CN110967414A - 一种检测虎杖药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒指纹图谱的高效液相方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种可适用于整体控制虎杖药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒质量的高效液相指纹图谱检测方法。本发明的HPLC指纹图谱检测方法能整体控制虎杖药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒中的特征成分，确保虎杖药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒整体质量的稳定，且方法梯度洗脱时间更短，所得指纹图谱质量更佳，特征共有峰信息更多，精密度高，稳定性好，重复性好，准确度高。

Description

一种检测虎杖药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒指纹图谱的高 效液相方法

技术领域

本发明具体涉及一种虎杖药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒指纹图谱的HPLC检测方法。

背景技术

虎杖为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根茎和根，始载于《雷公炮炙论》，具有利湿退黄，清热解毒，散瘀止痛，止咳化痰等功效，用于湿热黄疸，淋浊，带下，风湿痹痛，痈肿疮毒，水火烫伤，经闭，癥瘕，跌打损伤，肺热咳嗽，为临床常用中药品种。虎杖含化学成分较多且复杂，其中以虎杖苷为代表的二苯乙烯类成分和以大黄素为代表的蒽醌类成分，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血糖血脂等广泛药理作用，是虎杖的主要有效部位，是虎杖发挥临床疗效的基础。因此，要确保虎杖的临床疗效，需要对虎杖苷、大黄素等药效成分进行质量控制。

目前，《中国药典》2015年版一部虎杖项下收载了采用高效液相色谱分别单独测定其中虎杖苷、大黄素含量的方法，但尚未建立虎杖的指纹图谱检测方法及标准。其他有少量文献研究建立了虎杖饮片(蔺红伟，朴淑娟，江春霞，等.虎杖饮片指纹图谱的研究及其耐用性考察[J].药学实践杂志，2016，34(2)：174‐176,187.)、配方颗粒(梁俊，郑江萍，黄良永.虎杖配方颗粒的HPLC指纹图谱研究[J].中国药师2015，18(4)：578‐582)、水煎液(韦红言，温庆伟，陆东，等.虎杖饮片、水煎剂、配方颗粒高效液相色谱特征图谱相关性研究[J].中国药业，2014，，23(18)：37‐40的指纹图谱)。

然而，上述文献方法存在如下问题：一是流动相梯度洗脱程序设计要么步骤较多，所需检测时间较长，要么太简单，时间太短，分离所得特征色谱峰太少；二则检测波长不统一，较为混乱，不同检测波长下，色谱峰图质量与信息存在较大差异，如采用230nm为检测波长时，色谱图基线漂移、杂质峰较多，影响色谱图质量不太理想，特征峰的色谱分离不佳，而采用306nm为检测波长时，特征色谱峰明显减少。

因此，针对虎杖的特征共性成分，建立一个流动相梯度洗脱程序、检测波长最优的指纹图谱检测方法，有利于整体高效地控制虎杖药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的内在质量，确保虎杖的临床疗效。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种适用于虎杖药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒指纹图谱测定的HPLC检测方法。

本发明的整体控虎杖药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC指纹图谱的检测方法，包括如下操作步骤：

1)参照物溶液制备：取对照品，溶解，即得参照物溶液；

2)供试品溶液制备：取虎杖药材或饮片或标准汤剂或配方颗粒，经提取，取续滤液，即得供试品溶液；

3)分别吸取参照物溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；检测波长：230～306nm；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序如下：

其中，步骤1)所述对照品包括：虎杖苷、大黄素、白藜芦醇三种对照品。

其中，步骤1)所述溶解是加入甲醇溶解。

其中，步骤2)所述提取溶剂是指甲醇、水和稀乙醇中任一一种，加入溶剂量为样品的200倍～400倍，采用超声或回流提取，提取时间为20～40分钟。

进一步地，所述提取方法如下：

取虎杖标准汤剂粉末，加入200倍甲醇，称定重量，超声或回流处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得虎杖标准汤剂粉末的供试品溶液。

取虎杖配方颗粒粉末，加入400倍甲醇，称定重量，超声或回流处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得虎杖配方颗粒的供试品溶液。

取虎杖药材或饮片粉末，加入66.7倍甲醇，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得虎杖药材或饮片的供试品溶液。

其中，所用色谱柱为Agilent ZORBAX Extend‐C18(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)。

