CN117783340A - 一种煨木香及其制剂的hplc特征图谱构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种煨木香及其制剂的HPLC特征图谱构建方法，包括：A)将供试品原料采用水煎煮后，再用溶剂提取，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到煨木香及其制剂的HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％醋酸水溶液，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用乙腈‑0.1％醋酸溶液为流动相进行梯度洗脱，以紫丁香苷、木香烃内酯、去氢木香内酯为参照物，建立了区别煨木香、麸煨木香、木香及其制剂的HPLC特征图谱，充分展示煨木香的化学成分特征，全面地反映出煨木香的质量信息，从而能够达到全面、有效地控制煨木香及其相关制剂的质量保证了其化学组成稳定性和使用安全性。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析检测技术领域，尤其是涉及一种煨木香及其制剂的HPLC特征图谱构建方法。
背景技术
木香为菊科植物木香Aucklandia lappa Decne.的干燥根。秋、冬二季采挖，除去泥沙和须根，切段，大的再纵剖成瓣，干燥后撞去粗皮。煨木香为木香的加工炮制品。煨木香味辛、苦，温。归脾、胃、大肠、三焦、胆经。具有行气止痛，健脾消食。用于胸胁、脘腹胀痛，泻痢后重，食积不消，不思饮食。煨木香实肠止泻。用于泄泻腹痛。其化学成分类型较多，主要为萜类，还有生物碱、蒽醌、黄酮等其他类，萜类尤其倍半萜类成分受重点关注，为其主要活性成分。现代药理学研究表明，木香除具有解除平滑肌痉挛、降压、抗菌等作用，在抗癌、免疫、抗炎等方面也具有一定的活性。
《中国药典》2020版中木香的炮制品收录了去除杂质的木香和纸煨品煨木香，文献报道对木香的炮制品多关注于麦麸煨品的麸煨木香，而对纸煨品的煨木香及其相关制剂的质量控制方法进行研究较少，且并未对其特征图谱进行深入研究。
因此，构建一种高效液相特征图谱方法，全面反映煨木香的质量水平，并对煨木香与麸煨木香和木香的鉴别提供依据是非常必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种煨木香及其制剂的HPLC特征图谱，本发明构建的特征图谱方法稳定，可靠，可以对煨木香与麸煨木香和木香的质量进行控制，同时可以对上述药材进行鉴别。
本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示:单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A,B可以是单数或者复数。
本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
本发明公开了一种煨木香的高效液相特征图谱检测方法的构建及应用，该方法运用于煨木香及其相关制剂，指认了9个指标成分，确认了14个共有特征峰，并对其相对保留时间和相对峰面积进行了研究，规定其相对保留时间和相对峰面积，建立对照特征图谱，充分展示煨木香的化学成分特征，全面地反映出煨木香的质量信息，从而能够达到全面、有效地控制煨木香及其相关制剂的质量保证了其化学组成稳定性和使用安全性。
该方法运用于煨木香、麸煨木香及木香的鉴别，指认了9个指标成分，确认了14个共有特征峰，在进行不同炮制品制剂鉴别时，拥有14个共有特征峰，指认了9个指标成分，峰1相对峰面积不大于0.12，峰12相对峰面积不大于0.20的为煨木香。峰1相对峰面积不大于0.12，峰12相对峰面积不小于0.20的为木香。峰1相对峰面积不小于0.12，峰12相对峰面积不小于0.20的为麸煨木香。
本发明提供了一种煨木香及其制剂的HPLC特征图谱构建方法，包括：
A)将供试品原料采用水煎煮后，再用溶剂提取，得到待测液；
B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到煨木香及其制剂的HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％醋酸水溶液，梯度洗脱。
本发明提供的煨木香及其制剂的HPLC特征图谱构建方法首先将供试品原料采用水煎煮。本发明所述将供试品原料和水的质量体积比为(0.3～1)g：50mL；
采用水煎煮后，再用溶剂提取，得到待测液。
所述溶剂优选为70％甲醇。
本发明采用上述提取溶剂色谱峰信息量大，色谱图峰形较好
本发明所述供试品原料包括煨木香饮片、煨木香颗粒、煨木香药材中的一种或几种。本发明对其不进行限定，上述原料皆可通过本发明的方法进行质量控制和定性检测。
本发明所述提取为超声提取；所述超声的功率为600W，频率40kHz；超声时间为20～40min；更优选为30min。
本发明超声提取时间为20～40min；优选为30min，在不同提取时间条件下，色谱图效果基本一致。为保障提取充分，提取时间为30min时，色谱图峰形与分离度较好。
本发明其中一个具体实施例中，煨木香饮片供试品的制备可以为：
取煨木香饮片，加水，煎煮30分钟，取出，离心，取上清液，蒸干，残渣加70％甲醇10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
