CN110441456B - 一种基于量稳活多维网络模式的血府逐瘀胶囊质控标志物发现方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于量稳活多维网络模式的血府逐瘀胶囊质控标志物发现方法，包括以下步骤：步骤一：血府逐瘀胶囊含量维度值的获取；步骤二：血府逐瘀胶囊稳定性维度值的获取；步骤三：血府逐瘀胶囊活性维度值的获取；步骤四：构建“含量‑稳定性‑活性”三维网络分析，采用三维网络回归面积辨析血府逐瘀胶囊化学成分群，将各候选成分按照回归面积大小排序，确定血府逐瘀胶囊质控标志物。本发明选取血府逐瘀胶囊20个候选成分的含量、稳定性、活性三个维度，构建基于“量‑稳‑活”多维网络模式的质控标志物辨析技术，通过计算各个成分回归面积，评价各候选成分在复方中的综合贡献，为优选质控指标提供依据。

Description

一种基于量稳活多维网络模式的血府逐瘀胶囊质控标志物发 现方法

技术领域

本发明属于中药质量标志物选取技术领域，尤其涉及一种基于量稳活多维网络模式的血府逐瘀胶囊质控标志物发现方法。

背景技术

中药的质量控制与评价是中药现代化发展的关键科学问题，也是中药发展进程中不可缺少的一部分。中药具有化学成分复杂多样、含量差异大、药理作用广泛、机理不清晰等特点，中药质控指标选择困难，并且现行的中药质量控制的评价模式主要参照化学药品的质量控制模式，检测单一指标成分，并不能反映中药的整体疗效从而准确的评价中药质量。针对中药质量控制研究现状，刘昌孝院士于2016年提出中药质量标志物(Q-marker)的中药质量控制新概念，引起了行业内学者的强烈反响。中药及复方中化学成分种类众多，含量高低悬殊，如何合理地选择指标性成分是其质量控制的关键。

血府逐瘀胶囊是采用现代制药工艺制成的中药固体制剂，具有活血祛瘀、行气止痛之功效，主要用于治疗瘀血停滞胸中而见胸痛、头痛，痛如针刺而有定处，或烦急、呃逆干呕、午后潮热、心悸失眠，或舌有瘀点、唇舌紫暗、脉弦涩等症。现代药理学研究表明，血府逐瘀胶囊具有抗血小板聚集、降血脂、抗氧化、增强免疫力、抗炎及镇痛等多种药理作用。血府逐瘀胶囊由红花、桃仁、赤芍、川芎、牛膝、当归、生地、枳壳、柴胡、桔梗、甘草共11味中药组成，临床疗效明确，但对其质量控制的研究相对较少。

基于中药质量标志物的质控新概念，结合药物基本属性及临床应用特点，对血府逐瘀胶囊的质量标志物进行系统化研究具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于量稳活多维网络模式的血府逐瘀胶囊质控标志物发现方法。

本发明采取以下技术方案实现：

一种基于量稳活多维网络模式的血府逐瘀胶囊质控标志物发现方法，包括以下步骤：

步骤一：血府逐瘀胶囊含量维度值的获取，测定11批血府逐瘀胶囊20个候选成分的含量，将实验结果取平均值，以反映各成分在血府逐瘀胶囊中的含量高低，将各成分含量除以成分含量最大值进行数据归一化处理，即得到含量维度值；

步骤二：血府逐瘀胶囊稳定性维度值的获取，通过高温稳定性归一化处理结果得到高温稳定性维度、高湿稳定性归一化处理结果得到高湿稳定性维度、强光稳定性归一化处理结果得到强光稳定性维度，根据回归面积的大小评价各组分的稳定性贡献，计算三元网络回归面积，即得到各稳定性维度值；

步骤三：血府逐瘀胶囊活性维度值的获取，通过抗氧化活性归一化处理结果得到抗氧化活性维度、抗炎活性归一化处理结果得到抗炎活性维度，由抗氧化活性维度和抗炎活性维度在坐标轴上组成的三角形的斜边长度大小评价各组分的活性贡献，计算活性贡献值，即得到活性维度值；

步骤四：通过整合血府逐瘀胶囊含量维度值、稳定性维度值及活性维度值，对各维度进行归一化处理，构建“含量-稳定性-活性”三维网络分析，采用三维网络回归面积辨析血府逐瘀胶囊化学成分群，并将各候选成分按照回归面积大小进行排序，确定血府逐瘀胶囊质控标志物(质控markers)。

优选的，步骤一中所述含量维度、含量之间有如下式限定：

Relative Content＝含量/Max 4-1

其中：Relative Content为含量维度；含量为11批血府逐瘀胶囊含量测定结果的平均值；Max为血府逐瘀胶囊含量测定结果中20个成分中的含量最大值。

优选的，步骤二中所述高温稳定性归一化处理的步骤为：检测血府逐瘀胶囊中20个候选成分在RH 40％±5％、60℃高温与避光条件下放置10天后的含量变化情况，计算20个候选成分相对于0天含量测定结果的比值减100％的绝对值，以表示含量变化的程度，再用1减该绝对值，使计算结果与稳定性正相关，得到高温稳定性维度值；

所述高温稳定性维度值、含量比值之间有如下式限定：

HTS＝1-︱CR-100％︱ 4-2

其中：HTS为高温稳定性维度值；CR为含量比值，血府逐瘀胶囊于60℃温度下避光放置10天，20个候选成分相对于0天含量测定结果的比值。

优选的，步骤二中所述高湿稳定性归一化处理的步骤为：检测血府逐瘀胶囊中20个候选成分在25℃、RH90％±5％高湿与避光条件下放置10天后的含量变化情况，计算20个候选成分相对于0天含量测定结果的比值减100％的绝对值，以表示含量变化的程度，再用1减该绝对值，使计算结果与稳定性正相关，得到高湿稳定性维度值；

所述高湿稳定性维度值、含量比值之间有如下式限定：

HHS＝1-︱CR-100％︱ 4-3

其中：HHS为高湿稳定性维度值；CR为含量比值，血府逐瘀胶囊于25℃、RH90％±5％湿度下避光放置10天，20个候选成分相对于0天含量测定结果的比值。

优选的，步骤二中所述强光稳定性归一化处理的步骤为：检测血府逐瘀胶囊中20个候选成分在25℃、RH 40％±5％、4500Lx±500Lx强光条件下放置10天后的含量变化情况，计算20个候选成分相对于0天含量测定结果的比值减100％的绝对值，以表示含量变化的程度，再用1减该绝对值，使计算结果与稳定性正相关，得到强光稳定性维度值；

所述强光稳定性维度值、含量比值之间有如下式限定：

SLS＝1-︱CR-100％︱ 4-4

其中：SLS为强光稳定性维度值；CR为含量比值，血府逐瘀胶囊于4500Lx±500Lx强光照射条件下放置10天，20个候选成分相对于0天含量测定结果的比值。

进一步优选的，步骤二中所述三元网络回归面积、HTS值、HHS值、SLS值之间有如下式限定：

其中：A为三元网络回归面积；S为三角形周长；a为HTS值；b为HHS值；c为SLS值。

优选的，步骤三中所述抗氧化活性归一化处理的步骤为：由剂量曲线计算得出IC₅₀值，求IC₅₀值倒数，以直接反映各成分的活性强弱，将各成分IC₅₀值倒数除以最大值进行数据归一化处理，计算结果作为抗氧化活性维度值；

所述抗氧化活性维度值、IC₅₀、Max之间有如下式限定：

AOA＝(1/IC₅₀)/Max 4-7

其中：AOA为抗氧化活性维度值；IC₅₀为DPPH·清除率(SR值)到达一半时所需要样品(血府成分)的浓度；Max为血府逐瘀胶囊20个候选成分抗氧化活性1/IC₅₀中的最大值；

步骤三中所述抗炎活性归一化处理的步骤为：由剂量曲线计算得出IC₅₀值，求IC₅₀值倒数，以直接反映该成分活性强弱，将各成分IC₅₀值倒数除以最大值进行数据归一化处理，计算结果作为抗炎活性维度值；

所述抗炎活性维度值、IC₅₀、Max之间有如下式限定：

AIA＝(1/IC₅₀)/Max 4-8

其中：AIA为抗炎活性维度值；IC₅₀为NO抑制率到达一半时所需要样品的浓度；Max为血府逐瘀胶囊20个成分抗炎活性1/IC₅₀中的最大值。

优选的，步骤三中所述活性贡献值、AOA值、AIA值之间有如下式限定：

其中：C为活性贡献值；A为AOA值；B为AIA值。

优选的，步骤四中所述三维网络回归面积、含量维度值、稳定性维度值、活性维度值之间有如下式限定：

其中：A′为三维网络回归面积；S′为三角形周长；e为活性维度值；f为含量维度值；g为稳定性维度值。

优选的，血府逐瘀胶囊20个所述候选成分分别为:原儿茶酸、羟基红花黄色素A(HSYA)、绿原酸、对羟基苯甲酸、芍药内酯苷、芍药苷、芦丁、甘草苷、阿魏酸、柚皮芸香苷、柚皮苷、蜕皮激素、野漆树苷、橙皮苷、新橙皮苷、异甘草苷、甘草素、柚皮素、甘草酸、川陈皮素。

