CN106918673A - 一种中药组合物的指纹图谱的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种中药组合物的指纹图谱建立方法，以及采用所述方法建立的指纹图谱来检测所述中药组合物的成分的方法。所述中药组合物的原料组成为：狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔、黑老虎、牛大力、蒸女贞子、蒸桑寄生、盐水制菟丝子、制延胡索、两面针、制乳香和制没药；所述指纹图谱的建立方法包括采用高效液相色谱法检测所述中药组合物中各类化合物和药材的保留时间；其中所述高效液相色谱的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；流动相由乙腈和重量百分浓度0.1％的磷酸水溶液组成，0～170min乙腈在流动相中的体积百分比由5％匀速地递增至90％；流速1ml/min；柱温为30℃；紫外检测波长为254nm。

Description

一种中药组合物的指纹图谱的建立方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种中药组合物的指纹图谱的建立方法，所述中药组合物为舒筋健腰丸。

背景技术

基于中医药理论的中药组合物(中成药)，药味组成一般比较繁多；在药物组合物的制备过程中，不同成分之间还可能相互发生反应，导致药物组合物的成分更加复杂。仅靠定性或定量检测其中某个或某几个成分，由于信息量有限，难以体现组合物作为整体的化学特征。随着现代分析技术的发展，指纹图谱已经成为评价多组分中药组合物样品的整体质量的有效手段。美国食品药品管理局(FDA)在植物药制品指导原则中允许申报者提供产品的色谱指纹图谱资料,德国药用植物学会、英国草药典、印度草药典以及加拿大药用及芳香植物学会也都将指纹图谱作为质量控制标准的内容之一。因此，建立指纹图谱对于中药组合物的质量控制和研究具有重要意义。

中药组合物指纹图谱的建立，应以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，体现系统性、特征性和稳定性三个基本原则。才能保证指纹图谱的标准化、规范化、客观化，从而便于推广和应用。高效液相色谱法(HPLC)具有分离效率高，分析速度快，定量精密度高，检测器种类多，稳定性好等特点。不受样品挥发性和热稳定性的限制，样品中大多数成分均可在高效液相色谱仪上进行分析检测，是构建指纹图谱的主要方法之一。2010版《中国药典》收载了中成药品种共计1069个，但是仅收载了高效液相指纹图谱9项，其中中成药仅6项。可见中成药指纹图谱的建立，绝非易事，需要解决众多的技术问题，花费大量的劳动。

舒筋健腰丸，由狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔、黑老虎、牛大力、女贞子、桑寄生、菟丝子、延胡索、两面针、乳香、没药等13味中药材组成，具有补益肝肾、强健筋骨、驱风除湿、活络止痛的作用，用于腰膝酸痛、坐骨神经痛。舒筋健腰丸最早收载于《广东省药品标准》(1985年版)第243页，现执行标准为《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第十二册(1997年编，第194页)，标准编号：WS3-B-2441-97，标准中仅有显微鉴别、化学鉴别、薄层鉴别(狗脊、没药)。

上述药品标准是对个别成分进行的鉴别，理化反应仅表明含生物碱类成分，无法全面表征舒筋健腰丸的化学特征和质量情况。因此，有必要研究如何建立舒筋健腰丸的指纹图谱，从而更好地保证临床用药的质量和治疗效果。

发明内容

针对上述问题，本发明的一个目的在于提供一种中药组合物指纹图谱的建立方法，其中所述中药组合物为舒筋健腰丸。本发明利用HPLC-UV技术，建立了舒筋健腰丸指纹图谱共有模式，标定了40个共有峰，其中，确定了6个峰的化学成分归属：原儿茶酸、原儿茶醛、特女贞苷、日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲和(2′S)-南五味子木质素；同时可以鉴别出处方中狗脊、千斤拔、女贞子、两面针、没药、黑老虎、乳香等7味药材的特有峰，从而可以用这些指标成分来检测舒筋健腰丸中上述各味药材的投料情况，并且提供了比现有技术的检测方法更深层次和更全面的质量评价依据。

为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种中药组合物的指纹图谱建立方法，所述中药组合物以狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔、黑老虎、牛大力、蒸女贞子、蒸桑寄生、盐水制菟丝子、制延胡索、两面针、制乳香和制没药为原料，通过本领域常用的方法，与药学上可以接受的辅料，制备成临床上可以接受的制剂；所述指纹图谱建立方法包括采用高效液相色谱法检测所述中药组合物中各类化合物的保留时间，其中所述高效液相色谱的条件如下：

