CN102323371A - 一种止血药物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种止血药物的检测方法，所述止血药物由大黄、黄连、三七、白芷、阿胶、龙骨、白及、没药、海螵蛸、茜草和龙血竭组成，该检测方法包括采用薄层色谱法鉴定所述致康胶囊中的没药、采用薄层色谱法鉴定所述致康胶囊中的黄连、采用液相色谱法检测大黄中的土大黄苷、检测大黄中的大黄酚以及采用气相色谱法检测所述致康胶囊中冰片的含量。本发明能够有效控制致康胶囊的质量，使致康胶囊质量达到稳定、可控、高效及安全，是对产品的投料要求及原料的质量控制严格，克服现有技术的不足，提高产品的质量、疗效、生物利用度，更好的满足医疗的需要。

Description

一种止血药物的检测方法

技术领域

本发明属于制药技术领域，具体涉及一种止血药物的检测方法，特别是涉及一种用于止血的胶囊剂(致康胶囊)的检测方法。

背景技术

致康胶囊由大黄、黄连、三七、白芷、阿胶、龙骨(煅)、白及、没药(制)、海螵蛸、茜草、龙血竭等十四味中药材组成，具有协同作用，符合中药组方原则，达到标本兼治的目的。该制剂吸收了古方“七厘散”、“锡类散”、“腐尽生肌散”、“铁扇散”和“刀剪散”等经典古方之精华，具有“止血、促进组织修复、消炎”之功效。在全国各地医院临床应用过程中证明具有显著的临床疗效，深得广大医务工作者和患者的信任。

在现有的致康胶囊的检测方法中，未制定成份没药的TLC鉴别方法、土大黄苷的液相检测方法、大黄酚的含量检测方法、冰片含量的气相测定法，对黄连的薄层色谱鉴别方法中含有苯，易对人体和环境造成危害。为进一步控制该产品的质量，保证检测人员的身体健康，减少环境污染，需要对该产品的检测进行改进，从而更进一步保证该产品的质量和疗效。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种止血药物的检测方法，该检测方法能够有效控制药物的质量，使药物质量达到稳定、可控、高效及安全的标准，从而更好地满足医疗需要。

本发明的目的是采用如下技术方案来实现的。

一种止血药物的检测方法，所述止血药物由大黄、黄连、三七、白芷、阿胶、龙骨、白及、没药、海螵蛸、茜草和龙血竭组成(即致康胶囊)，该检测方法包括采用薄层色谱法鉴定所述止血药物中的没药，其中，所述薄层色谱的条件包括：

采用体积比为28～35∶0.9～1.2，优选为30∶1的甲苯-醋酸乙酯作为展开剂；

采用加热显色，显色剂为1％w/v～5％w/v，优选为1％w/v的香草醛浓硫酸溶液，加热温度为80-120℃，优选为105℃。

在一个具体实施方案中，采用薄层色谱法鉴定所述止血药物中的没药包括如下步骤：

取止血药物内容物3g，置具塞锥形瓶中，加无水乙醇50ml，超声60分钟，滤过，滤液挥干，加水50ml使溶解，滤过，滤液用乙醚萃取3次，每次20ml，收集合并乙醚液，挥干，残渣加石油醚(60～90℃)1ml使溶解，作为供试品溶液；另取没药对照药材0.3g，同法制成对照药材溶液；再取不含没药的阴性样品，同供试品溶液的制法制成阴性对照溶液；吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为30∶1的甲苯-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以新制的1％香草醛浓硫酸溶液，在105℃加热至斑点清晰。上述鉴定方法阴性无干扰，样品重性形良好，可以作为鉴别致康胶囊中没药的依据。

上述检测方法还包括采用薄层色谱法鉴定所述止血药物中的黄连，其中，所述薄层色谱的条件包括：

采用体积比为5～8∶2.5～4∶1～2.5∶1～2.5∶0.25～0.4，优选为6∶3∶1.5∶1.5∶0.3的甲苯-醋酸乙酯-异丙醇-甲醇-水作为展开剂。现有方法中以苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水为展开剂，因苯对人体和环境有很大的危害，上述检测方法使用了甲苯代替苯，取得了较好的效果。

在一个具体实施方案中，采用薄层色谱法鉴定所述止血药物中的黄连包括如下步骤：

取止血药物内容物3g，加1％盐酸甲醇溶液20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液；另取黄连对照药材0.1g，加1％盐酸甲醇5ml溶液，滤过，滤液作为对照药材溶液；再取不含黄连的阴性样品，同供试品溶液的制法制成阴性对照溶液；吸取溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为6∶3∶1.5∶1.5∶0.3的甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水为展开剂，置氨蒸汽饱和的层析缸内，展开，取出，晾干，置365nm的紫外光灯下检视。

