ES2284559T3 - Genes y proteinas e6 y e7 modificados del vph utiles como vacuna. - Google Patents
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Abstract
Una secuencia de ADN que codifica para una proteína de fusión de E6 o E7 del VPH, en donde dicha secuencia de ADN se caracteriza por una combinación de las siguientes propiedades: (a) al menos el 20% de los codones originales se han sustituido por codones que producen un aumento en la traducción en células de mamífero; (b) contiene una mutación que resulta en la producción de una proteína truncada no funcional; y (c) codifica para un componente de la proteína de fusión que es un polipéptido altamente inmunogénico capaz de aumentar la inmunogenicidad de la proteína E6 o E7 en el huésped mamífero.
Description
Genes y proteínas E6 y E7 modificados del VPH
útiles como vacuna.
La presente invención se refiere a las
secuencias de ADN que codifican para una proteína de fusión de E6 o
E7 del VPH, en donde dichas secuencias de ADN están caracterizadas
por una combinación de las siguientes propiedades: al menos el 20%
de los codones originales se sustituyen por codones que producen un
aumento de la traducción en células de mamífero, contienen una
mutación que resulta en la producción de una proteína truncada no
funcional, y codifican para un componente de la proteína fusión que
es un polipéptido altamente inmunogénico capaz de aumentar la
inmunogenicidad de las proteínas E6 o E7 en el huésped mamífero.
Además, esta invención se refiere a las proteínas de fusión de E6 o
E7 modificadas codificadas por dichas secuencias de ADN así como a
vectores de expresión que contienen dichas secuencias de ADN.
Finalmente, la presente invención se refiere a varios usos de los
compuestos arriba mencionados, particularmente como vacunas eficaces
en el tratamiento o prevención de una infección por VPH o una
neoplasia asociada a una infección por VPH.
El carcinoma de cérvix o cuello de útero (cáncer
cervical, CC) es el segundo cáncer más común en mujeres en el
mundo, y el primero en países en desarrollo. El CC se desarrolla a
través de fases intermedias premalignas de severidad creciente
conocidas como neoplasia intraepitelial cervical (NIC), de grados
1-3, produciendo el último el desarrollo de cáncer
invasivo en aproximadamente el 50% de los casos en un período de
1-2 décadas. Más del 11% de la incidencia global de
cáncer en mujeres es debido a infecciones por papilomavirus humano
(VPH). Las infecciones por VPH de tipo 16 y 18 se han relacionado
con el desarrollo de NIC y CC, siendo el genotipo 16 del VPH el
tipo viral más frecuente en la infección de cérvix. Se cree que las
proteínas E6 y E7 codificadas por estos tipos de VPH están
implicadas en la patogénesis del CC induciendo una proliferación
celular anormal. La expresión de E6 y E7 se detecta consistentemente
en tejidos y células tumorales de CCs asociados a VPH. Además, los
genes E6 y E7 de VPH de tipo 16 y 18 bastan para transformar células
epiteliales en cultivo (zur Hausen, Biochim. Biophys. Acta
1288(2) (1996): F55-78).
Existen evidencias cada vez mayores de que las
proteínas E6 y E7 codificadas por VPH de tipo 16 y 18 pueden ser
dianas inmunológicas efectivas para el rechazo del tumor por el
huésped. Se están realizando esfuerzos para desarrollar vacunas
preventivas y terapéuticas que puedan ser útiles en el tratamiento y
prevención de la neoplasia asociada al VPH. Las diferentes
estrategias empleadas hasta ahora para inducir una respuesta inmune
contra las proteínas del VPH de tipo 16 y 18 son: (a) uso de
péptidos antigénicos sintéticos, (b) uso de microorganismos
recombinantes (bacilo recombinante Calmette-Guerin;
BCG), (c) uso de vacunas de ADN utilizando genes virales salvajes y
(d) uso de partículas pseudovirales (Virus-like
particles, VLPs).
Sin embargo, desafortunadamente, las estrategias
descritas arriba muestran una serie de inconvenientes que han
impedido hasta ahora el desarrollo de una vacuna segura y eficiente.
Por lo que se refiere al uso de péptidos antigénicos sintéticos
debe subrayarse que la identificación de péptidos inmunoreactivos,
específicos del VPH es muy compleja. Exige gran número y cantidades
de péptidos para que las vacunas sean efectivas y de un amplio
espectro. Por otra parte, los péptidos sintéticos no contienen
modificaciones postraduccionales (p.ej., glicosilación,
sulfatación, fosforilación) normalmente presentes en las proteínas
nativas y por lo tanto no son suficientemente efectivas como
vacunas. Se han utilizado como inmunógenos sistemas de distribución
de vacunas basados en el BCG que expresan la proteína tardía L1 del
VPH 6b o la proteína temprana E7 del VPH 16. Sin embargo, las
respuestas inmunes obtenidas con estos sistemas han sido incluso
menores que las obtenidas con vacunas proteína/adyuvante y, así, se
considera poco probable que este sistema sea útil como estrategia
de vacuna de un solo componente. Por lo que se refiere a las vacunas
de ADN se ha observado que la expresión de genes salvajes del VPH
es bastante baja incluso si se expresan bajo promotores fuertes,
como el del citomegalovirus (CMV). En cuanto al uso de partículas
pseudovirales (VLPs) se debe decir que las verdaderas VLPs están
hechas de la proteína L1 (cápsida) de un tipo específico de VPH.
Por lo tanto, puede que solo sean útiles como vacunas profilácticas
más que como vacunas terapéuticas. También se han descrito VLPs
pseudotipadas que contenían, por ejemplo, epítopos de E7 del
VPH-16 y pueden ser útiles como vacunas
profilácticas y terapéuticas. Sin embargo, una limitación
importante es que las VLPs se producen en células de insecto o en
levaduras. Hasta ahora no se han establecido sistemas de producción
apropiados en células de mamífero. Por lo tanto en estos sistemas
se pierden epítopos críticos que dependen de las modificaciones
postraduccionales que tienen lugar en células humanas.