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；

流动相由乙腈和体积百分浓度0.1％的磷酸水溶液组成，0～170min乙腈在流动相中的体积百分比由5％匀速地递增至90％；流速1ml/min；

柱温为30℃；

紫外检测波长为254nm。

优选的，所述指纹图谱建立方法还包括通过以下方法制备供试品溶液：取所述中药组合物5g，粉碎，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，超声30min，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

优选的，所述指纹图谱建立方法还包括通过如下方法制备对照品溶液：分别精密称取原儿茶酸、原儿茶醛、特女贞苷、日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木质素对照品，加甲醇制成浓度为原儿茶酸90μg/ml、原儿茶醛30μg/ml、特女贞苷50μg/ml、日本南五味子素甲20μg/ml、乙酰日本南五味子素甲20μg/ml、(2′S)-南五味子木质素40μg/ml的混合对照品溶液，即得。

作为一个优选的实施方式，本发明提供上述中药组合物的指纹图谱建立方法，具体的操作步骤包括：

1)对照品溶液的制备：分别精密称取原儿茶酸、原儿茶醛、特女贞苷、日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木质素对照品，加甲醇制成浓度为原儿茶酸90μg/ml、原儿茶醛30μg/ml、特女贞苷50μg/ml、日本南五味子素甲20μg/ml、乙酰日本南五味子素甲20μg/ml、(2′S)-南五味子木质素40μg/ml的混合对照品溶液，即得；

2)供试品溶液的制备：取所述中药组合物5g，粉碎，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，超声30min，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

3)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，根据以下色谱条件进行测定，记录170min内的色谱图，得到指纹图谱：

色谱柱：Waters Atlantis色谱柱，250×4.6mm，固定相平均粒径5μm；

流动相：乙腈-体积百分浓度0.1％的磷酸水溶液，0～170min乙腈在流动相中的体积百分比由5％匀速地递增至90％；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

紫外检测波长：254nm。

优选的，上述指纹图谱建立方法，建立的指纹图谱包括原儿茶酸吸收峰，并以原儿茶酸吸收峰为参照。

更优选的，上述指纹图谱建立方法，建立的指纹图谱以原儿茶酸吸收峰为参照，还包括原儿茶醛吸收峰、特女贞苷吸收峰、日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、或(2′S)-南五味子木质素吸收峰中的一个或多个，相对保留时间分别为：

原儿茶醛吸收峰：1.348±0.13％，特女贞苷吸收峰：2.870±0.05％，日本南五味子素甲吸收峰：7.423±0.02％，乙酰日本南五味子素甲：8.185±0.02％，(2′S)-南五味子木质素吸收峰：10.145±0.02％。

优选的，上述指纹图谱建立方法中，所述的中药组合物的原料由如下重量份的药材组成：

狗脊600重量份，金樱子192重量份，鸡血藤360重量份，千斤拔144重量份，黑老虎360重量份，牛大力240重量份，蒸女贞子30重量份，蒸桑寄生180重量份，盐水制菟丝子30重量份，制延胡索26重量份，两面针26重量份，制乳香12重量份，制没药20重量份。

还优选的，所述中药组合物为丸剂。

更优选的，所述中药组合物为舒筋健腰丸，通过如下方法制备：

1)准备如下重量份的药材：狗脊600重量份，金樱子192重量份，鸡血藤360重量份，千斤拔144重量份，黑老虎360重量份，牛大力240重量份，蒸女贞子30重量份，蒸桑寄生180重量份，盐水制菟丝子30重量份，制延胡索26重量份，两面针26重量份，制乳香12重量份，制没药20重量份；

2)狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔和黑老虎的木部加水煎煮二次，滤过，合并滤液，浓缩成稠膏；其余牛大力等八味及黑老虎的皮部共粉碎成粗粉，加入上述稠膏，混匀，干燥，粉碎成细粉，过筛，混匀。每100g粉末用炼蜜35～45g与适量的水泛丸，用黑氧化铁包衣，干燥，打光，即得。