上述检测方法还包括采用液相色谱法检测大黄中的土大黄苷，其中，所述液相色谱的条件包括：

采用十八烷基硅烷键合硅胶的填充剂；

采用体积比为36∶64的甲醇-水为流动相；以及

采用320nm的检测波长。

在一个具体实施方案中，采用液相色谱法检测大黄中的土大黄苷包括如下步骤：

(1)色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为36∶64的甲醇-水为流动相；检测波长为320nm；理论板数按大黄苷峰计算应不低于2000；

(2)对照品溶液的制备

取土大黄苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含10μg的溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备

取止血药物内容物，研细，取0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理40分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得；

(4)测定

分别精密吸取上述两种溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。

大黄为致康胶囊中的主药，对疗效起着重要作用，而劣质大黄和土大黄等非正品大黄，在化学成分上与正品大黄存在较大差异(均含土大黄苷)，因而在药效上必然存在很大差别。现有市场大黄中伪品较多，且性状相似，《中国药典2010年版一部》中用纸色谱对其进行检测且没有对照品比较，人为误差较大，考虑到投料量和提取的影响，再用纸色谱进行控制其意义不大。本发明采用高效液相色谱法检测大黄中的土大黄苷，经过方法学考察证明本法灵敏度高，重复性好，回收率良好，且阴性对照无干扰，整个试验过程可操作性强，可以作为控制本品内在质量的指标之一。增加该检测方法旨在为更好的保证产品质量，维护病人用药的安全有效，净化药品市场及秩序，打击制假售假的违法行为，是为人民用药安全有效负责任。

上述检测方法还包括采用液相色谱法检测大黄中的大黄酚，其中，所述液相色谱的条件包括：

采用十八烷基硅烷键合硅胶的填充剂；

采用体积比为60∶40∶1的乙腈-水-冰醋酸为流动相；以及

采用254nm的检测波长。

在一个具体实施方案中，采用液相色谱法检测大黄中的大黄酚包括如下步骤：

(1)色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为60∶40∶1的乙腈-水-冰醋酸为流动相；检测波长254nm，理论板数按大黄素峰计算应不低于3000；

(2)对照品溶液的制备

取大黄素对照品、大黄酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含5μg的混合溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备

取止血药物内容物，研细，取约0.4g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理(功率200W，频率40kHz)40分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过；精密吸取上述滤液10ml，置烧瓶中，蒸干，加1mol/L盐酸溶液30ml，加三氯甲烷20ml，加热回流1小时，冷却，分取三氯甲烷层，水层再用三氯甲烷振摇提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，蒸至近干，用甲醇定量转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度；用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得；

(4)测定

分别精密吸取上述两种溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

大黄为致康胶囊处方中的君药，其有效成分为大黄素，大黄酚，大黄酸，芦荟大黄素，大黄素甲醚以及甙类等蒽醌类成分。大黄素，大黄酚为其中含量较高的成分。致康胶囊的功能主治为清热凉血，化瘀止血。用于崩漏，吐血及便血。文献报道大黄酚的口服和皮下注射，均有明显缩短血液凝固时间的作用，具有止血作用，为制剂中的活性成分。现有技术中仅对大黄素进行了测定，为了更好地控制制剂质量，本发明对大黄酚的含量进行了测定。用大黄素和大黄酚双分组控制制剂质量。经过方法学考察证明本法灵敏度高，重复性好，回收率良好，且阴性对照无干扰。整个试验过程可操作性强，可以作为控制本品内在质量的指标之一。

上述检测方法还包括采用气相色谱法检测所述止血药物中冰片的含量，其中所述气相色谱的条件包括：

采用聚乙二醇-20M为固定相，涂布浓度为10％；以及

采用柱温120℃保持1分钟，再以5℃/min升至180℃，保持2分钟。

在一个具体实施方案中，采用气相色谱法检测所述止血药物中冰片的含量包括如下步骤：

(1)色谱条件与系统适用性试验

以聚乙二醇(PEG)-20M为固定相，涂布浓度为10％，柱温120℃保持1分钟，再以5℃/min升至180℃，保持2分钟，理论板数按龙脑峰计算应不低于1900；

(2)校正因子测定

取水杨酸甲酯适量，精密称定，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，另取冰片对照品8mg，精密称定，置10ml量瓶中，加内标溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，吸取1ul，注入气相色谱仪，计算校正因子；

(3)测定

取止血药物内容物，研细，取0.6g，精密称定，置10ml量瓶中，加内标溶液适量，超声处理(功率200W，频率40kHz)20分钟，放冷，加内标溶液至刻度，摇匀，滤过，吸取1ul，注入气相色谱仪，测定。