本发明的优点和积极效果是：

1.本发明开展血府逐瘀胶囊含量测定、稳定性和活性研究，并构建“含量-稳定性-活性”多维网络评价体系，根据血府逐瘀胶囊各成分的多维网络回归面积大小及“维度”得分均一度综合评价其在复方中的“地位”，即作为血府逐瘀胶囊质控标志物的辨析标准。选取回归面积大、均一性好的化合物作为血府逐瘀胶囊优选的质控标志物，最终筛选出柚皮苷、异甘草苷、芍药苷、原儿茶酸、新橙皮苷、阿魏酸6个成分作为血府逐瘀胶囊的质控标志物，在保证血府逐瘀胶囊安全性和有效性及质量控制方面具有重要意义，为进一步开展血府逐瘀胶囊的质量控制研究奠定基础。

2.本发明选取血府逐瘀胶囊20个候选成分的含量、稳定性(高温稳定性、高湿稳定性、强光稳定性)、活性(抗氧化活性和抗炎活性)三个维度，构建基于“量-稳-活”多维网络模式的质控标志物辨析技术，通过计算各个成分回归面积，评价各候选成分在复方中的综合贡献，为优选质控指标提供依据。

附图说明

图1–1血府逐瘀胶囊中20个成分的化学结构图；

图1–2血府逐瘀胶囊化学成分的超高效液相色谱图；注：(1、原儿茶酸2、HSYA 3、绿原酸4、对羟基苯甲酸5、芍药内酯苷6、芍药苷7、芦丁8、甘草苷9、阿魏酸10、柚皮芸香苷11、柚皮苷12、蜕皮激素13、野漆树苷14、橙皮苷15、新橙皮苷16、异甘草苷17、甘草素18、柚皮素19、甘草酸20、川陈皮素)；

图1–3 11批次血府逐瘀胶囊中20个化合物含量测定结果图；注：(A)11批次血府逐瘀胶囊20个化合物含量测定结果箱图；(B)11批次血府逐瘀胶囊20个化合物含量测定结果热图；(横坐标：1、原儿茶酸2、HSYA 3、绿原酸4、对羟基苯甲酸5、芍药内酯苷6、芍药苷7、芦丁8、甘草苷9、阿魏酸10、柚皮芸香苷11、柚皮苷12、蜕皮激素13、野漆树苷14、橙皮苷15、新橙皮苷16、异甘草苷17、甘草素18、柚皮素19、甘草酸20、川陈皮素；纵坐标：B1～B11为不同批次血府逐瘀胶囊，批号依次为：F03124、F03013、F03062、F03097、F03100、E03254、E03182、E03208、E03155、E03181、E03188)；

图2-1 Vc DPPH·清除活性的剂量-效应曲线；

图2-2血府逐瘀胶囊DPPH·清除活性的剂量-效应曲线；

图2-3原儿茶酸DPPH·清除活性的剂量-效应曲线；

图2-4绿原酸DPPH·清除活性的剂量-效应曲线；

图2-5芦丁DPPH·清除活性的剂量-效应曲线；

图2-6阿魏酸DPPH·清除活性的剂量-效应曲线；

图2-7不同浓度血府逐瘀胶囊对LPS诱导的RAW264.7细胞活性的影响；

图2-8不同浓度DEX对LPS诱导的RAW264.7细胞活性的影响；

图2-9不同浓度原儿茶酸、绿原酸对LPS诱导的RAW264.7细胞活性的影响；

图2-10不同浓度芍药苷、甘草苷对LPS诱导的RAW264.7细胞活性的影响；

图2-11不同浓度甘草酸、新橙皮苷对LPS诱导的RAW264.7细胞活性的影响；

图2-12不同浓度异甘草苷、甘草素对LPS诱导的RAW264.7细胞活性的影响；

图2-13不同浓度柚皮素、川陈皮素对LPS诱导的RAW264.7细胞活性的影响；

图2-14Griess法测定NO产生量标准曲线；

图2-15血府逐瘀胶囊对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的影响；(vs Control，###P＜0.001；vs LPS，***P＜0.001)

图2-16血府逐瘀胶囊抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO产生的剂量-效应曲线；

图2-17原儿茶酸对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的影响；(vs Control，###P＜0.001；vs LPS，***P＜0.001)

图2-18绿原酸对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的影响；(vs Control，###P＜0.001；vs LPS，***P＜0.001)

图2-19芍药苷对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的影响；(vs Control，###P＜0.001；vs LPS，***P＜0.001)

图2-20甘草苷对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的影响；(vs Control，###P＜0.001；vs LPS，***P＜0.001)

图2-21新橙皮苷对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的影响；(vs Control，###P＜0.001；vs LPS，***P＜0.001)

图2-22异甘草苷对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的影响；(vs Control，###P＜0.001；vs LPS，***P＜0.001)

图2-23甘草素对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的影响；(vs Control，###P＜0.001；vs LPS，***P＜0.001)

图2-24柚皮素对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的影响；(vs Control，###P＜0.001；vs LPS，***P＜0.001)

图2-25甘草酸对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的影响；(vs Control，###P＜0.001；vs LPS，***P＜0.001)

图2-26川陈皮素对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的影响；(vs Control，###P＜0.001；vs LPS，***P＜0.001)

图3-1血府逐瘀胶囊20个候选成分含量、稳定性及活性三维回归面积图；

图3-2血府逐瘀胶囊“质控标志物”的辨析图；

图3-3血府逐瘀胶囊20个成分回归面积排序图；(注：图3-2、3-3中，C1、原儿茶酸C2、HSYA C3、绿原酸C4、对羟基苯甲酸C5、芍药内酯苷C6、芍药苷C7、芦丁C8、甘草苷C9、阿魏酸C10、柚皮芸香苷C11、柚皮苷C12、蜕皮激素C13、野漆树苷C14、橙皮苷C15、新橙皮苷C16、异甘草苷C17、甘草素C18、柚皮素C19、甘草酸C20、川陈皮素)

具体实施方式

实施例1血府逐瘀胶囊多成分含量测定研究

1.1材料与方法

1.1.1仪器

1.1.2试药

原儿茶酸(B21614)、芦丁(B20771)、绿原酸(B20782)、阿魏酸(B20007)、新橙皮苷(B21390)、羟基红花黄色素A(B20968)、橙皮苷(B20182)、对羟基苯甲酸(B20328)、芍药苷(B21148)、柚皮苷(B21594)、柚皮芸香苷(B21634)、柚皮素(B21596)、野漆树苷(B21484)、甘草苷(B20414)、甘草素(B20416)、甘草酸(B20417)、新异甘草苷(B24043)、蜕皮激素(B21268)购自上海源叶生物科技有限公司，芍药内酯苷(S-011-161028)、川陈皮素(C-015-150729)购自成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度均≥98％，化学结构式见图1–1。

红花、赤芍、枳壳、当归、桃仁、川芎、牛膝，生地、甘草、桔梗、柴胡11味饮片以及11批次血府逐瘀胶囊(批号：B1-F03124、B2-F03013、B3-F03062、B4-F03097、B5-F03100、B6-E03154、B7-E03182、B8-E03208、B9-E03155、B10-E03181、B11-E03188)由天津宏仁堂药业有限公司提供。

1.1.3试剂

1.1.4方法

1.1.4.1色谱条件

色谱柱ZORBAX SB-C18(4.6mm×100mm，1.8μm)；流动相：甲醇(B)–0.1％甲酸水(A)，梯度洗脱程序见表1–1；进样量2μL；流速0.5mL/min；柱温60℃；PDA扫描范围：全波长扫描(λ＝210nm～400nm)；波长切换具体方法见表1–2。

表1–1流动相梯度洗脱条件

表1–2化合物检测波长切换表

1.1.4.2对照品溶液的制备

分别取原儿茶酸、HSYA、绿原酸、对羟基苯甲酸、芍药内酯苷、芍药苷、芦丁、甘草苷、阿魏酸、柚皮芸香苷、柚皮苷、蜕皮激素、野漆树苷、橙皮苷、新橙皮苷、异甘草苷、甘草素、柚皮素、甘草酸、川陈皮素对照品5.00mg、5.04mg、5.11mg、5.02mg、5.01mg、11.14mg、5.07mg、5.08mg、5.20mg、5.03mg、11.28mg、5.17mg、5.27mg、5.00mg、8.21mg、4.97mg、5.04mg、5.23mg、5.05mg、5.14mg，精密称定，分别置于5mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到浓度为1.00mg/mL、1.01mg/mL、1.02mg/mL、1.00mg/mL、1.00mg/mL、2.228mg/mL、1.01mg/mL、1.02mg/mL、1.04mg/mL、1.01mg/mL、2.256mg/mL、1.03mg/mL、1.05mg/mL、1.00mg/mL、1.03mg/mL、1.62mg/mL、0.994mg/mL、1.02mg/mL、1.05mg/mL、1.01mg/mL、1.03mg/mL的对照品储备液，精密量取各对照品储备液适量置于10mL量瓶中，用50％甲醇定容至刻度，摇匀，得混合对照品溶液。混合对照品溶液中含原儿茶酸26.7μg/mL、HSYA 3.89μg/mL、绿原酸22.9μg/mL、对羟基苯甲酸36.3μg/mL、芍药内酯苷37.9μg/mL、芍药苷891.2μg/mL、芦丁1.08μg/mL、甘草苷24.5μg/mL、阿魏酸20.6μg/mL、柚皮芸香苷106μg/mL、柚皮苷902.4μg/mL、蜕皮激素17.6μg/mL、野漆树苷20.8μg/mL、橙皮苷65.2μg/mL、新橙皮苷657μg/mL、异甘草苷7.75μg/mL、甘草素9.88μg/mL、柚皮素5.34μg/mL、甘草酸93.0μg/mL、川陈皮素6.68μg/mL。

