CN115032288B - 一种龙胆草配方颗粒hplc特征图谱构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，包括：A)将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C 18柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.05％冰乙酸，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用甲醇‑0.05％冰乙酸为流动相进行梯度洗脱，以龙胆苦苷和异荭草素为参照物，建立了龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对龙胆草配方颗粒的质量进行控制。

Description

一种龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，尤其是涉及一种龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法。
背景技术
龙胆草，(学名丝裂沙参Adenophora capillaris)，属于桔梗科，沙参属多年生草本植物，茎单生，高50厘米至1米余，无毛或有长硬毛。茎生叶常为卵形，卵状披针形，少为条形，顶端渐尖，全缘或有锯齿，无毛或有硬毛，长3-19厘米，宽0.5-4.5厘米。花序具长分枝，常组成大而疏散的圆锥花序，少为狭圆锥花序，更少仅数朵花集成假总状花序，花序梗和花梗常纤细如丝。花萼筒部球状，少为卵状，裂片毛发状，下部有时有1至数个瘤状小齿，偶尔叉状分枝，伸展开或反折，长(3)6-14(20)毫米；花冠细，近于筒状或筒状钟形，长11-18毫米，白色、淡蓝色或淡紫色，裂片狭三角形，长3-4毫米；花盘细筒状，长2-5毫米，常无毛，花柱长20-25毫米。蒴果多为球状，极少为卵状，长4-9毫米，直径4-5毫米。
龙胆草性苦，寒。归肝、胆经。清热燥湿，泻肝胆火。用于湿热黄疸，阴肿阴痒，带下，湿疹瘙痒，肝火目赤，耳鸣耳聋，胁痛口苦，强中，惊风抽搐。
龙胆草虽然性、味、归经几乎与龙胆相同，但是其来源、入药部位及其性状等与龙胆都不同，除此之外，还有龙胆、龙胆草的混淆品伪品较多，因此，目前缺少一种有效手段对其进行质量控制。本发明旨在构建一种龙胆草配方颗粒高效液相特征图谱方法，全面反映龙胆草配方颗粒及其相关制剂的质量水平，为龙胆草配方颗粒药材、饮片及其相关制剂在质量控制方面提供指导。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，本发明构建的龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱方法稳定，可靠，可以对龙胆草配方颗粒的质量进行控制。
本发明提供了一种龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，包括：
A)将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液；
B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.05％冰乙酸，梯度洗脱。
优选的，还包括制备参照物溶液：取龙胆苦苷和异荭草素，分别采用甲醇溶解，得到参照物溶液；
将所述参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱的成分进行定性。
优选的，所述参照物溶液的浓度具体为：龙胆苦苷为50μg/mL，异荭草素为50μg/mL。
优选的，所述梯度洗脱具体为：
0～10min，A相：10％～15％、B相：90％～85％；
10～20min，A相：15％～20％、B相：85％～80％；
20～35min，A相：20％～25％、B相：80％～75％；
35～70min，A相：25％～65％、B相：75％～35％。
优选的，所述色谱柱为Agilent 5TC-C18(250×4.6mm,5μm)、Agilent ZORBAXExtend-C18(250×4.6mm，5μm)、Kromasil 100-5-C18(250×4.6mm，5μm)；柱温30℃。
优选的，所述流动相流速为1.0mL/min；检测波长为240nm；进样量为5～10μL，理论板数按龙胆苦苷峰计算应不低于5000。
优选的，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由11个特征峰构成的龙胆草配方颗粒HPLC标准特征图谱，其中龙胆苦苷参照物相应的峰为S1峰，与异荭草素参照物相应的峰为S2峰。
优选的，在所述标准特征图谱中，计算特征峰1、峰2、峰3、峰4、峰5与S1峰的相对保留时间，特征峰7、峰8、峰9、峰11与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.253(峰1)、0.397(峰2)、0.473(峰3)、0.771(峰4)、0.881(峰5)、0.705(峰7)、0.908(峰8)、0.936(峰9)、1.137(峰11)。
优选的，步骤A)所述提取为超声提取；所述超声提取的时间为20～40min；所述超声的功率为600W，频率40kHz；所述溶剂为70％甲醇；所述供试品原料的质量g和溶剂的体积mL的比为(0.1～0.2)：(50～60)；
所述供试品原料为龙胆草配方颗粒。