冰片为合成龙脑，具有开窍醒神，清热止痛的功效，对致康胶囊的临床疗效，起着重要的作用。本发明确定了冰片含量的测定方法，且经过方法学考察证明本方法灵敏度高，重复性好，回收率良好，且阴性对照无干扰，整个试验过程可操作性强，可以作为控制本品内在质量的指标之一。

与现有技术相比，本发明至少存在以下有益效果：

1、本发明了增加了没药的薄层色谱鉴定，此方法阴性无干扰，样品重性形良好，可以作为鉴别致康胶囊中没药的依据。

2、本发明在采用薄层色谱鉴定黄连时，使用甲苯-醋酸乙酯-异丙醇-甲醇-水为展开剂，减少了对人体和环境有很大的危害，取得了较好的效果。

3、本发明增加了土大黄苷的液相色谱检测方法，试验过程可操作性强，可以作为控制本品内在质量的指标之一。

4、本发明增加了大黄酚的含量测定，用大黄素和大黄酚双组分控制制剂质量，经过方法学考察证明本法灵敏度高，重复性好，回收率良好，且阴性对照无干扰。

5、本发明增加了冰片含量的气相色谱检测法，试验过程可操作性强，可以作为控制本品内在质量的指标之一。

本发明通过对止血药物致康胶囊中多种成分进行检测，能够有效控制致康胶囊的质量，使致康胶囊质量达到稳定、可控、高效及安全，是对产品的投料要求及原料的质量控制严格，克服现有技术的不足，提高产品的质量、疗效、生物利用度，更好的满足医疗的需要。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1是致康胶囊中没药的薄层色谱鉴定图，其中，1表示没药阴性；2-4表示三批样品；5表示没药对照药材；

图2是致康胶囊中黄连的薄层色谱鉴定图，其中，1表示黄连阴性；2-4表示三批样品；5表示黄连对照药材；

图3是土大黄苷的紫外光谱图；

图4是大黄酚的紫外光谱图。

具体实施方式

下面通过实施例详细说明本发明，应当理解，下述实施例仅用于说明本发明，而不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1致康胶囊中没药的薄层色谱鉴定

1、试验条件：双槽展开缸(上海信谊)；硅胶G(薄层色谱用，青岛海洋化工厂)；羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司)；薄层板自制，厚度0.3mm。其余试剂均为分析纯。

2、试验步骤：取致康胶囊(由西安千禾药业有限责任公司提供)内容物3g，置具塞锥形瓶中，加无水乙醇50ml，超声60分钟，滤过，滤液挥干，加水50ml使溶解，滤过，滤液用乙醚萃取3次，每次20ml，收集合并乙醚液，挥干，残渣加石油醚(60～90℃)1ml使溶解，作为供试品溶液。另取没药对照药材0.3g，同法制成对照药材溶液。再取按处方比例和工艺制备的不含没药的阴性样品，同供试品溶液的制法制成阴性对照溶液。

照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-醋酸乙酯(30∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以新制的1％香草醛浓硫酸溶液，在105℃加热至斑点清晰。

三批供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显一相同颜色的蓝色斑点。而阴性样品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，未显相同颜色的斑点，阴性无干扰。说明方中其它药味不影响没药的检出，因此，可以作为鉴别致康胶囊中没药的依据(见图1)。

实施例2致康胶囊中黄连的薄层色谱鉴定

1、试验条件：双槽展开缸(上海信谊)；硅胶G(薄层色谱用，青岛海洋化工厂)；羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司)；薄层板自制，厚度0.3mm。其余试剂均为分析纯。

2、试验步骤：取致康胶囊(由西安千禾药业有限责任公司提供)内容物3g，加1％盐酸甲醇溶液20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液。另取黄连对照药材0.1g，加1％盐酸甲醇5ml溶液，滤过，滤液作为对照药材溶液。再取按处方比例和工艺制备的不含黄连的阴性样品，同供试品溶液的制法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水(6∶3∶1.5∶1.5∶0.3)为展开剂，置氨蒸汽饱和的层析缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。三批供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。而阴性样品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，未显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。说明方中其它药味不影响黄连的检出，因此，可以作为鉴别致康胶囊中黄连的依据(见图2)。

实施例3采用液相色谱法检测大黄中的土大黄苷

一、检测方法

参照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定。

1、色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(36∶64)为流动相；检测波长为320nm；理论板数按大黄苷峰计算应不低于2000。

2、对照品溶液的制备

取土大黄苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含10μg的溶液，即得。

3、供试品溶液的制备

取致康胶囊(由西安千禾药业有限责任公司提供)内容物，研细，取0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理40分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。