1.1.4.3供试品溶液的制备

取血府逐瘀胶囊，倾出粉末，取约0.5g，精密称定，置于25mL容量瓶中，加适量50％甲醇，超声处理20min，取出，放冷至室温，并定容至刻度，摇匀，取适量于14000rpm离心10min，取上清，得供试品溶液，备用。

1.2不同批次血府逐瘀胶囊含量测定

取各批次血府逐瘀胶囊，按“1.1.4.3”项下方法制备供试品溶液，采用“1.1.4.1”项下色谱条件测定各批次中候选成分的含量，超高效液相色谱图见图1–2，含量测定结果见表1–3和图1–3。

表1–3 11批次血府逐瘀胶囊20个化合物含量测定结果(n＝2，μg/g)

“*”化合物含量单位为mg/g。

采用血府逐瘀胶囊多成分定量分析方法，检测11批次血府逐瘀胶囊中20个化学成分的含量，由表1-3可知，在20个化学成分中，芍药苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量较高，均大于1.000mg/g，含量均值分布于3.924mg/g～5.484mg/g范围内；原儿茶酸、绿原酸、芦丁、甘草苷、阿魏酸、柚皮芸香苷、蜕皮激素、野漆树苷、橙皮苷、甘草酸的含量在100.0μg/g～1.000mg/g之间，含量均值分布于121.7μg/g～728.1μg/g范围内；HSYA、对羟基苯甲酸、芍药内酯苷、异甘草苷、甘草素、柚皮素、川陈皮素的含量较低，均小于100.0μg/g，含量均值分布于13.89μg/g～94.99μg/g范围内。不同批次样品中20个成分含量在13.89μg/g～5.484mg/g之间，反映了血府逐瘀胶囊各成分含量差异大的特征。

由图1-3(A)可知，柚皮苷的离散程度大，原儿茶酸、芍药内酯苷、芍药苷、新橙皮苷的离散程度较柚皮苷小，其余15个化学成分的离散程度小。由图1-3(B)可知，不同批次样品中柚皮苷、原儿茶酸、芍药内酯苷、芍药苷、新橙皮苷的颜色深浅存在差异，表明含量波动幅度较大，结果与图1-3(A)一致。

1.3小结

本研究基于UPLC-PDA技术，以原儿茶酸、HSYA、绿原酸等20个化学成分为指标，建立了血府逐瘀胶囊多成分定量分析方法；经方法学验证，该方法符合定量分析要求；应用此方法对11批次血府逐瘀胶囊成分进行了含量测定，阐明了各成分在不同批次样品中的分布规律。研究所得数据作为“含量-稳定性-活性”多维网络中的含量维度值。

实施例2血府逐瘀胶囊强光、高温及高湿稳定性研究

2.1材料与方法

2.1.1仪器

2.1.2试药

原儿茶酸(B21614)、芦丁(B20771)、绿原酸(B20782)、阿魏酸(B20007)、新橙皮苷(B21390)、羟基红花黄色素A(B20968)、橙皮苷(B20182)、对羟基苯甲酸(B20328)、芍药苷(B21148)、柚皮苷(B21594)、柚皮芸香苷(B21634)、柚皮素(B21596)、野漆树苷(B21484)、甘草苷(B20414)、甘草素(B20416)、甘草酸(B20417)、新异甘草苷(B24043)、蜕皮激素(B21268)(纯度≥98％)购自上海源叶生物科技有限公司，芍药内酯苷(S-011-161028)、川陈皮素(C-015-150729)购自成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度均≥98％。

血府逐瘀胶囊(批号：F03124)由天津宏仁堂药业有限公司提供。

2.1.3试剂

2.1.4方法

2.1.4.1色谱条件

色谱柱ZORBAX SB-C18(4.6mm×100mm，1.8μm)；流动相：甲醇(B)–0.1％甲酸水(A)，梯度洗脱程序见表2–1；进样量2μL；流速0.5mL/min；柱温60℃；PDA扫描范围：柱温60℃；PDA扫描范围：全波长扫描(λ＝210nm～400nm)；波长切换具体方法见表2–2。

表2–1流动相梯度洗脱条件

表2–2化合物检测波长切换表

2.1.4.2对照品溶液的制备

取原儿茶酸、HSYA、绿原酸、对羟基苯甲酸、芍药内酯苷、芍药苷、芦丁、甘草苷、阿魏酸、柚皮芸香苷、柚皮苷、蜕皮激素、野漆树苷、橙皮苷、新橙皮苷、异甘草苷、甘草素、柚皮素、甘草酸、川陈皮素对照品5.00mg、5.04mg、5.11mg、5.02mg、5.01mg、11.14mg、5.07mg、5.08mg、5.20mg、5.03mg、11.28mg、5.17mg、5.27mg、5.00mg、8.21mg、4.97mg、5.04mg、5.23mg、5.05mg、5.14mg，精密称定，分别置于5mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到浓度为1.00mg/mL、1.01mg/mL、1.02mg/mL、1.00mg/mL、1.00mg/mL、2.228mg/mL、1.01mg/mL、1.02mg/mL、1.04mg/mL、1.01mg/mL、2.256mg/mL、1.03mg/mL、1.05mg/mL、1.00mg/mL、1.03mg/mL、1.62mg/mL、0.994mg/mL、1.02mg/mL、1.05mg/mL、1.01mg/mL、1.03mg/mL的对照品储备液，精密量取各对照品储备液适量置于10mL量瓶中，用50％甲醇定容至刻度，摇匀，得混合对照品溶液。混合对照品溶液中含原儿茶酸26.7μg/mL、HSYA 3.89μg/mL、绿原酸22.9μg/mL、对羟基苯甲酸36.3μg/mL、芍药内酯苷37.9μg/mL、芍药苷891.2μg/mL、芦丁1.08μg/mL、甘草苷24.5μg/mL、阿魏酸20.6μg/mL、柚皮芸香苷106μg/mL、柚皮苷902.4μg/mL、蜕皮激素17.6μg/mL、野漆树苷20.8μg/mL、橙皮苷65.2μg/mL、新橙皮苷657μg/mL、异甘草苷7.75μg/mL、甘草素9.88μg/mL、柚皮素5.34μg/mL、甘草酸93.0μg/mL、川陈皮素6.68μg/mL。

2.1.4.3供试品溶液的制备

取血府逐瘀胶囊，倾出粉末，取约0.5g，精密称定，置于25mL容量瓶中，加适量50％甲醇，超声处理20min，取出，放冷至室温，并定容至刻度，摇匀，取适量于14000rpm离心10min，取上清，得供试品溶液，备用。

2.2结果

2.2.1强光稳定性试验

将血府逐瘀胶囊置于光照恒温恒湿箱中，在强光(4500Lx±500Lx、25℃、RH 40％±5％)条件下放置10天，于第0、5、10天取样，按“2.1.4.3”项下方法制备供试品溶液，采用“2.1.4.1”项下色谱条件测定20个候选成分的含量，考察强光因素对血府逐瘀胶囊中候选成分稳定性的影响，结果见表2–3。

表2–3血府逐瘀胶囊中20个化合物强光稳定性试验结果(n＝2，μg/g)

“*”化合物含量单位为mg/g。

由表2–3可知，血府逐瘀胶囊在强光(4500Lx±500Lx、25℃、RH 40％±5％)条件处理后，样品含量无明显差异，血府逐瘀胶囊在强光条件下比较稳定。

2.2.2高温稳定性试验

将血府逐瘀胶囊置于光照恒温恒湿箱中，在高温(60℃、RH 40％±5％)条件下放置10天，于第0、5、10天取样，按“2.1.4.3”项下方法制备供试品溶液，采用“2.1.4.1”项下色谱条件测定20个候选成分的含量，考察高温因素对血府逐瘀胶囊中候选成分稳定性的影响，结果见表2–4。

表2–4血府逐瘀胶囊中20个化合物高温稳定性试验结果(n＝2，μg/g)

“*”化合物含量单位为mg/g。

由表2–4可知，血府逐瘀胶囊在经过高温(60℃、RH 40％±5％)处理后，原儿茶酸、HSYA、芦丁、阿魏酸以及野漆树苷含量明显降低，并且经过10d高温处理，其含量相对0d分别降低了21.44％、46.32％、8.78％、16.93％及10.12％，其余15个成分的含量无明显变化。血府逐瘀胶囊在高温条件下较不稳定，因此，不适合置于温度较高的环境中储存。

2.2.3高湿稳定性试验

将血府逐瘀胶囊置于光照恒温恒湿箱中，在高湿(25℃、RH 90％±5％)条件下放置10天，于第0、5、10天取样，按“2.1.4.3”项下方法制备供试品溶液，采用“2.1.4.1”项下色谱条件测定20个候选成分的含量，考察高湿因素对血府逐瘀胶囊中候选成分稳定性的影响，结果见表2–5。

表2–5血府逐瘀胶囊中20个化合物高温稳定性试验结果(n＝2，μg/g)

