CN105738499A - 精制冠心片特征图谱的构建和6种成分的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种精制冠心片特征图谱的构建和6种成分的测定方法。首先取①芍药苷，迷迭香酸，丹酚酸B，藁本内酯，隐丹参酮，丹参酮IIA对照品，②13批精制冠心片样品，③按《中国药典》收载的精制冠心片处方比例及工艺制备的分别缺少丹参，赤芍，川芎，红花的4种阴性样品，先后制备对照品、供试品和阴性样品溶液，精密吸取上述溶液各0.5μL注入液相色谱仪中进行测定得到色谱图，以中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算后即得特征图谱。本发明首次构建的特征图谱所包含的特征峰全面，定位准确，实现了有效鉴别该中成药的真伪，评价其质量的优劣，能同时快速准确定量检测出精制冠心片的多种成分，有望成为精制冠心片中成药质量控制的标准方法。

Description

精制冠心片特征图谱的构建和6种成分的测定方法
技术领域
本发明涉及中药质量检测领域，具体涉及精制冠心片特征图谱的构建和6种成分的测定方法。
背景技术
精制冠心片是由丹参、赤芍、川芎、红花、降香共5味中药饮片组成的中药制剂，所含化学成分十分复杂。该制剂具有活血化瘀的功效。用于瘀血内停所致的胸痹，症见胸闷、心前区刺痛；冠心病心绞痛见上述证候者。其制备方法是降香提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集，其余赤芍等四味中药饮片用85％乙醇加热回流提取，滤过，合并滤液，回收乙醇，与上述降香水溶液合并，减压浓缩至相对密度为1.35～1.40(50℃)的稠膏，加辅料适量，制成颗粒，干燥，加入降香挥发油，混匀，压制成片，包衣，即得。
特征图谱技术是一种应用于中药成分的检测技术，是通过对共有特征峰的检测以达到对样品的多种成分进行检测的目的，是一种综合的检测手段。因此构建精制冠心片的特征图谱能较为全面的、定性的反映精制冠心片中复杂的化学成分，是非常必要的。若再将检测的定性的成分准确量化，则可更加严谨准确的控制精制冠心片的质量优劣。
目前精制冠心片中成药尚无整体性有效控制其质量的检测方法，仅依靠薄层色谱法对成药中的部分药味进行薄层色谱检测，或对成药中的某一种或多种成分采用高效液相色谱-紫外检测器法进行含量测定，来片面地反映精制冠心片中成药的质量，如蒋珍藕等(中医药导报.17(1)：83-85)采用高效液相色谱-紫外检测器法测定精制冠心片中丹酚酸B的含量，仅测定精制冠心片中丹参所含的1种成分。张玲艳等(中草药.46(14)：2092-2095)测定精制冠心片中7种指标成分的含量，仅能测定丹参素等可定性的7种成分的含量，其不能对精制冠心片中无法定性的成分进行检测，对精制冠心片的质量可控性差，不能全面有效地衡量精制冠心片质量的优劣。显然检验效率高，同时定性、定量准确的检测方法，以满足中成药复杂的化学成分的质量可控的检测是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是提供精制冠心片特征图谱和6种成分的测定方法，全面快速地检测出中成药精制冠心片中组方的各药材的特征成分，达到鉴别该中成药的真伪，并评价其质量的优劣，以弥补现有技术的不足。
本发明运用中医药理论，为建立精制冠心片的特征图谱对其组方进行了研究分析：
首先，丹参是精制冠心片组方中的君药，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈的功能。丹参主要含有水溶性和脂溶性两类成分，不同的成分具有不同的药理活性，以丹参酮ⅡA、隐丹参酮为代表的丹参酮类脂溶性成分具有天然抗氧化、抗菌消炎、抗肿瘤和心血管药理作用，以丹酚酸B、迷迭香酸为代表的的酚酸类水溶性成分则具有抗心肌缺血、清除自由基抗氧化、抗肝脏损伤、抗神经凋亡改善记忆功能等作用。因此，本发明选择的丹参的特征成分为迷迭香酸、丹酚酸B、隐丹参酮和丹参酮ⅡA。
其次，赤芍、川芎均为组方中的臣药。赤芍具有清热凉血，散瘀止痛的功能。而衡量赤芍药材质量优劣的指标性成分为赤芍中的芍药苷，如《中国药典》2015年版一部赤芍项下采用了高效液相色谱-紫外检测器法测定芍药苷的含量，以芍药苷的含量作为判定赤芍药材质量优劣的指标。川芎具有活血行气，祛风止痛的功能。川芎中所含藁本内酯为苯酞类衍生物，在川芎中含量可达1％以上，在川芎挥发油中达30％以上，是川芎的主要活性成分之一，藁本内酯可作为川芎药材质量评价的指标成分之一。因此，本发明选择的赤芍的特征成分为芍药苷。选择的川芎的特征成分为藁本内酯。