4、测定

分别精密吸取上述两种溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。结果判断：供试品色谱中应不得出现与对照品色谱保留时间相同的色谱峰。

二、方法学研究

(1)测定波长的选择

称取土大黄苷对照品适量，用甲醇溶解，在200～700nm范围内进行光谱扫描，结果在320nm波长处有最大吸收，故将检测波长选定为320nm。(见图3)

(2)色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(36∶64)为流动相；检测波长为320nm；流速1.0ml/min，理论板数按土大黄苷峰计算应不低于2000，分离度大于1.5。

(3)对照品溶液的制备

取土大黄苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含10μg的溶液，即得。

(4)干扰性试验

称取不含大黄的阴性样品，同样品方法制备阴性对照样品。结果阴性无干扰。

(5)回收率试验

取样品6份，分别加入土大黄苷对照品溶液5ml(0.0801mg/ml)，置50ml量瓶中，再加甲醇适量，超声处理(功率200W，频率40kHz)40分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得加样回收样品溶液，以下式计算回收率，结果见表1。

表1回收率试验结果

(6)样品测定：

对10批样品按上述检测方法进行测定，结果如下：

表210批样品中土大黄苷含量测定结果

序号	批号	土大黄苷含量(mg/粒)
			1	20100307	未检出
2	20100308	未检出
			3	20100409	未检出
4	20100410	未检出
			5	20100511	未检出
6	20100512	未检出
			7	20100613	未检出
8	20100614	未检出
			9	20100615	未检出
10	20100616	未检出

实施例4采用液相色谱法检测大黄中的大黄酚、大黄素

一、检测方法

照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定。

1、色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水-冰醋酸(60∶40∶1)为流动相；检测波长254nm，理论板数按大黄素峰计算应不低于3000。

2、对照品溶液的制备

取大黄素对照品、大黄酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含5μg的混合溶液，即得。

3、供试品溶液的制备

取致康胶囊(由西安千禾药业有限责任公司提供)内容物，研细，取约0.4g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理(功率200W，频率40kHz)40分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过。精密吸取上述滤液10ml，置烧瓶中，蒸干，加1mol/L盐酸溶液30ml，加三氯甲烷20ml，加热回流1小时，冷却，分取三氯甲烷层，水层再用三氯甲烷振摇提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，蒸至近干，用甲醇定量转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度。用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。

4、测定

分别精密吸取上述两种溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每粒含大黄以大黄素(C₁₅H₁₀O₅)和大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)的总量计，不得少于0.20mg。

二、方法学研究

1、测定波长的选择：

称取大黄素，大黄酚对照品适量，分别用甲醇溶解，在200～900nm范围内进行光谱扫描，结果大黄酚在429nm波长处有最大吸收，大黄素在437.5nm波长处有最大吸收，故参照中国药典2010年版药典将检测波长选定为254nm。(见图4)

2、色谱条件与系统适用性试验：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水-冰醋酸(60∶40∶1)为流动相；检测波长254nm，理论板数按大黄素峰计算应不低于3000，分离度不小于1.5。

3、对照品溶液的制备

取大黄素和大黄酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含5μg的混合溶液，即得。

4、干扰性试验：

称取不含大黄的阴性样品，同样品方法制备阴性对照样品。结果阴性无干扰。

5、线性关系考察：

分别精密吸取大黄素和大黄酚的混合对照品溶液(大黄素浓度6.04μg/ml，大黄酚浓度6.41μg/ml)1μl、5μl、10μl、20μl、25μl、50μl分别注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积y(A)对对照浓度进行线性回归，得回归方程：y＝36697x-7146.6，相关系数r＝0.9998(n＝7)，其线性范围为0.00604μg～0.302μg(大黄素)；y＝52656x-8722，相关系数r＝0.99995(n＝7)，其线性范围为0.00641μg～0.3205μg(大黄酚)。

6、精密度试验：

精密吸取大黄素浓度为6.04μg/ml，大黄酚浓度为6.41μg/ml的对照品溶液，重复进样6次，每次10μl，按上述色谱条件测定峰面积，结果如表3和表4：大黄酚和大黄素峰面积积分值的相对标准偏差分别为0.965％和1.267％.。

表3大黄酚精密度试验结果

表4大黄素精密度试验结果

测定结果表明，本方法精密度良好。

7、稳定性试验：

取本品(批号：20100308)内容物，精密称取0.4g，配制供试品溶液，精密吸取续滤液10μl，分别于0小时，2小时，4小时，6小时，8小时，10小时进样，测定。结果见表5和表6。

