CN105092725A - 白花龙胆的hplc检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了白花龙胆的HPLC检测方法，包括如下操作步骤：取待检药材标准品，甲醇提取，制备供试品溶液；将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，检测即可，建立标准指纹图谱；取待检药材，按照前述步骤的方法得到指纹图谱，将其与标准指纹图谱的对比即可。本发明检测方法，分离度良好，出峰数量较多，并可以将白花龙胆中的多个品种以及混伪品进行区分，为白花龙胆药材的品质提供了保障。

Description

白花龙胆的HPLC检测方法

技术领域

本发明涉及白花龙胆的HPLC检测方法。

背景技术

(bāngjiān，“榜间”)，“榜”藏语意为“高山草甸”，“间”有“装饰”之意，即“高山草甸的点缀”，中文名，龙胆花。《晶珠本草》中归为的花类药物。以花色的不同常分为白、蓝、黑三种，分别为“榜间嘎保”(中文名，白花龙胆)，为花白色者，深秋生长在高山寒凉地带，叶状如秦艽叶；无茎，从地面开出四、五朵白花，有红色光泽，花基部合生。“榜间恩保”(蓝花龙胆)，花蓝色者，初秋生长在非常潮湿的沼泽草滩，叶小，花淡蓝色；“榜间那保”(黑花龙胆)，花黑色者，中秋生长在高山草甸，形态与前同，花深蓝色，比蓝色种略大。关于“榜间”有这样一段传说：仙女三姐妹化作草地三姐妹，大地春回，阳气上泛，三姐妹作为诸药先导化为马兰花、报春花、点地梅，迎接三春。三花一开，诸药不得不生，百花相继开放。秋风萧瑟，阳气下降，诸药枯萎，百花凋谢，三姐妹化作大、中、小三种榜间，分别开在三秋。三花一开，诸药不得不去。

“榜间”来源于龙胆科龙胆属多种药用植物。是具有代表性的常用大宗藏药材，功效为治毒病，各种热症，喉炎热闭。目前，10余家藏药企业拥有总计14个国药准字号的藏药复方制剂，分别是十味龙胆花颗粒(胶囊)、三味龙胆花片(丸)、十五味龙胆花丸(散)；“龙胆花”商品药材在青海、四川、西藏等地药材市场和土特产门市出售，是内地最常用的藏药材之一。

然则就功效来看“榜间”分类不同其功效有异，“榜间嘎保”，即是白花龙胆，治一切热病，解毒，利喉，列为上品，“榜间恩保”与前者同效而性凉，“榜间那保”治黑痘疤疹。就使用现状看，“榜间”基原品种复杂，仅“榜间嘎保”的使用就不只一种，尚有“榜间恩保”替代“榜间嘎保”使用的情况。现代藏医药学著作及国家、地方标准收载的品种繁多，且质量控制方法简单，缺乏内在质量评价的标准。

因此，目前亟需找到一种有效鉴别白花龙胆各基原品种及其混伪品的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供白花龙胆的HPLC检测方法。

本发明提供了白花龙胆的HPLC检测方法，它包括如下操作步骤：

(1)取待检药材，甲醇提取，制备供试品溶液；

(2)将供试品溶液注入高翔液相色谱仪中，检测即可，其色谱条件如下:

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料；

检测波长：240±3nm；

流动相：A相为0.1～0.3％磷酸水溶液，B相为甲醇，梯度程序如下：

进一步地，步骤(1)中，采用超声或者回流提取。

进一步地，步骤(2)中，所述色谱柱尺寸为4.6×250mm，5μm。

进一步地，步骤(2)中，流动相流速为1.0mL/min。

进一步地，步骤(2)中，柱温：30℃。

进一步地，所述待检药材为大花龙胆、短柄龙胆、高山龙胆无茎植株、高山龙胆有茎植株或岷县龙胆。

本发明还提供了一种蓝花龙胆、麻花秦艽或龙胆草HPLC检测方法，包括如下操作步骤：

(1)取待检药材标准品，甲醇提取，制备供试品溶液；

(2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，检测即可，建立标准指纹图谱，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料；