本发明还包括制备参照物溶液：分别取紫丁香苷、木香烃内酯、去氢木香内酯对照品，采用70％甲醇溶解，得到参照物溶液；
将所述参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对煨木香及其制剂HPLC特征图谱的成分进行定性。所述参照物溶液的浓度具体为：紫丁香苷0.1mg/mL，木香烃内酯为0.1mg/mL，去氢木香内酯为0.1mg/mL。
上述溶剂为70％的甲醇。70％甲醇作为提取溶剂时色谱峰信息量大且各色谱峰分离效果好。
流动相A为乙腈，流动相B为0.1％醋酸水溶液，梯度洗脱。
本发明所述梯度洗脱具体为：
0～10min，A相：5％～8％、B相：95～92％；
10～20min，A相：8％～15％、B相：92％～85％；
20～25min，A相：15％～19％、B相：85％～81％；
25～35min，A相：19％～23％、B相：81％～77％；
35～42min，A相：23％、B相：77％；
42～55min，A相：23％～35％、B相：77％～65％；
55～60min，A相：35％～65％、B相：65％～35％；
60～70min，A相：65％～75％、B相：35％～25％；
70～75min，A相：75％～100％、B相：25％～0％。
本发明在上述洗脱梯度下基线分离好，各个峰分离度好，基线平稳。
本发明色谱柱为C18柱；所述色谱柱为规格是250×4.6mm 5μm；
本发明人发现，C18上述规格的色谱柱都能满足本发明的检测要求。
特别优选的，可以选择Agilent 5TC-C18色谱柱。
本发明柱温25℃。理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于3000。
本发明在柱温为25℃时，色谱图峰形较为对称，分离度较好，保留时间较适宜。
本发明所述流动相流速为1.2mL/min；
本发明发现流速1.2ml/min下各色谱峰分离度较好，峰形较好，峰型对称且保留时间合适，作为最优选方案。
本发明检测波长为254nm；
本发明人发现，在254nm处色谱信息丰富，各成分均有较好吸收，响应值适中，色谱峰信息量较大，各峰分离度较好，基线平稳。
本发明进样量为10μL。
本发明还采用对照品溶液和木香对照药材溶液对煨木香特征图谱进行指认：其中峰2为新绿原酸；峰3为紫丁香苷；峰4为绿原酸；峰5为隐绿原酸；峰8为异绿原酸A；峰9为异绿原酸B；峰10为异绿原酸C；峰12为木香烃内酯；峰13为去氢木香内酯；
其中，所述对照品溶液的制备具体为：分别取紫丁香苷、木香烃内酯、去氢木香内酯、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品，采用70％甲醇溶解，得到对照品溶液；所述参照物溶液的浓度具体为：紫丁香苷0.1mg/mL，木香烃内酯为0.1mg/mL，去氢木香内酯为0.1mg/mL，绿原酸为0.1mg/mL，新绿原酸0.1mg/mL，隐绿原酸为0.1mg/mL，异绿原酸A为0.1mg/mL，异绿原酸B为0.1mg/mL，异绿原酸C为0.1mg/mL。
本发明指认了上述9个特征峰。
采用木香对照药材加水煎煮后，再采用70％甲醇提取，得到对照药材参照物溶液。
本发明采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对煨木香及其制剂的HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由14个特征峰构成的HPLC标准特征图谱，其中峰3为紫丁香苷，峰12木香烃内酯，峰13为去氢木香内酯。在所述煨木香及其制剂的特征图谱中，以紫丁香苷为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±10％之内，所述规定值分别为：0.41(峰1)、0.77(峰2)、1.04(峰4)、1.11(峰5)、1.29(峰6)、1.83(峰7)、1.90(峰8)、1.93(峰9)、2.06(峰10)、2.89(峰11)、3.40(峰14)。
采用本发明所提供的方法能有效的监控不同批次煨木香的质量，使其质量稳定，方法具有精密度高、重现性好等特点，有利于全面监控产品的质量。
本发明还提供了一种煨木香、麸煨木香、木香及其制剂的特征图谱的鉴别方法，采用上述技术方案任一项所述的方法进行检测，分析检测结果；
煨木香相对峰面积规定：峰1不得大于0.12，峰12不得大于0.20；
木香相对峰面积规定：峰1不得大于0.12，峰12不得小于0.20；
麸煨木香相对峰面积规定：峰1不得小于0.12，峰12不得小于0.20。
本发明提供了一种煨木香及其制剂的HPLC特征图谱构建方法，包括：A)将供试品原料采用水煎煮后，再用溶剂提取，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到煨木香及其制剂的HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％醋酸水溶液，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用乙腈-0.1％醋酸溶液为流动相进行梯度洗脱，以紫丁香苷、木香烃内酯、去氢木香内酯为参照物，建立了区别煨木香、麸煨木香、木香及其制剂的HPLC特征图谱，充分展示煨木香的化学成分特征，全面地反映出煨木香的质量信息，从而能够达到全面、有效地控制煨木香及其相关制剂的质量保证了其化学组成稳定性和使用安全性。