上述丸剂按照本发明所述指纹图谱建立方法建立的指纹图谱，包括40个特征峰，以原儿茶酸吸收峰为参照，所述特征峰的相对保留时间分别为：

峰1：0.587±0.16％；峰2：0.626±0.18％；峰3：0.787±0.17％；

峰4：0.860±0.18％；峰5：1.000±0.18％；峰6：1.124±0.14％；

峰7：1.348±0.13％；峰8：1.456±0.14％；峰9：1.696±0.11％；

峰10：1.888±0.08％；峰11：2.500±0.06％；峰12：2.636±0.06％；

峰13：2.687±0.05％；峰14：2.721±0.06％；峰15：2.788±0.06％；

峰16：2.870±0.05％；峰17：3.011±0.05％；峰18：3.093±0.05％；

峰19：3.114±0.05％；峰20：3.145±0.05％；峰21：3.501±0.04％；

峰22：4.015±0.05％；峰23：4.079±0.05％；峰24：6.622±0.04％；

峰25：7.423±0.02％；峰26：7.927±0.03％；峰27：8.185±0.02％；

峰28：8.355±0.02％；峰29：8.542±0.03％；峰30：8.764±0.02％；

峰31：9.248±0.02％；峰32：9.445±0.02％；峰33：9.622±0.02％；

峰34：9.755±0.02％；峰35：9.976±0.02％；峰36：10.145±0.02％；

峰37：10.543±0.01％；峰38：11.364±0.01％；峰39：11.799±0.01％；

峰40：12.162±0.02％；

从化学成分的比对来看，其中峰5是原儿茶酸吸收峰，峰7是原儿茶醛吸收峰，峰16是特女贞苷吸收峰，峰25是日本南五味子素甲吸收峰，峰27是乙酰日本南五味子素甲吸收峰，峰36是(2′S)-南五味子木质素吸收峰。

上述建立的指纹图谱中，各峰的药材归属为：峰4是狗脊药材特有峰，峰10是千斤拔药材特有峰，峰16(特女贞苷)是女贞子药材特有峰，峰18、19是两面针药材特有峰，峰24为没药特有峰，峰25(日本南五味子素甲)、27(乙酰日本南五味子素甲)、33、35、36((2′S)-南五味子木质素)是黑老虎药材特有峰，峰39是乳香药材特有峰。

本发明的另一目的在于提供上述指纹图谱建立方法在一种中药组合物的真伪鉴别和成分检测中的应用；所述中药组合物的原料组成为狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔、黑老虎、牛大力、蒸女贞子、蒸桑寄生、盐水制菟丝子、制延胡索、两面针、制乳香和制没药。

优选的，所述中药组合物为舒筋健腰丸。

本发明还有一个目的在于提供一种检测原料组成为狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔、黑老虎、牛大力、蒸女贞子、蒸桑寄生、盐水制菟丝子、制延胡索、两面针、制乳香和制没药的中药组合物的成分的方法，其特征在于，采用上述指纹图谱建立方法建立的指纹图谱。

优选的，所述中药组合物为舒筋健腰丸。

本发明提供的指纹图谱建立方法，以高效液相色谱和紫外光谱联用为分离和鉴别手段，得到的指纹图谱具有系统性、特征性和稳定性，具体体现在：

1.系统性：所述中药组合物，优选为舒筋健腰丸，原料组成为狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔、黑老虎、牛大力、蒸女贞子、蒸桑寄生、盐水制菟丝子、制延胡索、两面针、制乳香和制没药，在指纹图谱中，不仅体现了原儿茶酸、原儿茶醛、特女贞苷、日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木质素等指标性成分，还对狗脊、千斤拔、女贞子、两面针、没药、黑老虎、乳香等7种药材的特征峰进行了归属。

2.特征性：采用本发明所述方法建立的指纹图谱，是基于本发明所述中药组合物的特定的原料药以及在制剂过程中化学成分间的相互作用，以原儿茶酸吸收峰为参照，各个特征峰的相对保留时间和相对峰面积在一定范围内是相对稳定，并且会在药味组成发生变化(比如使用伪劣药材或者投料量不足)时产生差异。据此，可以很好地鉴别真伪，控制质量，减少了人为处理产品使检测结果为假阳性的可能性。

另外，本发明所述方法建立的所述中药组合物(优选为舒筋健腰丸)的指纹图谱，特征峰多，峰形好，易于鉴别，相似性高(与对照图谱的相似度均大于0.9)，准确可靠。

3.稳定性：本发明所述方法对供试品溶液的制备、色谱条件、测定过程、数据采集、处理、分析等都做了详细限定，从而保证不同操作者、不同实验室重复做出的指纹图谱都在允许的误差范围内，体现了所述方法的通用性和实用性。