检测波长：240±3nm；

流动相：A相为0.1～0.3％磷酸水溶液，B相为甲醇，梯度程序如下：

(3)取待检药材，按照步骤(1)和(2)的方法得到指纹图谱，将其与标准指纹图谱的对比即可。

进一步优选地，步骤(2)中，所述色谱柱尺寸为4.6×250mm，5μm，流动相流速为1.0mL/min，柱温为30℃。

进一步优选地，所述指纹图谱的参照物为獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、异荭草苷和异牡荆苷。

本发明的检测方法，得到了出峰量较多和峰形较好的指纹图谱，不仅可以有效分辨白花龙胆与其近似品种和混伪品，还可以准确区分白花龙胆的不同基原品种及不同存放时间的药材。因此，本发明的检测方法可以有效保障白花龙胆的品质。

同时，由于一些其他的龙胆花和龙胆草同样具有药用价值，如蓝花龙胆、麻花秦艽和龙胆草等，这些品种与白花龙胆均属于龙胆科，其内部的主要化学成分存在一定的相似性。因此，我们推测，尽管专属性可能会稍差于白花龙胆的标准指纹图谱，但是本发明的技术方案有用于对这些白花龙胆以外的其他龙胆科药材进行鉴别的可能。幸运的是，最终实验证明，将本发明的方法在用于以上龙胆科药材时，可以获得出峰量较多和峰形较好的指纹图谱。因此，本发明的方法还可用于对蓝花龙胆、麻花秦艽或龙胆草进行检测。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为Welchrom-C18柱图谱。

图2为Swell-C18柱图谱。

图3为流动相为乙腈-0.2％磷酸水时的色谱图，上为岷县龙胆、下为大花龙胆。

图4为流动相为甲醇-0.2％磷酸水时的色谱图，上为岷县龙胆、下为大花龙胆。

图5为岷县龙胆(MX-6)的特征3D谱图。

图6为大花龙胆(DH-14)的特征3D谱图。

图7为供试品的乙酸乙酯、乙醇、甲醇提取色谱图，1和2依次为乙酸乙酯提取岷县龙胆和大花龙胆，3和4依次为乙醇提取大花龙胆和岷县龙胆，5的上方为甲醇提取的岷县龙胆，下方为甲醇提取的大花龙胆。

图8为对照品色谱图：1獐牙菜苦苷、2龙胆苦苷、3异荭草苷、4异牡荆苷。

图9为大花龙胆(上)和岷县龙胆(下)的HPLC指纹色谱图，。

图10为岷县龙胆(上)和大花龙胆(下)的对照品色谱峰指认色谱图：1獐牙菜苦苷、2龙胆苦苷、3异荭草苷、4异牡荆苷。

图11为大花龙胆(上)和短柄龙胆(下)的特征图谱。

图12为岷县龙胆(上)、高山龙胆“有茎”(中)、高山龙胆“无茎”(下)的特征图谱。

图13为条纹龙胆的特征图谱

图14为蓝花类龙胆、麻花秦艽、乌奴龙胆、中药龙胆的特征图谱。

图15为白花龙胆、蓝花龙胆、混伪品及龙胆草的投影图。

图16为白花龙胆、蓝花龙胆、混伪品及龙胆草的系统聚类图。

图17为26批大花龙胆、短柄龙胆高效液相指纹图谱。

图18为对照图谱共有峰标定。

图19为大花龙胆、短柄龙胆三维投影图。

图20为19批高山龙胆、岷县龙胆、蓝花类龙胆高效液相指纹图谱。

图21为对照图谱共有峰标定。

图22为高山龙胆、岷县龙胆、蓝花类龙胆三维投影图。

具体实施方式

材料：

样品来源如表1所示：

表1样品来源编号

通过查阅文献资料、核对四川大学及中国科学院成都生物研究所标本，经鉴定，以上样品1号～18号为龙胆科植物大花龙胆G.szechenyiiKanitz，19号～28号为龙胆科植物短柄龙胆G.stipitataEdgew.，29号～34号为龙胆科植物高山龙胆G.algidapall.,35号～40号为龙胆科植物岷县龙胆G.purdomiiMarq，41号～45号为条纹龙胆G.striataMaxim.。以上样品为白花龙胆的不同基原品种。