再次，红花为组方中的佐使药，具有活血通经，散瘀止痛的功能。可以加强君、臣药的治疗作用，亦可解除次要的兼证，红花中的特征成分的检测也是不可缺少的。
因此，按照中药君、臣、佐、使组方原则，并依照药味作用主次而选择了芍药苷、迷迭香酸、丹酚酸B、藁本内酯、隐丹参酮、丹参酮IIA共6种已定性的成分和3种不能定性的成分，共9种特征成分为指标构建了精制冠心片的特征图谱，可以较全面的反映精制冠心片成药的质量的优劣。本发明并通过对其中6种已定性的指标性成分进行定量检测，进一步全面控制其质量。
本发明的特征图谱的构建步骤如下：
(1)首先取①芍药苷，迷迭香酸，丹酚酸B，藁本内酯，隐丹参酮，丹参酮IIA对照品，②13批精制冠心片样品，③按《中国药典》2015年版一部收载的精制冠心片处方比例及工艺制备的分别缺少丹参，赤芍，川芎，红花的4种阴性样品，即先后制备对照品溶液，供试品溶液和阴性样品溶液，分别精密吸取对照品溶液，供试品溶液和阴性样品溶液各0.5μL，注入液相色谱仪中，按照设定的色谱条件进行测定，检测40分钟，选取记录的前35分钟的色谱图，并以国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统进行计算后即生成精制冠心片的特征图谱。
(2)对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品17.57mg、迷迭香酸对照品96.16mg、丹酚酸B对照品93.80mg、藁本内酯对照品34.26mg、隐丹参酮对照品18.67mg、丹参酮IIA对照品24.26mg，分别置于100mL量瓶中，加甲醇定容至100ml，制成对照品浓溶液。分别精密量取对照品浓溶液各3mL，置于50mL量瓶中，加甲醇定容至50mL，制成每1mL含芍药苷10.162μg、迷迭香酸56.888μg、丹酚酸B52.734μg、藁本内酯20.556μg、隐丹参酮11.202μg、丹参酮IIA14.396μg的混合溶液作为对照品溶液。
(3)供试品溶液的制备：取精制冠心片样品10片，除去包衣，精密称定(精密至0.1mg)，研细，精密称定粉末0.3g(精密至0.1mg)，加入80％甲醇10mL，超声处理(功率300W,频率40KHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，制成供试品溶液。
(4)阴性样品溶液的制备：按《中国药典》2015年版一部收载的精制冠心片处方比例及工艺制备分别缺少丹参、赤芍、川芎、红花的4种阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备4种阴性样品溶液。
其中的共有特征峰的标定是通过对照品溶液，供试品溶液和阴性样品溶液的比较，得出供试品溶液图谱中9个共有特征峰的归属。1号峰为芍药苷峰，属于赤芍；2号峰为迷迭香酸峰，属于丹参；3号峰为未知成分峰，属于川芎；4号峰为丹酚酸B峰，属于丹参；5号峰为未知成分峰，属于红花；6号峰为未知成分峰，属于川芎；7号峰为藁本内酯峰，属于川芎；8号峰为隐丹参酮峰，属于丹参；9号峰为丹参酮ⅡA峰，属于丹参。
显然本发明的上述构建的精制冠心片特征图谱应用于精制冠心片的真伪鉴别和质量优劣的判定。
应用方法：只要分别精密吸取对照品溶液，供试品溶液各0.5μL，注入液相色谱仪中，按照上述设定的色谱条件进行测定，检测40分钟，选取记录的前35分钟的色谱图即可进行判定；
结果判定如下：供试品溶液图谱中应有9个特征峰，其中有6个峰应分别与相应的对照品峰保留时间相同，与丹酚酸B对照品相应的峰为S峰，计算特征峰1～9号与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内，规定值为：0.61，0.92，0.94，1.00，1.11，1.48，1.60，1.73，1.90，如供试品溶液图谱完全满足上述判定条件，则可判定检测样品为合格样品；否则可判定检测样品为不合格样品。
本发明的精制冠心片6种成分含量的测定方法：其特征是分别精密吸取上述的对照品溶液、供试品溶液各0.5μL，注入液相色谱仪中，按照设定的色谱条件进行测定，用已有的外标法直接计算出精制冠心片中6种成分的含量：含量测定芍药苷检测波长为230nm；迷迭香酸、丹酚酸B检测波长为288nm；藁本内酯检测波长为321nm；隐丹参酮、丹参酮IIA检测波长为270nm。
显然，本发明首次构建的精制冠心片的特征图谱所包含的特征峰全面，定位准确，实现了有效鉴别该中成药的真伪，为评价其质量的优劣提供了标准检测方法，能同时快速准确定量检测出精制冠心片的多种成分，有望成为精制冠心片中成药质量控制的标准方法。
附图说明
图1：本发明的精制冠心片6种成分的对照品溶液的HPLC-UV色谱图。
图2：本发明的精制冠心片供试品溶液的HPLC-UV色谱图。
