CN108459091B - 当归四逆汤组合物指纹图谱的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了当归四逆汤组合物指纹图谱的建立方法，属于中药分析领域。本发明采用高效液相色谱法建立指纹图谱，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；柱温：25‑35℃；流速：0.9‑1.1ml/min；检测波长：220nm；以乙腈A‑0.1％磷酸溶液B为流动相，按如下顺序梯度洗脱：

Description

当归四逆汤组合物指纹图谱的建立方法

技术领域

本发明属于中药分析领域，涉及一种中药复方颗粒质量标准检测方法，特别涉及一种当归四逆汤组合物指纹图谱的建立方法。

背景技术

中药汤剂是临床用药的主流，但因起煎煮、携带不方便，煎煮制备的汤剂质量往往因人、因煎煮器具而存在较大差异，而经典名方临床疗效确切，因简、便、验、廉而深受广大消费者喜爱，运用现代科学技术将经典名方开发承携带方便、便于服用的中药制剂，不仅是对中医药的传承，也是更好的促进经典名方的临床应用。颗粒剂制备工艺相对简单、易于赋形，服用、携带方便，在服用形式上与传统汤剂最为一致，能较大限度的保持传统汤剂的特点，因此以汤剂形式服用的经典名方选择颗粒剂最为适宜。颗粒剂的开发应遵循“原汁原味”的原则，在现有技术条件下，首先通过研究制备明确煎煮参数的标准(基准)汤剂，对基准汤剂的关键质量属性进行研究，主要以单处方标准汤剂的固含量(干膏率)、指纹图谱、多指标成分作为质量参比，指导颗粒的研制。研究中为减少不同来源的饮片存在的质量差异对一致性研究带来影响，选择随行对照的方式，采用同一批次的饮片，煎煮至少10份标准汤剂，以其关键质量的均值作为颗粒剂制备工艺参数研制的“基准”。

当归四逆汤出自《伤寒论》，该方原治厥阴伤寒，为素体血虚、寒凝经脉所致之证。该方由当归、桂枝、细辛、白芍、炙甘草、通草(川木通)、大枣组成。当归四逆汤方适应症广泛、功效明确，且现今没有以当归四逆汤原方为基础开发而成的中成药。该方虽已逾千年，但由于其组方严谨、配伍精良、功效卓越等特点，在临床上以其为基本方应用甚为广泛。现有中药饮片及复方汤剂及颗粒的质量标准，一般包括两方面，形态鉴别、理化鉴别和光谱色谱分析等，其中光谱色谱分析通常包括薄层色谱法、高效液相含量测定方法、指纹图谱法等。作为中药复方当归四逆汤，由两味以上药味组成，有相对规定性的加工方法和使用方法，其所含化学成分相对复杂、药理作用具有多靶点多层次的特点，而且多方面干扰因素众多，因此研究难度颇大，且生产上难以做到精确稳定可控。而目前药复方制剂领域在含量控制上基本只有一个或两个指标性成分，质量控制单一，指标少，难以全面反映当归四逆汤产品的质量状况。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的中药复方制剂在含量控制上基本只有一个或两个指标性成分，质量控制单一，指标少，存在难以全面反映药味多，组分多、靶标多的当归四逆汤组合物的质量状况的缺陷，从而提供当归四逆汤组合物指纹图谱的建立方法。

为此，本发明提供如下技术方案：

当归四逆汤组合物指纹图谱的建立方法，其特征在于，采用高效液相色谱法，色谱条件为：

色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

柱温：25-35℃；流速：0.9-1.1ml/min；

检测波长：220nm；

以乙腈A-0.1％磷酸溶液B为流动相，按如下顺序梯度洗脱：

所述指纹图谱包括9个共有峰，各峰相对保留时间与参照峰相对保留时间比值分别为：1号峰相对保留时间RRT为0.31，2号峰相对保留时间RRT为0.72，3号峰相对保留时间RRT为0.81，4号峰相对保留时间RRT为0.90，5号峰相对保留时间RRT为1.00，6号峰相对保留时间RRT为1.38，7号峰相对保留时间RRT为1.72，8号峰相对保留时间RRT为1.80，9号峰相对保留时间RRT为1.97，其中5号S峰是参照物的色谱峰。