本发明提供了一种龙胆草配方颗粒的鉴别方法，采用上述技术方案所述的方法进行检测，分析检测结果。
与现有技术相比，本发明提供了一种龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，包括：A)将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.05％冰乙酸，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用甲醇-0.05％冰乙酸为流动相进行梯度洗脱，以龙胆苦苷和异荭草素为参照物，建立了龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对龙胆草配方颗粒的质量进行控制。
附图说明
图1为实施例1流动相选择结果；
图2为龙胆草配方颗粒的3D图；
图3为龙胆草配方颗粒不同波长色谱图；
图4为流速考察结果；
图5为柱温考察结果；
图6为延迟性试验色谱图；
图7为提取溶剂考察结果图；
图8为提取方式考察结果图；
图9为提取时间考察结果图；
图10为龙胆草对照药材色谱图；
图11为色谱图指认结果图；
图12为中间精密度考察结果图；
图13为不同色谱柱考察结果图；
图14为龙胆草配方颗粒特征图谱；
图15龙胆草配方颗粒对照特征图谱；
图16为本发明对比例1不同梯度条件结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，包括：
A)将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液；
B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.05％冰乙酸，梯度洗脱。
本发明供试品原料包括但不限于龙胆草配方颗粒。
本发明提供的一种龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法首先将取龙胆草配方颗粒原料，溶剂溶解，提取，得到待测液。所述溶剂优选为70％甲醇。
本发明人发现，采用70％甲醇作为提取溶剂，色谱峰中峰型和分离度均较好。
具体为将龙胆草配方颗粒内容物，溶剂溶解，提取，放冷，摇匀，滤过，即得。
本发明所述提取为加热回流提取或超声提取；优选为超声提取。
所述超声的功率为600W，频率40kHz；超声时间优选为20～40min；更优选为30min。
其中，所述龙胆草配方颗粒原料的质量g和溶剂的体积mL的比优选为(0.1～0.2)：(50～60)；更优选为0.1：50。
本发明上述原料皆可通过本发明的方法进行质量控制和定性定量检测。
本发明还包括制备参照物溶液：取龙胆苦苷和异荭草素，分别采用甲醇溶解，得到参照物溶液。
其中，龙胆苦苷为50μg/mL，异荭草素为50μg/mL。
将所述参照物溶液采用高效液相色谱法测定，分别得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱的成分进行定性测定。
本发明所述流动相A为甲醇，流动相B为0.05％冰乙酸，梯度洗脱。
本发明所述梯度洗脱优选具体为：
0～10min，A相：10％～15％、B相：90％～85％；
10～20min，A相：15％～20％、B相：85％～80％；
20～35min，A相：20％～25％、B相：80％～75％；
35～70min，A相：25％～65％、B相：75％～35％。
本发明在上述洗脱梯度下基线分离好，各个峰分离度好，基线平稳。
本发明所述色谱柱为Agilent 5TC-C18(250×4.6mm,5μm)、Agilent ZORBAXExtend-C18(250×4.6mm，5μm)、Kromasil 100-5-C18(250×4.6mm，5μm)；本发明采用色谱柱进行耐用性检测，耐用性良好。
本发明柱温优选为30℃。本发明在上述色谱柱温度下色谱峰峰形较好，分离度适中。
流动相流速优选为1.0mL/min。
本发明发现流速1.0mL/min下各色谱峰分离较好，分离度适中，作为最优选方案。
本发明检测波长优选为280nm。
本发明人发现，在240nm处色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，各峰峰面积较大。
本发明理论板数按龙胆苦苷峰计算应不低于5000。
本发明进样量为5～10μL；优选为5μL。
本发明的有益效果是，一个液相色谱条件下，以特征图谱控制龙胆草配方颗粒的物质群，以龙胆苦苷和异荭草素对特征图谱进行定位；能够大大降低检测的成本，实现定性检测。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由11个特征峰构成的龙胆草配方颗粒HPLC标准特征图谱，其中龙胆苦苷参照物相应的峰为S1峰，与异荭草素参照物相应的峰为S2峰。
在所述标准特征图谱中，计算特征峰1、峰2、峰3、峰4、峰5与S1峰的相对保留时间，特征峰7、峰8、峰9、峰11与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.253(峰1)、0.397(峰2)、0.473(峰3)、0.771(峰4)、0.881(峰5)、0.705(峰7)、0.908(峰8)、0.936(峰9)、1.137(峰11)。
质量判断标准：取龙胆草配方颗粒样品，按上述同法操作，得到龙胆草配方颗粒特征图谱，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版对龙胆草配方颗粒标准特征图谱和样品特征图谱进行分析，相似度大于0.90。
