m2。上述优化工艺确保了高效率，实现了生产成本的有效控制，适用于工业化生产。
附图说明
图1为血浆蛋白组分II沉淀的阴离子交换层析谱图；
图2为血浆蛋白组分II沉淀的阴离子交换实验室放大层析谱图；
图3为纳米膜过滤通量(纳滤膜采用Pall(FTK SV4)，pH是4.1)；
图4为IVIG原始样品的液相色谱纯度分析谱图；
图5为实施例1得到的IVIG成品的液相色谱纯度分析谱图；
图6为IVIG层析杂质产物的液相色谱纯度分析谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供了一种从血浆蛋白组分II沉淀中制备静注人免疫球蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)血浆蛋白组分II溶解
称取一定量的血浆蛋白组分II沉淀，用5倍体积的5mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH＝5.30)溶解，在8℃条件下搅拌溶解3h，过滤澄清后调节pH为5.30，电导率为1.0mS/cm，蛋白浓度为40mg/ml。
(2)阴离子交换层析
DEAE离子交换层析柱预先用8个柱体积的平衡缓冲液(10mM乙酸-乙酸钠，pH＝5.30)平衡，然后上样(流速216cm/h)，IgG流穿，收集流穿液。IgA等吸附在层析柱上，用高盐缓冲液(10mM乙酸-乙酸钠，0.5M NaCl，pH＝5.30)洗脱吸附在层析柱上的蛋白。
(3)纳米膜过滤
将离子交换流穿液的pH调至4.15，蛋白浓度调至10mg/ml，然后用0.1微米滤膜预过滤，再用纳米膜(FTK SV4)进行除病毒过滤。
(4)纳米膜过滤液经超滤浓缩，添加保护剂后配制成50mg/ml，低pH孵放等处理后，得到静注人免疫球蛋白成品。
对个样品进行分析检测，蛋白浓度为50.2mg/ml，IgG纯度>99.5％，IgA含量为25.6μg/ml。
实施例2：阴离子交换层析工艺参数优化实验
1.pH优化实验
实验方法：实验步骤和条件同实施例1，区别在于：分别考察缓冲液的pH(4.8、5.0、5.3、5.5、5.8，样品pH也调到相应值)对流穿液中蛋白收率和IgA含量的影响。结果如表1所示。
表1pH条件对阴离子交换层析效果的影响
从表1的结果可以看出：在所考察的pH范围内，随着缓冲液中pH的升高，蛋白更容易吸附到阴离子交换介质上，流穿液中蛋白回收率逐步降低，IgA含量也逐步降低。根据药典通则3428制度标准，按标准单位折算IgA含量应低于50ug/mL；蛋白回收率应不低于95％。因此综合考虑蛋白收率和IgA残留，选择pH＝5.0-5.3的工艺条件。
2.上样量优化实验
实验方法：实验步骤和条件同实施例1，区别在于：在pH＝5.30的条件下，分别考察不同的上样量(0.16、0.56、1.10、1.52、2.10g蛋白/ml介质)对流穿液中蛋白收率和IgA含量的影响。所得结果如表2所示。
表2上样量对阴离子交换层析效果的影响
从表2的结果可以看出：在所考察的上样量范围内，随着上样量的增加，流穿液中蛋白回收率小幅度升高，IgA含量也逐步上升，并在2.10g蛋白/ml介质上样量时超过了50μg/ml的预期控制指标。综合考虑介质处理量和IgA残留，选择不高于2g蛋白/ml介质的上样量。
3.样品浓度优化实验
实验方法：实验步骤和条件同实施例1，区别在于：在pH＝5.30、上样量为2g蛋白/ml介质的条件下，分别考察不同样品浓度(31、40、52mg/ml)对流穿液中蛋白收率和IgA含量的影响。所得结果如表3所示。
表3样品浓度对阴离子交换层析效果的影响
表3的结果显示：在所考察的蛋白浓度范围内，随着蛋白浓度的增加，流穿液中蛋白回收率无明显变化，IgA含量逐步上升，并在52mg/ml的样品浓度时超过了50μg/ml的预期控制指标。综合考虑层析操作时间和IgA残留，选择不高于40mg/ml的样品浓度。
实施例3：纳米膜过滤工艺参数优化实验
1.纳米膜型号优化实验
实验方法：实验步骤和条件同实施例1，区别在于：分别考察不同厂家的不同型号的纳米膜(Planova 20N、Planova BioEX、FTK SV4、Virosart HC)对纳米膜过滤通量的影响。所得结果如表4所示。
表4纳米膜型号对纳米膜过滤通量的影响
表4的结果显示：在所考察的4种纳米膜中，FTK SV4对于样品具有最高的过滤通量，是本发明的优选方案。
2.pH优化实验
实验方法：实验步骤和条件同实施例1，区别在于：选用FTK SV4纳米膜，分别考察不同pH(3.80、4.10、4.40、5.15)对纳米膜过滤通量的影响。所得结果如表5所示。
表5pH对纳米膜过滤通量的影响
表5的结果显示：在所考察的pH范围内，较低的pH有利于保持较高的过滤通量，因此优选地调节滤料的pH为3.80-4.40。
