CN116063452A - 一种人绒毛膜促性腺激素高效纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人绒毛膜促性腺激素高效纯化方法，该方法采用染料亲和层析与反相高效液相色谱层析相结合，通过两步层析就可获得高纯度绒促性素，产品效价大于11500IU/mg，较现有产品提高15％以上，远高于国家药典标准。本方法操作简便，生产周期较现有工艺缩短三分之一以上，生产成本较低，适合工业化推广。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种人绒毛膜促性腺激素的高效纯化方法。
背景技术
人绒毛膜促性腺激素(hCG)系自健康孕妇尿中提取、精制而成的一种天然促性腺激素，具有类似黄体生成素的功能。对女性可促进卵泡的成熟及排卵，并维持黄体的功能。对男性能刺激睾丸间质细胞的发育，增加雄激素分泌，促使睾丸下降和男性第二性征发育。与尿促性素合用，可模拟生理性的促黄体生成素高峰，而触发排卵。临床上至今仍是治疗月经失调、无排卵性不孕症、先兆流产和习惯性流产、隐睾症、男性性功能低下等的首选药物。
人绒毛膜促性腺激素传统纯化工艺一般采用离子交换层析、亲和层析、疏水层析、凝胶层析等多种层析技术组合的方法，层析工艺过程通常都在三步以上，有的甚至达到五步，操作繁琐，工艺周期长，产品收率低，生产成本居高不下，所得产品也无法满足国内外市场对高纯度人绒毛膜促性腺激素的需求。
因此，有必要发展一种更为简洁高效的人绒毛膜促性腺激素的纯化生产工艺。
发明内容
针对现有技术不足，本发明运用传统纯化工艺结合现代制备液相色谱技术，采用独创的染料亲和层析和反相高效液相色谱层析两步纯化技术方案，在大幅缩短生产周期(较现有工艺缩短三分之一以上)的同时，利用反相高效液相层析独有高分辨率和高效率，可有效提高产品收率和产品活性。
本发明的目的在于提供了一种人绒毛膜促性腺激素(HCG)的高效制备方法，包括以下步骤：
(1)将HCG粗制品经过染料亲和层析纯化，得到中间体A；
(2)将所述中间体A经反相高效液相色谱层析纯化，得到中间体B；
(3)将所述中间体B经过超滤浓缩、冷冻干燥，得到HCG成品。
在另一实施方案中，本发明所述方法步骤(1)中，其中HCG粗制品是指来源于CHO细胞表达后得到培养基上清中的重组人绒毛膜促性腺激素，来源于纯化孕妇尿液原浓缩液中的尿液人绒毛膜促性腺激素，以及来源于其它哺乳动物的绒毛膜促性腺激素，例如牛、马、猪、羊、和猴。
在另一实施方案中，本发明所述方法步骤(1)中，所述的染料亲和层析填料的染料配基选自Cibacron Blue、Orange、Red、Green。在另一优选实施方案中，所述染料亲和层析的填料的固相载体选自淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素或琼脂糖。在另一优选实施方案中，所述染料亲和层析为Blue亲和层析，例如Blue Sepharose CL-6B、Blue Sepharose 6FastFlow或者Blue Sepharose High Performance等。染料亲和层析过程主要用于捕获HCG粗制品中的HCG，同时除去少量杂质蛋白，而且染料亲和层析洗脱液不用经过样品处理就可以直接进行后续的反相层析，简化了操作步骤。
在另一实施方案中，本发明所述方法步骤(1)中，当HCG吸附于染料亲和层析介质上后采用添加了NaCl的平衡缓冲液对其进行洗脱，其中NaCl的浓度为1.0mol/L-4.0mol/L，更优选为2.0mol/L-3.0mol/L。优选的洗脱方案为：采用梯度洗脱，洗脱液A为、浓度为20-50mmol的磷酸盐平衡缓冲液，洗脱液B为在洗脱液A基础上添加了3mol/L氯化钠，染料亲和层析填料优选GE蓝色染料亲和层析。
在另一实施方案中，本发明所述方法步骤(2)中，所述的反相高效液相色谱层析填料选自C12、C16、C18或C30的RP-HPLC基体，优选亲水性C18填料，孔径大于300埃，粒径10微米。优选的反相高效液相色谱层析步骤为：A相为pH2-3、浓度为20-50mmol混合磷酸盐缓冲液，B相为甲醇，上样后平衡使用95％A+5％B的混合缓冲液，洗脱条件为B相50分钟内由5％升到35％。
本发明优化了纯化工艺，使纯化过程简单化，生产周期较现有工艺缩短三分之一以上，且收率明显提高，效价高于现有工艺，生产成本显著降低。经两步层析后的效价大于11500IU/mg左右，收率大于93％，相比现有生产工艺具有明显的进步。
附图说明
附图1：工艺流程图
附图2：绒促性素成品典型色谱图(SEC-HPLC)
具体实施方式
通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，所述实施例不应解释为进一步限制。
实施例1
第一步：染料亲和层析
取效价为105IU粗品25g，用20mmol磷酸盐(PH7.0)充分溶解后过0.45微米膜，然后上样至预先用20mmol磷酸盐(PH7.0)平衡好的染料亲和色谱柱中(填料230ml，径高比1∶3)，上样结束用平衡液洗涤至色谱基线走平，然后采用梯度洗脱，洗脱液A为20mmol磷酸盐(PH7.0)，洗脱液B为20mmol磷酸盐(PH7.0)+3mol氯化钠，洗脱20个柱体积。收集HCG活性峰约350ml，采用小型超滤器浓缩至约20ml(中间体A)供下一步使用。