图3：本发明的精制冠心片缺丹参阴性样品溶液的HPLC-UV色谱图。
图4：本发明的精制冠心片缺赤芍阴性样品溶液的HPLC-UV色谱图。
图5：本发明的精制冠心片缺川芎阴性样品溶液的HPLC-UV色谱图。
图6：本发明的精制冠心片缺红花阴性样品溶液的HPLC-UV色谱图。
图7：本发明构建的精制冠心片特征图谱。
具体实施方式
下面给出详细的实施例。
本发明采用：仪器与试药：Agilent1290超高效液相色谱仪(美国，安捷伦)；SartorisBP211D电子天平；AUTOSCIENCEAS10200BT型超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。乙腈为色谱用试剂，其它试剂均为分析纯。芍药苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110736-201438，含量为96.4％)、迷迭香酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111871-201404，含量为98.6％)、丹酚酸B对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111562-201514，含量为93.7％)、藁本内酯对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111737-201305)、隐丹参酮对照品(中国食品药品检定研究院，批号：0852-9902)、丹参酮IIA对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110766-201520，含量为98.9％)。
色谱条件：色谱柱：DikmaEndevaorsilC182.1×100mm，1.8μm；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱0→13min，95％B→75％B，13→30min，75％B→20％B，30→35min，20％B，35→40min，95％B，流速为每分钟0.2ml；特征图谱的检测波长为270nm；含量测定芍药苷检测波长为230nm；迷迭香酸、丹酚酸B检测波长为288nm；藁本内酯检测波长为321nm；隐丹参酮、丹参酮IIA检测波长为270nm；柱温为30℃。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于10000。
对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品17.57mg、迷迭香酸对照品96.16mg、丹酚酸B对照品93.80mg、藁本内酯对照品34.26mg、隐丹参酮对照品18.67mg、丹参酮IIA对照品24.26mg(精密至0.1mg)，分别置于100mL量瓶中，加甲醇定容至100ml，制成对照品浓溶液。分别精密量取对照品浓溶液各3mL，置于50mL量瓶中，加甲醇定容至50mL，制成每1mL含芍药苷10.162μg、迷迭香酸56.888μg、丹酚酸B52.734μg、藁本内酯20.556μg、隐丹参酮11.202μg、丹参酮IIA14.396μg的混合溶液作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：取精制冠心片样品10片，除去包衣，精密称定(精密至0.1mg)，研细，精密称定粉末0.3g(精密至0.1mg)，精密加入80％甲醇10mL，超声处理(功率300W，频率40KHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，制成供试品溶液。
阴性样品溶液的制备：按《中国药典》2015年版一部收载的精制冠心片处方比例及工艺制备分别缺少丹参、赤芍、川芎、红花的4种阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备4种阴性样品溶液。
特征图谱的构建：首先取①芍药苷、迷迭香酸、丹酚酸B、藁本内酯、隐丹参酮、丹参酮IIA对照品；②13批精制冠心片样品；③按《中国药典》2015年版一部收载的精制冠心片处方比例及工艺制备的分别缺少丹参、赤芍、川芎、红花的4种阴性样品，先后制备对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，按照设定的色谱条件进行测定，并以国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行计算，生成精制冠心片的特征图谱，其中选定共有特征峰为9个。