表5大黄酚稳定性试验结果表

表6大黄素稳定性试验结果表

结果表明，本品10小时内稳定性良好。

8、重复性试验：

取本品(批号：20100308)内容物，研细，精密称取6份，按供试品制备方法制备样品溶液，吸取续滤液10μl，测定。结果见表7和表8。

表7大黄酚重复性试验结果

表8大黄素酚表重复性试验结果

结果表明，本方法重复性良好。

9、回收率试验：

取已知含量的样品(批号：20100308)6份各0.2g，分别加入对照品溶液(大黄酚浓度64.1μg/ml、大黄素浓度60.4μg/ml)2ml，按供试品制备方法配备加样回收样品溶液，以下式计算回收率，结果见表9：

表9回收率试验结果

结果表明，本品具有良好的回收率。

10、样品测定：

对10批样品按上述检测方法进行测定，结果如表10：

表1010批样品含量测定结果

批号	大黄酚+大黄素总量(mg/粒)
		20100307	0.309
20100308	0.348
		20100409	0.321
20100410	0.323
		20100511	0.325
20100512	0.321
		20100613	0.365
20100614	0.338
		20100615	0.360
20100616	0.289

通过对10批样品含量测定，考虑到药材来源以及制剂生产、贮藏、转移率等因素，制定本品每粒含本品每粒含大黄以大黄素(C₁₅H₁₀O₅)和大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)的总量计，不得少于0.20mg。

实施例5采用气相色谱法检测致康胶囊中的冰片

一、检测方法

照气相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI E)测定。

1、色谱条件与系统适用性试验

以聚乙二醇(PEG)-20M为固定相，涂布浓度为10％，柱温120℃保持1分钟，再以5℃/min升至180℃，保持2分钟。理论板数按龙脑峰计算应不低于1900。

2、校正因子测定

取水杨酸甲酯适量，精密称定，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，另取冰片对照品8mg，精密称定，置10ml量瓶中，加内标溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，吸取1ul，注入气相色谱仪，计算校正因子。

3、测定

取致康胶囊(由西安千禾药业有限责任公司提供)的内容物，研细，取0.6g，精密称定，置10ml量瓶中，加内标溶液适量，超声处理(功率200W，频率40kHz)20分钟，放冷，加内标溶液至刻度，摇匀，滤过，吸取1ul，注入气相色谱仪，测定，即得。

本品每粒含冰片(C₁₀H₁₈O)的量，应为3.2mg～4.8mg。

二、方法学研究

(一)色谱条件与系统适用性实验：

弹性石英毛细管柱DB-WAX(30m*0.32mm，0.25μm)，FID检测器，氮气为载气，柱温120℃保持1分钟，再以5℃/min升至180℃，保持2分钟。理论板数按龙脑峰计算应不低于1900。

(二)对照品溶液的制备：

精密称取冰片对照品8mg，置10ml量瓶中，加内标溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

(三)专属性试验：

称取不含冰片的阴性样品，同样品方法制备阴性对照样品。结果阴性无干扰。

(四)线性关系考察：

分别精密量取浓度为4.77mg/ml、2.385mg/ml、1.1925mg/ml、0.59625mg/ml、0.2981251mg/ml的冰片对照品溶液1μl注入气相色谱仪，按正文所述色谱条件测定峰面积，以浓度为横坐标(X)，对照品峰面积与内标峰面积之比为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算回归方程为Y＝0.7648X-0.0072.

(五)精密度试验：

精密吸取浓度为0.974mg/ml的冰片对照品溶液，重复进样6次，每次1μl，按上述色谱条件测定，结果如表11：相对标准偏差分别为0.226％。

表11冰片精密度试验

(六)回收率试验：

取已知含量的样品(批号：20100308，已知含量：4.31mg/粒)6份，分别加入浓度为4.77mg/ml的对照品溶液1ml，按供试品制备方法配备加样回收样品溶液，以下式计算回收率，结果见表12。

表12回收率试验结果

(七)重复性试验：

取同一批号的致康胶囊(批号：20100308)6份，按含量测定方法项下平行试验，结果冰片含量(以异龙脑和龙脑合计)测得数据如表13：

表13冰片含量的测定结果

(八)稳定性试验：

取本品(批号：20100308)内容物，精密称取0.6g，配制供试品溶液，精密吸取续滤液1μl，分别于0小时，2小时，4小时，6小时，8小时，10小时，12小时进样，测定。结果见表14。

表14冰片稳定性试验

(九)样品测定：

对10批供试品进行测定，结果如表15：

表1510批样品含量测定结果

批号	冰片含量(mg/粒)
		20100307	4.25
20100308	4.31
		20100409	4.21
20100410	4.21
		20100511	4.28
20100512	4.16
		20100613	4.23
20100614	4.25
		20100615	4.20
20100616	4.19