第二步：反相高效液相色谱层析
流动相A为20mmol、PH2.8的混合磷酸盐，流动相B为甲醇，首先用95％的A，5％的B平衡高效制备液相系统(柱规格：50*250mm)，然后将上一步得到的中间体A注入系统中，随后采用梯度洗脱，B相50分钟内由5％升到35％，收集HCG活性峰210ml，经浓缩脱盐，冻干后得到精品208.2mg，单位效价11800IU，收率93.6％，SEC-HPLC纯度大于98％。
实施例2
第一步：染料亲和层析
取效价为105IU粗品100g，用50mmol磷酸盐(PH7.2)充分溶解后过0.45微米膜，然后上样至预先用50mmol磷酸盐(PH7.2)平衡好的染料亲和色谱柱中(填料1000ml，径高比1：3)，上样结束用平衡液洗涤至色谱基线走平，然后采用梯度洗脱，洗脱液A为50mmol磷酸盐(PH7.2)，洗脱液B为50mmol磷酸盐(PH7.2)+3mol氯化钠，洗脱20个柱体积。收集HCG活性峰约3000ml，采用小型超滤器浓缩至180ml(中间体A)供下一步使用。
第二步：反相高效液相色谱层析
流动相A为20mmol、PH2.6的混合磷酸盐，流动相B为甲醇，首先用95％的A，5％的B平衡高效制备液相系统(柱规格：100*250mm)，然后将上一步得到的中间体A注入系统中，随后采用梯度洗脱，B相50分钟内由5％升到35％，收集HCG活性峰770ml，经浓缩脱盐，冻干后得到精品815.7mg，单位效价12100IU，收率94.0％，SEC-HPLC纯度大于98％。
检测方法说明
绒促性素纯度检测采用waters Xbridge SEC色谱柱，流动相为0.1mol/L磷酸盐缓冲液，流速0.5ml/min。柱温25℃。
绒促性素效价检测按照中国药典2020版四部1209绒促性素生物测定法测定。
Claims (10)
1.一种人绒毛膜促性腺激素(HCG)的高效制备方法，包括以下步骤：
(1)将HCG粗制品经过染料亲和层析纯化，得到中间体A；
(2)将所述中间体A经反相高效液相色谱层析纯化，得到中间体B；
(3)将所述中间体B经过超滤浓缩、冷冻干燥，得到HCG成品。
2.如权利要求1所述的人绒毛膜促性腺激素(HCG)的高效制备方法，其特征在于：步骤(1)中，HCG粗制品是指来源于CHO细胞表达后得到培养基上清中的重组人绒毛膜促性腺激素，来源于纯化孕妇尿液原浓缩液中的尿液人绒毛膜促性腺激素，以及来源于其它哺乳动物的绒毛膜促性腺激素，例如牛、马、猪、羊、和猴。
3.如权利要求1所述的人绒毛膜促性腺激素(HCG)的高效制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的染料亲和层析填料的染料配基选自Cibacron Blue、Orange、Red、Green。在另一优选实施方案中，所述染料亲和层析的填料的固相载体选自淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素或琼脂糖。
4.如权利要求1所述的人绒毛膜促性腺激素(HCG)的高效制备方法，其特征在于：所述染料亲和层析的填料的固相载体选自淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素或琼脂糖。
5.如权利要求1所述的人绒毛膜促性腺激素(HCG)的高效制备方法，其特征在于：所述染料亲和层析为Blue亲和层析，如Blue Sepharose CL-6B、Blue Sepharose 6FastFlow或者Blue Sepharose High Performance。
6.如权利要求1所述的人绒毛膜促性腺激素(HCG)的高效制备方法，其特征在于：步骤(1)中，当HCG吸附于染料亲和层析介质上后采用添加了NaCl的平衡缓冲液对其进行洗脱，其中NaCl的浓度为1.0mol/L-4.0mol/L，更优选为2.0mol/L-3.0mol/L。
7.如权利要求6所述的人绒毛膜促性腺激素(HCG)的高效制备方法，其特征在于：采用梯度洗脱，洗脱液A为、浓度为20-50mmol的磷酸盐平衡缓冲液，洗脱液B为在洗脱液A基础上添加了3mol/L氯化钠，染料亲和层析填料优选GE蓝色染料亲和层析。
8.如权利要求1所述的人绒毛膜促性腺激素(HCG)的高效制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的反相高效液相色谱层析填料选自C12、C16、C18或C30的RP-HPLC基体。
9.如权利要求8所述的人绒毛膜促性腺激素(HCG)的高效制备方法，其特征在于：所述亲水性C18填料，孔径大于300埃，粒径10微米。
10.如权利要求8所述的人绒毛膜促性腺激素(HCG)的高效制备方法，其特征在于：所述反相高效液相色谱层析步骤为：A相为pH2-3、浓度为20-50mmol混合磷酸盐缓冲液，B相为甲醇，上样后平衡使用95％A+5％B的混合缓冲液，洗脱条件为B相50分钟内由5％升到35％。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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