“*”化合物含量单位为mg/g。

由表2–5可知，血府逐瘀胶囊在经过高湿(25℃、RH 90％±5％)条件处理后，样品含量无明显差异，血府逐瘀胶囊在高湿条件下比较稳定。

2.3小结

本研究将血府逐瘀胶囊置于光照恒温恒湿箱中，在强光(4500Lx±500Lx、25℃、RH40％±5％)、高温(60℃、RH 40％±5％)、高湿(25℃、RH 90％±5％)条件下分别放置10天，于第0、5、10天取样，用UPLC-PDA法测定血府逐瘀胶囊中化学成分的含量，考察强光、高温及高湿因素对血府逐瘀胶囊中化学成分稳定性的影响。结果表明，经过高湿和强光条件处理后，血府逐瘀胶囊样品中20个化合物的含量无明显变化；经过高温处理后，原儿茶酸、HSYA、芦丁、阿魏酸以及野漆树苷含量明显降低，其余成分无显著差异。本研究为血府逐瘀胶囊的储存提供了科学理论基础，所得数据作为“含量-稳定性-活性”多维网络中的稳定性维度值。

实施例3血府逐瘀胶囊候选成分的抗氧化及抗炎活性研究

3.1抗氧化活性研究

3.1.1材料与方法

3.1.1.1仪器

3.1.1.2试药

原儿茶酸(B21614)、芦丁(B20771)、绿原酸(B20782)、阿魏酸(B20007)、新橙皮苷(B21390)、羟基红花黄色素A(B20968)、橙皮苷(B20182)、对羟基苯甲酸(B20328)、芍药苷(B21148)、柚皮苷(B21594)、柚皮芸香苷(B21634)、柚皮素(B21596)、野漆树苷(B21484)、甘草苷(B20414)、甘草素(B20416)、甘草酸(B20417)、新异甘草苷(B24043)、蜕皮激素(B21268)(纯度≥98％)购自上海源叶生物科技有限公司，芍药内酯苷(S-011-161028)、川陈皮素(C-015-150729)购自成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度均≥98％。

血府逐瘀胶囊(批号：F03103)由天津宏仁堂药业有限公司提供。

3.1.1.3试剂

3.1.1.4方法

3.1.1.4.1 DPPH·法测试原理及计算公式

DPPH·(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)是一种稳定存在的自由基，具有较强的氧化反应能力。DPPH·在512nm左右波长处有强吸收，醇溶液为深紫色。有自由基清除剂的存在时，与DPPH·的单电子结合配对，形成稳定的DPPH-R结合物，其醇溶液褪色为淡黄色，吸光值(Optical density，OD)降低，降低程度与自由基的清除能力及配对电子数成化学计量关系，用清除率(Savenging rate,SR)表示，计算方法见公式3-1，SR值越大，抗氧化能力越强。因此，可用紫外-分光光度法对DPPH·清除能力进行快速的定量分析，以此来评价某物质的抗氧化能力。

SR(％)＝[1-(OD_药物-OD_空白)/(OD_对照-OD_空白)]×100％； 3-1

其中OD_药物＝DPPH·+样品吸光度值；OD_空白＝50％甲醇+样品吸光度值；OD_对照＝DPPH·+50％甲醇吸光度值。

3.1.1.4.2 DPPH·法测试条件

根据本实验室构建的DPPH·微孔定量测定法，开展血府逐瘀胶囊及其20个候选成分DPPH·清除活性研究。采用

型台式多功能读板机，在512nm、37℃条件下测定血府逐瘀胶囊DPPH·清除活性。实验分组：药物组：50μL工作溶液及150μL DPPH·甲醇溶液；空白对照组：50μL工作溶液及150μL 50％甲醇溶液；DPPH·对照组：50μL甲醇溶液及150μL DPPH·甲醇溶液；每组平行三个复孔，求其平均值。

将各组溶液加入96孔细胞培养板中，并置于多功能读板机，在温度为37℃、吸收波长为512nm处检测，每45s读取一次吸光值，连续记录45min，取最终时刻得到的OD值，所有试验平行测试3次。

3.1.1.4.3阳性药供试品储备液的制备

精密称取Vc 2.79mg，置于25mL容量瓶中，加适量甲醇，超声处理5min使其充分溶解，取出，放冷至室温，加甲醇定容至刻度，摇匀，取适量用甲醇将其稀释3倍，即得Vc工作溶液，备用。

3.1.1.4.4阳性药供试品工作溶液的制备

取Vc对照品储备溶液适量，用甲醇依次稀释0倍、1.25倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、6倍、10倍、20倍、50倍，配制成111.6μg/mL、89.28μg/mL、74.40μg/mL、55.80μg/mL、37.20μg/mL、27.90μg/mL、18.60μg/mL、11.16μg/mL、5.580μg/mL、2.232μg/mL 10个浓度的供试品溶液，备用。

3.1.1.4.5测试药物供试品储备液的制备

0.1mg/mL DPPH·甲醇溶液(现用现配)：取DPPH·试剂25mg，精密称定，置于250mL棕色容量瓶中，甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，即得DPPH·甲醇工作溶液。

取血府逐瘀胶囊粉末0.5g，精密称定，置于25mL容量瓶中，加适量50％甲醇，超声处理10min，取出，放冷至室温，并定容至刻度，摇匀，取适量于14000rpm离心10min，取上清，得供试品储备液。

取原儿茶酸、绿原酸、芦丁、阿魏酸标准品，精密称定5.05mg、5.03mg、5.01mg、5.02mg，分别置于5mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻线，摇匀，得到浓度为为1.010mg/mL、1.006mg/mL、1.002mg/mL、1.004mg/mL供试品储备溶液，备用。

取HSYA、橙皮苷、新橙皮苷标准品，精密称定3.00mg、3.00mg、3.01mg，分别置于1mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻线，摇匀，得到浓度为3.00mg/mL、3.00mg/mL、3.01mg/mL供试品储备溶液，备用。

3.1.1.4.6测试药物供试品工作溶液的制备

取血府逐瘀胶囊供试品储备溶液适量，用50％甲醇稀释，依次配制成20.00mg/mL、10.00mg/mL、5.000mg/mL、3.333mg/mL、2.000mg/mL、1.000mg/mL、0.4000mg/mL、0.2000mg/mL、0.1000mg/mL、0.0400mg/mL 10个浓度的供试品溶液，备用。

取原儿茶酸供试品储备溶液适量，用甲醇稀释，依次配制成335.3μg/mL、201.2μg/mL、125.8μg/mL、83.83μg/mL、40.24μg/mL、16.77μg/mL、8.048μg/mL、5.030μg/mL、2.515μg/mL、1.677μg/mL 10个浓度的工作溶液，备用。

取绿原酸供试品储备溶液适量，用甲醇稀释，依次配制成503.0μg/mL、167.7μg/mL、125.8μg/mL、83.83μg/mL、50.30μg/mL、25.15μg/mL、16.77μg/mL、10.06μg/mL、5.030μg/mL、2.515μg/mL 10个浓度的供试品溶液，备用。

取芦丁供试品储备溶液适量，用甲醇稀释，依次配制成501.0μg/mL、250.5μg/mL、167.0μg/mL、125.2μg/mL、100.2μg/mL、66.80μg/mL、33.40μg/mL、20.04μg/mL、10.02μg/mL、5.010μg/mL 10个浓度的供试品溶液，备用。

取阿魏酸供试品储备溶液适量，用甲醇稀释，依次配制成502.0μg/mL、251.0μg/mL、167.3μg/mL、125.5μg/mL、83.67μg/mL、50.20μg/mL、25.10μg/mL、10.04μg/mL、5.020μg/mL、2.510μg/mL 10个浓度的供试品溶液，备用。

取HSYA供试品储备溶液适量，用甲醇稀释，依次配制成3000μg/mL、1500μg/mL、500.0μg/mL、100.0μg/mL、25.00μg/mL、10.00μg/mL 6个浓度的供试品溶液，备用。

取橙皮苷供试品储备溶液适量，用甲醇稀释，依次配制成3000μg/mL、1500μg/mL、500.0μg/mL、100.0μg/mL、25.00μg/mL、12.50μg/mL 6个浓度的供试品溶液，备用。

取新橙皮苷供试品储备溶液适量，用甲醇稀释，依次配制成3001μg/mL、1500μg/mL、750.2μg/mL、375.1μg/mL、150.0μg/mL、30.01μg/mL 6个浓度的供试品溶液，备用。

取对羟基苯甲酸、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、柚皮芸香苷、柚皮苷、蜕皮激素、野漆树苷、异甘草苷、甘草素、柚皮素、甘草酸、川陈皮素标准品，精密称定3.02mg、3.01mg、3.00mg、3.01mg、3.02mg、3.03mg、3.03mg、3.03mg、3.01mg、3.03mg、3.04mg、3.03mg、3.03mg，分别置于1mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻线，摇匀，得到浓度为3.020mg/mL、3.010mg/mL、3.000mg/mL、3.010mg/mL、3.020mg/mL、3.030mg/mL、3.030mg/mL、3.030mg/mL、3.010mg/mL、3.030mg/mL、3.040mg/mL、3.030mg/mL、3.030mg/mL，供试品储备溶液，备用。

由于样品工作溶液和DPPH·甲醇液是按1：3的体积比例加入96孔细胞培养板孔中，因此，样品溶液终浓度为样品工作液浓度的1/4倍。

3.1.1.5数据处理

将上述供试品溶液按照“3.1.1.4.2”项下DPPH微孔定量法测定OD值，依公式3-1计算其DPPH·清除率。应用Origin Pro 8.5.1拟合S型剂量-效应曲线，并由量效曲线得出IC₅₀值。