通过对10批样品含量测定，考虑到药材来源以及制剂生产、贮藏、转移率等因素，制定本品每粒含本品每粒含冰片(C₁₀H₁₈O)的量，应为3.2mg～4.8mg。

实施例6

本实施例旨在证明通过对止血药物致康胶囊中多种成分进行检测，能够有效控制致康胶囊的质量，使致康胶囊质量达到稳定、可控、高效及安全。本实施例采用的致康胶囊由西安千禾药业有限责任公司生产，具有清热凉血，化瘀止血之功效，适用于崩漏、呕血及便血等症。

试验方法

一、崩漏诊断标准

参照中华人民共和国卫生部发布的《中药新药临床研究指导原则》(第一辑)中“中药新药治疗功能失调性子宫出血的临床研究指导原则”制订。

1、西医诊断标准

(1)无排卵型功血：由于排卵障碍，无黄体形成，子宫内膜增生过长，临床表现不规则子宫出血，经期长短不一，出血量时多时少，甚至大量出血。妇科检查：出血时宫颈充血、较软，宫口松，子宫亦较软，有时伴有一侧或双侧卵巢囊性增大。基础体温单相型，阴道脱落细胞涂片无排卵周期性改变，出血前1-2天宫颈粘液呈现羊齿植物叶状结晶，内膜病理检查可见增生期变化或增生过长，无分泌期变化。

(2)排卵型功血：

①黄体不健：经前子宫内膜分泌功能不良；临床表现月经周期缩短，经量多少不一，经期延长；阴道涂片有时可见角化细胞指数偏高，细胞堆积，皱褶不佳；基础体温双相型，黄体期缩短，在10天以下，或呈梯形上升或下降。

②黄体萎缩不全：经期第5天子宫内膜活检呈分泌期改变；临床表现为月经周期正常，经期延长，经量多少不一；基础体温呈不典型双相型，下降延迟或逐渐下降。

2、中医血热兼瘀证辨证标准

①突然出血，量多，或淋漓不尽，色深红或紫红，质粘稠或夹有血块；

②头晕面赤；③烦渴，喜冷饮；④大便秘结，小便黄；⑤小腹胀痛拒按，块下痛减；⑥胸胁胀满不舒，或乳房胀痛；⑦舌质红绛或舌尖红，舌苔黄或黄腻，或舌质紫暗或有瘀点。⑧脉数或弦数、洪数，或脉涩、紧或弦涩。

以上①为必备项，兼具其余项中任四项即可诊断。

3、症状轻重计分标准：

主症：①出血量；②出血频次；③出血颜色。

次症：④头晕面赤；⑤烦渴，喜冷饮；⑥大便秘结，小便黄；⑦小腹胀痛拒按，块下痛减；⑧胸胁胀满不舒，或乳房胀痛；⑨舌质红绛或舌尖红，舌苔黄或黄腻，或舌质紫暗或有瘀点；⑩脉数或弦数、洪数，或脉涩、紧或弦涩。

4、病情程度分级标准

①轻度：中医证候积分和≤总分的1/3；

②中度：总积分的1/3＜中医证候积分和＜总积分的2/3；

③重度：中医证候积分和≥总积分的2/3。

二、崩漏入选病例标准

1、符合西医诊断标准。

2、符合中医辨证诊断标准。

3、年龄14-50岁之间。

4、知情同意，志愿受试。

三、崩漏病例排除标准

1、不符合上述病例纳入标准者。

2、年龄在14岁以下或50岁以上者。

3、经检查证实子宫出血系由妊娠、肿瘤、上环、外伤或出血性疾病等引起者。

4、合并有心血管、脑血管、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病，精神病患者。

5、不符合纳入标准，未按规定用药，无法判断疗效，或资料不全等影响疗效或安全性判断者。

6、病情危重，难以对药物的有效性和安全性作出确切评价者。

7、准备妊娠、妊娠或哺乳期的妇女。

8、过敏体质或对本药过敏者。

9、正在参加其它药物临床试验者。

四、受试者的纳入方式

符合本临床试验病例入选标准，且不属于排除病例标准的受试者均可纳入临床观察。

研究方案

一、试验药品

试验药：标准提高后致康胶囊(即为对多种成分进行检测后，对致康胶囊进行质量控制后的产品)，批准文号：国药准字Z20025043，每粒装0.3g，由西安千禾药业有限责任公司生产。