Por tanto, el propósito de la presente invención
es proporcionar una vacuna segura y efectiva, preferentemente una
vacuna genética, para el tratamiento o prevención de una infección
por VPH o una neoplasia asociada al VHP.
Según la invención esto se consigue con el
objeto definido en las reivindicaciones. La presente invención
proporciona secuencias de ADN para inducir respuesta inmune a las
proteínas E6 y/o E7 del VPH oncogénico en un huésped animal,
preferentemente administrando vectores que contienen dichas
secuencias de ADN, p.ej. plásmidos, amplicon del virus del herpes
simple tipo I o vectores recombinantes derivados del virus del
bosque de Semliki. Dichas secuencias de ADN codifican proteínas del
VPH como proteínas de fusión que son inmunogénicas pero no son
capaces de inducir transformación celular. Las secuencias de ADN de
la invención tienen las siguientes características:
(a) Las secuencias de ADN de los genes E6/E7 del
VPH se han modificado para transformar su uso de codones en uno más
próximo al de los genes humanos, es decir, al menos el 20% de los
codones originales se han sustituido por codones que producen un
aumento de la traducción en células de mamífero, (b) los genes se
han modificado por mutación para hacerlos no funcionales, de ese
modo inhabilitando su capacidad oncogénica (las deleciones son,
preferentemente, mutaciones puntuales, porque estas conducen a la
pérdida de epítopos potencialmente esenciales), (c) los genes del
VPH se han fusionado a proteínas altamente inmunogénicas para
aumentar su inmunogenicidad en el huésped (no se espera que estas
fusiones enmascaren epítopos de las proteínas del VPH, ya que los
fragmentos fusionados tienen la suficiente longitud para evitar
este problema), y, preferentemente, la expresión de los genes del
VPH se produce por medio vectores recombinantes, HSV deficientes en
replicación, SFV o plásmidos de alto número de copia, o
combinaciones de los mismos.
Este planteamiento ofrece una serie de ventajas,
a saber:
(a) Se obtienen niveles de expresión más altos
de la proteína del VPH como resultado de las mutaciones silenciosas
introducidas en los genes del VPH para hacer su uso de codones más
próximo al humano. Esto resulta en una respuesta del huésped más
eficiente en ensayos de inmunización comparado con el uso de genes
salvajes del VPH.
(b) Las proteínas y genes del VPH generadas por
la presente invención se expresan en células humanas y, a
diferencia de las proteínas expresadas en otros sistemas como
bacteria, levaduras o células de insecto, contienen las
modificaciones postraduccionales normalmente encontradas en
proteínas expresadas en células humanas. Esto es decisivo para un
reconocimiento adecuado de las proteínas del VPH por el sistema
inmune del huésped.
(c) Puesto que las proteínas del VPH se expresan
fusionadas a proteínas que se sabe son altamente inmunogénicas,
provocan respuestas inmunes más fuertes en el huésped animal.
(d) Las proteínas del VPH no transforman células
ni in vitro ni en el huésped animal porque en ningún caso se
expresan como polipéptidos completos. Los genes de fusión del VPH
expresan proteínas incompletas, cuyas funciones están deterioradas.
Además, las proteínas del VPH se expresan como fusiones a proteínas
citoplásmicas y por lo tanto no pueden alcanzar el núcleo donde
ejercen sus funciones.
(e) Las proteínas del VPH se expresan,
preferentemente, etiquetadas con una secuencia específica, que puede
ser fácilmente detectada en Western blots y por
inmunofluorescencia con la ayuda de anticuerpos disponibles
comercialmente.
(f) La combinación de varios vectores virales y
de estos con vectores plasmídicos asegura una inmunización más
eficiente, ya que previene la neutralización del vector por una
reacción inmune provocada en una estimulación previa.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a
secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión de E6 o E7 del
VPH, en donde dicha secuencia de ADN se caracteriza por una
combinación de las siguientes propiedades:
- (a)
- al menos el 20% de los codones originales se sustituyen por codones que producen un incremento en la traducción en células de mamífero;
- (b)
- contiene una mutación que resulta en la producción de una proteína truncada no funcional; y
- (c)
- codifica un componente de la proteína de fusión que es un polipéptido altamente inmunogénico capaz de aumentar la inmunogenicidad de las proteínas E6 o E7 en el huésped mamífero.
La expresión "codones originales" se
refiere a los codones que se encuentran en la correspondiente
versión salvaje del VPH.
La expresión "incremento en la traducción en
células de mamífero" se refiere a los genes que resultan de
introducir mutaciones silenciosas en las secuencias del VPH, como
se describe en la presente invención, que crea un marco abierto de
lectura compuesto totalmente por codones preferidos en humanos, y
así produce un aumento de la expresión de las proteínas que
codifican en células de mamífero.
El término "mutación que resulta en la
producción de una proteína truncada, no funcional" se refiere a
cualquier mutación que lleva a la producción de una versión no
funcional de la proteína. Preferentemente, tal mutación lleva a una
versión truncada de la proteína. Ejemplos de mutaciones apropiadas
incluyen una mutación, en donde al menos un codón se ha delecionado
o una mutación que lleva a una terminación prematura de la
traducción. Tal mutación es, p.ej., la sustitución de un codón que
codifica para un determinado aminoácido por un codón de
terminación, una inserción o deleción de uno o dos nucleótidos que
resulta en una mutación con cambio en el marco de lectura etc. El
término "proteína o gen no funcional" significa que los genes
y proteínas mutantes del VPH de la presente invención son "no
transformantes ni in vitro ni in vivo"
significando que se ha eliminado la capacidad de los genes y
proteínas E6 o E7 para transformar células a un fenotipo
tumorigénico como se demuestra mediante ensayos estándar. El
experto en la materia puede determinar fácilmente si una mutación
particular produce un gen o proteína E6 o E7 con las características
deseadas, es decir, que es "no transformante" de acuerdo a
procedimientos estándar. Estos incluyen:
- 1)
- In vitro: ensayos de transformación de células NIH 3T3 y queratinocitos primarios humanos. Rutinariamente se han identificado genes transformantes (oncogenes) mediante el uso de ensayos en los que focos transformados resultan de la transfección de ADN tumoral o recombinante en células NIH 3T3 (Todaro et al., PNAS USA 51: 66-73, 1964; Jainchill et al., J. Virol. 4: 549-553, 1969; Andersson et al., Cell 16: 63-75, 1979). Estas células son fibroblastos murinos mantenidas como lineas celulares no tumorigénicas inhibidas por contacto. La transferencia de ADN que contenga un oncogén activo producirá ocasionalmente focos de células morfológicamente alteradas que tienen propiedades tumorigénicas.