3.1.2结果

3.1.2.1阳性药Vc DPPH·清除活性剂量-效应曲线

取“3.1.1.4.4”项下Vc供试品工作溶液，按“3.1.1.4.2”项下条件，将各组溶液加入96孔细胞培养板，并置于多功能读板机中检测，取最终时刻得到的OD值，所有试验平行测试3次。

按“3.1.1.5”项下方法处理数据，以Vc对照品终浓度(x，μg/mL)为横坐标，平均DPPH·清除率(SR，％)为纵坐标(y)绘制DPPH·清除活性剂量-效应曲线，计算其IC₅₀值，如表3-1、图2-1所示。

表3-1 Vc DPPH·清除率(n＝3)

由表3-1、图2-1可知，根据Vc DPPH·清除活性的剂量-效应曲线得出，Vc具有明显的DPPH·清除活性，且存在剂量依赖关系，由剂量曲线计算得其IC₅₀值为8.660μg/mL。

3.1.2.2血府逐瘀胶囊DPPH·清除活性剂量-效应曲线

取“3.1.1.4.6”项下血府逐瘀胶囊供试品工作溶液，按“3.1.1.4.2”项下条件测定，取OD值，所有试验平行测试3次。

按“3.1.1.5”项下方法处理数据，以血府逐瘀胶囊供试品终浓度(x，μg/mL)为横坐标，平均DPPH·清除率(SR，％)为纵坐标(y)绘制DPPH·清除活性剂量-效应曲线，计算其IC₅₀值，如表3-2、图2-2所示。

表3-2血府逐瘀胶囊DPPH·清除率(n＝3)

由表3-2、图2-2可知，血府逐瘀胶囊具有明显的DPPH·清除活性，且存在剂量依赖关系，由DPPH·清除活性的剂量-效应曲线计算得其IC₅₀值为529.4μg/mL。

3.1.2.3血府逐瘀胶囊20个候选成分的DPPH·清除活性

取“3.1.1.4.6”项下原儿茶酸、绿原酸、芦丁、阿魏酸供试品工作溶液，按“3.1.1.4.2”项下条件测定，取OD值，测定DPPH·清除活性，按“3.1.1.5”项下方法处理数据，绘制其相应的S型剂量-效应曲线，并计算IC₅₀值，具体结果见表3-3～3-6、图2-3～2-6。

取“3.1.1.4.6”项下HSYA、橙皮苷、新橙皮苷供试品工作溶液，按“3.1.1.4.2”项下条件测定，取OD值，测定DPPH·清除活性，按“3.1.1.5”项下方法处理数据，并计算IC₅₀值。结果显示，3个化合物具有一定的DPPH·清除活性，但活性较弱，不同浓度下SR值具体结果见表3-7～3-9。

取“3.1.1.4.6”项下对羟基苯甲酸、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、柚皮芸香苷、柚皮苷、蜕皮激素、野漆树苷、异甘草苷、甘草素、柚皮素、甘草酸、川陈皮素供试品工作溶液，按“3.1.1.4.2”项下条件测定，取OD值，测定DPPH·清除活性，按“3.1.1.5”项下方法处理数据，具体结果见表3-10。

表3-3原儿茶酸DPPH·清除率(n＝3)

由表3-3、图2-3可知，原儿茶酸具有明显的DPPH·清除活性，且存在剂量依赖关系，由DPPH·清除活性的剂量-效应曲线计算得其IC₅₀值为7.967μg/mL。

表3-4绿原酸DPPH·清除率(n＝3)

由表3-4、图2-4可知，绿原酸具有明显的DPPH·清除活性，且存在剂量依赖关系，由DPPH·清除活性的剂量-效应曲线计算得其IC₅₀值为15.27μg/mL。

表3-5芦丁DPPH·清除率(n＝3)

由表3-5、图2-5可知，芦丁具有明显的DPPH·清除活性，且存在剂量依赖关系，由DPPH·清除活性的剂量-效应曲线计算得其IC₅₀值为16.52μg/mL。

表3-6阿魏酸DPPH·清除率(n＝3)

由表3-6、图2-6可知，阿魏酸具有明显的DPPH·清除活性，且存在剂量依赖关系，由DPPH·清除活性的剂量-效应曲线计算得其IC₅₀值为12.24μg/mL。

表3-7不同浓度HSYA供试品溶液DPPH·清除活性结果(n＝3)

由表3-7可知，HSYA具有一定的DPPH·清除活性，且存在剂量依赖关系，由DPPH·清除活性的剂量效应曲线计算得其IC₅₀值为163.4μg/mL。

表3-8不同浓度橙皮苷供试品溶液DPPH·清除活性结果(n＝3)

由表3-8可知，橙皮苷具有一定的DPPH·清除活性，且存在剂量依赖关系，由DPPH·清除活性的剂量效应曲线计算得其IC₅₀值为185.2μg/mL。

表3-9不同浓度新橙皮苷供试品溶液DPPH·清除活性结果(n＝3)

由表3-9可知，新橙皮苷具有一定的DPPH·清除活性，且存在剂量依赖关系，由DPPH·清除活性的剂量效应曲线计算得其IC₅₀值为214.9μg/mL。

表3-10一定浓度下(3mg/mL)13个弱活性成分DPPH·清除活性(n＝1)

由表3-10可知，化合物对羟基苯甲酸、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、柚皮芸香苷、柚皮苷、蜕皮激素、野漆树苷、异甘草苷、甘草素、柚皮素、甘草酸、川陈皮素在浓度为3mg/mL时，DPPH·清除率在20％以下，认为其不显示抗氧化活性。

综上所述，对血府逐瘀胶囊中的20个成分进行抗氧化活性研究，由DPPH·清除活性的剂量效应曲线计算可知，原儿茶酸、绿原酸、芦丁、阿魏酸的IC₅₀值分别为7.967μg/mL、15.27μg/mL、16.52μg/mL、12.24μg/mL，其具有较强的抗氧化活性；HSYA、橙皮苷、新橙皮苷IC₅₀值分别为163.4μg/mL、185.2μg/mL、214.9μg/mL，具有一定的抗氧化活性；对羟基苯甲酸、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、柚皮芸香苷、柚皮苷、蜕皮激素、野漆树苷、异甘草苷、甘草素、柚皮素、甘草酸、川陈皮素未检测出抗氧化活性。

3.2抗炎活性研究

3.2.1材料与方法

3.2.1.1仪器

3.2.1.2试药

RAW264.7小鼠单核巨噬细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；

地塞米松磷酸钠(纯度≥99％)，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

原儿茶酸(B21614)、芦丁(B20771)、绿原酸(B20782)、阿魏酸(B20007)、新橙皮苷(B21390)、羟基红花黄色素A(B20968)、橙皮苷(B20182)、对羟基苯甲酸(B20328)、芍药苷(B21148)、柚皮苷(B21594)、柚皮芸香苷(B21634)、川陈皮素(C-015-150729)、柚皮素(B21596)、野漆树苷(B21484)、甘草苷(B20414)、甘草素(B20416)、甘草酸(B20417)、新异甘草苷(B24043)、蜕皮激素(B21268)(纯度≥98％)购自上海源叶生物科技有限公司，芍药内酯苷(S-011-161028)、川陈皮素(C-015-150729)购自成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度均≥98％。

血府逐瘀胶囊(批号：F03124)，由天津宏仁堂药业有限公司提供。

3.2.1.3试剂

3.2.1.4方法

3.2.1.4.1测试溶液的制备

DMEM完全培养液：40mL DMEM培养基，4.5mL FBS，0.5mL双抗。

磷酸盐(PBS)缓冲液的配制：精密称取0.2g KCl，8g NaCl，0.27g KH₂PO₄，1.42gNa₂HPO₄，加入超纯水并利用磁力搅拌器搅拌使其充分溶解，定容至1L，调pH值至7.3左右，用0.2μM滤膜过滤除菌，4℃保存。

LPS溶液的配制：精密称取LPS 1mg溶解于1mL无菌PBS中，制成质量浓度为1mg/mL的LPS溶液，分装在离心管中，于-20℃保存。

冻存液：90％FBS和10％DMSO溶液。

3.2.1.4.2供试品溶液的制备

取地塞米松磷酸钠(DEX)标准品，置于2mL离心管中，加适量DMEM完全培养基溶解，并稀释成浓度为100.0μg/mL、50.00μg/mL、25.00μg/mL的供试品溶液，备用。

取血府逐瘀胶囊粉末0.5g，精密称定，置于25mL容量瓶中，加适量50％甲醇，超声处理10min，取出，放冷至室温，并定容至刻度，摇匀，取适量于14000rpm离心10min，取上清10mL于100mL旋瓶中，旋干，加适量DMEM完全培养基溶解，并稀释成浓度为1250μg/mL、625.0μg/mL、312.5μg/mL、78.13μg/mL、19.53μg/mL、9.766μg/mL的供试品溶液，备用。

取原儿茶酸、HSYA、绿原酸、芍药苷、阿魏酸、柚皮芸香苷标准品，分别置于2mL离心管中，加适量DMEM完全培养基溶解，并稀释成浓度为100.0μg/mL、50.00μg/mL、25.00μg/mL、12.50μg/mL的供试品溶液，备用。