编号46～53号为蓝花类龙胆，藏医及藏药厂替代白花龙胆使用，鉴定为龙胆科植物青藏龙胆G.futtereriDiels、华丽龙胆G.sino-ornataBalf.f.、蓝玉簪龙胆G.veitchiorumHemsl.、六叶龙胆G.hexaphyllaMaxim.；编号54～56为麻花秦艽G.stramineaMaxim，白花龙胆伪品；57、58号乌奴龙胆G.urnulaH.，花为白色，藏药做“岗嘎琼”使用；59～62号为中药龙胆草。以上样品为白花龙胆的近似品种和混伪品，用于与白花龙胆比较鉴定。

仪器：

1200型高效液相色谱仪(美国，安捷伦，DAD检测器，自动进样器)，BP121S型电子分析天平(万分之一，Sartorius德国赛多利斯股份公司)，BP211D型电子分析天平(十万分之一，Sartorius德国赛多利斯股份公司)；KQ5200E型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DZKW-4电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)；

纯水机(UPH-IV-20T功率100W)，

试药与试剂：

龙胆苦苷对照品(中国药品生物制品检定所，110770-201013)、獐牙菜苦苷(成都曼思特生物科技有限公司，MUST-12070203含量＞98.5％)、异荭草苷(成都曼思特生物科技有限公司，MUST-12100902含量＞99.00％)、异牡荆苷(成都曼思特生物科技有限公司MUST-12072501含量＞98.2％)。甲醇、乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲酸、甲酸乙酯等均为分析纯、水(自制超纯水)乙腈(色谱纯，sigma)，甲醇(色谱纯，fisher)。

在下述实施例中，进样量均为10μL。

实施例1本发明检测方法

(1)制备供试品溶液：取样品粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率250w，频率50Hz)30分钟，取出，放冷，甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(2)高效液相色谱检测供试品溶液：

色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱Swell(4.6×250mm，5μm，型号：1118254605)。

检测波长：240nm。

流动相：A相为0.2％磷酸水溶液，B相为甲醇：。

流速：1mL/min。

柱温：30℃。

进样量：10μL

梯度洗脱程序为：

在上述检测方法下，可以分离得到多个共有峰，且各峰分离度良好，为测定各指标成分的含量以及指纹图谱相似度对照提供了便利。本检测方法不仅可以有效分辨白花龙胆与其近似品种和混伪品，还可以准确区分白花龙胆的不同基原品种，尤其是可以区分利用其他手段难以区分的短柄龙胆、大花龙胆、高山龙胆“无茎”植株、“有茎”植株、岷县龙胆和条纹龙胆。因此，本发明的检测方法可以有效保障白花龙胆的品质。

实施例2本发明检测方法色谱条件的筛选

1、色谱柱的筛选

发明人对以下色谱柱进行了筛选：Diamonsil-C18(迪马)、Global(SP-120-5-C18-BIO)、Welchrom-C18(型号：U15LP18425)、Swell-C18。

如图1和图2所示，当色谱柱为Welchrom-C18、Swell-C18时，所得图谱各色谱峰的分离度良好。最终确定色谱柱为Swell-C18。

2、流动相的筛选

供试品溶液的制备方法为：

取大花龙胆(DH-1)粉末0.5g，加甲醇25ml提取，超声30min，滤过，取续滤液作为大花龙胆供试品溶液；

取岷县龙胆(MX-6)粉末0.5g，加甲醇25ml提取，超声30min，滤过，取续滤液作为岷县龙胆供试品溶液。

发明人对以下流动相进行了筛选：乙腈-0.2％磷酸水；甲醇-0.2％磷酸水。乙腈-0.2％磷酸水系统的色谱图如图3所示，甲醇-0.2％磷酸水系统的色谱图如图4所示。

结果显示，当流动相为甲醇-0.2％磷酸水系统时，所得图谱上各色谱峰的分离度较好，保留时间适中。

3、检测波长的筛选

采用DAD检测器，在3200～400nm的范围内分别对大花龙胆(DH-14)和岷县龙胆(MX-6)的供试品溶液进行全波段扫描。特征3D谱图结果分别如图5和图6所示。