本发明提供的方法建立的舒筋健腰丸的指纹图谱，能有效地表征本发明所述中药组合物，有利于全面监控产品的质量，更好地保障患者用药安全和治疗效果。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为实施例1考察提取溶剂试验的色谱图，其中S1是甲醇为提取溶剂的色谱图，S2是75％甲醇为提取溶剂的色谱图，S3是50％甲醇为提取溶剂的色谱图，S4是95％乙醇为提取溶剂的色谱图，S5是稀乙醇为提取溶剂的色谱图。

图2为实施例2考察检测波长试验的叠加色谱图，图中沿着纵坐标方向自下而上分别是检测波长215nm、230nm、254nm、280nm、310nm下的色谱图。

图3为实施例5中10批样品的叠加色谱图，其中S1-S10为样品的编号，R为生成的对照指纹图谱。

图4为本发明建立的舒筋健腰丸指纹图谱，图中的标号1-40为共有色谱峰的标号。

图5为本发明的指纹图谱与狗脊阴性样品、狗脊对照药材和混合对照品色谱图的叠加比对图。其中S1是本发明的指纹图谱的色谱图，S2是狗脊阴性样品的色谱图，S3是狗脊对照药材的色谱图，S4是混合对照品的色谱图。

图6为本发明的指纹图谱与千斤拔阴性样品、千斤拔对照药材色谱图的叠加比对图。其中S1是本发明的指纹图谱，S2是千斤拔阴性样品的色谱图，S3是千斤拔对照药材的色谱图。

图7为本发明的指纹图谱与女贞子阴性样品、女贞子对照药材和特女贞苷对照品色谱图的叠加比对图。其中S1是本发明的指纹图谱，S2是女贞子阴性样品的色谱图，S3是女贞子对照药材的色谱图，S4是特女贞苷对照品的色谱图。

图8为本发明的指纹图谱与两面针阴性样品、两面针对照药材色谱图的叠加比对图。其中S1是本发明的指纹图谱，S2是两面针阴性样品的色谱图，S3是两面针对照药材的色谱图。

图9为本发明的指纹图谱与黑老虎阴性样品、黑老虎对照药材和混合对照品色谱图的叠加比对图。其中S1是本发明的指纹图谱，S2是黑老虎阴性样品的色谱图，S3是黑老虎对照药材的色谱图，S4是混合对照品的色谱图。

图10为本发明的指纹图谱、乳香阴性样品和乳香对照药材色谱图的叠加比对图。其中S1是本发明的指纹图谱，S2是乳香阴性样品的色谱图，S3是乳香对照药材的色谱图。

图11为本发明的指纹图谱、没药阴性样品和没药对照药材色谱图的叠加比对图。其中S1是本发明的指纹图谱，S2是没药阴性样品的色谱图，S3是没药对照药材的色谱图。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中：

1.仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪；

色谱柱：Waters Atlantis色谱柱，250×4.6mm，固定相平均粒径5μm；

SB-5200DTD超声波处理器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；

CP225D电子天平(Sartorius)。

2.试剂

乙腈、甲醇(色谱级，Merck公司)；

磷酸(色谱级，科密欧)；

水(Millipore超纯水)；

甲醇、正丁醇、乙醚、乙酸乙酯(分析纯，广州化学试剂厂)；

3.样品、对照药材与标准品

3.1样品

舒筋健腰丸，批号D23095(S1)，D23101(S2)，D23103(S3)，D23119(S4)，D23121(S5)，D23220(S6)，D23221(S7)，D23222(S8)，D23223(S9)，D23224(S10)；均由广州白云山陈李济药厂有限公司提供；制备工艺为：

1)按照如下处方准备各味药材：

狗脊600g，金樱子192g，鸡血藤360g，千斤拔144g，黑老虎360g，牛大力240g，女贞子(蒸)30g，桑寄生(蒸)180g，菟丝子(盐水制)30g，延胡索(制)26g，两面针26g，乳香(制)12g，没药(制)20g；

2)狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔、黑老虎的木部加水煎煮二次，滤过，合并滤液，浓缩成稠膏；其余牛大力等八味及黑老虎的皮部共粉碎成粗粉，加入上述稠膏，混匀，干燥，粉碎成细粉，过筛，混匀。每100g粉末用炼蜜35～45g与适量的水泛丸，用黑氧化铁包衣，干燥，打光，即得。