共有特征峰的标定：通过对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液的比较，得出供试品溶液图谱中9个共有特征峰的归属。见表1。
表1共有特征峰的归属
具体应用方法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各0.5μL，注入液相色谱仪中，按照设定的色谱条件进行测定，检测40分钟，选取记录的前35分钟的色谱图进行结果判定。
结果判定：供试品溶液特征图谱中应有9个特征峰，其中有6个峰应分别与相应的对照品峰保留时间相同，与丹酚酸B对照品相应的峰为S峰，计算特征峰1～9号与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。规定值为：0.61(1号峰)、0.92(2号峰)、0.94(3号峰)、1.00(4号峰)、1.11(5号峰)、1.48(6号峰)、1.60(7号峰)、1.73(8号峰)、1.90(9号峰)。如供试品溶液图谱不能完全满足上述判定条件，则可判定检测样品为不合格样品。
精密度试验精密吸取同一供试品溶液0.5μl，按上述色谱条件连续进样6次，测定共有特征峰9个，峰1～9号以4号峰(丹酚酸B峰)为参照峰，各特征峰相对保留时间的RSD(n＝6)均小于1.5％，表明仪器精密度良好。
重复性试验取同一批精制冠心片样品，按供试品溶液的制备方法平行制备6份供试品溶液，分别在上述色谱条件下进行测定，测定共有特征峰9个，峰1～9号以4号峰(丹酚酸B峰)为参照峰，各特征峰相对保留时间的RSD(n＝6)均小于1.5％，表明该方法重复性良好。
稳定性试验精密吸取同一供试品溶液0.5μl，按上述色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24h进样1次，测定特征峰9个，峰1～9号以4号峰(丹酚酸B峰)为参照峰，各特征峰相对保留时间的RSD(n＝6)均小于1.5％，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
相对保留时间的确定采用上述色谱条件分析6批次精制冠心片样品，峰1～9号以4号峰(丹酚酸B峰)为参照峰，各共有特征峰相对保留时间平均值(n＝6)分别为：0.61、0.92、0.94、1.00、1.11、1.48、1.60、1.73、1.90。RSD均为0％。允许范围按±5％计算，各色谱峰相对保留时间均在规定范围内。
线性关系考察：取对照品溶液，进样0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0μl，按上述色谱条件测定峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标,以进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，各成分在相应的范围内均呈良好的线性关系。测定结果见表2，各成分回归方程及相关系数见表3。
表2进样量与峰面积积分值
表3各成分回归方程及相关系数
精密度试验：精密吸取对照品溶液0.5μl，重复进样6次，测定峰面积积分值，测定结果见表4。测定结果表明，各成分精密度均良好，能够满足测定需要。
表4精密度测定结果
重复性试验：取精制冠心片成品10片，按照供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，测定含量，测定结果见表5。测定结果表明，此方法的重复性良好。
表5重复性测定结果
稳定性试验：取精制冠心片成品10片，按照供试品溶液制备方法制备1份供试品溶液，分别在0、1、2、4、8、12小时进样1次，测定峰面积积分值，测定结果见表6。测定结果表明，供试品溶液在12小时内稳定性良好。
表6稳定性测定结果
回收率试验：采用加样回收法，取精制冠心片成品10片，除去包衣，精密称定总重(精密至0.1mg)，研细，精密称定已知含量的供试品粉末0.15g(精密至0.1mg)，分别准确加入6种对照品，按照供试品溶液制备方法制备，并按含量测定方法进行测定，计算回收率，测定结果见表7。测定结果表明，各成分加样回收率均良好。
表7回收率测定结果
综上，本发明所建立的精制冠心片的特征图谱可以较为全面的反映复方制剂中复杂的化学成分，并采用高效液相色谱-紫外检测法一次性高效检测中成药精制冠心片中的6种成分含量，因此具有操作简便，精密度好，重复性高的特点，有望成为精制冠心片中成药质量控制的标准方法，而可以更全面、更有效地控制和监查中成药精制冠心片的质量。

Claims (6)

1.一种精制冠心片特征图谱的构建方法，其特征是包括以下步骤：
