CN104777253A - 一种冠心丹参胶囊指纹图谱的建立方法及其指纹图谱 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种冠心丹参胶囊HPLC指纹图谱的建立方法，该方法包括供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、色谱条件的确定、供试品溶液的测定及HPLC标准指纹图谱的制作。本发明同时公开了由该方法得到的冠心丹参胶囊HPLC标准指纹图谱，该指纹图谱有11个共有峰，其相对保留时间t_R依次分别为0.206、0.370、0.894、0.924、1.000、1.070、1.716、1.892、2.101、2.148、2.422。本发明方法操作简便、稳定性高、重现性好，所得图谱特征峰多，通过标准指纹图谱共有峰的比较，可对冠心丹参胶囊的质量进行全面评价，有利于稳定产品质量，确保临床用药的安全性、有效性。

Description

一种冠心丹参胶囊指纹图谱的建立方法及其指纹图谱

技术领域

本发明涉及一种冠心丹参胶囊指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，属于中药分析领域。

背景技术

冠心丹参胶囊由丹参、三七、降香油组成,具有活血化瘀、理气止痛等功效,临床主要用于治疗气滞血瘀所致的胸痹心痛。冠心丹参胶囊用于气滞血瘀型冠心病所致的胸闷、胸痛、心悸气短。对垂体后叶素引起的大鼠心电图缺血性改变有一定的作用,可降低血清磷酸肌酸和乳酸脱氢酶,减少心肌组织中丙二醛的生成,保护心肌组织超氧化物歧化酶的活性,增强注射异丙肾上腺素小鼠耐缺氧的能力。中国药典(2010年版)以丹参酮ⅡA为检测指标,对该药进行定量控制。然而,丹参中水溶性物质对心脑血管疾病也具有良好的效果,如丹参素能明显扩张冠状动脉使其血流量显著增加；原儿茶醛具有扩张动脉、降低心肌耗氧量、抑制血小板聚集等作用,酚酸成分具有很强的抗脂质过氧化和清除自由基等作用。因此,丹参水溶性物质含量的高低也将影响冠心丹参胶囊的疗效,以上多种成分同时定量控制能更好地表征冠心丹参胶囊的质量。

近年来，关于冠心丹参制剂质量控制方法的报道较多,主要有薄层色谱鉴别、分光光度法、液相色谱-紫外分光光度法(HPLC-UV)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)法等。魏惠珍等在《HPLC同时测定冠心丹参胶囊中丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B和丹参酮A的含量》一文中建立了一种同时测定丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、丹参酮ⅡA4种指标成分的含量测定方法,可用于冠心丹参胶囊的质量控制和治疗药物监测。黄喜茹等在《冠心丹参制剂的质量控制方法研究》中建立反相高效液相色谱法同时测定冠心丹参制剂中3种丹参脂溶性成分隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的含量。刘亚东等在《HPLC法测定冠心丹参胶囊中隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA含量》建立了高效液相色谱法同时测定冠心丹参胶囊中隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA含量的方法，方法简便快捷、准确、重现性好，可用于该制剂的质量控制。虽然目前对其质量标准与药理临床研究较多,但其广泛而显著的药理作用的物质基础还有待进一步深入研究,其质量控制方法也需要更精细更全面的更全面的控制方法研究。

中药指纹图谱是指通过现代的分析检测方法对中药复杂的物质体系进行分析，并尽可能全面地获得中药中多个化学成分的化学特征图谱，并通过特征峰的有无及各峰之间的强度比来对中药中化学成分进行定性和定量分析，用于中药的质量控制和新药研发的物质基础的信息表征手段和方法；中药指纹图谱是建立在对中药中化学成分进行系统全面研究的基础上的一种多方面的，可量化的鉴定手段，具有宏观、整体评价和模糊分析等特点，特别适合于中药复杂体系的整体研究。中药指纹图谱是目前已经成为一种能被国内外学者广泛接受的质量控制模式，日本、美国FDA、世界卫生组织等都允许使用指纹图谱作为单味药材提取物的质量评价方法，而在国内中药的指纹图谱也成为中药质量评价的研究热点。HPLC指纹图谱具有分离效果好、检测灵敏度高、分析速度快、结果重现性好等优点，是中药指纹图谱研究应用较多的方法之一。