3.2对照药材：

下列对照药材均购买自中国药品生物制品检定所：狗脊对照药材(批号：121071-200602)、千斤拔对照药材(批号：121502-200501)、女贞子对照药材(批号：121041-200302)、两面针对照药材(批号：121014-200302)、黑老虎对照药材(批号：121438-200401)、乳香对照药材(批号：120970-200403)、没药对照药材(批号：967-9201)。

3.3对照品

下列对照品购买自中国药品生物制品检定所：原儿茶酸批号110809-200503、原儿茶醛批号110810-200205；特女贞苷批号111926-201102。

日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木质素均为自制(纯度＞95％，经中国科学院华南植物园结构鉴定)。

实施例1供试品溶液制备方法的建立

1.1提取溶剂的选择：

取批号D23095的舒筋健腰丸样品5g，粉碎，精密称定，置于50ml具塞锥形瓶中，分别精密加入25ml甲醇、75％甲醇(体积百分浓度)、50％甲醇(体积百分浓度)、95％乙醇(体积百分浓度)、稀乙醇(体积百分浓度50％)，超声30min后，放冷至室温，称定重量，分别用提取溶剂补足减失的重量，既得。

在下述色谱条件下，分别测定不同提取溶剂制备得到的供试品溶液，记录0～170min的色谱图：

色谱柱：Waters Atlantis色谱柱，250×4.6mm，固定相平均粒径5μm；

流动相：乙腈-体积百分浓度0.1％的磷酸水溶液，0～170min乙腈在流动相中的体积百分比由5％匀速地递增至90％；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

紫外检测波长：254nm。

结果见图1。图谱显示用甲醇提取时，峰的数目最多，且基线平稳，故选择甲醇为提取溶剂。

1.2提取方法的比较

取批号D23095的样品约5g。研细，精密称定，以25ml甲醇为提取溶剂，分别采取超声30min、45min、1h、回流1h及回流2h五种提取方法制备供试品。依照“1.1提取溶剂的选择”项下所述的色谱条件测定，记录0～170min的色谱图。

结果表明，五种提取方法得到的图谱无明显差别(色谱图略)，故选择最简单易行的超声30min为提取方法。

通过本实施例优选出了供试品溶液的制备方法，具体操作为：

取所述中药组合物5g，粉碎，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，超声30min，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

实施例2色谱条件的建立

2.1流动相的确定

按照实施例1优选出的供试品溶液的制备方法，取批号D23095的样品约5g制备供试品溶液。柱温30℃，进样量10μl，流速：1ml/min，分别以乙腈-水，乙腈-0.1％磷酸、甲醇-0.1％磷酸及乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相，洗脱时长170分钟，考察供试品溶液254nm下的色谱图。其中，两相系统的有机相体积百分比匀速地从5％→90％，水或磷酸溶液体积百分比相应匀速地从95％→10％。

结果显示：乙腈-0.1％磷酸为流动相，基线平稳且分离效果最好。因此选择乙腈-0.1％磷酸为流动相。(色谱图略)

2.2色谱柱的考察

研究发现，即使是同种规格的C18色谱柱，同一化合物在不同商家的产品中的出峰时间及峰形是有差异的。经过对比Phenomenex Luna色谱柱，Agilent Eclipse XDB C18色谱柱，Waters Atlantis色谱柱，结果表明，WatersAtlantis色谱柱的分离效果最好。(色谱图略)

2.3检测波长的考察

按照实施例1优选出的供试品溶液的制备方法，取批号D23095的样品约5g制备供试品溶液。采用Waters Atlantis色谱柱，乙腈-0.1％磷酸为流动相，梯度洗脱：0～170min乙腈在流动相中的体积百分比由5％匀速地递增至90％，柱温30℃，进样量10μl，流速：1ml/min。采用DAD检测器进行全波长扫描。各检测波长下的色谱图见图2。

从图2示出的色谱图中可以发现：215nm、230nm下峰的数目最多，但基线不平稳；280nm、310nm下峰的数目较少；254nm下色谱峰多、峰形较好且基线平稳。故选择254nm为检测波长。

实施例3舒筋健腰丸的成分检测

1.色谱柱：Waters Atlantis色谱柱(5μm，250×4.6mm)；

2.流动相：以乙腈-0.1％磷酸为流动相，0～170min乙腈在流动相中的体积百分比由5％匀速地递增至90％；

3.流速：1.0mL/分钟；

4.检测波长：254nm；

5.柱温：30℃；

6.供试品溶液的制备：按照实施例1优选出的方法制备；

7.对照品溶液的制备：分别精密称取原儿茶酸、原儿茶醛、特女贞苷、日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木质素对照品，加甲醇制成浓度为原儿茶酸90μg/ml、原儿茶醛30μg/ml、特女贞苷50μg/ml、日本南五味子素甲20μg/ml、乙酰日本南五味子素甲20μg/ml、(2′S)-南五味子木质素40μg/ml的混合对照品溶液，即得；