采用本发明所提供的方法能有效的监控不同批次龙胆草配方颗粒的质量，使其质量稳定，方法具有精密度高、重现性好等特点，有利于全面监控产品的质量。
本发明建立的龙胆草配方颗粒特征图谱以龙胆苦苷和异荭草素为参照物，注重各个特征峰的顺序和与药材及中间产品的相关性，能全面评价产品的整体质量面貌特征，方法科学可靠。
本发明提供了一种龙胆草配方颗粒的鉴别方法，采用上述技术方案所述的方法进行检测，分析检测结果。
本发明采用上述方法对龙胆草进行鉴别，可以对龙胆草配方颗粒的质量进行控制。
本发明对于具体的检测方法上述已经有了清楚的描述，在此不再赘述。
本发明提供了一种龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，包括：A)将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.05％冰乙酸，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用甲醇-0.05％冰乙酸为流动相进行梯度洗脱，以龙胆苦苷和异荭草素为参照物，建立了龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对龙胆草配方颗粒的质量进行控制。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法进行详细描述。
高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪、Waters e2695型高效液相色谱仪、岛津-20AD型高效液相色谱仪；
电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ5200DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250×4.6mm,5μm)、Agilent 5TC-C18(250×4.6mm,5μm)、Agilent ZORBAX Extend-C18(250×4.6mm，5μm)、Kromasil 100-5-C18(250×4.6mm，5μm)
甲醇(色谱纯，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司)、冰乙酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)、甲醇(分析纯、成都市科隆化学试剂有限公司)、流动相用水为实验室自制超纯水，其余均为实验室自制纯水。
龙胆苦苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110770-201918)；
当药苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111742--201704)；
马钱苷酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111865--200501)；
异荭草素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111974--201401)；
獐牙菜苦苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110785--201404)；
龙胆草对照药材(上海鸿永生物科技有限公司，批号：310036-202104)。
龙胆草配方颗粒SY2112001、SY2112002、SY2112003。
实施例1色谱条件筛选
1.1色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.05％冰乙酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；检测波长为240nm，理论板数按龙胆苦苷峰计算应不低于5000。
Figure GDA0003781840670000081
参照物溶液的制备 取龙胆草对照药材约0.5g，置具塞锥形瓶中，加30％甲醇溶液25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。取龙胆苦苷和异荭草素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含50μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备 取本品适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照药材参照物溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
1.2流动相选择
比较甲醇-0.05％冰乙酸水溶液、甲醇-0.1％冰乙酸、乙腈-0.1％磷酸水溶液、乙腈-0.1％冰乙酸四种混合溶剂对龙胆草配方颗粒供试品溶液中色谱峰的分离效果，选择较优的组合溶剂作为龙胆草配方颗粒特征图谱测定的流动相。结果如图1，图1为实施例1流动相选择结果。
1.3波长选择
在“1.1色谱条件”基础上，利用二极管阵列检测器分别对供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在210nm、240nm、270nm、290nm波长下的色谱图。如图2和图3，图2为龙胆草配方颗粒的3D图，图3为龙胆草配方颗粒不同波长色谱图。