取对羟基苯甲酸、芍药内酯苷、甘草酸标准品，分别置于2mL离心管中，加适量DMEM完全培养基溶解，并稀释成浓度为100.0μg/mL、50.00μg/mL、25.00μg/mL、6.250μg/mL的供试品溶液，备用。

取芦丁、甘草素、柚皮素标准品，分别置于2mL离心管中，加适量DMEM完全培养基溶解，并稀释成浓度为50.00μg/mL、25.00μg/mL、12.50μg/mL、6.250μg/mL的供试品溶液，备用。

取柚皮苷、蜕皮激素、野漆树苷、橙皮苷、新橙皮苷、异甘草苷标准品，分别置于2mL离心管中，加适量DMEM完全培养基溶解，并稀释成浓度为50.00μg/mL、12.50μg/mL、6.250μg/mL、3.125μg/mL的供试品溶液，备用。

取甘草苷、川陈皮素标准品，分别置于2mL离心管中，加适量DMEM完全培养基溶解，并稀释成浓度为25.00μg/mL、12.50μg/mL、6.250μg/mL、3.125μg/mL的供试品溶液，备用。3.2.1.4.3细胞培养

细胞复苏：将RAW 264.7细胞从液氮罐中取出，迅速至于37℃水浴中，待冻存管内液体完全融化后，将其置于15mL离心管中，加入4mL DMEM完全培养液，1000rpm离心3min，弃上清液，加入1mL DMEM培养液重悬细胞后移至细胞培养瓶中，置于5％CO₂和37℃条件的细胞培养箱中培养。

细胞传代：待细胞成对数生长且在培养皿中铺满80％以上面积时，弃去皿中培养基，用2mL PBS清洗2次，加入2mL PBS，用细胞刮刀将细胞轻轻刮起，再加入2mL PBS将细胞悬液进行混匀，加至15mL离心管中离心，弃上清液，加入1mL DMEM完全培养液重悬细胞后，移至含有4mL DMEM完全培养液细胞培养瓶中，置于5％CO₂和37℃条件的细胞培养箱中培养。

细胞冻存：按“细胞传代”的操作步骤弃上清液后，加入冻存液(1mL冻存液体系为900μL血清和100μL DMSO)，重悬细胞后分装至冻存管中，冻存管需标记细胞名称、代数及冻存日期。将冻存管放置程序降温盒中24h后转移到液氮罐中保存。

3.2.2结果

3.2.2.1 CCK8法测定血府逐瘀胶囊及化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞毒性试验

取对数生长期的RAW264.7细胞以6×10⁴个/mL的密度接种于96孔板中，每孔接种100μL，每一浓度设3个复孔。于5％CO₂和37℃条件的细胞培养箱中培养12h后，依据实验设计加入“3.2.1.4.2”项下不同浓度的药物，并设立正常对照组(含100μL 6×10³个/mL密度的细胞)，继续培养12h后，除正常对照组外，每孔加入适量LPS溶液，其在孔中的浓度为1μg/mL。置于细胞培养箱中培养24h，避光条件下再加入10μL CCK8试剂，在细胞培养箱中避光培养2h，酶标仪在450nm条件下测定96孔板每孔的OD值，计算出细胞存活率，如图2-7～2-13所示。

图2-7可知，1250μg/mL、625.0μg/mL、312.5μg/mL、78.13μg/mL、19.53μg/mL、9.766μg/mL血府逐瘀胶囊对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响(存活率≥90％)。

由图2-8可知，阳性药DEX在100.0μg/mL、50.00μg/mL、25.00μg/mL的浓度下对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响(存活率≥90％)。

由图2-9可知，原儿茶酸、绿原酸在100.0μg/mL、50.00μg/mL、25.00μg/mL的浓度下对LPS诱导的RAW264.7细胞活性均无影响(存活率≥90％)。

由图2-10可知，芍药苷在100.0μg/mL、50.00μg/mL、25.00μg/mL的浓度下与甘草苷在25.00μg/mL、12.50μg/mL、6.250μg/mL的浓度下，对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响(存活率≥90％)。

由图2-11可知，甘草酸在100.0μg/mL、50.00μg/mL、25.00μg/mL的浓度下与新橙皮苷在50.00μg/mL、12.50μg/mL、6.250μg/mL的浓度下，对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响(存活率≥90％)。

由图2-12可知，异甘草苷在50.00μg/mL、12.50μg/mL、6.250μg/mL的浓度下与甘草素在50.00μg/mL、25.00μg/mL、12.50μg/mL的浓度下，对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响(存活率≥90％)。

由图2-13可知，柚皮素在50.00μg/mL、25.00μg/mL、12.50μg/mL的浓度下与川陈皮素在25.00μg/mL、12.50μg/mL、6.250μg/mL的浓度下，对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响(存活率≥90％)。

综上所述，血府逐瘀胶囊在1250μg/mL、625.0μg/mL、312.5μg/mL、78.13μg/mL、19.53μg/mL、9.766μg/mL的浓度下对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响；原儿茶酸、绿原酸、芍药苷、甘草酸在100.0μg/mL、50.00μg/mL、25.00μg/mL的浓度下对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响；甘草素、柚皮素在50.0μg/mL、25.00μg/mL、12.5μg/mL的浓度下对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响；新橙皮苷、异甘草苷在50.0μg/mL、12.50μg/mL、6.250μg/mL的浓度下对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响；甘草苷、川陈皮素在25.00μg/mL、12.50μg/mL、6.250μg/mL的浓度下对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响；阳性药DEX在100.0μg/mL、50.00μg/mL、25.00μg/mL的浓度下对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响，因此选用50.00μg/mL浓度的DEX作为阳性药对照。

3.2.2.1 Griess法测定血府逐瘀胶囊及化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO试验

标准曲线的绘制：采用Griess法将Griess试剂盒放至室温，摇匀，用DMEM完全培养液依次稀释亚硝酸钠标准溶液至所需浓度。实验共设有100.0μM、50.00μM、25.00μM、12.50μM、6.250μM、3.125μM、1.562μM 7个浓度。以稀释溶剂作为空白对照组，将稀释溶剂、系列浓度亚硝酸钠标准溶液样品加至96孔板中，每孔50μL溶液，每个浓度平行3个复孔；在避光条件下，依次加入Griess ReagentⅠ和Griess ReagentⅡ，各50μL/孔，置于酶标仪中，在540nm条件下检测每孔OD值，以亚硝酸盐的浓度为横坐标x(μM)，以OD值y为纵坐标，绘制标准曲线，如图2-14所示。

取对数生长期的RAW264.7细胞以10×10⁴个/mL的密度接种于24孔板中，每孔接种1mL，每一浓度设3个复孔。于5％CO₂和37℃条件的细胞培养箱中培养12h后，依据实验分组加入不同浓度的药物，继续培养12h后，除正常对照组外，每孔加入适量LPS溶液，其在孔中的浓度为1μg/mL。实验分组：Control组；LPS组：含1μg/mL LPS；阳性对照(DEX)组：含1μg/mLLPS及50μg/mL DEX；药物组：含1μg/mL LPS及“2.1.4.2”项下不同浓度药物。置于细胞培养箱中培养24h，吸取各孔细胞上清液50μL于96孔板中，依次加入Griess reagent I和Griessreagent II各50μL，检测每孔的OD值，根据标准曲线计算上清液中NO的含量，结果见图2-15～2-26。

由图2-15、2-16可知，血府逐瘀胶囊在对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响的浓度下，对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO具有较好抑制作用，且存在剂量依赖关系，由NO抑制的剂量效应曲线计算得其IC₅₀值为148.9μg/mL。

由图2-17可知，原儿茶酸在对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响的浓度下，对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO具有较好抑制作用，且存在剂量依赖关系，由NO抑制的剂量效应曲线计算得其IC₅₀值为26.34μg/mL。

由图2-18可知，绿原酸在对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响的浓度下，对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO具有较好抑制作用，且存在剂量依赖关系，由NO抑制的剂量效应曲线计算得其IC₅₀值为25.57μg/mL。

由图2-19可知，芍药苷在对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响的浓度下，对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO具有较好抑制作用，且存在剂量依赖关系，由NO抑制的剂量效应曲线计算得其IC₅₀值为29.20μg/mL。

由图2-20可知，甘草苷在对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响的浓度下，对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO具有较好抑制作用，且存在剂量依赖关系，由NO抑制的剂量效应曲线计算得其IC₅₀值为6.922μg/mL。

由图2-21可知，新橙皮苷在对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响的浓度下，对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO具有较好抑制作用，且存在剂量依赖关系，由NO抑制的剂量效应曲线计算得其IC₅₀值为15.11μg/mL。

由图2-22可知，异甘草苷在对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响的浓度下，对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO具有较好抑制作用，且存在剂量依赖关系，由NO抑制的剂量效应曲线计算得其IC₅₀值为1.989μg/mL。

由图2-23可知，甘草素在对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响的浓度下，对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO具有较好抑制作用，且存在剂量依赖关系，由NO抑制的剂量效应曲线计算得其IC₅₀值为3.901μg/mL。

由图2-24可知，柚皮素在对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响的浓度下，对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO具有较好抑制作用，且存在剂量依赖关系，由NO抑制的剂量效应曲线计算得其IC₅₀值为10.98μg/mL。

由图2-25可知，甘草酸在对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响的浓度下，对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO具有较好抑制作用，且存在剂量依赖关系，由NO抑制的剂量效应曲线计算得其IC₅₀值为57.39μg/mL。