其中，所述检测波长为280nm。

其中，所述色谱条件还包括：流速为每分钟0.8ml～1.2ml/分，柱温为20～30℃，进样量为5～20μL。

进一步地，所述色谱条件还包括：流速为1.0mL/min，柱温为25℃，进样量为10μL。

进一步地，按照上述检测方法，测定得虎杖药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的指纹图谱的特征在于：

(1)呈现10个共有峰，其中3个峰应与虎杖苷、大黄素、白藜芦醇三种参照物峰的保留时间相同；

(2)以虎杖苷参照物相应的峰为S峰，计算10个共有峰的相对保留时间，依次应为：0.727(峰1)、1.000(峰2，S)、1.442(峰3)、1.758(峰4)、1.931(峰5)、1.998(峰6)、2.240(峰7)、2.347(峰8)、2.673(峰9)、4.529(峰10)，且各相对保留时间应在规定值的±5％之内。

本发明的HPLC指纹图谱检测方法能整体控制虎杖药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒中的特征成分，确保虎杖药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒整体质量的稳定，且方法梯度洗脱时间更短，所得指纹图谱质量更佳，特征共有峰信息更多，精密度高，稳定性好，重复性好，准确度高。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1虎杖药材、饮片对照指纹图谱，峰2‐虎杖苷(S峰)；峰4‐白藜芦醇；峰10‐大黄素

图2虎杖标准汤剂对照图谱，峰2‐虎杖苷(S峰)；峰4‐白藜芦醇；峰10‐大黄素

图3虎杖配方颗粒对照图谱，峰2‐虎杖苷(S峰)；峰4‐白藜芦醇；峰10‐大黄素

具体实施方式

仪器与试药

1仪器

高效液相色谱仪：安捷伦1260型高效液相色谱仪、Waters2695‐2996型高效液相色谱仪、岛津20AD型高效液相色谱仪；

电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒‐托利多仪器有限公司)；

超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；

超声波清洗器：KQ5200DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；

色谱柱：Agilent ZORBAX Extend‐C18(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)。

2试药

乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

虎杖苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111575‐201603，含量以87.3％计)；白藜芦醇对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110756‐201512，含量以98.7％计)；大黄素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：11535‐201703，含量以99.4％计)

虎杖药材(批号：HZ180201、HZ1802057、HZ1802041、HZ180401、HZ1802043、HZ180402、HZ1802046、HZ180403、HZ1802048、HZ180404、HZ1802049、HZ180405、HZ1802051、HZ180406、HZ1802053、HZ180407、HZ1802054、HZ180408、HZ1802056、HZ180409)

虎杖饮片(批号：HZ180201、HZ1802057、HZ1802041、HZ180401、HZ1802043、HZ180402、HZ1802046、HZ180403、HZ1802048、HZ180404、HZ1802049、HZ180405、HZ1802051、HZ180406、HZ1802053、HZ180407、HZ1802054、HZ180408、HZ1802056、HZ180409)

虎杖配方颗粒(批号：SY1804001、SY1804002、SY1804003)

虎杖标准汤剂(批号：HZBT180218)

实施例1本发明检测方法用于虎杖标准汤剂高效液相指纹图谱的检测

1参照物溶液制备：取虎杖苷、大黄素、白藜芦醇对照品适量，加甲醇分别制成每1ml各含50μg的对照品溶液，即得。

2供试品溶液制备：取虎杖标准汤剂(批号：HZBT180218)约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4检测：分别吸取参照物溶液和供试品溶液各5μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；检测波长：230nm；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序如下：

流速为0.8mlml/分，柱温为20℃。

5结果：供试品指纹图谱中呈现10个特征峰，其中3个峰应分别与虎杖苷、大黄素、白藜芦醇相应的参照物峰保留时间相同；以虎杖苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间均在规定值的±5％之内，表明该方法可准确高效地控制虎杖标准汤剂中的特征成分。

实施例2本发明检测方法用于虎杖标准汤剂高效液相指纹图谱的检测

1参照物溶液制备：取虎杖苷、大黄素、白藜芦醇对照品适量，加甲醇分别制成每1ml各含50μg的对照品溶液，即得。

2供试品溶液制备：取虎杖标准汤剂(批号：HZBT180218)约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4检测：分别吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；检测波长：280nm；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序如下：

流速为1.0ml/分，柱温为25℃。

5结果：供试品指纹图谱中呈现10个特征峰，其中3个峰均与参照物虎杖苷、大黄素、白藜芦醇的峰保留时间相同；与虎杖苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间均在规定值的±5％之内，该方法可准确高效地控制虎杖药材中的特征成分。