- 2)
- In vivo: Rutinariamente se realizan ensayos de tumorigenicidad en ratones inmunodeficientes mediante la inoculación de células transformadas humanas o de ratón. Se ha demostrado que células transfectadas que expresan los genes del VPH E6 y E7 y líneas celulares derivadas de carcinomas cervicales infectados por VPH, como las células HeLa, son tumorigénicas (Lichy et al. Cell Growth Differ. 3: 541-548, 1992, Stanbridge, Nature 260: 17-20, 1976).
En una forma de realización preferida, la
secuencia de ADN de la presente invención codifica la proteína E7
del VPH con las características descritas arriba.
En otra forma de realización preferida, al menos
el 50% de los codones originales de la secuencia de ADN de la
presente invención se sustituyen por codones que producen un aumento
de la traducción en células de mamífero; ejemplos de sustituciones
adecuadas se muestran p.ej., en las figuras 1 y 2.
En una forma de realización aún más preferida,
la secuencia de ADN de la presente invención contiene una mutación
puntual de cambio de marco de lectura que produce una terminación
prematura de la traducción.
El experto en la materia sabe de polipéptidos o
partes de los mismos que son adecuados como componentes de la
fusión para las proteínas E6 o E7 y que son altamente inmunogénicos
en mamíferos, particularmente en humanos. Ejemplos de polipéptidos
adecuados incluyen:
- 1)
- Proteína pequeña de la envuelta del virus de la hepatitis B (HBsAg-S). Esta proteína tiene la capacidad de auto ensamblarse con membranas procedentes del huésped para formar partículas subvirales vacías, que se liberan en la luz de un compartimento pre-Golgi y que son con posterioridad secretadas (Ganem, "Hepadnaviridae and their replication" p2703-37, in Fields, Knipe and Howley (eds.), Fields Virology 3^{rd} ed. 1996, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia). E6 o E7 se pueden fusionar a la zona C-terminal de la proteína que permanece expuesta en la superficie de la partícula subviral.
- 2)
- Glicoproteína E2 del virus del bosque de Semliki (SFV). E2 es un componente de la espícula del virión del SFV y un antígeno principal para anticuerpos neutralizantes (Schlessinger and Schlessinger, "Togaviridae: the virases and their replication" in Fields, Knipe and Howley (eds.), Fields Virology 3^{rd} ed. 1996, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia). E6 o E7 se pueden fusionar a la zona N-terminal de la proteína E2 que está expuesta en la superficie de la envuelta viral o de la membrana plasmática de células que expresan E2.
- 3)
- Proteína precursora del \beta-amiloide humana (APP). APP es una proteína transmembrana con una región extracelular grande y una cola citoplásmica pequeña. Normalmente es cortada por una proteasa para dar lugar a un péptido \beta de 40 aminoácidos (amiloide), que se encuentra en las placas de pacientes con la enfermedad de Alzheimer, o a un fragmento menor llamado p3, que puede asociarse con la matriz extracelular ("Principles of neural Science", Kandel, Schwartz and Jessell, (eds.) 3^{rd} ed., 1991, Elsevier, New York). E6 y E7 se pueden insertar en la parte extracelular de la APP y se cree que puedan liberarse junto con el péptido \beta o el fragmento p3.
- 4)
- Cromogranina B humana (hCgB). Aunque la hCgB es una proteína implicada en la vía secretora regulada, se ha demostrado que tras transfección se secreta constitutivamente en células sin vía regulada, como las células HeLa, (Kaether and Gerdes, FEBS Letters 369: 267-271, 1995). E6 o E7 se pueden fusionar a la región C-terminal de la hCgB.
- 5)
- La \beta-galactosidasa bacteriana, que se sabe que es altamente inmunogénica (Fijikawa et al. Virology 204: 789-793, 1994). E6 o E7 se pueden fusionar a las regiones N- o C-terminal de la proteína. Como el producto de fusión es una proteína soluble no de membrana que puede difundir al núcleo, E6 o E7 es un mutante de deleción (inactivo). Alternativamente, se añade a la fusión un péptido señal que dirige el producto hacía la superficie celular.
- 6)
- Fusión de las mitades N- o C-terminal de E6 o E7 juntas y fusión de la proteína quimérica resultante a cualquiera de las proteínas descritas arriba.
La presente invención se refiere
particularmente, pero no exclusivamente, a los genes y proteínas E6
y E7 de los genotipos VPH-16 y
VPH-18. Sin embargo, se valorará que la invención se
extiende a cualquier genotipo del VPH y a otros genotipos del VPH
que puedan tener potencial oncogénico o patológico.
En una forma de realización preferida, la
presente invención se refiere a genes quiméricos que codifican una
poliproteína que contiene E6 y E7 del VPH-16 y E6 y
E7 del VPH-18, bien completos o como fragmentos de
deleción que contienen la mitad N- o C-terminal de
dichas proteínas, fusionados juntos y a polipéptidos o partes de
los mismos mencionados arriba. Esto permite la inmunización contra
el VPH16 y el VPH18 utilizando un solo producto como
inmunógeno.