结果表明，在检测波长为240nm时色谱峰信息量较大，故龙胆草配方颗粒特征图谱方法的检测波长最终确定为240nm。
1.4流速考察
在“1.1色谱条件”基础上，分别考察0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min三种流速对供试品溶液中色谱峰的分离效果，结果见图4。图4为流速考察结果。
图4表明：在1.0ml/min的流速下，色谱峰峰型对称，分离度较好，故选择1.0ml/min作为龙胆草配方颗粒特征图谱的测定流速。
1.5柱温考察
在“1.1色谱条件”基础上，分别考察20℃、25℃、30℃、35℃四种柱温对供试品溶液中色谱峰的分离效果，结果见图5，图5为柱温考察结果。图5表明：在30℃的柱温下，色谱峰峰型对称，分离度较好，故选择30℃作为龙胆草配方颗粒特征图谱的测定柱温。
1.6延迟性实验
在“1.1色谱条件”基础上，将分析时间延长至160分钟，观察160分钟后是否有色谱峰，结果见图6，图6为延迟性试验色谱图；结果表明，延长70分钟后基本无较大的色谱峰，最终确定龙胆草配方颗粒特征图谱方法的分析时间为70分钟。
综上所述，龙胆草配方颗粒特征图谱色谱条件与系统适用性试验拟定为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，以甲醇为流动相A，以0.05％冰乙酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；检测波长为240nm，理论板数按龙胆苦苷峰计算应不低于5000。
Figure GDA0003781840670000091
Figure GDA0003781840670000101
实施例2供试品溶液的制备考察
2.1提取溶剂考察
取龙胆草配方颗粒(2104070)0.1g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇、70％甲醇、水各50ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“实施例1”结果进样测定，结果见图7。图7为提取溶剂考察结果图。结果表明：70％甲醇提取的供试品溶液中色谱峰中峰型和分离度均较好，因此选择70％甲醇作为龙胆草配方颗粒特征图谱测定中供试品溶液制备的提取溶剂。
2.2提取方式考察
取龙胆草配方颗粒(2104070)0.1g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“4色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定，结果见图8，图8为提取方式考察结果图。
从图8中可以看出，回流提取和超声提取的最终效果无显著差异，故选择操作更加简便的超声作为龙胆草配方颗粒特征图谱测定中供试品溶液制备的提取方式。
2.3提取时间考察
取龙胆草配方颗粒(2104070)0.1g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，分别超声(功率600W，频率40kHz)处理20分钟、30分钟、40分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“实施例1”拟定的结果进样测定，结果见图9，图9为提取时间考察结果图。
从图9中可以看出，超声提取时间为30分钟时，色谱峰分离更好，故选择30分钟作为龙胆草配方颗粒特征图谱测定中供试品溶液制备的提取时间。
综上所述，龙胆草配方颗粒特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取本品0.1g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实施例3方法学考察
3.1色谱峰指认
对照品溶液的制备：取马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷、异荭草素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含50μg的溶液，作为对照品溶液。
对照药材溶液的制备取龙胆草对照药材约0.5g，置具塞锥形瓶中，加30％甲醇溶液25ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
供试品溶液的制备：按“实施例2”结果制备龙胆草配方颗粒供试品溶液。
阴性对照溶液的制备：按“实施例2”结果制备缺龙胆草配方颗粒的阴性对照溶液。按“实施例1”结果进样测定，结果见图10、11，图10为龙胆草对照药材色谱图；图11为色谱图指认结果图。
3.2精密度试验
取龙胆草配方颗粒(批号：2104070)按实施例2结果制备供试品溶液，按实施例1结果进样测定，连续6次，每次5μl，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。结果见表1-2。
表1精密度考察-相对保留时间
Figure GDA0003781840670000111
表2精密度考察-相对峰面积
Figure GDA0003781840670000112
结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD在0.02％-0.13％，各特征峰相对峰面积的RSD在1.01％-26.24％，说明该仪器精密度良好。
3.3重复性考察