对照药：标准提高前致康胶囊(即对致康胶囊进行质量控制前的产品)，批准文号：国药准字Z20025043，每粒装0.3g，由西安千禾药业有限责任公司生产。

二、受试者的治疗

1、治疗方法

(1)试验组：标准提高后致康胶囊，口服，一次2～4粒，一日3次。

(2)对照组：标准提高前致康胶囊，口服，一次2～4粒，一日3次。

2、合并用药

(1)除试验用药及规定联合用药外，观察期间禁止使用其它影响本病治疗的中药和西药，以及与本病治疗相关的其他治疗。

(2)合并疾病所必须继续使用的药物，或其他治疗必须在研究病历记录药名(或其它疗法名)、用量、使用次数和时间等，以便总结时加以分析和报告。

三、疗程

根据《中药新药临床研究指导原则》中有关内容确定为28天。

四、观测指标

(一)安全性观测指标

1、体检项目。

2、血、尿、便常规检查。

3、心电图，肝功能(ALT)、肾功能(Bun、Cr)检查。

4、观察可能出现的不良反应，包括症状、体征、实验室检查等方面的不良反应，分析不良反应原因、作出判断。统计不良反应发生率。记录处理经过及结果等。

以上指标，于治疗前及治疗结束后各检测一次。

(二)疗效性观测指标

1、症状观察：崩漏的出血量、出血频次、出血色泽等以及崩漏所表现出的症状体征。

2、舌象、脉象。

3、血常规。

以上各项内容中症状体征观察及舌象、脉象于用药前及用药后每周各观察记录1次。其余指标治疗前、后各观察1次。

疗效判定标准

一、崩漏疗效判定标准

参照中华人民共和国卫生部《中药新药临床研究指导原则》第一辑中关于“中药新药治疗功能失调性子宫出血的临床研究指导原则”有关内容制订：

1、痊愈：控制出血后，连续3个月经周期、经期、血量均正常，自觉症状消失，血色素在10g以上。能恢复正常排卵，黄体期不少于12天。或更年期妇女血止后绝经者。

2、显效：控制出血后，月经周期、血量基本正常，但经期仍较长(7天以上，10天以下)，自觉症状基本消失，血色素在10g以上者。

3、有效：月经周期、经期、部分自觉症状得到明显改善，血量减少，血色素在8g以上者。

4、无效：以上各项均无改善者。

二、证候疗效评定标准

根据《中药新药临床研究指导原则(试行)》(中国医药科技出版社，2002年版)中有关内容制订：

1、临床痊愈：中医临床症状、体征消失或基本消失，证候积分减少≥95％。

2、显效：中医临床症状、体征明显改善，证候积分减少≥70％。

3、有效：中医临床症状、体征均有好转，证候积分减少≥30％。

4、无效：治疗后证候积分和较治疗前下降＜30％或无下降或增加。

注：计算公式(尼莫地平法)为：[(治疗前积分-治疗后积分)÷治疗前积分]×100％。

研究结果

一、总疗效

治疗后两组患者崩漏总疗效比较，如表1所示：

表1两组患者崩漏疗效比较

如上表所示，两组崩漏疗效经Raddit检验，P＞0.05，无显著性差异，但试验组总有效率比对照组高11.73％，说明试验组比对照组疗效更佳。

二、中医证候疗效

1、中医证候疗效

治疗后两组患者中医证候疗效比较，如表2所示：

表2两组患者中医证候疗效比较

如上表所示，两组中医证候疗效经Raddit检验，P＞0.05，无显著性差异，但试验组总有效率比对照组高12.11％，说明试验组比对照组疗效更佳。

三、不良事件分析

在整个临床试验过程中，未出现药物引起的不良反应或严重不良事件。

结论

临床试验采用随机、阳性药物标准提高前致康胶囊平行对照的临床试验原则，共完成观察病例174例，其中试验组107例，对照组67例。临床试验结果表明：致康胶囊标准提高后对崩漏临床总疗效的总有效率为87.85％，对照组总疗效的总有效率为76.12％，两组总疗效比较，说明标准提高后的致康胶囊比原致康胶囊疗效更佳。致康胶囊标准提高后对崩漏的中医证候疗效的总有效率为89.72％，对照组中医证候疗效的总有效率为77.61％，两组中医证候疗效比较，说明标准提高后的致康胶囊比原致康胶囊疗效更佳。

整个临床试验过程中，无一例退出，也未出现药物所致的明显不良反应。

Claims (10)

1.一种止血药物的检测方法，所述止血药物由大黄、黄连、三七、白芷、阿胶、龙骨、白及、没药、海螵蛸、茜草和龙血竭组成，该检测方法包括采用薄层色谱法鉴定所述止血药物中的没药，其中，所述薄层色谱的条件包括：