El experto en la materia valorará que la fusión
de E6 y/o E7 a las proteínas 1-4 de la lista de
arriba elimina la translocación de las primeras al núcleo, por lo
tanto interfiriendo con su función. Además, la secreción o
exposición en la superficie de las proteínas de fusión es
intencionada para facilitar su reconocimiento por el sistema
inmune.
inmune.
En una forma de realización particular
preferida, la presente invención se refiere a secuencias de ADN en
donde las partes (a) y (b) comprenden la región codificante de las
secuencias ADN como se representa en las figuras 1, 2, 3, o 4
incluyendo la etiqueta Flag o no. Una forma de realización aún más
preferida de las secuencias de ADN de la presente invención, es la
que comprende la región codificante de la secuencia de ADN como se
representa en la figura 5, incluyendo la etiqueta Flag o no.
Preferentemente, las secuencias de ADN que
codifican para las proteínas de fusión mutantes del VPH E6 y E7
están en un vector o en un vector de expresión. El experto en la
materia está familiarizado con ejemplos de esto. En el caso de un
vector de expresión para E. coli estos son p.ej. pGEMEX,
derivados de pUC, pGEX-2T, pET3b, vectores de
expresión basados en T7 y pQe-8. Para la expresión
en levaduras p.ej., pY100 y Ycpad1 deben mencionarse mientras que
pKCR, pEFBOS, cDM8, pMSCND y pCEV4 deben mencionarse para la
expresión en células animales. El vector de expresión de
baculovirus pAcSGHisNT-A es especialmente adecuado
para la expresión en células de insecto. Las secuencias de ADN de
la presente invención también pueden estar contenidas en virus
recombinantes que tengan casetes de expresión apropiados. Virus
adecuados que pueden usarse en la presente invención incluyen
baculovirus, virus de la vacuna, virus Sindbis, SV40, virus Sendai,
adenovirus, virus AAV, o parvovirus como el MVM o el
H-1. El vector también puede ser un retrovirus, como
MoMULV, MoMuLV, HaMuSv, MuMTV, RSV, o GaLV. Plásmidos y virus
recombinantes particulares preferidos son piREs-Neo2
(Clontech, Heidelberg, Alemania), pTet-On
(Clontech), pHSVPUC (Geller et al., PNAS USA 87 (1990),
8950-8954), amplicones de HSV y vectores de SFV
recombinante. Para su expresión en mamíferos, las secuencias de ADN
de la invención se unen operativamente a un promotor adecuado,
p.ej., al "promotor temprano inmediato" del citomegalovirus
humano (pCMV), promotor temprano y amplificador del SV40, promotor
SR\alpha (Takebe et al. Mol. Cell. Biol. 8:
466-472, 1988), sistema de expresión de genes
Tet-On / Tet-Off, el promotor
temprano inmediato E4/5 del HSV-1 (Geller et
al., PNAS USA 87: 8950-8954, 1990).
Para generar secuencias de ADN que codifican
proteínas de fusión de E6 y E7 que contienen las modificaciones
discutidas arriba y para construir los vectores de expresión que
contienen las secuencias de ADN según la invención es posible
utilizar métodos generales conocidos en la materia. Estos métodos
incluyen p.ej., técnicas de recombinación in vitro, métodos
sintéticos y métodos de recombinación in vivo como se
describen por ejemplo en Sambrook et al., Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, 2^{nd} edidition (1989) Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Además, la presente invención se refiere a las
células huésped que contienen las secuencias de ADN o vectores
descritos arriba. Estas células huésped incluyen bacterias,
levaduras, células de insecto y mamífero, preferentemente células
de mamífero. Las cepas de E. coli HB101, DH1, x1776, JM101,
JM109, BL21, XL1Blue, y SG 13009, la cepa de levadura
Saccharomyces cerevisiae, las células de insecto sf9 y las
células animales L, A9, 3T3, FM3A, BHK, SW13 humanas, CHO, COS,
Vero y HeLa son preferidas. Los métodos para transformar estas
células huésped, para seleccionar los transformantes
fenotípicamente y para expresar el ADN según la invención son
conocidos en la materia.
La presente invención también se refiere a una
proteína de fusión del VPH E6 o E7 codificada por las secuencias de
ADN descritas arriba. La proteína de fusión del VPH E6 o E7 se
suministra como material aislado, purificado y por lo tanto libre
de otras proteínas. Dichas proteínas de fusión del VPH se expresan,
preferentemente, en células humanas y, a diferencia de las
proteínas expresadas en otros sistemas tal como bacterias, levaduras
o células de insecto, contienen las modificaciones
postraduccionales normalmente encontradas en proteínas expresadas
en células humanas. Esto puede ser de una importancia decisiva para
un reconocimiento adecuado de las proteínas del VPH por el sistema
inmune del huésped.
Además, la presente invención se refiere a un
método para producir las proteína de fusión de E6 o E7 arriba
descritas, para lo cual p.ej., se cultivan células huésped de la
invención bajo condiciones que permitan la síntesis de la proteína
y la proteína posteriormente se aisla de las células en cultivo y/o
del medio de cultivo. El aislamiento y purificación de las
proteínas recombinantes producidas se puede llevar a cabo por
métodos convencionales incluyendo cromatografía preparativa y
separaciones de afinidad e inmunológicas mediante cromatografía de
afinidad con anticuerpos monoclonales o policlonales.
La presente invención también se refiere a una
composición farmacéutica que consta de una secuencia de ADN y un
vector de expresión de la invención o, alternativamente, la proteína
de fusión del VPH E6 o E7 codificada por dicha secuencia de ADN en
un soporte farmacéuticamente aceptable.