(1)本发明建立了高效液相特征图谱方法用于煨木香饮片的检测。
(2)本发明建立了煨木香饮片的特征图谱，确认了14个共有特征峰，并对其相对保留时间和相对峰面积进行了研究，保证了其化学组成稳定性和使用安全性。指认了9个指标成分，克服了单一成分含量测定难以反映整体含量的缺陷，可以从整体上、宏观上控制煨木香及其相关制剂的内在质量，保证了药物的疗效，使其相关制剂得到了更为正规的质量控制。
(3)本发明建立了煨木香特征图谱可用于煨木香、麸煨木香及木香的鉴别，指认了9个指标成分，确认了14个共有特征峰，在进行不同炮制品鉴别时，拥有14个共有特征峰，指认了9个指标成分，峰1相对峰面积不大于0.12，峰12相对峰面积不大于0.20的为煨木香。峰1相对峰面积不大于0.12，峰12相对峰面积不小于0.20的为木香。峰1相对峰面积不小于0.12，峰12相对峰面积不小于0.20的为麸煨木香。
(4)本发明方法稳定性好、精密度高、重现性好、便捷且易于掌握。
附图说明
图1为煨木香紫外吸收3D光谱图；
图2为煨木香不同波长色谱图；
图3为柱温考察色谱图；
图4为流速考察结果图；
图5为进样量考察结果图；
图6为延迟性考察结果图；
图7为提取溶剂考察结果图；
图8为提取方式考察结果图；
图9为提取时间考察结果图；
图10为称样量考察结果图；
图11煨木香色谱峰指认图；
图12为不同色谱柱结果图；
图13为3批煨木香特征图谱验证图；
图14为对照特征图谱；
图15为对比例1结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种煨木香、麸煨木香、木香及其制剂的HPLC特征图谱构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种煨木香、麸煨木香、木香及其标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱构建方法进行详细描述。
高效液相色谱仪：安捷伦1260型高效液相色谱仪、岛津20AD型高效液相色谱仪、Waters e2695型高效液相色谱仪；
电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：：KQ-600DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
色谱柱：Agilent 5TC-C18 250×4.6mm
试剂：甲醇、乙腈、冰乙酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
试药
木香烃内酯(中国食品药品检定研究院，批号：111524-201911，含量以99.9％计)；
去氢木香内酯(中国食品药品检定研究院，批号：111525-201912，含量以99.5％计)；
紫丁香苷(中国食品药品检定研究院，批号：111574-202106，含量以94.3％计)；
异绿原酸A(中国食品药品检定研究院，批号：110885-201703，含量以99.7％计)；
异绿原酸B(中国食品药品检定研究院，批号：110885-201703，含量以99.7％计)；
异绿原酸C(中国食品药品检定研究院，批号：110885-201703，含量以99.7％计)；
绿原酸(中国食品药品检定研究院，批号：110753-202018，含量以96.1％计)；
新绿原酸(中国食品药品检定研究院，批号：110885-201703，含量以99.7％计)；
隐绿原酸(中国食品药品检定研究院，批号：110885-201703，含量以99.7％计)；
木香对照药材(中国食品药品检定研究院，批号120921-202010)；
煨木香饮片(四川新绿色药业科技发展有限公司，批号：ZWMX2201、ZWMX2202、ZWMX2203)；
木香饮片(四川新绿色药业科技发展有限公司，批号：MX2201、MX2202、MX2203)；
麸煨木香饮片(四川新绿色药业科技发展有限公司，批号：FWMX2201、FWMX2202、FWMX2203)。
炮制方法：煨木香：取未干燥的木香片，在铁丝匾中，用一层草纸，一层木香片，间隔平铺数层，置炉火旁或烘干室内，烘煨至木香中所含的挥发油渗至纸上，取出。
麸煨木香：取木香片与麸皮同置炒制容器内，用文火炒至微变色，放凉。每100kg木香品用麸皮50kg。
实施例1色谱条件筛选
1.1色谱条件
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm。理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于3000。
流动相梯度见表1。
表1
参照物溶液的制备取木香对照药材0.5g，加水50ml煎煮30分钟，取出，离心，取上清液，蒸干，残渣加70％甲醇10ml溶解，超声(功率600W，频率40kHz)处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取紫丁香苷对照品、木香烃内酯对照品、去氢木香内酯对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含紫丁香苷10μg、木香烃内酯3μg、去氢木香内酯40μg的混合溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取本品粉末(过四号筛)0.5g，加水50ml，煎煮30分钟，取出，离心，取上清液，蒸干，残渣加70％甲醇10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