通过如下方法制备当归四逆汤组合物：

按重量份配比取当归3份；桂枝3份；白芍3份；细辛1份；炙甘草2份；川木通2份；大枣6.67份，加水提取两次，滤过，于50℃下将滤液浓缩相对密度为1.20-1.25的清膏，加麦芽糊精，混合，干燥，制粒，即得。

供试品水溶液按如下方法制备：

取当归四逆汤组合物，混匀，研细，取0.5-2.0重量份，置具塞容器中，加入70％甲醇20体积份，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

参照物溶液按如下方法制备：

取芍药苷对照品适量，称定，加甲醇制成每1体积份含0.0003重量份的溶液，即得。

进样量为10μl-20μl。

当归四逆汤指纹图谱，所述指纹图谱包括9个共有峰各峰相对保留时间与参照峰相对保留时间比值分别为：其中：1号峰相对保留时间RRT为0.31，2号峰相对保留时间RRT为0.72，3号峰相对保留时间RRT为0.81，4号峰相对保留时间RRT为0.90，5号峰相对保留时间RRT为1.00，6号峰相对保留时间RRT为1.38，7号峰相对保留时间RRT为1.72，8号峰相对保留时间RRT为1.80，9号峰相对保留时间RRT为1.97，其中5号S峰是参照物的色谱峰。

本发明技术方案，具有如下优点：

1、本发明提供的当归四逆汤组合物指纹图谱的建立方法所得的指纹图谱全面反映出当归四逆汤组合物质量信息，从而能够达到更加全面、有效地控制当归四逆汤制剂产品质量的目的。

2、本发明提供的当归四逆汤组合物指纹图谱的建立方法采用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统对所测指纹图谱的辨认，操作方便、快捷；而且，以此得出的相以度结果对制剂指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确。

3、本发明提供的当归四逆汤组合物指纹图谱的建立方法经过对供试品制备方法的考察及测定指纹图谱的仪器，色谱柱、流动相、检测波长等条件进行系统的优选，建立了指纹图谱测定条件并进行了方法学考察，在对多批本中药组合物指纹图谱检测结果的基础上，逐渐积累数据，提出了标准指纹图谱，作为本品指纹图谱标准，从而达到能够更全面、有效地控制制剂质量的目的。

4、本发明提供的当归四逆汤组合物指纹图谱的建立方法采用国家药典委员会提供中药色谱指纹图谱相似度评价系统做为本中药组合物指纹图谱相似度计算软件，经多次试验研究，通过与计算相对保留时间及相对峰面积的方法相比较，所得出的评价结论基本一致，使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统评价指纹图谱的相似度，操作方便、快捷，以其得出的相似度结果，对制剂指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确。

5、本发明提供的当归四逆汤组合物指纹图谱的建立方法采用指纹图谱较全面的表征组合物的质量信息，从整体上反映产品质量，同时针对处方五味药材，采用多波长切换技术建立所有药味的含量控制指标，供试品溶液的制备方法简单、便捷，且测定结果准确、可靠；本发明考虑目前现有技术在控制复方中成药上往往只有一个或两个指标性成分，且缺乏指纹图谱整体表征产品质量信息，因此提出以指纹图谱结合多指标成分含量控制的方式全面的控制当归四逆汤质量。

6、本发明提供的当归四逆汤组合物指纹图谱的建立方法提出采用指纹图谱，结合多波长切换技术测定当归四逆汤种多个指标成分。

7、本发明提供的当归四逆汤组合物指纹图谱的建立方法可以为当归四逆汤提供一种较全面的质量控制方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明当归四逆汤组合物药材指纹图谱三维图谱；