(1)首先取①芍药苷，迷迭香酸，丹酚酸B，藁本内酯，隐丹参酮，丹参酮IIA对照品，②13批精制冠心片样品，③按《中国药典》2015年版一部收载的精制冠心片处方比例及工艺制备的分别缺少丹参，赤芍，川芎，红花的4种阴性样品，即先后制备对照品溶液，供试品溶液和阴性样品溶液，分别精密吸取对照品溶液，供试品溶液和阴性样品溶液各0.5μL，注入液相色谱仪中，按照设定的色谱条件进行测定，检测40分钟，选取记录的前35分钟的色谱图，并以国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统进行计算后即生成精制冠心片的特征图谱；
(2)上述对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品17.57mg，迷迭香酸对照品96.16mg，丹酚酸B对照品93.80mg，藁本内酯对照品34.26mg，隐丹参酮对照品18.67mg，丹参酮IIA对照品24.26mg，分别置于100mL量瓶中，加甲醇定容至100ml，制成对照品浓溶液，分别精密量取对照品浓溶液各3mL，置于50mL量瓶中，加甲醇定容至50mL，制成每1mL含芍药苷10.162μg，迷迭香酸56.888μg，丹酚酸B52.734μg，藁本内酯20.556μg，隐丹参酮11.202μg，丹参酮IIA14.396μg的混合溶液作为对照品溶液；
(3)上述供试品溶液的制备：取精制冠心片样品10片，除去包衣，精密称定，研细，精密称定粉末0.3g，加入80％甲醇10mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，制成供试品溶液；
(4)上述阴性样品溶液的制备：按《中国药典》2015年版一部收载的精制冠心片处方比例及工艺制备分别缺少丹参，赤芍，川芎，红花的4种阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备4种阴性样品溶液；
其中的共有特征峰的标定是通过对照品溶液，供试品溶液和阴性样品溶液的比较，得出供试品溶液图谱中9个共有特征峰的归属，1号峰为芍药苷峰，属于赤芍；2号峰为迷迭香酸峰，属于丹参，3号峰为未知成分峰，属于川芎，4号峰为丹酚酸B峰，属于丹参，5号峰为未知成分峰，属于红花；6号峰为未知成分峰，属于川芎，7号峰为藁本内酯峰，属于川芎，8号峰为隐丹参酮峰，属于丹参，9号峰为丹参酮ⅡA峰，属于丹参。
2.如权利要求1所述的精制冠心片特征图谱的构建方法，其特征是上述高效液相色谱仪的设定条件：色谱柱：DikmaEndevaorsilC182.1×100mm，1.8μm；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱0→13min，95％B→75％B，13→30min，75％B→20％B，30→35min，20％B，35→40min，95％B，流速为每分钟0.2ml；柱温为30℃，检测波长为270nm；其中理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于10000。
3.如权利要求1所述的精制冠心片特征图谱的构建方法，其特征是上述的超声处理条件为功率300W，频率40KHz。
4.权利要求1构建的精制冠心片特征图谱应用于精制冠心片的真伪鉴别和质量优劣的判定。
5.权利要求4所述的应用方法：只要分别精密吸取对照品溶液，供试品溶液各0.5μL，注入液相色谱仪中，按照上述设定的色谱条件进行测定，检测40分钟，选取记录的前35分钟的色谱图即可进行判定；
结果判定如下：供试品溶液图谱中应有9个特征峰，其中有6个峰应分别与相应的对照品峰保留时间相同，与丹酚酸B对照品相应的峰为S峰，计算特征峰1～9号与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％之内，规定值为：0.61，0.92，0.94，1.00，1.11，1.48，1.60，1.73，1.90，如供试品溶液图谱完全满足上述判定条件，则可判定检测样品为合格样品；否则可判定检测样品为不合格样品。
6.精制冠心片6种成分含量的测定方法：其特征是分别精密吸取上述的对照品溶液、供试品溶液各0.5μL，注入液相色谱仪中，按照设定的色谱条件进行测定，用已有的外标法直接计算出精制冠心片中6种成分的含量：含量测定芍药苷检测波长为230nm；迷迭香酸、丹酚酸B检测波长为288nm；藁本内酯检测波长为321nm；隐丹参酮、丹参酮IIA检测波长为270nm。
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