7.测定法：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，记录170min的色谱图。

实施例4方法学验证

4.1仪器精密度

取舒筋健腰丸(批号D23095)，参照实施例3的方法，连续进样6次，测定色谱图。各共有峰中，原儿茶酸(5号峰)面积最大，以5号峰为参考峰，分别对各共有峰保留时间和相对峰面积的变化情况进行考察。

结果显示在测定时间内，共有40个吸收峰。各共有峰保留时间RSD均小于0.2％，相对峰面积RSD小于5％，表明实验仪器的精密度良好，符合指纹图谱要求。其中相对峰面积结果见表1。

表1精密度相对峰面积

4.2方法重现性

取舒筋健腰丸(批号D23095)，平行制备6份供试品溶液，参照实施例3的方法测定。以原儿茶酸吸收峰为参照，将其保留时间和峰面积定为1，考察其他各共有色谱峰的相对保留时间、相对峰面积。

40个共有峰的相对保留时间RSD均低于0.2％，相对峰面积RSD均小于5％，表明方法重现性良好。其中相对峰面积的结果见表2。

表2重复性相对峰面积

4.3稳定性考察

取咳舒筋健腰丸(批号D23095)，参照实施例3的方法，分别在0h、3h、6h、9h、12h、16h、48h，参照实施例3的方法测定。以原儿茶酸为参照，将其保留时间和峰面积定为1，考察其他各共有色谱峰的相对保留时间、相对峰面积。

结果表明，48小时内测定，40个峰的相对保留时间RSD均低于0.2％，相对峰面积RSD均小于5％，相对峰面积数据见表3。说明在测定时间内，供试品溶液稳定。

表3稳定性相对峰面积

通过本实施例的试验表明，本发明建立的测定方法稳定、重现性好。

实施例5舒筋健腰丸指纹图谱的建立

参照实施例3的方法，检测了10批舒筋健腰丸(S1-S10)，叠加的色谱图见图3。使用药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统，2004A版》软件，生成了舒筋健腰丸色谱共有模式，见图4，为对照指纹图谱。

5.1指纹图谱共有峰的标定

根据10批供试品检测图谱，用相对保留时间标定了HPLC指纹图谱中的40个共有峰，峰号见图4。

5.2指纹图谱参照峰的选择

5号峰(原儿茶酸吸收峰)峰面积最大，分离较好，且较稳定，因而选择原儿茶酸色谱峰作为参照峰。

5.3共有峰的相对保留时间及相对峰面积值

确定的40个共有峰，以原儿茶酸吸收峰为参照，将其保留时间和峰面积定为1，计算其他色谱峰的相对保留时间、相对峰面积，结果显示10批舒筋健腰丸40个共有峰保留时间的RSD均小于1％，相对峰面积的RSD小于19.53％。其中相对峰面积数据见表4。

表4 10批舒筋健腰丸相对峰面积

5.4 10批舒筋健腰丸HPLC指纹图谱相似度评价

以S1(批号：D23095)样品图谱为参照图谱，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004A版)评价10批舒筋健腰丸指纹图谱，结果见表5。

表5 10批舒筋健腰丸样品相似度比较结果

表5的数据显示10批次舒筋健腰丸供试液的相似度都在0.986～1.0之间，未发现离群样本，符合国家食品药品监督管理局对中药指纹图谱相似度的要求。

5.5制剂产品与各种原药材的相关性及特征峰归属

按照实施例3的方法，分别制备处方中各药材、阴性样品以及对照品的供试品溶液，在实施例3所述色谱条件下，分别测定与制剂相应量各药材的指纹图谱以及阴性样品和对照品的图谱。将获得的图谱导入指纹图谱相似性评价软件(中药色谱指纹图谱相似度评价系统，2004A版)中，通过比较药材与成品色谱峰保留时间及与阴性样品的对照，标示其对共有峰的贡献，保留时间RSD值小于1％的峰即为舒筋健腰丸样品指纹图谱在药材图谱上的归属峰，同时与阴性样品色谱图比较，阴性样品中无干扰的，即为该味药材的特有峰。利用上述方法对舒筋健腰丸中各峰进行药材及对照品归属。见图5～图11。