图2为本发明当归四逆汤组合物指纹图谱对照图谱；

图3为本发明当归四逆汤组合物精密度考察指纹图谱叠加图；

图4为本发明当归四逆汤组合物稳定性试验指纹图谱叠加图；

图5为本发明当归四逆汤组合物重复性试验指纹图谱叠加图；

图6为本发明当归四逆汤组合物指纹图谱方法检测的叠加图见图；

附图标识如下：

图2中的1号峰为没食子酸，5号峰为芍药苷，8号峰为肉桂酸，9号峰为甘草酸积分参数：斜率灵敏度5，峰宽0.02，最小峰面积1，最小峰高1.7相似度计算数据剪切范围为4～69min。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1.当归四逆汤组合物的制备

按如下比例取当归375g；桂枝375g；白芍375g；细辛125g；炙甘草250g；川木通250g；大枣833.3g加水煎煮二次，第一次1.5小时，第二次1.0小时，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20-1.25(60℃)的清膏，加麦芽糊精适量，混匀，干燥，制粒，制成1000g，得当归四逆汤组合物。

实施例2.建立当归四逆汤指纹图谱

仪器与试药

色谱仪：美国Agilent 1100系列(G1322A在线真空脱气机，G1311A四元梯度泵，G1313A自动进样器，G1316A柱温箱，G1315B二极管阵列检测器)；

色谱柱：Kromasil 100-5-C18 4.6×250mm 5μm；

试剂：甲醇，天津市大茂化学试剂厂，色谱纯，批号：20160310；乙腈，天津彪仕奇科技发展有限公司，色谱纯，批号：AC-12060107；磷酸，天津市通广精细化工公司，分析纯，批号：20150712；水，密理博超纯水；

当归四逆汤组合物药材：按实施例1的步骤试生产当归四逆汤组合物三批160501、160502、160504华润三九集团提供；芍药苷对照品，购于中国药品生物制品检定所，达到含量测定用对照品的要求。批号110736-201604甘草苷对照品，购于中国药品生物制品检定所，达到含量测定用对照品的要求。批号111610-201106阿魏酸对照品，购于中国药品生物制品检定所，达到含量测定用对照品的要求。批号110773-200607肉桂酸对照品，购于中国药品生物制品检定所，达到含量测定用对照品的要求。批号110786-200503甘草酸对照品，购于成都曼思特生物科技有限公司/中国科学院成都生物研究所，达到含量测定用对照品的要求。批号MUST1508510。

(1)色谱条件

十八烷基键合硅胶为填充相,型号为Kromasil 100-5-C18 4.6×250mm，乙腈-水(0.1％磷酸)为流动相梯度洗脱(洗脱梯度见表)，流速0.9mL/分钟，检测波长220nm，柱温25℃，理论塔板数按芍药苷峰计，应不低于3000；

表1当归四逆汤组合物HPLC指纹图谱检测洗脱的梯度条件

(2)对照品溶液的制备取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含300ug的溶液，即得。

(3)供试品溶液的制备取当归四逆汤组合物粉末(60目)1.0g，置具塞三角瓶中，加70％甲醇20ml，称定重量，超声提取30分钟，放冷后，称重并以70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。

(4)测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

所述指纹图谱包括9个共有峰，各峰相对保留时间与参照峰相对保留

时间比

值分别为：

1号峰相对保留时间RRT为0.31，2号峰相对保留时间RRT为0.72，3号峰相对保留时间RRT为0.81，4号峰相对保留时间RRT为0.90，5号峰相对保留时间RRT为1.00，6号峰相对保留时间RRT为1.38，7号峰相对保留时间RRT为1.72，8号峰相对保留时间RRT为1.80，9号峰相对保留时间RRT为1.97。其中，5号S峰是参照物的色谱峰。供试品指纹图谱与对照图谱比较，在相应的保留时间出现相同的色谱峰，采用指纹图谱相似度软件评价，其相似度不低于0.90。