3.样品浓度优化实验
实验方法：实验步骤和条件同实施例1，区别在于：选用FTK SV4纳米膜，分别考察不同样品浓度(10mg/mL、30mg/mL、50mg/mL、70mg/mL、100mg/mL)对纳米膜过滤通量的影响。所得结果如表6所示。
表6样品浓度对纳米膜过滤通量的影响
表6的结果显示：在所考察的样品浓度范围内，10-50mg/mL的样品浓度更有利于保存较高的过滤通量。
综上，本发明提供了一种静注免疫球蛋白的制备方法，该方法基于组分II沉淀，通过穿透式阴离子交换层析步骤并选择特定的层析填料，大幅度降低了IgA的含量，同时处理量达到了1g蛋白/ml介质；另外，通过选用特定的纳米膜过滤除病毒配合低pH孵放工艺，不仅提高了病毒去除效率，而且实现了很高的过滤通量，提高了生产效率。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (9)
1.一种人静注免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将血浆蛋白组分Ⅱ沉淀溶解于注射用水或缓冲液中，调节溶液的pH范围为4.00-6.50，电导率为0.10-2.50mS/cm；优选的pH为5.20±0.20，电导率为1.00±0.50mS/cm；
S2.取步骤S1所得溶液的上清液，进行穿透式阴离子交换层析，并收集流穿液；所述穿透式阴离子交换层析的填料为阴离子交换介质；所述阴离子交换介质为DEAE介质或者Q介质，优选DEAE介质；
S3.调节步骤S2所得流穿液的pH为3.50-5.50，优选为4.10±0.30；浓度为10-100mg/mL，接着先采用微滤膜过滤，再采用纳米膜过滤，收集滤液；
S4.将步骤S3所得滤液进行超滤浓缩，调节浓度后进行低pH孵放，即得人静注免疫球蛋白成品。
2.根据权利要求1所述的一种人静注免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种人静注免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述溶液的配制方法为：取血浆蛋白组分II沉淀，用5-30倍体积的注射用水或乙酸-乙酸钠缓冲液溶解，在2-8℃下搅拌至其充分溶解，调节溶液的pH范围为4.00-6.50，电导率为0.10-2.50mS/cm；优选的pH为5.20±0.20，电导率为1.00±0.50mS/cm。
4.根据权利要求1所述的一种人静注免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S2中，在进行穿透式阴离子交换层析时，预先采用平衡缓冲液对层析柱进行平衡，然后上样，收集流穿液；其中，所述平衡缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液，其pH值范围为4.00-6.50，电导率为0.10-2.50mS/cm；优选的pH为5.20±0.20，电导率为1.00±0.50mS/cm。
5.根据权利要求4所述的一种人静注免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，上样时，样品中的蛋白浓度不高于50mg/ml，上样量不高于2g蛋白/ml介质。
6.根据权利要求4所述的一种人静注免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，在进行穿透式阴离子交换层析后，还包括采用高盐缓冲液洗脱吸附在层析柱上的蛋白的步骤；其中，所述高盐缓冲液为含有氯化钠的乙酸-乙酸钠缓冲液，其pH值范围为4.00-6.50，电导率为0.10-2.50mS/cm；优选的pH为5.20±0.20，电导率为1.00±0.50mS/cm。
7.根据权利要求1所述的一种人静注免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S3中，调节步骤S2所得流穿液的pH范围为3.50-5.50，优选为4.10±0.30；
和/或，调节步骤S2所得流穿液的浓度为10-100mg/mL。
8.根据权利要求1所述的一种人静注免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述纳米膜过滤采用的病毒去除过滤器为Planova 20N、Planova BioEX、Virosart HC和FTK SV4中的一种。
9.根据权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到的人静注免疫球蛋白。
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