发明内容

本发明的目的是针对现有冠心丹参胶囊质量控制方法的不足，提供一种HPLC指纹图谱的建立方法及用该方法所得的HPLC标准指纹图谱。其特点是将冠心丹参胶囊制备成供试品溶液，经过HPLC分离检测，获得冠心丹参胶囊HPLC标准指纹图谱。本研究采用高效液相色谱法对冠心丹参胶囊指纹图谱进行了研究，并应用“中药指纹图谱相似度评价软件”对不同批号的冠心丹参胶囊指纹图谱相似度进行评价，结果显示，采用本发明方法所建立的冠心丹参胶囊指纹图谱具有分离效果好，检测灵敏度高，结果重现性好的优点，可为冠心丹参胶囊的真伪鉴别和内在质量控制提供可靠依据。

一种冠心丹参胶囊指纹图谱的建立方法，其特征是采用HPLC-UV法，包括如下步骤:

(1)供试品溶液的制备：精密称取冠心丹参胶囊内容物1～20g，加70％甲醇25～500ml，超声20～40min溶解后，冷却后取少量上清液过0.45μm微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密称取丹参素钠、迷迭香酸、丹酚酸B、原儿茶醛、二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA适量，分别用50％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇、甲醇、甲醇、甲醇、甲醇溶解成浓度分别为200μg/ml的溶液，再吸取对照品溶液各适量，用甲醇稀释成浓度分别为50μg/ml的对照品溶液；

(3)色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，250×4.6mm；流动相为0.1％磷酸水溶液-乙腈；采用梯度洗脱方式0min→40min→42min→60min→65min→95min，甲醇10％→40％→60％→70％→95％→95％；流速0.8ml/min；柱温25～35℃；检测波长：270nm；进样量为10～20μl；

(4)供试品溶液的测定：精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，得到冠心丹参胶囊的HPLC-UV图谱；

(5)HPLC标准指纹图谱的制作按照上述方法对10批供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，记录色谱图，得到10批冠心丹参胶囊的图谱；并进行分析比较，得到由测定所得的指纹图谱中有11个共有峰，这些共有特征峰构成了冠心丹参胶囊的指纹特征，图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算，相似度大于0.9；是冠心丹参胶囊标准指纹图谱，所述的冠心丹参胶囊标准指纹图谱如附图1所示。

其中，以5号峰即丹酚酸B为参照物峰，各峰的相对保留时间为：峰1丹参素钠:相对保留时间0.206；峰2原儿茶醛:相对保留时间0.370；峰3迷迭香酸：相对保留时间0.894；峰4：相对保留时间0.924；峰5丹酚酸B：相对保留时间1.000；峰6:相对保留时间1.070；峰7:相对保留时间1.716；峰8二氢丹参酮:相对保留时间1.892；峰9隐丹参酮：相对保留时间2.101；峰10丹参酮I:相对保留时间2.148；峰11丹参酮IIA:相对保留时间2.422。

优选地，所述的冠心丹参胶囊标准指纹图谱中，以5号峰即丹酚酸B为参照物峰，各峰的相对保留时间和相对峰面积分别为：

峰1丹参素钠:相对保留时间0.206，相对峰面积0.104；

峰2原儿茶醛:相对保留时间0.370，相对峰面积0.097；

峰3迷迭香酸：相对保留时间0.894，相对峰面积0.090；

峰4：相对保留时间0.924，相对峰面积0.080；

峰5丹酚酸B：相对保留时间1.000，相对峰面积1.000；

峰6:相对保留时间1.070，相对峰面积0.179；

峰7:相对保留时间1.716，相对峰面积0.017；

峰8二氢丹参酮:相对保留时间1.892，相对峰面积0.047；

峰9隐丹参酮：相对保留时间2.101，相对峰面积0.239；

峰10丹参酮I:相对保留时间2.148，相对峰面积0.145；

峰11丹参酮IIA:相对保留时间2.422，相对峰面积0.602；

实验例1 HPLC-UV紫外检测波长的选择

冠心丹参胶囊的组方有三七、丹参、降香三味药材，各药味的化学成分复杂，各成分的色谱行为及仪器的响应值也是迥乎不同，因此应在整体全面的原则下对测定波长进行选择。取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，采用二极管阵列检测器筛选波长，对样品进行190-400nm全波长扫描，结果见图2样品三维紫外吸收图和图3样品的等高线图。由样品的三维紫外吸收图和等高线图可见，样品中主要成分在200nm～360nm的紫外吸收较强，分别比较了190nm、203nm、254nm、270nm、330nm、360nm的样品紫外吸收光谱图，结果270nm为检测波长检出的样品信息量较多，其分离度、峰形和柱效及出峰的稳定性较为满意，故选择270nm为检测波长。