1.2.1波长选择
在以上1.1色谱条件基础上，利用二极管阵列检测器对供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在225nm、240nm、254nm、270nm波长下的色谱图。见图1-2，其中图1为煨木香紫外吸收3D光谱图，图2为煨木香不同波长色谱图。结果表明，在检测波长为254nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为254nm。
1.2.2柱温考察
在以上1.1色谱条件基础上，分别对柱温为25℃、30℃、35℃、40℃时进行考察。见图3。图3为柱温考察色谱图。结果表明，当柱温为25℃时，色谱图峰形较为对称，分离度较好，故最终确定25℃作为煨木香特征图谱方法的柱温。
1.2.3流速考察
在以1.1色谱条件基础上，分别对流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时进行了考察，见图4。图4为流速考察结果图。结果表明，在流速为1.2ml/min时，色谱图峰形较好，分离度适中，故流速确定为1.2ml/min。
1.2.4进样量考察
在以上1.1色谱条件基础上，分别对进样量5μl、10μl、15μl时进行考察，见图5。图5为进样量考察结果图。结果表明，不同进样量色谱峰信息一致，为能清楚显示色谱信息，进样量确定为10μL。
1.2.5延迟性考察
在以上1.1色谱条件基础上，将梯度洗脱的泵结束时间延长至150分钟，结果见图6。图6为延迟性考察结果图。结果表明，样品在75min后基本无色谱峰，故样品检测时间定为75min。
综上所述，煨木香特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.2ml，柱温为25℃；检测波长为254nm。理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于3000。
1.3供试品溶液的制备
1.3.1提取溶剂考察
取煨木香粉末(过四号筛)0.5g，加水50ml煎煮30分钟，取出，离心，取上清液，蒸干，残渣分别加30％甲醇、70％甲醇、甲醇、30％乙醇、70％乙醇、乙醇10ml溶解，超声(功率600W，频率40kHz)处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得，见图7。图7为提取溶剂考察结果图。结果表明，提取溶剂中70％甲醇作为提取溶剂时色谱峰信息量大，色谱图峰形较好，故供试品提取溶剂确定为70％甲醇。
1.3.2提取方式考察
取煨木香粉末(过四号筛)0.5g，置锥形瓶中，加水50ml，分别超声提取、煎煮30分钟，取出，离心，取上清液，蒸干，残渣加70％甲醇10ml溶解，超声(功率600W，频率40kHz)处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得，见图8。见图8，图8为提取方式考察结果图。结果表明，对供试品分别进行超声提取与回流提取时效果一致。因超声提取操作更为简便，故供试品提取方法确定为超声提取。
1.3.3提取时间考察
取煨木香粉末(过四号筛)0.5g，加水50ml煎煮30分钟，取出，离心，取上清液，蒸干，残渣加70％甲醇10ml溶解，分别超声(功率600W，频率40kHz)处理20、30、40分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得，见图9。图9为提取时间考察结果图。
1.3.4称样量考察
取煨木香粉末(过四号筛)适量，分别取0.3g、0.5g、1g，加水50ml煎煮30分钟，取出，离心，取上清液，蒸干，残渣加70％甲醇10ml溶解，超声(功率600W，频率40kHz)处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得，见图10。图10为称样量考察结果图。结果表明，在称样量为0.5g时，特征图谱色谱峰面积适中。故供试品称样量确定为0.5g。
1.3.5最终确定供试品制备方法
特征图谱方法确定为：照高效液相色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.2ml，柱温为25℃；检测波长为254nm。理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于3000。
参照物溶液的制备取木香对照药材0.5g，加水50ml，煎煮30分钟，离心，取上清液，蒸干，残渣加70％甲醇10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取紫丁香苷对照品、木香烃内酯对照品、去氢木香内酯对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含紫丁香苷10μg、木香烃内酯3μg、去氢木香内酯40μg的混合溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取本品粉末(过四号筛)0.5g，加水50ml，煎煮30分钟，取出，离心，取上清液，蒸干，残渣加70％甲醇10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例2方法学考察