在指纹图谱的40个共有峰中，4号峰为狗脊的特有峰，10号峰为千斤拔的特有峰，16号峰特女贞苷为女贞子的特有峰，18、19号峰为两面针的特有峰，24号峰为没药的特有峰，25号日本南五味子素甲、27号乙酰日本南五味子素甲、33号、35号、36号(2′S)-南五味子木质素号峰为黑老虎的特有峰，39号峰为乳香的特有峰。结果见表6。

表6 10批舒筋健腰丸样品40号共有峰平均相对保留时间、峰归属

结果显示，本发明建立的指纹图谱，原料中的各个药材的化学成分都有体现，与药材有良好的相关性。通过特征峰的归属，避免了舒筋健腰丸质量控制的单一性和片面性，可以鉴别出处方中药材成分的缺失，减少了人为处理产品质量达标的可能性。

通过以上研究，本发明建立了舒筋健腰丸的高效液相指纹图谱。通过对多批次样品的测定证明该方法重现性、专属性等良好，色谱体现了原儿茶酸、原儿茶醛、特女贞苷、日本南五味子素、乙酰日本南五味子素、(2′S)-南五味子木质素为指标的主要特征，可以用这些指标成分来检测舒筋健腰丸狗脊、千斤拔、女贞子、两面针、没药、黑老虎、乳香等药材的投料情况，并且可以提供比常规质量标准更深层次的质量评价依据。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (10)

1.一种中药组合物的指纹图谱建立方法，所述中药组合物以狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔、黑老虎、牛大力、蒸女贞子、蒸桑寄生、盐水制菟丝子、制延胡索、两面针、制乳香和制没药为原料，通过本领域常用的方法，与药学上可以接受的辅料，制备成临床上可以接受的制剂；所述指纹图谱建立方法包括采用高效液相色谱法检测所述中药组合物中各类化合物的保留时间，其中所述高效液相色谱的条件如下：

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；

流动相由乙腈和体积百分浓度0.1％的磷酸水溶液组成，0～170min乙腈在流动相中的体积百分比由5％匀速地递增至90％；流速1ml/min；

柱温为30℃；

紫外检测波长为254nm。

2.根据权利要求1所述的指纹图谱建立方法，其特征在于，还包括通过以下方法制备供试品溶液：取所述中药组合物5g，粉碎，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，超声30min，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.根据权利要求1或2所述的指纹图谱建立方法，其特征在于，还包括通过如下方法制备对照品溶液：分别精密称取原儿茶酸、原儿茶醛、特女贞苷、日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木质素对照品，混合，加甲醇制成浓度为原儿茶酸90μg/ml、原儿茶醛30μg/ml、特女贞苷50μg/ml、日本南五味子素甲20μg/ml、乙酰日本南五味子素甲20μg/ml、(2′S)-南五味子木质素40μg/ml的混合对照品溶液，即得。

4.根据权利要求1所述的指纹图谱建立方法，其特征在于，具体的操作步骤包括：

1)对照品溶液的制备：分别精密称取原儿茶酸、原儿茶醛、特女贞苷、日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木质素对照品，混合，加甲醇制成浓度为原儿茶酸90μg/ml、原儿茶醛30μg/ml、特女贞苷50μg/ml、日本南五味子素甲20μg/ml、乙酰日本南五味子素甲20μg/ml、(2′S)-南五味子木质素40μg/ml的溶液，即得；

2)供试品溶液的制备：取所述中药组合物5g，粉碎，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，超声30min，放冷至室温，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

3)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，根据以下色谱条件进行测定，记录170min内的色谱图，得到指纹图谱：

色谱柱：Waters Atlantis色谱柱，250×4.6mm，固定相平均粒径5μm；

流动相：乙腈-体积百分浓度0.1％的磷酸水溶液，0～170min乙腈在流动相中的体积百分比由5％匀速地递增至90％；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

紫外检测波长：254nm。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的指纹图谱建立方法，其特征在于，建立的指纹图谱包括原儿茶酸吸收峰，并以原儿茶酸吸收峰为参照；

优选的，建立的指纹图谱以原儿茶酸吸收峰为参照，还包括原儿茶醛吸收峰、特女贞苷吸收峰、日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、或(2′S)-南五味子木质素吸收峰中的一个或多个，相对保留时间分别为：