实施例3本发明检测方法用于虎杖标准汤剂高效液相指纹图谱的检测

1参照物溶液制备：取虎杖苷、大黄素、白藜芦醇对照品适量，加甲醇分别制成每1ml各含50μg的对照品溶液，即得。

2供试品溶液制备：取虎杖标准汤剂(批号：HZBT180218)约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水30ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4检测：分别吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；检测波长：280nm；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序如下：

流速为1.0ml/分，柱温为25℃。

5结果：供试品指纹图谱中呈现10个特征峰，其中3个峰均与参照物虎杖苷、大黄素、白藜芦醇的峰保留时间相同；与虎杖苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间均在规定值的±5％之内，该方法可准确高效地控制虎杖药材中的特征成分。

实施例4本发明检测方法用于虎杖配方颗粒高效液相指纹图谱的检测

1参照物溶液制备：取虎杖苷、大黄素、白藜芦醇对照品适量，加甲醇分别制成每1ml各含50μg的对照品溶液，即得。

2供试品溶液制备：取虎杖配方颗粒(批号：SY1804001)约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇40ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4检测：分别吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；检测波长：280nm；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序如下：

流速为1.0ml/分，柱温为25℃。

5结果：供试品指纹图谱中呈现10个特征峰，其中3个峰均与参照物虎杖苷、大黄素、白藜芦醇的峰保留时间相同；与虎杖苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间均在规定值的±5％之内，该方法可准确高效地控制虎杖药材中的特征成分。

实施例5本发明检测方法用于虎杖配方颗粒高效液相指纹图谱的检测

1参照物溶液制备：取虎杖苷、大黄素、白藜芦醇对照品适量，加甲醇分别制成每1ml各含50μg的对照品溶液，即得。

2供试品溶液制备：取虎杖配方颗粒(批号：SY1804001)约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇40ml，密塞，称定重量，回流提取20分钟，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4检测：分别吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；检测波长：280nm；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序如下：

流速为1.0ml/分，柱温为25℃。

5结果：供试品指纹图谱中呈现10个特征峰，其中3个峰均与参照物虎杖苷、大黄素、白藜芦醇的峰保留时间相同；与虎杖苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间均在规定值的±5％之内，该方法可准确高效地控制虎杖中的特征成分。

实施例6本发明检测方法用于虎杖药材高效液相指纹图谱的检测

1参照物溶液制备：取虎杖苷、大黄素、白藜芦醇对照品适量，加甲醇分别制成每1ml各含50μg的对照品溶液，即得。

2供试品溶液制备：取虎杖药材(批号：HZ180201)粉末约0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇40ml，密塞，称定重量，回流提取20分钟，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4检测：分别吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；检测波长：280nm；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序如下：

流速为1.0ml/分，柱温为25℃。

5结果：供试品指纹图谱中呈现10个特征峰，其中3个峰均与参照物虎杖苷、大黄素、白藜芦醇的峰保留时间相同；与虎杖苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间均在规定值的±5％之内，该方法可准确高效地控制虎杖药材中的特征成分。

实施例6本发明检测方法用于虎杖药材高效液相指纹图谱的检测

1参照物溶液制备：取虎杖苷、大黄素、白藜芦醇对照品适量，加甲醇分别制成每1ml各含50μg的对照品溶液，即得。

2供试品溶液制备：取虎杖饮片(批号：HZ180201)粉末约0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇40ml，密塞，称定重量，回流提取20分钟，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4检测：分别吸取参照物溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；检测波长：280nm；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序如下：

流速为1.0ml/分，柱温为25℃。

5结果：供试品指纹图谱中呈现10个特征峰，其中3个峰均与参照物虎杖苷、大黄素、白藜芦醇的峰保留时间相同；与虎杖苷参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间均在规定值的±5％之内，该方法可准确高效地控制虎杖饮片中的特征成分。

实验例1色谱条件与系统适用性试验

流动相选择：考察了3种不同流动相的分离效果，分别为：(1)乙腈‐水梯度洗脱；(2)乙腈‐0.1％磷酸；(3)甲醇‐水梯度洗脱。结果表明，乙腈‐0.1％磷酸梯度洗脱条件下色谱峰多，且峰形更好，故将乙腈‐0.1％磷酸作为虎杖标准汤剂指纹图谱测定方法的流动相。