结果显示，当检测波长为240nm时，出峰较多，能较全面反映供试品甲醇部位的化学信息。

4、柱温的筛选

在上述色谱条件的基础上，发明人对以下柱温进行了筛选：25℃、30℃、35℃、40℃。

结果表明，当柱温为30℃时，所得图谱上各色谱峰的分离度较好，峰形较好。

5、梯度洗脱程序的筛选

发明人通过不同洗脱方式的考察，结果表明，梯度洗脱程序为下述程序时，效果最佳。

综上所述，本发明检测方法的最佳色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱Swell(4.6×250mm，5μm，型号：1118254605)。

检测波长：240nm。

流动相：A相为0.2％磷酸水溶液，B相为甲醇：。

流速：1mL/min。

柱温：30℃。

梯度洗脱程序为：

实施例3本发明供试品溶液制备方法的筛选

发明人对供试品溶液的制备方法进行了筛选，包括回流提取和超声提取，提取剂包括甲醇、乙醇和乙酸乙酯。

结果如图7所示，当以乙醇或乙酸乙酯提取时，效果不理想。而当以甲醇提取时，无论采用回流和超声还是处理，所得图谱上各色谱峰的分离度较好，峰形较好。

综上所述，本发明最佳的供试品溶液制备方法如下：

取样品粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率250w，频率50Hz)30分钟，取出，放冷，甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

实施例4本发明参照色谱峰的选择

对照品溶液的制备方法如下：取龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、异荭草苷、异牡荆苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL各含0.1mg的混合溶液，即得。

色谱条件如下：

检测波长：240nm。

流动相：A相为0.2％磷酸水溶液，B相为甲醇：。

流速：1mL/min。

柱温：30℃。

进样量：10μL

梯度洗脱程序为：

本发明以獐牙菜苦苷对照品、龙胆苦苷对照品、异荭草苷对照品、异牡荆苷作为指纹图谱的参照色谱峰。结果如图8所示。

实施例5本发明检测方法的方法学验证

1、精密度试验

取岷县龙胆(MX-6)、大花龙胆(DH-14)样品，分别按照实施例3的最佳方法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，连续进样5次，测得保留时间和峰面积。在0～76min之间，标定岷县龙胆(MX-6)峰面积大于150的共有峰15个，标定大花龙胆(DH-14)峰面积大于150的共有峰12个。结果如表2-5所示。

表2岷县龙胆(MX-6)精密度保留时间测定结果

表3岷县龙胆(MX-6)精密度峰面积测定结果

表4大花龙胆(DH-14)精密度保留时间测定结果

表.5大花龙胆(DH-14)精密度峰面积测定结果

以上测定结果表明，岷县龙胆、大花龙胆共有峰的保留时间的RSD<1.30％、峰面积RSD<3.0％，证明本发明方法精密度良好。

2、稳定性试验

取岷县龙胆(MX-6)、大花龙胆(DH-14)各样品，分别按照实施例3的最佳方法制备供试品溶液。在0h、2h、4h、6h、8h及12h，精密吸取样品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测得样品保留时间与峰面积。标定0～76min的共有峰，共标定岷县龙胆(MX-6)共有峰15个、大花龙胆(DH-14)共有峰12个。结果如表6-9所示。

表.6岷县龙胆(MX-6)稳定性保留时间测定结果

表7岷县龙胆(MX-6)稳定性峰面积测定结果

表8大花龙胆(DH-14)稳定性保留时间测定结果

表9大花龙胆(DH-14)稳定性峰面积测定结果

以上测定结果表明，岷县龙胆、大花龙胆共有峰的保留时间RSD<1.20％，相对峰面积RSD<3.60％，供试品在12h内测定结果稳定，证明本发明方法稳定性良好。

3、重复性试验

取岷县龙胆(MX-6)、大花龙胆(DH-14)样品各5份，按照实施例3的最佳方法制备供试品溶液。精密吸取样品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测得样品保留时间与峰面积。标定0～76min的共有峰，标定岷县龙胆(MX-6)共有峰15个，大花龙胆(DH-14)共有峰12个。结果如表10-13所示。