精密称取龙胆草配方颗粒(批号：2104070)6份，按实施例2结果制备供试品溶液，按“4色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定。结果见表3、4。
表3重复性考察-相对保留时间
Figure GDA0003781840670000121
表4重复性考察-相对峰面积
Figure GDA0003781840670000122
结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD在0.01％-0.10％，各特征峰相对峰面积的RSD在0.97％-4.00％，说明该方法重复性良好。
4.4中间精密度考察
取同一供试品(批号：2104070)由不同人员(A、B)在不同时间(Ⅰ、Ⅱ)下按“5供试品溶液的制备考察”结果制备供试品溶液，并按“实施例1”结果分别在仪器a、b上进样测定，结果见表5、6，图12。图12为中间精密度考察结果图，S1-S3为AaⅠ1-AaⅠ3，S4-S6为BbⅡ1-BbⅡ3。
表5中间精密度-相对保留时间
Figure GDA0003781840670000123
Figure GDA0003781840670000131
注：A人员：汪席敏，B人员：吴秋妍，a：岛津LC～20AD型高效液相色谱仪，b：安捷伦1260型高效液相色谱仪，Ⅰ：2021.08.03，Ⅱ:2021.07.19.
表6中间精密度-相对峰面积
Figure GDA0003781840670000132
注：A人员：汪席敏，B人员：吴秋妍，a：岛津LC～20AD型高效液相色谱仪，b：安捷伦1260型高效液相色谱仪，Ⅰ：2021.08.03，Ⅱ:2021.07.19.
由表16、17及图12可知，不同供试品溶液制备人员和不同供试品溶液制备时间下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.35％-1.85％，各特征峰相对峰面积的RSD在1.68％-18.68％，说明本方法适用性较好。
5.5色谱柱耐用性考察
在以上实验条件基础上，分别对色谱柱Agilent 5TC-C18(250×4.6mm,5μm)、Agilent ZORBAX Extend-C18(250×4.6mm，5μm)、Kromasil 100-5-C18(250×4.6mm，5μm)进行考察。结果见表7、表8和图13，图13为不同色谱柱考察结果图。
表7色谱柱耐用性考察-相对保留时间比值
Figure GDA0003781840670000133
Figure GDA0003781840670000141
表8色谱柱耐用性考察-相对峰面积比值
Figure GDA0003781840670000142
结果表明，用上述表8、9中3种色谱柱对样品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD在0.08％-4.46％，各特征峰相对峰面积的RSD在4.42％-39.56％，说明本方法对不同色谱柱耐用性较好。
3.6稳定性
按“实施例2”结果制备供试品溶液一份，并按“实施例1”结果，分别于0h，4h，7h，13h，19h，24h时进样测定。结果见表9、10。
表9稳定性考察-相对保留时间
Figure GDA0003781840670000143
表10稳定性考察-相对保留峰面积
Figure GDA0003781840670000144
结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD在0.03％～0.17％，各特征峰相对峰面积的RSD在0.92％-16.49％，说明供试品溶液的稳定性良好，在24小时内可供检测。
实施例4特征峰的确定及对照图谱的建立
按“5供试品溶液的制备考察”结果制备3批配方颗粒的供试品溶液，并按“4色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定分析，计算相对保留时间和相对峰面积比值。结果见图14，表11、12。图14为龙胆草配方颗粒特征图谱，(从下到上批号依次为：SY2112001、SY2112002、SY2112003)。
表11 3批龙胆草配方颗粒相对保留时间
Figure GDA0003781840670000151
表12 3批龙胆草配方颗粒相对峰面积
Figure GDA0003781840670000152
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了11个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，当峰6作为S1峰，峰10作为S2时，3批次龙胆草配方颗粒11个特征峰相对保留时间RSD在0.00％～0.12％，均小于10％。
最终规定：供试品特征图谱中应呈现11个特征峰，并应与对照药材参照物中的11个特征峰保留时间相对应，其中与龙胆苦苷参照物相应的峰为S1峰，与异荭草素参照物相应的峰为S2峰，计算特征峰1、峰2、峰3、峰4、峰5与S1峰的相对保留时间，特征峰7、峰8、峰9、峰11与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.253(峰1)、0.397(峰2)、0.473(峰3)、0.771(峰4)、0.881(峰5)、0.705(峰7)、0.908(峰8)、0.936(峰9)、1.137(峰11)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对3批龙胆草配方颗粒进行合成，建立了龙胆草配方颗粒特征图谱的对照图谱。见图15。图15为龙胆草配方颗粒对照特征图谱；峰4：马钱苷酸；峰5：獐牙菜苦苷；峰6(S1)：龙胆苦苷；峰7：当药苷；峰10(S2)：异荭草素。色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB C18(250×4.6mm,5μm)。