原儿茶醛吸收峰：1.348±0.13％，特女贞苷吸收峰：2.870±0.05％，日本南五味子素甲吸收峰：7.423±0.02％，乙酰日本南五味子素甲：8.185±0.02％，(2′S)-南五味子木质素吸收峰：10.145±0.02％。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述的中药组合物的原料由如下重量份的药材组成：

狗脊600重量份，金樱子192重量份，鸡血藤360重量份，千斤拔144重量份，黑老虎360重量份，牛大力240重量份，蒸女贞子30重量份，蒸桑寄生180重量份，盐水制菟丝子30重量份，制延胡索26重量份，两面针26重量份，制乳香12重量份，制没药20重量份；

优选的，所述中药组合物为丸剂。

7.根据权利要求6所述的指纹图谱建立方法，其特征在于，所述中药组合物为舒筋健腰丸，通过如下方法制备：

1)准备如下重量份的药材：狗脊600重量份，金樱子192重量份，鸡血藤360重量份，千斤拔144重量份，黑老虎360重量份，牛大力240重量份，蒸女贞子30重量份，蒸桑寄生180重量份，盐水制菟丝子30重量份，制延胡索26重量份，两面针26重量份，制乳香12重量份，制没药20重量份；

2)狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔和黑老虎的木部加水煎煮二次，滤过，合并滤液，浓缩成稠膏；其余牛大力等八味及黑老虎的皮部共粉碎成粗粉，加入上述稠膏，混匀，干燥，粉碎成细粉，过筛，混匀；每100g粉末用炼蜜35～45g与适量的水泛丸，用黑氧化铁包衣，干燥，打光，即得。

8.根据权利要求7所述的指纹图谱建立方法，其特征在于所述丸剂按照所述方法建立的指纹图谱，包括40个特征峰，以原儿茶酸吸收峰为参照，所述特征峰的相对保留时间分别为：

峰1：0.587±0.16％；峰2：0.626±0.18％；峰3：0.787±0.17％；

峰4：0.860±0.18％；峰5：1.000±0.18％；峰6：1.124±0.14％；

峰7：1.348±0.13％；峰8：1.456±0.14％；峰9：1.696±0.11％；

峰10：1.888±0.08％；峰11：2.500±0.06％；峰12：2.636±0.06％；

峰13：2.687±0.05％；峰14：2.721±0.06％；峰15：2.788±0.06％；

峰16：2.870±0.05％；峰17：3.011±0.05％；峰18：3.093±0.05％；

峰19：3.114±0.05％；峰20：3.145±0.05％；峰21：3.501±0.04％；

峰22：4.015±0.05％；峰23：4.079±0.05％；峰24：6.622±0.04％；

峰25：7.423±0.02％；峰26：7.927±0.03％；峰27：8.185±0.02％；

峰28：8.355±0.02％；峰29：8.542±0.03％；峰30：8.764±0.02％；

峰31：9.248±0.02％；峰32：9.445±0.02％；峰33：9.622±0.02％；

峰34：9.755±0.02％；峰35：9.976±0.02％；峰36：10.145±0.02％；

峰37：10.543±0.01％；峰38：11.364±0.01％；峰39：11.799±0.01％；

峰40：12.162±0.02％；

其中峰5是原儿茶酸吸收峰，峰7是原儿茶醛吸收峰，峰16是特女贞苷吸收峰，峰25是日本南五味子素甲吸收峰，峰27是乙酰日本南五味子素甲吸收峰，峰36是(2′S)-南五味子木质素吸收峰；

峰4是狗脊药材特有峰，峰10是千斤拔药材特有峰，峰16(特女贞苷)是女贞子药材特有峰，峰18、19是两面针药材特有峰，峰24为没药特有峰，峰25、27、33、35、36是黑老虎药材特有峰，峰39是乳香药材特有峰。

9.权利要求1至8中任一项所述的指纹图谱建立方法在一种中药组合物的真伪鉴别和成分检测中的应用；所述中药组合物的原料组成为狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔、黑老虎、牛大力、蒸女贞子、蒸桑寄生、盐水制菟丝子、制延胡索、两面针、制乳香和制没药；

优选的，所述中药组合物为舒筋健腰丸。

10.一种检测原料组成为狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔、黑老虎、牛大力、蒸女贞子、蒸桑寄生、盐水制菟丝子、制延胡索、两面针、制乳香和制没药的中药组合物的成分的方法，其特征在于，采用权利要求1至8中任一项所述的指纹图谱建立方法建立的指纹图谱；

优选的，所述中药组合物为舒筋健腰丸。