表10岷县龙胆(MX-6)重复性保留时间测定结果

表11岷县龙胆(MX-6)重复性峰面积测定结果

表12大花龙胆(DH-14)重复性保留时间测定结果

表13大花龙胆(DH-14)重复性峰面积测定结果

以上测定结果表明，岷县龙胆(MX-6)、大花龙胆(DH-14)共有峰的保留时间的RSD<1.60％、峰面积RSD<4.00％，证明本发明方法的重复性好。

4、重现性试验

取岷县龙胆(MX-6)、大花龙胆(DH-14)样品各5份，由不同人员、在不同实验室按照实施例3的最佳方法制备供试品溶液。

精密吸取样品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，AgilentTechnologies1260Infinity型高效液相色谱仪测定。结果如图9所示。

结果表明，所得色谱图中的色谱峰分离效果较好，证明本发明方法重现性较好。

实施例6大花龙胆和岷县龙胆的区分

取按照实施4方法制备得到的(请核实)对照品溶液10μL，按照本发明的方法检测，各参照色谱峰的保留时间如表14所示。同时对大花龙胆(DH-14)、岷县龙胆(MX-6)样品指纹图谱的主要色谱峰提取光谱曲线，保留时间和紫外吸收曲线，结果如图10所示。

表14对照品溶液中的参照色谱峰保留时间

结果显示，大花龙胆和岷县龙胆的图谱差异大，大花龙胆獐牙菜苦苷、龙胆苦苷的色谱峰不明显。因此，本发明的检测方法可以有效区分大花龙胆和岷县龙胆。

实施例7白花龙胆不同基原品种及近似品种和混伪品的区分

1、不同品种间的特征图谱对比

将收集的62批样品按照实施例1的方法检测。各个品种分别经相关系数软件两两对比，筛选出相似度较高的样品确定为特征图谱并进行比较，结果如图11-14所示。

结果表明，不同物种的HPLC特征图谱峰的数目、峰高、峰面积均有差别。其中，条纹龙胆与其他白花龙胆的基原品种差异尤为明显；白花龙胆与其混伪品乌奴龙胆、麻花秦艽、中药龙胆草相比，差异尤为明显。

因此，通过特征图谱对比，即可有效鉴别条纹龙胆、乌奴龙胆、麻花秦艽和中药龙胆草。

2、白花龙胆、蓝花龙胆、混伪品及中药龙胆草的指纹图谱数据分析

基于Matlab软件，采用中南大学“计算机辅助相似度评价系统”对62批样品的指纹图谱数据，进行主成分分析。用dps软件进行系统聚类分析，卡方距离，离差平方和法。结果如图15和图16所示。

由图15可知，白花龙胆、蓝花龙胆及其混伪品明显聚成了3个区域。Ⅰ区主要为大花龙胆样品(1～17号)、短柄龙胆(18～26号)，Ⅱ区主要为高山龙胆(27～33)、岷县龙胆(34～39号)，Ⅲ区主要为蓝花类龙胆(45～52号)、麻花艽(53～55号)、乌奴龙胆(56～59)、条纹龙胆(40～44号)。且Ⅲ区的蓝花龙胆、麻花秦艽等与Ⅱ区高山龙胆、岷县龙胆接近，与Ⅰ区大花龙胆、短柄龙胆较远。

由图16结果可见，在卡方距离为65.24分为两大类，大花龙胆与短柄龙胆距离较近，岷县龙胆与高山龙胆较近，且高山龙胆有茎、无茎植株没有种间差异，需要进一步。从WNLD-1-G(植株地下部分)、WNLD-2-G(植株地下部分)、DB-5-G(植株地下部分)样品可知，样品的地上部分与地下部分差异较大。

因此，通过指纹图谱数据分析，即可有效鉴别白花龙胆与蓝花龙胆、混伪品及中药龙胆草。

3、近似种的HPLC指纹图谱数据分析

将大花龙胆、短柄龙胆共26批样品指纹图谱数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版的色谱峰进行校正，进行相似度计算，标定9个共有峰。结果如图17和图18，以及表15所示。

通过KMO检验、球形检验各个峰相关程度较好，取值有联系，可以进行主成分分析。并根据主成分得分值用Origin8.0.SR4软件绘制投影图。结果如图19和表16、17所示。