对比例1
测试梯度1：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，以甲醇为流动相A，以0.05％冰乙酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；检测波长为240nm，理论板数按龙胆苦苷峰计算应不低于5000。
Figure GDA0003781840670000161
测试梯度2：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，以甲醇为流动相A，以0.05％冰乙酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；检测波长为240nm，理论板数按龙胆苦苷峰计算应不低于5000。
Figure GDA0003781840670000162
测试梯度3：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，以甲醇为流动相A，以0.05％冰乙酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；检测波长为240nm，理论板数按龙胆苦苷峰计算应不低于5000。
Figure GDA0003781840670000171
如图16所示，图16为本发明对比例1不同梯度条件结果图；确认梯度比测试梯度1、测试梯度2、测试梯度3峰分离效果较好，故选择此梯度为本方法梯度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱构建方法，包括：
A )将供试品原料采用溶剂溶解，提取，得到待测液；
B）将待测液采用高效液相色谱法测定，得到龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱；还包括制备参照物溶液：取龙胆苦苷和异荭草素，分别采用甲醇溶解，得到参照物溶液；
将所述参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱的成分进行定性；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C 18柱；流动相A为甲醇，流动相B为0.05%冰乙酸，梯度洗脱；
所述梯度洗脱具体为：
0～10min，A相：10%～15%、B相：90%～85%；
10～20min，A相：15%～20%、B相：85%～80%；
20～35min，A相：20%～25%、B相：80%～75%；
35～70min，A相：25%～65%、B相：75%～35%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述参照物溶液的浓度具体为：龙胆苦苷为50μg/mL，异荭草素为50μg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为Agilent 5TC-C18(250×4.6mm,5µm)、Agilent ZORBAX Extend-C18(250×4.6 mm，5µm)、Kromasil 100-5-C18 (250×4.6 mm，5µm)；柱温30℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相流速为1.0mL/min；检测波长为240nm；进样量为5~10μL，理论板数按龙胆苦苷峰计算应不低于5000。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对龙胆草配方颗粒HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由11个特征峰构成的龙胆草配方颗粒HPLC标准特征图谱，其中龙胆苦苷参照物相应的峰为S1峰，与异荭草素参照物相应的峰为S2峰。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述标准特征图谱中，计算特征峰1、峰2、峰3、峰4、峰5与S1峰的相对保留时间，特征峰7、峰8、峰9、峰11与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内，规定值为：0.253（峰1）、0.397（峰2）、0.473（峰3）、0.771（峰4）、0.881（峰5）、0.705（峰7）、0.908（峰8）、0.936（峰9）、1.137（峰11）。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A）所述提取为超声提取；所述超声提取的时间为20~40min；所述超声的功率为600W，频率40kHz；所述溶剂为70%甲醇；所述供试品原料的质量g和溶剂的体积mL的比为（0.1~0.2）：（50~60）；
所述供试品原料为龙胆草配方颗粒。
8.一种龙胆草配方颗粒的鉴别方法，其特征在于，采用权利要求1~7任一项所述的方法进行检测，分析检测结果。
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