2.5.1色谱峰指认
供试品溶液的制备：按以上实施例1拟定的实验条件，制备煨木香供试品溶液。
参照物溶液的制备：分别取木香烃内酯、去氢木香内酯、紫丁香苷、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品适量，精密称定，分别加70％甲醇制成每1ml各含0.1mg的溶液，作为对照品参照物溶液。
木香对照药材溶液的制备：取木香对照药材0.5g，加水50ml，煎煮30分钟，离心，取上清液，蒸干，残渣加70％甲醇10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺煨木香的阴性对照溶液。
对煨木香特征图谱峰进行定位，见图11。其中图11煨木香色谱峰指认图。
由图可知，共指认9个色谱峰，峰2为新绿原酸；峰3为紫丁香苷；峰4为绿原酸；峰5为隐绿原酸；峰8为异绿原酸A；峰9为异绿原酸B；峰10为异绿原酸C；峰12为木香烃内酯；峰13为去氢木香内酯。
2.5.2精密度试验
精密称取煨木香供试品溶液，按实施例1拟定实验方法连续进样6次，每次10μl，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。见表1。
表1精密度考察-保留时间
表2精密度考察-峰面积
结果表明，精密度考察中各特征峰保留时间的RSD为0.01％～0.11％；各特征峰峰面积的RSD在0.18％～1.94％，该方法精密度良好。
2.5.3重复性考察
精密称取煨木香6份，按实施例1拟定实验方法进行制备及测定。见表3-4。
表3重复性考察-相对保留时间
表4重复性考察-相对峰面积
结果表明，特征峰相对保留时间的RSD在0.00％～0.12％；特征峰相对峰面积的RSD在1.09％
2.5.4中间精密度考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A1、A2)在不同时间(T1、T2)分别精密称取煨木香各6份，制备供试品溶液，分别在不同仪器(C1：Agilent 1260、C2：Waterse2695)高效液相色谱仪上进行测定。见表5-6。
表5中间精密度考察-相对保留时间
表6中间精密度考察-相对峰面积
结果表明，由不同人员在不同时间制备供试品溶液，分别在不同仪器上进行测定时，各特征峰相对保留时间的RSD为0.28％-1.67％，该方法中间精密度较好。
2.5.5耐用性考察
2.5.5.1色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱XC18250mm×4.6mm，5μm、Phenomenex/>C18 110A250mm×4.6mm，5μm、Agilent 5TC-C18 250mm×4.6mm，5μm进行考察。见表7-8，图13。图13为不同类型色谱柱结果图，其中图12为不同色谱柱结果图。S1:Phenomenex/>C18 110A，S2:X/>C18，S3:Agilent 5TC-C18
表7色谱柱耐用性考察-相对保留时间
表8色谱柱耐用性考察-相对峰面积
由上图及表可知，该方法对色谱柱具有选择性，3种不同的品牌的色谱柱中XBridge、Phenomenex Gemini对样品不能达到理想的分离效果，故本研究建议使用Agilent5TC-C18色谱柱。
2.5.6稳定性
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，3h，9h，12h，18h，24h时测定。见表9-10。
表9稳定性考察-保留时间
表10稳定性考察-峰面积
结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD为0.01～0.12％，峰面积RSD为0.20％-4.28％，样品溶液在24小时内稳定。
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述14个特征峰纳入后续考察。
实施例3
3.5.6特征峰的确定及对照图谱的建立
3.5.6.1 3批煨木香验证结果
采用实施例1拟定的方法对本品3批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积。见表11-12，图13，图13为3批煨木香特征图谱验证图，表11 3批煨木香相对保留时间
表12 3批煨木香相对峰面积