实验例2 供试品溶液的制备方法的确定

试验的研究过程中，采用水、甲醇水溶液(甲醇浓度分别为30％、50％、70％、100％)、分别对冠心丹参胶囊进行了提取。使用不同溶剂提取下冠心丹参胶囊的指纹图谱如附图4所示，。其中自上而下所对应的溶剂依次为水提，甲醇提，70％甲醇提，50％甲醇提，30％甲醇提。从色谱图上可以看出，不同溶剂提取溶液的液相图谱差异较大，其中水提取物中提取的物质很少；70％甲醇提取物中提取出的成分较多，而且各色谱峰的响应值适中，因而选用70％甲醇作提取溶剂。

在试验阶段，进行了提取方法的考察，分别进行了超声提取30min、超声提取1h、超声提取1.5h、超声提取2h；回流提取30min、回流提取1h、回流提取1.5h、回流提取2h作提取提取冠心丹参胶囊。使用不同提取方式及提取时间提取下冠心丹参胶囊的指纹图谱如附图5所示。其中自上而下所对应的提取方式和提取时间分别为：回流2h,超声2h，回流1.5h，超声1.5h，回流1h,超声1h，超声30min，回流30min。结果表明，超声提取30min的提取效果较好，色谱图信息量最多，成分含量略高。所以选用超声提取30min供试品溶液的制备方法。

据此，将供试品溶液的制备方法确定为：取冠心丹参胶囊约1g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，并精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声提取30min，放冷，补重，摇匀，滤过，过0.45μm的微孔滤膜，作为供试品溶液。

本发明与现有技术相比，其显著优点是：

(1)本发明特征峰的选择更注重药材指标性化学成分与制剂药效学研究结果的关联性和指纹图谱的整体面貌特征，避免了因只测定其中一个或两个化学成分而判断制剂整体质量的片面性，减少人为处理产品质量达标的可能性，为完整、准确评价制剂的质量提供了新的控制标准，从而能更好的控制制剂的质量；

(2)本发明基于指纹图谱用多指标成分(包括8个已知成分)控制产品质量，保证了产品质量的长期稳定性，疗效的安全性和可靠性；

(3)本发明具有测定方法操作简便、精密度高、稳定性好、重现性好、易于掌握的特点；

(4)本发明提供了一种冠心丹参胶囊的检测方法，在相同测定条件下所获得的冠心丹参胶囊成品的特征指纹图谱的特征指纹图谱重合性好，测定重复性好，达到更科学的控制制剂的目的。

附图说明

图1本发明供试品冠心丹参胶囊1g-20g的在紫外吸收270nm处的标准特征指纹图谱。

图中从左至右分别标出了其共有特征峰1至11号,其中图1的图示中峰1为丹参素钠，峰2为原儿茶醛，峰3为迷迭香酸，峰4，峰5为丹酚酸B，峰6，峰7，峰8为二氢丹参酮，峰9为隐丹参酮，峰10为丹参酮I，峰11为丹参酮IIA。

图2本发明供试品冠心丹参胶囊三维紫外吸收图。

图3本发明供试品冠心丹参胶囊紫外吸收等高线图

图4使用不同溶剂提取下冠心丹参胶囊在270nm下的指纹图谱，其中自上而下所对应的溶剂依次为水提，甲醇提，70％甲醇提，50％甲醇提，30％甲醇提。

图5使用不同提取方式及提取时间提取下冠心丹参胶囊在270nm下的指纹图谱，其中自上而下所对应的提取方式和提取时间分别为：回流2h,超声2h，回流1.5h，超声1.5h，回流1h,超声1h，超声30min，回流30min。

图6为冠心丹参胶囊溶液在270nm处的重复性试验指纹图谱。

图7为冠心丹参胶囊溶液在270nm处的稳定性试验指纹图谱。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但本领域技术人员应该知晓，所述实施例并不以任何方式限定本发明的保护范围。

实施例1 一种冠心丹参胶囊指纹图谱的建立方法及其指纹图谱

一种冠心丹参胶囊指纹图谱的建立方法，其特征是采用HPLC-UV法，包括如下步骤:

(1)供试品溶液的制备：精密称取冠心丹参胶囊内容物1g，加70％甲醇25ml，超声20min溶解后，冷却后取少量上清液过0.45μm微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密称取丹参素钠、迷迭香酸、丹酚酸B、原儿茶醛、二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA适量，分别用50％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇、甲醇、甲醇、甲醇、甲醇溶解成浓度分别为200μg/ml的溶液，再吸取对照品溶液各适量，用甲醇稀释成浓度分别为50μg/ml的对照品溶液；