当归四逆汤组合物指纹图谱共有模式见图2。

实施例3.当归四逆汤指纹图谱的方法学考察

精密度考察

取当归四逆汤组合物1份(160501)，按正文方法制备供试品溶液，连续进样6次，测定指纹图谱，叠加图见图3，利用指纹图谱软件评价相似度，计算结果见表2，并计算部分色谱峰的保留时间和峰面积的相对标准偏差，见表3。结果表明，仪器精密度良好。

表2当归四逆颗粒指纹图谱精密度考察相似度计算结果

表3精密度考察部分色谱峰保留时间和峰面积相对标准偏差

稳定性考察

取当归四逆汤组合物1份(160501)，按正文方法制备供试品溶液，分别在约0、4、8、10、18、20、25、33小时进样，测定指纹图谱，叠加图见图4，采用指纹图谱软件计算其相似度，计算结果见表4，并计算部分色谱峰的保留时间和峰面积的相对标准偏差，见表5。结果表明：供试品溶液33小时内测定稳定。

表4当归四逆颗粒指纹图谱稳定性考察相似度计算结果

表5稳定性考察部分色谱峰保留时间和峰面积相对标准偏差

重复性考察

取当归四逆汤组合物1份(160501)，按正文方法平行制备6份供试品溶液，测定指纹图谱，指纹图谱叠加图见图5，利用指纹图谱软件计算其相似度，计算结果见表6，并计算部分色谱峰的保留时间和峰面积的相对标准偏差，见表7。结果表明：方法重复性良好。

表6当归四逆汤组合物指纹图谱重复性考察相似度计算结果

表7重复性部分色谱峰保留时间和峰面积相对标准偏差

样品测定

指纹图谱检测照正文方法将9批当归四逆汤组合物分别制备成供试品溶液，精密吸取10μl，注入液相色谱仪，按指纹图谱方法检测，叠加图见图6。

指纹图谱相似度计算利用药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件，将9批当归四逆汤组合物样品的指纹图谱进行了相似度计算。结果表明，各药材与共有模式相比，相似度值在0.967～0.993之间，平均值为0.982，根据数据结果暂定当归四逆汤组合物指纹图谱与对照图谱比较，其相似度应不低于0.90。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (4)

1.当归四逆汤组合物指纹图谱的建立方法，其特征在于，采用高效液相色谱法，

当归四逆汤组合物按如下方法制备：

按重量配比取当归3份；桂枝3份；白芍3份；细辛1份；炙甘草2份；川木通2份；大枣6.67份，加水提取两次，滤过，于50℃下将滤液浓缩相对密度为1.20-1.25的清膏，加麦芽糊精，混合，干燥，制粒，即得；

供试品溶液按如下方法制备：

取当归四逆汤组合物，混匀，研细，取0.5-2.0重量份，置具塞容器中，加入70％甲醇20体积份，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，其中，1重量份表示1g，1体积份表示1ml；

色谱条件为：

色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

柱温：25-35℃；流速：0.9-1.1ml/min；

检测波长：220nm；

以乙腈A-0.1％磷酸溶液B为流动相，按如下顺序梯度洗脱：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述指纹图谱包括9个共有峰，各峰相对保留时间与参照峰相对保留时间比值分别为：

1号峰相对保留时间RRT为0.31，2号峰相对保留时间RRT为0.72，3号峰相对保留时间RRT为0.81，4号峰相对保留时间RRT为0.90，5号峰相对保留时间RRT为1.00，6号峰相对保留时间RRT为1.38，7号峰相对保留时间RRT为1.72，8号峰相对保留时间RRT为1.80，9号峰相对保留时间RRT为1.97，其中5号峰是参照物的色谱峰。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，参照物溶液按如下方法制备：取芍药苷对照品适量，称定，加甲醇制成每1体积份含0.0003重量份的溶液，即得，其中，1重量份表示1g，1体积份表示1ml。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，进样量为10μl-20μl。

Images