延迟性实验：按照以上拟定的流动相将分析时间延长至2倍，观察45min后是否有色谱峰。结果表明，45min后基本无色谱峰，确定分析时间为45min。

波长选择：参考药典中含量测定项下的指标，分别提取供试品溶液在230nm、254nm、270nm、280nm、290nm、306nm波长下的色谱图，并结合3D色谱图，筛选指纹图谱的最适宜波长。结果表明，在检测波长为280nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为280nm。

柱温考察：分别对柱温为20℃、25℃、30℃时进行考察。结果表明，不同柱温下的指纹图谱无显著差异，为方便后续研究，暂定柱温为25℃。

流速考察：分别对流速为0.8ml/分钟、1.0ml/分钟、1.2ml/分钟时进行了考察。结果表明，不同流速下色谱图的峰形及数目均差异不大，依照实验习惯，流速确定为1.0ml/min。

实验例2供试品溶液的制备考察

提取溶剂考察：取虎杖标准汤剂粉末(批号HZBT802018)约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别对供试品提取溶剂为甲醇、水、稀乙醇时进行考察，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，在拟定色谱条件下进样，测定样品的色谱图。结果表明，在提取溶剂为甲醇、水和稀乙醇时，所得的色谱图接近，色谱峰信息量大，但甲醇样品易于保存和制备，故供试品提取溶剂确定为甲醇。

提取方法考察：取虎杖标准汤剂粉末(批号HZBT802018)约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，分别对供试品提取方法为回流、超声时进行考察，提取时间30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，在拟定色谱条件下进样，测定样品的色谱图。结果表明，对供试品分别进行超声提取与回流提取时效果一致。因超声提取操作更为简便，故供试品提取方法确定为超声提取。

提取时间考察：取虎杖标准汤剂粉末(批号HZBT180218)约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)，分别对供试品提取时间为20分钟、30分钟、40分钟时进行考察，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，在拟定色谱条件下进样，测定样品的色谱图。结果表明，在提取时间为20分钟时，即可充分提取。故供试品提取时间确定为20分钟。

溶剂加入量考察：取虎杖标准汤剂粉末(批号HZBT180218)约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别对供试品精密加入甲醇20ml，30ml，40ml时进行考察。密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)，对供试品提取时间为20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，在拟定色谱条件下进样，测定样品的色谱图。结果表明，在提取溶剂为40ml时，样品色谱峰的峰面积适中，故供试品提取溶剂确定为40ml。

实验例3精密度试验

取同一批虎杖标准汤剂供试品溶液，在拟定色谱条件下，连续进样6次，以虎杖苷(2号峰)为参照峰，计算各共有峰保留时间和峰面积的RSD，结果表明各峰保留时间RSD＜0.1％，相对峰面积RSD＜4.0％，表明仪器精密度良好。

实验例4稳定性试验

在以上拟定的实验条件基础上，取虎杖标准汤剂同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、20、24h时测定，以虎杖苷(2号峰)为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果各峰相对保留时间的RSD＜0.10％，相对峰面积的RSD＜7.0％，表明虎杖标准汤剂供试品溶液在24h内稳定。

实验例5重复性试验

平行取虎杖标准汤剂(批号HZBT802018)6份分别制备供试品溶液，在拟定色谱条件下进样，测定供试品溶液中各共有峰的保留时间和峰面积。以虎杖苷(2号峰)为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果表明各峰相对保留时间的RSD＜0.10％，相对峰面积的RSD＜6.0％，表明该方法的重复性较好。

实验例6虎杖色谱指纹对照图谱的建立

1.虎杖标准汤剂指纹图谱的建立

取20批虎杖标准汤剂，按照拟定方法分别制备各供试品溶液，再按拟定的色谱条件分别测定，记录HPLC图。将20批供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版)，以HZBT180218色谱图为参照，采用中位数法，时间窗为0.1，进行相似度计算，结果见下表。

表20批标准汤剂指纹图谱相似度计算结果

结果发现，20批虎杖标准汤剂与对照指纹图谱相似度均大于0.95，表明各批次虎杖标准汤剂具有较好的一致性。根据20批标准汤剂验证结果，规定：虎杖标准汤剂的指纹图谱中应呈现10个共有峰，其中3个峰应与参照物峰保留时间相同，与虎杖苷参照物相应的峰为S峰，计算各共有峰S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。规定值为：0.727(峰1)、1.000(峰2，S)、1.442(峰3)、1.758(峰4)、1.931(峰5)、1.998(峰6)、2.240(峰7)、2.347(峰8)、2.673(峰9)、4.529(峰10)。