(3)色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，250×4.6mm；流动相为0.1％磷酸水溶液-乙腈；采用用梯度洗脱方式0min→40min→42min→60min→65min→95min，甲醇10％→40％→60％→70％→95％→95％；流速0.8ml/min；柱温30℃。；检测波长：270nm；进样量为10μl；；

(4)供试品溶液的测定：精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，得到冠心丹参胶囊的HPLC-UV图谱；

(5)HPLC标准指纹图谱的制作按照上述方法对10批供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，记录色谱图，得到10批冠心丹参胶囊的图谱；并进行分析比较，得到由测定所得的指纹图谱中有11个共有峰，其中，以5号峰即丹酚酸B为参照物峰，分别为：

峰1丹参素钠:相对保留时间0.205，相对峰面积0.105；

峰2原儿茶醛:相对保留时间0.371，相对峰面积0.098；

峰3迷迭香酸：相对保留时间0.893，相对峰面积0.087；

峰4：相对保留时间0.922，相对峰面积0.087；

峰5丹酚酸B：相对保留时间1.000，相对峰面积1.000；

峰6:相对保留时间1.068，相对峰面积0.168；

峰7:相对保留时间1.705，相对峰面积0.016；

峰8二氢丹参酮:相对保留时间1.877，相对峰面积0.047；

峰9隐丹参酮：相对保留时间2.093，相对峰面积0.238；

峰10丹参酮I:相对保留时间2.135，相对峰面积0.145；

峰11丹参酮IIA:相对保留时间2.410，相对峰面积0.602；

这些共有特征峰构成了冠心丹参胶囊指纹特征，图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算，相似度大于0.9；是冠心丹参胶囊标准指纹图谱。

实施例2 一种冠心丹参胶囊指纹图谱的建立方法及其指纹图谱

一种冠心丹参胶囊指纹图谱的建立方法，其特征是采用HPLC-UV法，包括如下步骤:

(1)供试品溶液的制备：精密称取冠心丹参胶囊内容物10g，加70％甲醇250ml，超声30min溶解后，冷却后取少量上清液过0.45μm微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；

除供试品溶液的制备不同外,其他步骤与实施例1相同，按照所述方法对10批供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，记录色谱图，得到10批冠心丹参胶囊的图谱；并进行分析比较，得到由测定所得的指纹图谱中有11个共有峰，其中，以5号峰即丹酚酸B为参照物峰，分别为：

峰1丹参素钠:相对保留时间0.206，相对峰面积0.104；

峰2原儿茶醛:相对保留时间0.370，相对峰面积0.097；

峰3迷迭香酸：相对保留时间0.894，相对峰面积0.090；

峰4：相对保留时间0.924，相对峰面积0.080；

峰5丹酚酸B：相对保留时间1.000，相对峰面积1.000；

峰6:相对保留时间1.070，相对峰面积0.179；

峰7:相对保留时间1.716，相对峰面积0.017；

峰8二氢丹参酮:相对保留时间1.892，相对峰面积0.047；

峰9隐丹参酮：相对保留时间2.101，相对峰面积0.239；

峰10丹参酮I:相对保留时间2.148，相对峰面积0.145；

峰11丹参酮IIA:相对保留时间2.422，相对峰面积0.602；

这些共有特征峰构成了冠心丹参胶囊的指纹特征，图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算，相似度大于0.9；

实施例3 一种冠心丹参胶囊指纹图谱的建立方法及其指纹图谱

一种冠心丹参胶囊指纹图谱的建立方法，其特征是采用HPLC-UV法，包括如下步骤:

(1)供试品溶液的制备：精密称取冠心丹参胶囊内容物20g，加70％甲醇500ml，超声40min溶解后，冷却后取少量上清液过0.45μm微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；

除供试品溶液的制备不同外,其他步骤与实施例1相同，按照所述方法对10批供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，记录色谱图，得到10批冠心丹参胶囊的图谱；并进行分析比较，得到由测定所得的指纹图谱中有11个共有峰，其中，以5号峰即丹酚酸B为参照物峰，分别为：

峰1丹参素钠:相对保留时间0.206，相对峰面积0.105；

峰2原儿茶醛:相对保留时间0.371，相对峰面积0.097；

峰3迷迭香酸：相对保留时间0.894，相对峰面积0.091；

峰4：相对保留时间0.924，相对峰面积0.080；

峰5丹酚酸B：相对保留时间1.000，相对峰面积1.000；

峰6:相对保留时间1.071，相对峰面积0.178；

峰7:相对保留时间1.716，相对峰面积0.017；

峰8二氢丹参酮:相对保留时间1.892，相对峰面积0.046；

峰9隐丹参酮：相对保留时间2.102，相对峰面积0.238；

峰10丹参酮I:相对保留时间2.147，相对峰面积0.144；

峰11丹参酮IIA:相对保留时间2.423，相对峰面积0.601；

这些共有特征峰构成了冠心丹参胶囊的指纹特征，图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算，相似度大于0.9；