由图2-26可知，川陈皮素在对LPS诱导的RAW264.7细胞活性无影响的浓度下，对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO具有较好抑制作用，且存在剂量依赖关系，由NO抑制的剂量效应曲线计算得其IC₅₀值为5.532μg/mL。

综上所述，应用建立LPS诱导RAW264.7细胞产生炎症因子NO的炎症模型，对血府逐瘀胶囊及其成分进行抗炎活性试验。血府逐瘀胶囊具有良好的抗炎活性，原儿茶酸、绿原酸、芍药苷、甘草苷、新橙皮苷、异甘草苷、甘草素、柚皮素、甘草酸、川陈皮素的抗炎活性较强。除此之外，HSYA、对羟基苯甲酸、芍药内酯苷、芦丁、柚皮苷、蜕皮激素、野漆树苷、橙皮苷的抗炎活性较弱，不能完成NO抑制的剂量效应曲线，阿魏酸和柚皮芸香苷对LPS诱导RAW264.7细胞产生炎症因子NO无抑制作用，因此不显示抗炎活性。

3.3小结

本研究应用DPPH·微孔定量测定法测定血府逐瘀胶囊及20个化学成分的抗氧化活性，并建立LPS诱导RAW264.7细胞产生炎症因子NO的炎症模型，测定20个化学成分对NO产生的抑制作用，阐明其抗炎活性。所得数据作为“含量-稳定性-活性”多维网络中的活性维度值。

实施例4基于“量-稳-活”多维网络模式的血府逐瘀胶囊“质控标志物”的辨析

4.1血府逐瘀胶囊“质控标志物”辨析研究的多维度分析

4.1.1血府逐瘀胶囊含量维度

含量维度，Relative Content。

测定11批血府逐瘀胶囊20个候选成分的含量，将该实验结果取平均值，以反映各成分在血府逐瘀胶囊中的含量高低。

参照公式4-1，将各成分含量除以成分含量最大值进行数据归一化处理，作为“含量维度”。

Relative Content＝含量/Max 4-1

Relative Content，含量维度；

含量，11批血府逐瘀胶囊含量测定结果的平均值；

Max，血府逐瘀胶囊含量测定结果中20个成分中的含量最大值。

表4-1血府逐瘀胶囊20个候选成分含量归一化结果

“*”化合物含量单位为mg/g。

4.1.2血府逐瘀胶囊稳定性维度

4.1.2.1高温稳定性归一化处理

高温稳定性，定义为HTS(High temperature stability)。

检测血府逐瘀胶囊中20个候选成分在RH 40％±5％、60℃高温与避光条件下放置10天后的含量变化情况。

参照公式4-2，计算20个候选成分相对于0天含量测定结果的比值减100％的绝对值，以表示含量变化的程度，含量变化越大，稳定性越差；再用1减该绝对值，使计算结果与稳定性正相关，得到“高温稳定性结果”，反映各成分在高温下的稳定性。

HTS＝1-︱CR-100％︱ 4-2

HTS，High temperature stability，高温稳定性维度；

CR，Content ratio，含量比值，血府逐瘀胶囊于60℃温度下避光放置10天，20个候选成分相对于0天含量测定结果的比值。

4.1.2.2高湿稳定性归一化处理

高湿稳定性，定义为HHS(High humidity stability)。

检测血府逐瘀胶囊中20个候选成分在25℃、RH90％±5％高湿与避光条件下放置10天后的含量变化情况。

参照公式4-3，计算20个候选成分相对于0天含量测定结果的比值减100％的绝对值，以表示含量变化的程度，含量变化越大，稳定性越差；再用1减该绝对值，使计算结果与稳定性正相关，得到“高湿稳定性结果”，反映各成分在高湿下的稳定性。

HHS＝1-︱CR-100％︱ 4-3

HHS，High humidity stability，高温稳定性维度；

CR，Content ratio，含量比值，血府逐瘀胶囊于25℃、RH90％±5％湿度下避光放置10天，20个候选成分相对于0天含量测定结果的比值。

4.1.2.3强光稳定性归一化处理

强光稳定性，定义为SLS(Strong light stability)。

检测血府逐瘀胶囊中20个候选成分在25℃、RH 40％±5％、4500Lx±500Lx强光条件下放置10天后的含量变化情况。

参照公式4-4，计算20个候选成分相对于0天含量测定结果的比值减100％的绝对值，以表示含量变化的程度，含量变化越大，稳定性越差；再用1减该绝对值，使计算结果与稳定性正相关，得到“强光稳定性结果”，从而反映各成分在强光下的稳定性。

SLS＝1-︱CR-100％︱ 4-4

SLS，Strong light stability，强光稳定性维度；

CR，Content ratio，含量比值，血府逐瘀胶囊于4500Lx±500Lx强光照射条件下放置10天，20个候选成分相对于0天含量测定结果的比值。

4.1.2.4高温、高湿、强光稳定性维度

高温、高湿和强光稳定性作为“三元网络评价模式”的三个重要参数，其取值范围具有较大差异，为消除三个参数间数值的不一致性，对各自进行归一化处理，结果分别为HTS值、HHS值和SLS值；其中回归面积是该评价模式的一个重要评价标准，根据回归面积的大小评价各组分的稳定性贡献，计算公式4-5，4-6如下，结果见表4-2。

A：三元网络回归面积；S：三角形周长；a：HTS值；b：HHS值；c：SLS值

表4-2血府逐瘀胶囊20个候选成分稳定性归一化结果

4.1.3血府逐瘀胶囊活性维度

4.1.3.1抗氧化活性归一化处理

抗氧化活性，定义为AOA(Antioxidant activity)。

IC₅₀是评价抗氧化活性的重要指标之一，IC₅₀值越小，抗氧化活性越强。

参照公式4-7，求IC₅₀值倒数，以直接反映各成分的活性强弱；将各成分IC₅₀值倒数除以最大值进行数据归一化处理，计算结果作为“抗氧化活性维度”，见表4-3。本研究中规定，3mg/mL浓度时，清除率SR值低于50％的成分认为不具有抗氧化活性。

AOA＝(1/IC₅₀)/Max 4-7

AOA，Antioxidant activity，抗氧化活性维度；

IC₅₀，DPPH·清除率(SR值)到达一半时所需要样品(血府成分)的浓度；

Max，血府逐瘀胶囊20个候选成分抗氧化活性1/IC₅₀中的最大值。

4.1.3.2抗炎活性归一化处理

抗炎活性，定义为AIA(Anti-inflammatory Activity)

IC₅₀是评价抗炎活性的重要指标之一，IC₅₀值越小，抗炎活性越强。

参照公式4-8，求IC₅₀值倒数，以直接反映该成分活性强弱；将各成分IC₅₀值倒数除以最大值进行数据归一化处理，计算结果作为“抗炎活性维度”。

AIA＝(1/IC₅₀)/Max 4-8

AIA，Anti-inflammatory Activity，抗炎活性维度；

IC₅₀，抗炎活性到达一半时所需要样品(血府成分)的浓度；

Max，血府逐瘀胶囊20个成分抗炎活性1/IC₅₀中的最大值。

4.1.3.3抗氧化与抗炎活性维度

抗氧化活性和抗炎活性作为“网络评价模式”的两个重要参数，其取值范围具有较大差异，为消除两个参数间数值的不一致性，对各自进行归一化处理，结果分别为AOA值和AIA值；其中由AOA和AIA在坐标轴上组成的三角形的斜边长度是该评价模式的一个重要评价标准，根据三角形的斜边长度大小评价各组分的活性贡献，计算公式4-9如下，结果见表4-3。

注：C为活性贡献值；A为AOA值；B为AIA值。

表4-3血府逐瘀胶囊20个候选成分活性的归一化结果

4.2血府逐瘀胶囊含量、稳定性及活性三个维度回归面积

将血府逐瘀胶囊的含量、稳定性及活性作为多维网络模式的三个重要维度，其取值范围具有较大差异，为消除三个维度间数值的不一致性，对各维度进行归一化处理，其中回归面积是该评价模式的一个重要评价标准。根据回归面积的大小评价各组分的贡献度，并将各化合物按照回归面积大小进行排序，计算公式4-10，4-11，结果见表4-4、图3-1～3-3。

其中：A′为三维网络回归面积；S′为三角形周长；e为活性维度值；f为含量维度值；g为稳定性维度值。

表4-4血府逐瘀胶囊20个候选成分含量、稳定性及活性的回归面积

由表4-4、图3-1可知，在含量维度中，柚皮苷的含量最高，其次是芍药苷与新橙皮苷；在稳定性维度中，HSYA的稳定性变化较大，整体来说，20个检测成分均比较稳定；在活性维度中，除对羟基苯甲酸、芍药内酯苷、柚皮芸香苷、柚皮苷、蜕皮激素、野漆树苷以外，血府逐瘀胶囊中其余14个检测成分均具有一定的抗氧化活性或抗炎活性，其中原儿茶酸、异甘草苷的活性维度值最高。