供试品色谱中应呈现14个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的14个特征峰保留时间相对应，其中峰3、12、13应分别与紫丁香苷对照品、木香烃内酯对照品、去氢木香内酯对照品参照物色谱峰的保留时间相对应。与紫丁香苷参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间；其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.41(峰1)、0.77(峰2)、1.04(峰4)、1.11(峰5)、1.29(峰6)、1.83(峰7)、1.90(峰8)、1.93(峰9)、2.06(峰10)、2.89(峰11)、3.40(峰14)。计算峰1、峰12与S峰的相对峰面积比值，其相对峰面积应在规定值范围之内，规定值为：不得大于0.12(峰1)、不得大于0.20(峰12)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对3批煨木香进行合成，建立了煨木香特征图谱的对照图谱。见图14。图14为对照特征图谱。峰2：新绿原酸；峰3(S)：紫丁香苷；峰4：绿原酸；峰5：隐绿原酸；峰8：异绿原酸A；峰9：异绿原酸B；峰10：异绿原酸C；峰12：木香烃内酯；峰13：去氢木香内酯；色谱柱：TC C18，4.6mm×250mm，5μm。
确定煨木香的特征图谱检测方法为：照高效液相色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.2ml，柱温为25℃；检测波长为254nm。理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于3000。
参照物溶液的制备取木香对照药材0.5g，加水50ml，煎煮30分钟，离心，取上清液，蒸干，残渣加70％甲醇10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取紫丁香苷对照品、木香烃内酯对照品、去氢木香内酯对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含紫丁香苷10μg、木香烃内酯3μg、去氢木香内酯40μg的混合溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取本品粉末(过四号筛)0.5g，加水50ml，煎煮30分钟，取出，离心，取上清液，蒸干，残渣加70％甲醇10ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
供试品色谱中应呈现14个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的14个特征峰保留时间相对应，其中峰3、12、13应分别与紫丁香苷对照品、木香烃内酯对照品、去氢木香内酯对照品参照物色谱峰的保留时间相对应。与紫丁香苷参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间；其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.41(峰1)、0.77(峰3)、1.04(峰4)、1.11(峰5)、1.29(峰6)、1.83(峰7)、1.90(峰8)、1.93(峰9)、2.06(峰10)、2.89(峰11)、3.40(峰14)。计算峰1、峰12与S峰的相对峰面积比值，其相对峰面积应在规定值范围之内，规定值为：不得大于1.2(峰1)、不得大于0.20(峰12)。色谱图为图14所示。
实施例4 3批木香验证结果
采用本发明特征图谱的构建方法及供试品溶液制备方法对3批木香进行特征图谱的测定，计算相对保留时间及相对峰面积，验证结果如下表13～14所示。
表13 3批木香相对保留时间
表14 3批木香相对峰面积
实施例5 3批麸煨木香验证结果
采用本发明特征图谱的构建方法及供试品溶液制备方法对3批麸煨木香进行特征图谱的测定，计算相对保留时间及相对峰面积，验证结果如下表15～16所示。
表15 3批麸煨木香相对保留时间
表16 3批麸煨木香相对峰面积
结果表明，木香通过炮制成为煨木香和麸煨木香后，峰1的峰面积均有增大，峰12的峰面积均有减小。煨木香峰1的峰面积略有增加，相对峰面积为0.07，无法与木香峰1相对峰面积0.05明显区别，但峰12的峰面积减小明显，相对峰面积为0.13，可与木香峰12相对峰面积0.38明显区别。麸煨木香峰1的峰面积明显增加，相对峰面积为0.19，可与木香峰1相对峰面积0.05和煨木香峰1相对峰面积0.07明显区别，峰12的峰面积减小程度不如煨木香，相对峰面积为0.25，可与木香峰12相对峰面积0.38和煨木香峰12相对峰面积0.13明显区别。
本发明可进行煨木香特征图谱的验证，并且可通过相对峰面积与木香和麸煨木香进行明显区分。煨木香相对峰面积规定：峰1不得大于0.12，峰12不得大于0.20。木香相对峰面积规定：峰1不得大于0.12，峰12不得小于0.20。麸煨木香相对峰面积规定：峰1不得小于0.12，峰12不得小于0.20。
对比例1
UPLC色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.30ml/min；柱温为30℃；检测波长为254nm；
供试品溶液的制备方法：取木香药材粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60-80％甲醇25-50ml，称定重量，超声处理15-45分钟，放冷，再称定重量，用60-80％甲醇补足损失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
用本研究方法更换流动相B为0.05％磷酸溶液进行方法对比，结果见图15。图15为对比例1结果图。