\newpage
Finalmente, la presente invención se refiere a
varios usos de las secuencias de ADN de la invención, vectores de
expresión o proteínas de fusión del VPH E6 o E7. Los usos preferidos
son:
- (a)
- Preparación de una vacuna para la prevención o tratamiento de una infección por VPH o neoplasia asociada con una infección por VPH. Preferentemente, la vacuna es una vacuna genética basada en las secuencias de ADN de la invención insertadas en un vector apropiado bajo el control de un promotor adecuado, p.ej., un vector o promotor como los descritos arriba. Una vacuna semejante se puede usar para estimular la respuesta inmune humoral y/o celular en sujetos que se puedan beneficiar de tales respuestas por protección contra o tratamiento de posibles infecciones por VPH o por rechazo de células de tumores o lesiones que están infectadas por VPH y expresan las proteínas virales.
- (b)
- Producción de anticuerpos policlonales o monoclonales que pudieran ser útiles como agentes terapéuticos. Tales anticuerpos se pueden generar según métodos bien conocidos.
- (c)
- Detección de anticuerpos específicos o linfocitos T citotóxicos en sujetos infectados por VPH, es decir, uso en ensayo diagnóstico. Formatos de ensayo adecuados (RIA, ELISA, etc.) son bien conocidos para el experto en la materia.
- (d)
- Generación de una línea de ratones transgénicos utilizando, p.ej., las secuencias de ADN de la invención bajo el control de un promotor inducible por tetraciclina. Tal línea de ratones podría ser útil para ensayar vacunas contra el VPH.
\vskip1.000000\baselineskip
Se muestra la secuencia de nucleótidos y la
secuencia de aminoácidos derivada (código de una letra) del gen E7
del VPH-16 mutagenizado (EE7T). Las mutaciones
silenciosas introducidas para crear un marco abierto de lectura con
los codones preferidos en humanos están indicadas en negrita. Las
secuencias que codifican para las etiquetas
hexa-His o Flag están subrayadas. El codón de
terminación está indicado con un asterisco.
Se muestra la secuencia de nucleótidos y la
secuencia de aminoácidos derivada (código de una letra) del gen E6
del VPH-16 mutagenizado (EE6T). Las mutaciones
silenciosas introducidas para crear un marco abierto de lectura con
los codones preferidos en humanos están indicadas en negrita. Las
secuencias que codifican para las etiquetas
hexa-His o Flag están subrayadas. El codón de
terminación está indicado con un asterisco.
Se muestra la secuencia de nucleótidos y la
secuencia de aminoácidos derivada (código de una letra) del gen E7
del VPH-18 mutagenizado (EE7T). Las mutaciones
silenciosas introducidas para crear un marco abierto de lectura con
los codones preferidos en humanos están indicadas en negrita. Las
secuencias que codifican para las etiquetas
hexa-His o Flag están subrayadas. El codón de
terminación está indicado con un asterisco.
Se muestra la secuencia de nucleótidos y la
secuencia de aminoácidos derivada (código de una letra) del gen E6
del VPH-18 mutagenizado (EE6T). Las mutaciones
silenciosas introducidas para crear un marco abierto de lectura con
los codones preferidos en humanos están indicadas en negrita. Las
secuencias que codifican para las etiquetas
hexa-His o Flag están subrayadas. El codón de
terminación está indicado con un asterisco.
Se muestra la secuencia de nucleótidos y la
secuencia de aminoácidos derivada (código de una letra) del gen de
fusión HbsAg-EE7T. Los fragmentos fusionados están
separados por tres puntos. Las mutaciones silenciosas introducidas
en el gen E7 del VPH-16 (EE7T) para convertir el
marco abierto de lectura en uno con los codones preferidos en
humanos están indicadas en negrita. La secuencia que codifica para
la etiqueta Flag está subrayada. El codón de terminación está
indicado con un asterisco.
Se transfectaron células Vero crecidas en
cubreobjetos con los plásmidos pIRES-Neo2/EE7T o
pIRES-Neo2E7T utilizando el reactivo de
transfección "FuGene" (Roche, Basilea, Suiza). Las células se
incubaron durante 48 horas, se fijaron con paraformaldehído al 2%,
se permeabilizaron con Triton X-100 al 0.2% y se
tiñeron mediante incubaciones secuenciales con anticuerpos
monoclonales M2 anti-Flag
(Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) y anticuerpos
de cabra anti-ratón conjugados a cy2 (Dianova,
Hamburgo, Alemania).
Se transfectaron células HeLa como se describe
en la Figura 6. Las células se lisaron tras 24 horas en tampón SDS,
las proteínas se separaron mediante PAGE (poliacrilamida al 15%), se
transfieron a membrana de PVDF (Immobilon-p,
Millipore, Eschborn, Alemania) y se hibridaron con anticuerpos
monoclonales M2 anti-Flag conjugados con peroxidasa
de rábano, cuya actividad se detectó mediante el ensayo de ECL.
La presente invención se explica mediante los
ejemplos.
El gen E7 del VPH-16 se
mutagenizó in vitro para introducir 64 mutaciones
silenciosas que crean un marco abierto de lectura compuesto por los
codones preferidos en humanos. Además, los genes mutantes del E7 se
fusionaron a etiquetas de hexahistidina y Flag.
Los genes mutantes E7 se produjeron
sintéticamente mediante pasos secuenciales de la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En el primer paso de la PCR, se usaron los
cebadores (b) y (e) (PCR1) y los cebadores (c) y (f) (PCR2) para
generar los fragmentos respectivos por extensión de la cadena sin
utilizar molde. En un segundo paso, los productos de PCR1 y PCR2 se
utilizaron para amplificar un fragmento individual sin utilizar
cebadores (PCR3). En un tercer paso, el producto de PCR3 se utilizó
como molde para amplificar el gen E7 completo con los cebadores (a)
y (d)
(PCR4).
(PCR4).