实施例4 本发明冠心丹参胶囊指纹图谱的建立方法及其指纹图谱方法学考察

4.1重复性试验

取同一批号样品(批号：120705)的供试品6份，按照拟定的提取方法制备样品溶液，各取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，经指纹图谱相似度软件计算，测得的色谱图谱在270nm波长处的相似度分别为1、0.999、1、1、1、1(以yp-3-01为参照，图6所示)，表明测定方法的重现性好。

4.2稳定性试验

取同一份冠心丹参胶囊(批号：120705)的供试品，分别在0h、3h、6h、9h、12h、24h共6个时间点进行检测，6次测定结果经指纹图谱相似度软件计算，测得的色谱指纹图谱的相似度在270nm波长处为0.999、1、1、1、0.999、0.999(如图7所示)满足相似度不小于0.95；表明在24h内供试品溶液的成分是稳定的。

Claims (4)

1.一种冠心丹参胶囊标准指纹图谱的建立方法，其特征在于，其是采用HPLC-UV法，包括如下步骤:

(1)供试品溶液的制备：精密称取冠心丹参胶囊内容物1～20g，加70％甲醇25～500ml，超声20～40min溶解后，冷却后取少量上清液过0.45μm微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密称取丹参素钠、迷迭香酸、丹酚酸B、原儿茶醛、二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA适量，分别用50％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇、甲醇、甲醇、甲醇、甲醇溶解成浓度分别为200μg/ml的溶液，再吸取对照品溶液各适量，用甲醇稀释成浓度分别为50μg/ml的对照品溶液；

(3)色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，250×4.6mm；流动相为0.1％磷酸水溶液-乙腈；采用用梯度洗脱方式0min→40min→42min→60min→65min→95min，甲醇10％→40％→60％→70％→95％→95％；流速0.8ml/min；柱温25～35℃；检测波长：270nm；进样量为10～20μl；

(4)供试品溶液的测定：精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，得到冠心丹参胶囊的HPLC-UV图谱；

(5)HPLC标准指纹图谱的制作按照上述方法对10批供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，记录色谱图，得到10批冠心丹参胶囊的图谱，并进行分析比较，得到由测定所得的指纹图谱中有11个共有峰，这些共有特征峰构成了冠心丹参胶囊的指纹特征，图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算，相似度大于0.9，即可得到冠心丹参胶囊标准指纹图谱。

2.如权利要求1所述的冠心丹参胶囊标准指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述的冠心丹参胶囊标准指纹图谱如附图1所示，其中，以5号峰即丹酚酸B为参照物峰，各峰的相对保留时间为：峰1丹参素钠:相对保留时间0.206；峰2原儿茶醛:相对保留时间0.370；峰3迷迭香酸：相对保留时间0.894；峰4：相对保留时间0.924；峰5丹酚酸B：相对保留时间1.000；峰6:相对保留时间1.070；峰7:相对保留时间1.716；峰8二氢丹参酮:相对保留时间1.892；峰9隐丹参酮：相对保留时间2.101；峰10丹参酮I:相对保留时间2.148；峰11丹参酮IIA:相对保留时间2.422。

3.如权利要求1所述的冠心丹参胶囊标准指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述的冠心丹参胶囊标准指纹图谱如附图1所示，其中，以5号峰即丹酚酸B为参照物峰，分别为：

峰1丹参素钠:相对保留时间0.206，相对峰面积0.104；

峰2原儿茶醛:相对保留时间0.370，相对峰面积0.097；

峰3迷迭香酸：相对保留时间0.894，相对峰面积0.090；

峰4：相对保留时间0.924，相对峰面积0.080；

峰5丹酚酸B：相对保留时间1.000，相对峰面积1.000；

峰6:相对保留时间1.070，相对峰面积0.179；

峰7:相对保留时间1.716，相对峰面积0.017；

峰8二氢丹参酮:相对保留时间1.892，相对峰面积0.047；

峰9隐丹参酮：相对保留时间2.101，相对峰面积0.239；

峰10丹参酮I:相对保留时间2.148，相对峰面积0.145；

峰11丹参酮IIA:相对保留时间2.422，相对峰面积0.602。

4.一种按照权利要求1-3任一所述的方法得到的冠心丹参胶囊标准指纹图谱。