通过采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对20批虎杖标准汤剂图谱进行合成，建立了虎杖标准汤剂指纹图谱的对照指纹图谱，建立的指纹图谱检测方法可以较为准确地整体控制虎杖的质量。

2.虎杖药材、饮片指纹图谱的建立

取20批虎杖药材、饮片，按照拟定方法分别制备各供试品溶液，再按拟定的色谱条件分别测定，记录HPLC图。将20批供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版)，以HZBT180218色谱图为参照，采用中位数法，时间窗为0.1，进行相似度计算，结果见下表。

表20批药材、饮片指纹图谱相似度计算结果

结果发现，20批虎杖药材、饮片与对照指纹图谱相似度均大于0.95，表明各批次虎杖药材、饮片具有较好的一致性。根据20批药材、饮片验证结果，规定虎杖药材、饮片的指纹图谱中应呈现10个共有峰，其中3个峰应与参照物峰保留时间相同，与虎杖苷参照物相应的峰为S峰，计算各共有峰S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。通过采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对20批虎杖药材、饮片图谱进行合成，建立了虎杖药材、饮片指纹图谱的对照指纹图谱，建立的指纹图谱检测方法可以较为准确地整体控制虎杖药材、饮片的质量。

3.虎杖配方颗粒指纹图谱的建立

取3批虎杖配方颗粒(SY1804001、SY1804002、SY1804003)，按照拟定方法分别制备各供试品溶液，再按拟定的色谱条件分别测定，记录HPLC图，见表。

表虎杖药材(饮片)指纹图谱共有峰相对保留时间

将3批供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版)，以HZBT180218色谱图为参照，采用中位数法，时间窗为0.1，进行相似度计算，结果3批虎杖配方颗粒与对照指纹图谱的相似度均在0.995以上。

根据考察结果，规定虎杖配方颗粒的指纹图谱中应呈现10个共有峰，其中3个峰应与参照物峰保留时间相同，与虎杖苷参照物相应的峰为S峰，计算各共有峰S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。

综上，本发明的虎杖药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒高效液相指纹图谱的检测方法，能整体控制虎杖药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒中的特征成分，确保虎杖药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒质量的整体稳定，且方法梯度洗脱时间更短，所得指纹图谱质量更佳，特征共有峰信息更多，精密度高，稳定性好，重复性好，准确度高，具有良好应用前景。

Claims (10)

1.一种虎杖药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC指纹图谱的检测方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

1)参照物溶液制备：取对照品，溶解，即得参照物溶液；

2)供试品溶液制备：取虎杖药材或饮片或标准汤剂或配方颗粒，经提取，取续滤液，即得供试品溶液；

3)分别吸取参照物溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长：230～306nm；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序如下：

。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1)所述对照品包括虎杖苷、大黄素、白藜芦醇三种对照品。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1)所述溶解是加入甲醇溶解。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2)所述提取溶剂是指甲醇、水和稀乙醇中任一一种，加入溶剂量为样品的200倍～400倍，采用超声或回流提取，提取时间为20～40分钟。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2)所述提取方法如下：

取虎杖标准汤剂粉末，加入200倍甲醇，称定重量，超声或回流处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得虎杖标准汤剂粉末的供试品溶液。

取虎杖配方颗粒粉末，加入400倍甲醇，称定重量，超声或回流处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得虎杖配方颗粒的供试品溶液。

取虎杖药材或饮片粉末，加入66.7倍甲醇，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得虎杖药材或饮片的供试品溶液。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所用色谱柱为Agilent ZORBAXExtend‐C18；优选柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述检测波长为280nm。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述色谱条件还包括：流速为每分钟0.8ml～1.2ml/分，柱温为20～30℃，进样量为5～20μL。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：流速为1.0mL/min，柱温为25℃，进样量为10μL。

10.按照权利要求1所述的检测方法，其特征在于：虎杖药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的指纹图谱的特征在于：

(1)呈现10个共有峰，其中3个峰应与虎杖苷、大黄素、白藜芦醇三种参照物峰的保留时间相同；

(2)以虎杖苷参照物相应的峰为S峰，计算10个共有峰的相对保留时间，依次应为：0.727(峰1)、1.000(峰2，S)、1.442(峰3)、1.758(峰4)、1.931(峰5)、1.998(峰6)、2.240(峰7)、2.347(峰8)、2.673(峰9)、4.529(峰10)，且各相对保留时间应在规定值的±5％之内。

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