En un paso final de PCR, el producto de PCR4
(EE7) se utilizó como molde para amplificar lo siguiente: (1)
utilizando los cebadores (g) e (i) se sintetizó la secuencia
completa de E7 fusionada a las secuencias que codifican la etiqueta
hexa-His (epítopo HHHHHH) en su zona
N-terminal y la etiqueta Flag (epítopo DYKDDDDK) en
su zona C-terminal (E7 mejorado con marcadores:
EE7T); (2) usando los cebadores (h) e (i) se sintetizó un E7
truncado (EE7T\Delta1) sin los primeros 35 residuos y que contiene
las etiquetas His y Flag como se ha descrito arriba.
Los genes mutantes E7 etiquetados se aislaron de
las mezclas de reacción de PCR mediante electroforesis en gel de
agarosa, se digirieron con NheI y EcoRI y se clonaron en el sitio
múltiple de clonaje del plásmido pIRES-Neo2
(Clontech, Heidelberg, Alemania) digerido previamente con las mismas
enzimas de restricción. Después de transformar bacterias
DH5\alpha, se identificaron y secuenciaron clones individuales.
Los clones con la secuencia correcta se expandieron y se utilizaron
para purificar los plásmidos correspondientes. Como control, un gen
E7 salvaje y un mutante truncado sin los primeros 35 residuos, ambos
etiquetados de la misma manera que los mutantes de EE7T descritos
arriba, se clonaron por PCR (genes E7T y E7\Delta1T), y se
insertaron posteriormente en los sitios NheI y EcoRI del plásmido
pIRES-Neo2.
El producto EE7 de PCR4 también se clonó en un
vector pBluescript (Stratagene, Ámsterdam, Holanda) y se utilizó
para mutagénesis que dio como resultado un mutante de deleción doble
sin los residuos 26-32 y 70-74. El
producto EE7 de PCR4 se utilizó como molde para amplificación como
sigue: (1) utilizando los cebadores (g) e (i) se generó un mutante
de deleción de EE7T sin los residuos 26-32 y
70-74 (EE7T\Delta2,3) con etiquetas His y Flag,
(2) utilizando los cebadores (h) e (i) se generó un EE7T truncado
sin los primeros 35 residuos y sin los residuos
70-74 (EE7T\Delta1,3) con las etiquetas His y Flag
como se ha descrito arriba.
La expresión de los genes de fusión de EE7T
descritos en el Ejemplo 1, arriba, se ensayó in vitro
mediante análisis de inmunofluorescencia y Western blot comparada
con la de controles E7T. Los plásmidos de arriba se utilizaron para
transfección transitoria usando lineas celulares eucarióticas de
ratón (C-26), mono (Vero 2-2) y
humanas (HeLa). La línea celular Vero 2-2 contiene
el gen y promotor IE2 del HSV-1 (ICP27). Esta línea
fue originalmente establecida por R.M. Sandri-Goldin
et al. (Smith et al. Virology 186 (1992),
74-86). A diferentes tiempos de expresión las
células se fijaron con paraformaldehido y se procesaron para
inmunodetección o se lisaron en tampón de carga con SDS y se
analizaron por Western blot. En ambos casos las proteínas de fusión
de E7 se detectaron con anticuerpos monoclonales de ratón
específicos para los epítopos hexa-His
(anti-His-tag Ab-1,
Calbiochem-Novabiochem, Bad Soden, Alemania) o Flag
(anti-Flag M2, Sigma-Aldrich,
Steinheim, Alemania).
Análisis de las imágenes de las preparaciones de
inmunofluorescencia mostraron expresión de las proteínas mutantes
en el núcleo de las células transfectadas (Figura 6). Western blots
incubados con anticuerpos monoclonales dirigidos contra el epítopo
Flag mostraron que la expresión de los genes E7 mutagenizados (EE7
y sus mutantes de deleción descritos arriba) fue al menos dos
órdenes de magnitud mayor que aquella del gen E7 equivalente hecha
de codones salvajes (VE7 y sus mutantes de deleción) (Figura 7).
Para aumentar el potencial antigénico de E7, se
crearon proteínas de fusión entre el marco abierto de lectura del
EE7 etiquetado y un gen que codifica el antígeno de superficie del
virus de la hepatitis B (HbsAg). El gen de fusión se creó mediante
clonaje con PCR de los genes HbsAg y EE7. El plásmido
pRc/CMV-HBs (Aldevron, Fargo, USA) sirvió como
molde para amplificar el gen HbsAg utilizando los cebadores
5'-CTC GAG GAT TGG GGA-3' y
5'-GAT ATC AAT GTA TAC CCA AAG A-3'.
El fragmento resultante contiene la secuencia completa del marco
abierto de lectura del HbsAg excepto el codón de terminación, que
se reemplazó por un sitio EcoRV. Los genes mutantes de EE7T se
amplificaron utilizando como molde el gen EE7 completo descrito en
Ejemploa1 y como cebadores para el extremo 5' los oligonucleótidos
5'-GAT ATC GAG GAG GAC GAG ATC GA-3'
o 5'-GAT ATC ATG CAC GGC GAC A-3' y
para el extremo 3' el oligonucleótido (i) descrito en el Ejemplo 1.
Los genes EE7 amplificados de esta manera se cortaron con EcoRV y
se ligaron en el extremo 3' del HbsAg generado arriba para producir
genes de fusión HbsAg-EE7 que expresan bien el gen
EE7 completo, o los mutantes de deleción EE7T\Delta1 o
\Delta.
Los genes de fusión HbsAg-EE7T
se clonaron en el sitio múltiple de clonaje del plásmido pIRESNeo2
y se utilizaron para transfección transitoria usando líneas
celulares eucarióticas de ratón (C-26, librería de
tumor, DKFZ, Heidelberg, Alemania), mono (Vero 2-2)
y humanas (HeLa).