由图3-2、3-3可知，以血府逐瘀胶囊的含量、稳定性及活性作为多维网络模式的三个维度，对各维度进行归一化处理，计算各化合物的回归面积并进行排序，各成分由大到小依次为柚皮苷、异甘草苷、芍药苷、原儿茶酸、新橙皮苷、阿魏酸、绿原酸、甘草素、芦丁、川陈皮素、甘草苷、柚皮素、芍药内酯苷、甘草酸、橙皮苷、柚皮芸香苷、HSYA、野漆树苷、蜕皮激素、对羟基苯甲酸，其回归面积依次为0.4933、0.4876、0.4416、0.4271、0.3638、0.2894、0.2556、0.2298、0.2234、0.1750、0.1428、0.0903、0.0653、0.0486、0.0358、0.0349、0.0186、0.0110、0.0108、0.0026。选取回归面积较大的化合物作为血府逐瘀胶囊的“质控标志物”，因此，选择柚皮苷、异甘草苷、芍药苷、原儿茶酸、新橙皮苷和阿魏酸作为血府逐瘀胶囊的“质控标志物”。

4.3小结

通过整合血府逐瘀胶囊含量测定、稳定性及活性研究结果，构建“含量-稳定性-活性”三维网络分析，采用三维网络回归面积辨析血府逐瘀胶囊化学成分群，选取回归面积较大的化合物作为血府逐瘀胶囊优选的“质控标志物”；结果表明，柚皮苷、异甘草苷、芍药苷、原儿茶酸、新橙皮苷、阿魏酸6个化学成分回归面积较大，依次为0.4933、0.4876、0.4416、0.4271、0.3638、0.2894。其中，柚皮苷和新橙皮苷、芍药苷、原儿茶酸、异甘草苷分别为枳壳、赤芍、川芎、甘草的主要有效成分，阿魏酸在红花、川芎、生地、当归四味中药中均有分布，6个成分涵盖了血府逐瘀胶囊复方中的君药、臣药、佐药、使药。因此，选择柚皮苷、异甘草苷、芍药苷、原儿茶酸、新橙皮苷和阿魏酸为代表性“质控标志物”，为血府逐瘀胶囊质量控制研究提供科学依据。

综上所述，本发明提供了一种基于量稳活多维网络模式的血府逐瘀胶囊质控标志物发现方法。

Claims (9)

1.一种基于量稳活多维网络模式的血府逐瘀胶囊质控标志物发现方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：血府逐瘀胶囊含量维度值的获取，用超高效液相色谱法测定11批血府逐瘀胶囊20个候选成分的含量，取平均值，以反映各成分在血府逐瘀胶囊中的含量高低，将各成分含量除以成分含量最大值进行数据归一化处理，即得到含量维度值；所述20个候选成分分别为:原儿茶酸、羟基红花黄色素A、绿原酸、对羟基苯甲酸、芍药内酯苷、芍药苷、芦丁、甘草苷、阿魏酸、柚皮芸香苷、柚皮苷、蜕皮激素、野漆树苷、橙皮苷、新橙皮苷、异甘草苷、甘草素、柚皮素、甘草酸、川陈皮素；所述超高效液相色谱法的色谱条件为：

色谱柱ZORBAXSB-C18，4.6mm×100mm，1.8μm；流动相：流动相 A为0.1％甲酸水、流动相B为甲醇，梯度洗脱程序如下：

进样量2μL；流速0.5mL/min；柱温60℃；PDA扫描范围：全波长扫描，λ＝210nm～400nm；

步骤二：血府逐瘀胶囊稳定性维度值的获取，通过高温稳定性归一化处理结果得到高温稳定性维度、高湿稳定性归一化处理结果得到高湿稳定性维度、强光稳定性归一化处理结果得到强光稳定性维度，根据回归面积的大小评价各组分的稳定性贡献，计算三元网络回归面积，即得到各稳定性维度值；

步骤三：血府逐瘀胶囊活性维度值的获取，通过抗氧化活性归一化处理结果得到抗氧化活性维度、抗炎活性归一化处理结果得到抗炎活性维度，由抗氧化活性维度和抗炎活性维度在坐标轴上组成的三角形的斜边长度大小评价各组分的活性贡献，计算活性贡献值，即得到活性维度值；

步骤四：通过整合血府逐瘀胶囊含量维度值、稳定性维度值及活性维度值，对各维度进行归一化处理，构建“含量-稳定性-活性”三维网络分析，采用三维网络回归面积辨析血府逐瘀胶囊化学成分群，并将各候选成分按照回归面积大小进行排序，确定血府逐瘀胶囊质控标志物。

2.根据权利要求1所述的一种基于量稳活多维网络模式的血府逐瘀胶囊质控标志物发现方法，其特征在于：步骤一中所述含量维度、含量之间有如下式限定：

Relative Content＝含量/Max

其中：Relative Content为含量维度；含量为11批血府逐瘀胶囊含量测定结果的平均值；Max为血府逐瘀胶囊含量测定结果中20个成分中的含量最大值。

3.根据权利要求1所述的一种基于量稳活多维网络模式的血府逐瘀胶囊质控标志物发现方法，其特征在于：步骤二中所述高温稳定性归一化处理的步骤为：检测血府逐瘀胶囊中20个候选成分在RH40％±5％、60℃高温与避光条件下放置10天后的含量变化情况，计算20个候选成分相对于0天含量测定结果的比值减100％的绝对值，以表示含量变化的程度，再用1减该绝对值，使计算结果与稳定性正相关，得到高温稳定性维度值；

所述高温稳定性维度值、含量比值之间有如下式限定：

HTS＝1-︱CR-100％︱

其中：HTS为高温稳定性维度值；CR为含量比值，血府逐瘀胶囊于60℃温度下避光放置10天，20个候选成分相对于0天含量测定结果的比值。

4.根据权利要求3所述的一种基于量稳活多维网络模式的血府逐瘀胶囊质控标志物发现方法，其特征在于：步骤二中所述高湿稳定性归一化处理的步骤为：检测血府逐瘀胶囊中20个候选成分在25℃、RH90％±5％高湿与避光条件下放置10天后的含量变化情况，计算20个候选成分相对于0天含量测定结果的比值减100％的绝对值，以表示含量变化的程度，再用1减该绝对值，使计算结果与稳定性正相关，得到高湿稳定性维度值；

所述高湿稳定性维度值、含量比值之间有如下式限定：

HHS＝1-︱CR-100％︱

其中：HHS为高湿稳定性维度值；CR为含量比值，血府逐瘀胶囊于25℃、RH90％±5％湿度下避光放置10天，20个候选成分相对于0天含量测定结果的比值。

5.根据权利要求4所述的一种基于量稳活多维网络模式的血府逐瘀胶囊质控标志物发现方法，其特征在于：步骤二中所述强光稳定性归一化处理的步骤为：检测血府逐瘀胶囊中20个候选成分在25℃、RH40％±5％、4500Lx±500Lx强光条件下放置10天后的含量变化情况，计算20个候选成分相对于0天含量测定结果的比值减100％的绝对值，以表示含量变化的程度，再用1减该绝对值，使计算结果与稳定性正相关，得到强光稳定性维度值；

所述强光稳定性维度值、含量比值之间有如下式限定：

SLS＝1-︱CR-100％︱

其中：SLS为强光稳定性维度；CR为含量比值，血府逐瘀胶囊于4500Lx±500Lx强光照射条件下放置10天，20个候选成分相对于0天含量测定结果的比值。

6.根据权利要求5所述的一种基于量稳活多维网络模式的血府逐瘀胶囊质控标志物发现方法，其特征在于：步骤二中所述三元网络回归面积、HTS值、HHS值、SLS值之间有如下式限定：

其中：A为三元网络回归面积；S为三角形周长；a为HTS值；b为HHS值；c为SLS值。

7.根据权利要求1所述的一种基于量稳活多维网络模式的血府逐瘀胶囊质控标志物发现方法，其特征在于：步骤三中所述抗氧化活性归一化处理的步骤为：由剂量曲线计算得出IC50值，求IC50值倒数，以直接反映各成分的活性强弱，将各成分IC50值倒数除以最大值进行数据归一化处理，计算结果作为抗氧化活性维度值；

所述抗氧化活性维度值、IC50、Max之间有如下式限定：

AOA＝(1/IC₅₀)/Max

其中：AOA为抗氧化活性维度值；IC₅₀为DPPH·清除率到达一半时所需要样品的浓度；Max为血府逐瘀胶囊20个候选成分抗氧化活性1/IC50中的最大值；

步骤三中所述抗炎活性归一化处理的步骤为：由剂量曲线计算得出IC50值，求IC50值倒数，以直接反映各成分活性强弱，将各成分IC50值倒数除以最大值进行数据归一化处理，计算结果作为抗炎活性维度值；

所述抗炎活性维度值、IC₅₀、Max之间有如下式限定：

AIA＝(1/IC₅₀)/Max

其中：AIA为抗炎活性维度值；IC₅₀为NO抑制率到达一半时所需要样品的浓度；Max为血府逐瘀胶囊20个成分抗炎活性1/IC₅₀中的最大值。

8.根据权利要求7所述的一种基于量稳活多维网络模式的血府逐瘀胶囊质控标志物发现方法，其特征在于：步骤三中所述活性贡献值、AOA值、AIA值之间有如下式限定：

其中：C为活性贡献值；A为AOA值；B为AIA值。

9.根据权利要求1所述的一种基于量稳活多维网络模式的血府逐瘀胶囊质控标志物发现方法，其特征在于：步骤四中所述三维网络回归面积、含量维度值、稳定性维度值、活性维度值之间有如下式限定：

其中：A′为三维网络回归面积；S′为三角形周长；e为活性维度值；f为含量维度值；g为稳定性维度值。

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