表15大花龙胆与短柄龙胆间的相似度比较

表1626批大花龙胆、短柄龙胆共有峰峰面积

表17大花龙胆、短柄龙胆样品主成分得分

结果表明，大花龙胆样品间的相似度>0.92，短柄龙胆样品间相似度>0.96，大花龙胆与短柄龙胆的相似度在0.8～0.9之间。从主成分分析的三维投影图分析，短柄龙胆的样品间距离较近，大花龙胆样品较分散，反应出样品间差异较大。值得注意的是，样品4、18、15、13距离较远，分析原因发现，其样品是存放了3年的药材，说明了存放时间对化学成分有影响。

因此，可以通过相似度的比较和主成分分析鉴别大花龙胆与短柄龙胆，还可以进一步鉴别出药材的新鲜度。

4、高山龙胆无茎植株、高山龙胆有茎植株、岷县龙胆及蓝花类龙胆的主成分分析

由于蓝花类龙胆与高山龙胆(有茎)、高山龙胆(无茎)、岷县龙胆的高效液相指纹图谱峰也较相似，将以上4者共19批样品进行分析，方法同前项。共标定8个共有峰。结果如图20、图21和图22，以及表18～20所示。

表18高山龙胆、岷县龙胆、蓝花类龙胆间的相似度比较

表1919批高山龙胆、岷县龙胆及蓝花类龙胆共有峰峰面积

表20高山龙胆、岷县龙胆与蓝花类龙胆样品的主成分得分

结果表明，高山龙胆与岷县龙胆相似度较高，相似度>0.85，高山龙胆“无茎”植株、高山龙胆“有茎”植株的相似度较高，相似度为0.98。蓝花龙胆与前两者相似度较低0.29～0.7。从主成分分析得分分析，总体看高山龙胆、岷县龙胆距离较近，与蓝花龙胆距离较远。岷县龙胆样品中，样品9号(批号MX-3)存放时间较久，12号(MX-6花偏白色)，与其他样品相似度较低，距离较远。说明样品存放时间对其化学成分有影响，这与前面的研究结果一致。

因此，可以通过相似度的比较和主成分分析鉴别以上近似品种，还可以进一步鉴别出药材的新鲜度。

综上所述，本发明的检测方法，得到了出峰量较多和峰形较好的指纹图谱，不仅可以有效分辨白花龙胆与其近似品种和混伪品，还可以准确区分白花龙胆的不同基原品种及不同存放时间的药材。因此，本发明的检测方法可以有效保障白花龙胆的品质。

Claims (10)

1.白花龙胆的HPLC检测方法，其特征在于：包括如下操作步骤：

(1)取待检药材标准品，甲醇提取，制备供试品溶液；

(2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，检测即可，建立标准指纹图谱，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料；

检测波长：240±3nm；

流动相：A相为0.1～0.3％磷酸水溶液，B相为甲醇，梯度程序如下：

(3)取待检药材，按照步骤(1)和(2)的方法得到指纹图谱，将其与标准指纹图谱的对比即可。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，采用超声或者回流提取。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，所述色谱柱尺寸为4.6×250mm，5μm。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，流动相流速为1.0mL/min。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，柱温：30℃。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述待检药材为大花龙胆、短柄龙胆、高山龙胆无茎植株、高山龙胆有茎植株、岷县龙胆或条纹龙胆。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述指纹图谱的参照物为獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、异荭草苷和异牡荆苷。

8.一种蓝花龙胆、麻花秦艽或龙胆草HPLC检测方法，包括如下操作步骤：

(1)取待检药材标准品，甲醇提取，制备供试品溶液；

(2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，检测即可，建立标准指纹图谱，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料；

检测波长：240±3nm；

流动相：A相为0.1～0.3％磷酸水溶液，B相为甲醇，梯度程序如下：

(3)取待检药材，按照步骤(1)和(2)的方法得到指纹图谱，将其与标准指纹图谱的对比即可。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，所述色谱柱尺寸为4.6×250mm，5μm，流动相流速为1.0mL/min，柱温为30℃。

10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述指纹图谱的参照物为獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、异荭草苷和异牡荆苷。