Se ha acumulado evidencia experimental que
demuestra que E6 y E7 de los VPH16 y VPH18 tienen potencial de
transformación. Cuando se expresan bajo el control de promotores
heterólogos fuertes, se ha mostrado que estos genes transforman
células de ratón establecidas (Kanda et al., J. Virol. 62:
610-613, 1988; Vousden et al., Oncogene Res.
3:167-175, 1989) y que inmortalizan queratinocitos
primarios de prepucio murinos y humanos (Halbert et al., J.
Virol. 65:473-478, 1991; Hudson et al., J.
Virol. 64: 519-526, 1990; Sedman et al., J.
Virol. 65: 4860-4866).
El potencial de transformación de los genes
mejorados de la presente invención y de sus derivados (proteínas de
fusión como la de la Figura 5 y otras en que el gen del VPH tiene
una deleción de al menos el 50%) se ensayaron mediante métodos
estándar usando células de ratón NIH 3T3 y queratinocitos humanos
primarios. Sus homólogos salvajes y vectores vacíos se utilizaron
como controles positivo y negativo, respectivamente.
Los genes mejorados del VPH y sus construcciones
de ADN de fusión se subclonaron en el sitio múltiple de clonaje del
plásmido pIRESNeo2 (Clontech, Heidelberg, Alemania). Los plásmidos
resultantes se amplificaron en E. coli y se purificaron con
resinas (Quiagen, Hilden, Alemania), se eluyeron, se precipitaron
con etanol y se resuspendieron en agua desionizada, estéril. La
cantidad y pureza del ADN se determinaron mediante medidas
espectrofotométricas de absorbancia a 260 y 280 nm y por
electroforesis en gel de agarosa. Las células NIH 3T3 (ATCC,
Manassas) se man-
tuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con L-glutamina y suero fetal de ternera al 10%.
tuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con L-glutamina y suero fetal de ternera al 10%.
La tranfección de células NIH 3T3 con ADN de
plásmidos se llevó a cabo utilizando el reactivo de transfección
FuGene^{TM} 6 (Roche, Mannheim, Alemania) esencialmente como
describe el fabricante. Las células sembradas a 3x10 en placas de
100 mm se transfectaron al día siguiente con 3 \mug del plásmido a
ensayar. Cada transfección se hizo por triplicado. Tras 48 horas de
incubación a 37ºC las células se retiraron por tripsinización y
bien se ensayó la formación de colonias en agar blando o bien se
subcultivaron en tres placas de 100 mm y se incubaron durante otras
24 horas a 37ºC antes de que se llevara a cabo la selección en medio
que contiene Geneticin (Life Technologies, Karlsruhe, Alemania) a
una concentración de 500 \mug/ml. Para los ensayos de formación
de colonias en agar blando, las células tripsinizadas se sembraron
en agar al 0.4% en medio de cultivo a una densidad de 10^{5}
células por placa de 60 mm y se incubaron a 37ºC. La formación de
colonias se contó en placas por duplicado tras dos semanas. Las
colonias resistentes a neomicina se seleccionaron mediante
suplemento de Geneticin a monocapas de células subconfluentes, las
células se tripsinizaron y se ensayaron para la formación de
colonias en agar blando como se ha descrito arriba.
La transfección de queratinocitos humanos
primarios con ADN de plásmidos se llevó a cabo usando el reactivo
de transfección FuGene^{TM} 6 como arriba. Los queratinocitos se
crecieron en medio KGM (kit KMK2, Sigma-Aldrich,
Steinheim, Alemania) en placas de 30 mm. Las células se
transfectaron en el pase 5 con 5 \mug de ADN. Tras acercarse a la
confluencia, los cultivos se repartieron en una proporción de 1:2 y
se llevó a cabo la selección con 100 \mug de Geneticin por
ml.
Todos los genes de fusión mejorados del VPH
ensayados fracasaron en la producción de focos de células NIH 3T3
en agar blando y en la inmortalización de queratinocitos humanos
primarios.
Los genes mejorados del VPH se subclonaron en
el plásmido pHSVPUC (Geller et al., PNAS USA 87:
8950-8954, 1990) y las construcciones recombinantes
resultantes se usaron para generar vectores del amplicon del
HSV-1 como se ha descrito
(Cid-Arregui, y Lim en Cid-Arregui y
Garcia (eds), "Viral Vectors: Basic Science and Gene Therapy",
Biotechniques Books, Eaton Publising, Natick), y estos utilizados
para estudios de inmunización en ratones BALB/c. Se utilizaron
grupos de cinco ratones (de ocho semanas de edad, hembras) para cada
experimento de inmunización. En el día 0, se inocularon
subcutáneamente 50 \mul de una suspensión de
10^{3}-10^{4} partículas virales en suero
salino. En el día 14, una segunda dosis de la formulación se aplicó
de la misma manera. En el día 28, los ratones se sangraron.
Se midieron las respuestas de anticuerpos en el
suero contra E6 y E7 utilizando placas cubiertas con proteínas
recombinantes E6 o E7 usando métodos estándar. Los sueros se
diluyeron en PBS, pH 7.2, que contenía 1 mg/ml de caseína, Tween 20
al 0.5% y alfazurina A al 0.002%.
Tras lavar las placas, se añadieron 0.1
ml/pocillo del suero a ensayar en la dilución apropiada, y se
incubaron las placas durante 1 hora a 38ºC. Para detectar el
anticuerpo unido, se añadieron 0.1 ml de una solución de 0.1
\mug/ml de IgG+IgM (específica para las cadenas H y L) de cabra
anti-ratón marcada con peroxidasa de rábano en PBS
pH 7.2 suplementado como arriba. Las placas se incubaron una hora a
20ºC y se lavaron seis veces con PBS pH 7.2 con Tween 20 al 0.5%.
Después se añadieron 0.1 ml de sustrato TMB (3,3',
5,5'tetrametilbencidina, Sigma-Aldrich, Steinheim,
Alemania). Tras 10 minutos de incubación a 20ºC la reacción se paró
añadiendo 50 \mul de H_{2}SO_{4} 0.5M. Se llevaron a cabo
medidas colorimétricas en un espectrofotómetro de haz vertical a 450
nm.