结果表明，与本研究方法相比，流动性B为0.05％磷酸溶液时，峰4和峰5、峰6和其后小峰、峰8和峰9与其后小峰、峰11和其前后小峰均无法分开，且峰4为绿原酸，为峰5隐绿原酸，峰8为对比文件中的含测指标3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸(异绿原酸A)，峰9为异绿原酸B，是同分异构体，极性相近、光谱相同，难以用光谱进行区分，分不开容易误认为是同一个峰。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种煨木香及其制剂的HPLC特征图谱构建方法，包括：
A)将供试品原料采用水煎煮后，再用溶剂提取，得到待测液；
B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到煨木香及其制剂的HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％醋酸水溶液，梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括制备参照物溶液：分别取紫丁香苷、木香烃内酯、去氢木香内酯对照品，采用70％甲醇溶解，得到参照物溶液；
将所述参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对煨木香及其制剂HPLC特征图谱的成分进行定性。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述参照物溶液的浓度具体为：紫丁香苷0.1mg/mL，木香烃内酯为0.1mg/mL，去氢木香内酯为0.1mg/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体为：
0～10min，A相：5％～8％、B相：95～92％；
10～20min，A相：8％～15％、B相：92％～85％；
20～25min，A相：15％～19％、B相：85％～81％；
25～35min，A相：19％～23％、B相：81％～77％；
35～42min，A相：23％、B相：77％；
42～55min，A相：23％～35％、B相：77％～65％；
55～60min，A相：35％～65％、B相：65％～35％；
60～70min，A相：65％～75％、B相：35％～25％；
70～75min，A相：75％～100％、B相：25％～0％。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为规格是250×4.6mm 5μm；柱温25℃；理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于3000；所述流动相流速为1.2mL/min；检测波长为254nm；进样量为10μL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用对照品溶液和木香对照药材溶液对煨木香特征图谱进行指认：其中峰2为新绿原酸；峰3为紫丁香苷；峰4为绿原酸；峰5为隐绿原酸；峰8为异绿原酸A；峰9为异绿原酸B；峰10为异绿原酸C；峰12为木香烃内酯；峰13为去氢木香内酯；
所述对照品溶液的制备具体为：分别取紫丁香苷、木香烃内酯、去氢木香内酯、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C对照品，采用70％甲醇溶解，得到对照品溶液；
采用木香对照药材加水煎煮后，再采用70％甲醇提取，得到对照药材参照物溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对煨木香及其制剂的HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由14个特征峰构成的HPLC标准特征图谱，其中峰3为紫丁香苷，峰12木香烃内酯，峰13为去氢木香内酯。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述煨木香及其制剂的特征图谱中，以紫丁香苷为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±10％之内，所述规定值分别为：0.41(峰1)、0.77(峰2)、1.04(峰4)、1.11(峰5)、1.29(峰6)、1.83(峰7)、1.90(峰8)、1.93(峰9)、2.06(峰10)、2.89(峰11)、3.40(峰14)。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A)所述溶剂为70％甲醇；所述提取为超声提取；所述超声的功率为600W，频率40kHz；超声时间为20～40min；
所述将供试品原料和水的质量体积比为(0.3～1)g：50mL；
所述供试品原料为煨木香饮片、煨木香颗粒、煨木香药材中的一种或几种。
10.一种煨木香、麸煨木香、木香及其制剂的特征图谱的鉴别方法，其特征在于，采用权利要求1～9任一项所述的方法进行检测，分析检测结果；
煨木香相对峰面积规定：峰1不得大于0.12，峰12不得大于0.20；
木香相对峰面积规定：峰1不得大于0.12，峰12不得小于0.20；
麸煨木香相对峰面积规定：峰1不得小于0.12，峰12不得小于0.20。
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