采用体积比为28～35∶0.9～1.2，优选为30∶1的甲苯-醋酸乙酯作为展开剂；

采用加热显色，显色剂为1％w/v～5％w/v，优选为1％w/v的香草醛浓硫酸溶液，加热温度为80-120℃，优选为105℃。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，采用薄层色谱法鉴定所述止血药物中的没药包括如下步骤：

取止血药物内容物3g，置具塞锥形瓶中，加无水乙醇50ml，超声60分钟，滤过，滤液挥干，加水50ml使溶解，滤过，滤液用乙醚萃取3次，每次20ml，收集合并乙醚液，挥干，残渣加石油醚(60～90℃)1ml使溶解，作为供试品溶液；另取没药对照药材0.3g，同法制成对照药材溶液；再取不含没药的阴性样品，同供试品溶液的制法制成阴性对照溶液；吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为30∶1的甲苯-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以新制的1％香草醛浓硫酸溶液，在105℃加热至斑点清晰。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括采用薄层色谱法鉴定所述止血药物中的黄连，其中，所述薄层色谱的条件包括：

采用体积比为5～8∶2.5～4∶1～2.5∶1～2.5∶0.25～0.4，优选为6∶3∶1.5∶1.5∶0.3的甲苯-醋酸乙酯-异丙醇-甲醇-水作为展开剂。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，采用薄层色谱法鉴定所述止血药物中的黄连包括如下步骤：

取止血药物内容物3g，加1％盐酸甲醇溶液20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液；另取黄连对照药材0.1g，加1％盐酸甲醇5ml溶液，滤过，滤液作为对照药材溶液；再取不含黄连的阴性样品，同供试品溶液的制法制成阴性对照溶液；吸取溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为6∶3∶1.5∶1.5∶0.3的甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水为展开剂，置氨蒸汽饱和的层析缸内，展开，取出，晾干，置365nm的紫外光灯下检视。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括采用液相色谱法检测大黄中的土大黄苷，其中，所述液相色谱的条件包括：

采用十八烷基硅烷键合硅胶的填充剂；

采用体积比为36∶64的甲醇-水为流动相；以及

采用320nm的检测波长。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，采用液相色谱法检测大黄中的土大黄苷包括如下步骤：

(1)色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为36∶64的甲醇-水为流动相；检测波长为320nm；理论板数按大黄苷峰计算应不低于2000；

(2)对照品溶液的制备

取土大黄苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含10μg的溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备

取止血药物内容物，研细，取0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理40分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得；

(4)测定

分别精密吸取上述两种溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括采用液相色谱法检测大黄中的大黄酚，其中，所述液相色谱的条件包括：

采用十八烷基硅烷键合硅胶的填充剂；

采用体积比为60∶40∶1的乙腈-水-冰醋酸为流动相；以及

采用254nm的检测波长。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，采用液相色谱法检测大黄中的大黄酚包括如下步骤：

(1)色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为60∶40∶1的乙腈-水-冰醋酸为流动相；检测波长254nm，理论板数按大黄素峰计算应不低于3000；

(2)对照品溶液的制备

取大黄素对照品、大黄酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含5μg的混合溶液，即得；

(3)供试品溶液的制备

取止血药物内容物，研细，取约0.4g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理(功率200W，频率40kHz)40分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过；精密吸取上述滤液10ml，置烧瓶中，蒸干，加1mol/L盐酸溶液30ml，加三氯甲烷20ml，加热回流1小时，冷却，分取三氯甲烷层，水层再用三氯甲烷振摇提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，蒸至近干，用甲醇定量转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度；用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得；

(4)测定

分别精密吸取上述两种溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括采用气相色谱法检测所述止血药物中冰片的含量，其中所述气相色谱的条件包括：

采用聚乙二醇-20M为固定相，涂布浓度为10％；以及

采用柱温120℃保持1分钟，再以5℃/min升至180℃，保持2分钟。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的检测方法，其特征在于，采用气相色谱法检测所述止血药物中冰片的含量包括如下步骤：

(1)色谱条件与系统适用性试验

以聚乙二醇(PEG)-20M为固定相，涂布浓度为10％，柱温120℃保持1分钟，再以5℃/min升至180℃，保持2分钟，理论板数按龙脑峰计算应不低于1900；

(2)校正因子测定

取水杨酸甲酯适量，精密称定，加乙酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，另取冰片对照品8mg，精密称定，置10ml量瓶中，加内标溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，吸取1ul，注入气相色谱仪，计算校正因子；

(3)测定

取止血药物内容物，研细，取0.6g，精密称定，置10ml量瓶中，加内标溶液适量，超声处理(功率200W，频率40kHz)20分钟，放冷，加内标溶液至刻度，摇匀，滤过，吸取1ul，注入气相色谱仪，测定。

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