Todos los ratones inmunizados con vectores que
expresan genes mejorados E6 y E7 del VPH separados o como genes de
fusión como se describe en la presente invención produjeron una
respuesta significativa tras la inmunización que fue claramente
mayor que la producida por los controles
no-mejorados.
<110> Deutsches Krebsforschungzentrum
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Genes y proteínas modificados E6 y
E7 del VPH útiles para vacunación
\vskip0.400000\baselineskip
<130> K 2939
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 01107271.7
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-03-23
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 542
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Gen E6 mutagenizado del VPH-16
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(526)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 171
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Gen E6 mutagenizado del VPH-16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 362
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Gen E7 mutagenizado del VPH-16
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(346)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Gen E7 mutagenizado del VPH-16
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 545
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Gen E6 mutagenizado del VPH-18
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(529)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Gen E6 mutagenizado del VPH-18
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 383
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Gen E7 mutagenizado del VPH-18
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(367)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Gen E7 mutagenizado del VPH-18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1046
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Proteína de fusión HbsAG-EE7T
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (29)...(1030)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 334
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Proteína de fusión HbsAG-EE7T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
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<211> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
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<211> 38
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacctgtact gctacgagca gttgaacgac agctccga
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtgcggat gtccacgtgg gtgctctgca cgca
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaagcttgct agcatgcacc accaccacca ccacggcgac acccccacct tgcacgagta
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaagcttgct agcatgcacc accaccacca ccacgacgag atcgacggcc ccgccggcca
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Marcador Hexa-His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His His His His His His}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Marcador Flag
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
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<400> 22
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgaggatt gggga
\hfill15
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<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
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<400> 23
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\hskip-.1em\dddseqskipgatatcaatg tatacccaaa ga
\hfill22
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<210> 24
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
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<400> 24
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\hskip-.1em\dddseqskipgatatcgagg aggacgagat cga
\hfill23
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
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<400> 25
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\hskip-.1em\dddseqskipgatatcatgc acggcgaca
\hfill19
Claims (19)
1. Una secuencia de ADN que codifica para una
proteína de fusión de E6 o E7 del VPH, en donde dicha secuencia de
ADN se caracteriza por una combinación de las siguientes
propiedades:
- (a)
- al menos el 20% de los codones originales se han sustituido por codones que producen un aumento en la traducción en células de mamífero;
- (b)
- contiene una mutación que resulta en la producción de una proteína truncada no funcional; y
- (c)
- codifica para un componente de la proteína de fusión que es un polipéptido altamente inmunogénico capaz de aumentar la inmunogenicidad de la proteína E6 o E7 en el huésped mamífero.
2. La secuencia de ADN de la reivindicación 1,
en donde la proteína del VPH es una proteína E7.
3. La secuencia de ADN de las reivindicaciones 1
o 2, en donde al menos el 50% de los codones originales se han
sustituido por codones que producen un aumento de la traducción en
células de mamífero.
4. La secuencia de ADN de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la mutación es una mutación puntual
con cambio en el marco de lectura que conduce a una terminación
prematura de la traducción.
5. La secuencia de ADN de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde el componente de la fusión
altamente inmunogénico es el HbsAg o una parte inmunogénica del
mismo.
6. La secuencia de ADN de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde el VPH es VPH-16 o
VPH-18.
7. La secuencia de ADN de cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 6, en donde las partes (a) y (b) comprenden la
región codificante de la secuencia de ADN como se representa en las
Figuras 1, 2, 3, o 4, incluyendo o no la etiqueta Flag.
8. La secuencia de ADN de cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 7, que comprende la región codificante de la
secuencia de ADN como se representa en la figura 5, incluyendo o no
la etiqueta Flag.
9. Un vector de expresión que contenga la
secuencia de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. El vector de expresión de la reivindicación
9, que es un plásmido o un virus recombinante.
11. El vector de expresión de la reivindicación
10, en donde el plásmido o el virus recombinante sea
pIRES-Neo2, pTet-On, pHSVPUC, un
amplicon del HSV o un vector del SFV.
12. Células huésped que contengan la secuencia
de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un vector
de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.
13. Una proteína de fusión de E6 o E7 que está
codificada por la secuencia de ADN de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8.
14. Un método para producir una proteína de
fusión de E6 o E7 según la reivindicación 13, que comprende el
cultivo de las células huésped según la reivindicación 12 bajo
condiciones adecuadas.
15. Composición farmacéutica que comprende una
secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un
vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11,
proteínas de fusión de E6 o E7 según la reivindicación 13 o las
proteínas de fusión de E6 o E7 producidas según el método de la
reivindicación 14 con un soporte farmacéuticamente aceptable.
16. Uso de una secuencia de ADN según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, de un vector de expresión
según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, de las proteínas
de fusión de E6 o E7 según la reivindicación 13 o de las proteínas
de fusión de E6 o E7 producidas según el método de la reivindicación
14 para la preparación de una vacuna para la prevención o
tratamiento de una infección por VPH o una neoplasia asociada a una
infección por
VPH.
VPH.
17. Uso de proteínas de fusión de E6 o E7 según
la reivindicación 13 o producidas según el método de la
reivindicación 14 para la producción in vitro de anticuerpos
policlonales o monoclonales.
18. Uso de proteínas de fusión de E6 o E7 según
la reivindicación 13 o producidas según el método de la
reivindicación 14 en un ensayo in vitro para la detección de
anticuerpos específicos o linfocitos T citotóxicos en una muestra
obtenida de un sujeto infectado por VPH.
19. Uso de una línea de ratones transgénicos
transformada con una secuencia de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 o un vector de expresión de cualquiera de
las reivindicaciones 9 a 11 para probar vacunas contra el VPH in
vitro.
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