CN118090974A - 一种普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法及应用，所述检测方法采用高效液相色谱法，以乙腈‑水溶液或甲醇‑水溶液为流动相A，以含有十二烷基硫酸钠的磷酸水溶液或含有十二烷基硫酸钠的磷酸二氢钾溶液为流动相B进行梯度洗脱，设定分段检测波长0～30min：275nm～285nm，30～55min：340nm～350nm。实现了对普济消毒复方制剂中包含黄芩、黄连和牛蒡子3味药的有效成分进行同时检测，实现了对黄芩苷、牛蒡苷和盐酸小檗碱三个极性相似的成分稳定的分离，并定量和定性，本发明检测方法专属性强，重现性好、精密度高、可操作强，可实现普济消毒复方制剂的工艺开发过程中中间产品的监控。

Description

一种普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法及应用

技术领域

本发明属于药物制剂质量控制技术领域，具体涉及一种普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法及应用。

背景技术

普济消毒散是收录于《中华人民共和国兽药典》(2020年版二部)的中药散剂，具有清热解毒、疏风消肿的功效，临床多用于畜禽热毒上冲的防治。方中黄芩和黄连清泻上焦热毒，为君药；牛蒡子、连翘、薄荷、荆芥、柴胡和升麻疏风透邪，为臣药；马勃、板蓝根和青黛解毒消肿、清利咽喉，玄参滋阴降火，陈皮理气散结，滑石和大黄导热下行，为佐药；桔梗开肺透邪、引药上行，甘草调和诸药，为使药。诸药合用，共奏清热解毒、疏风消肿之功。该方对畜禽因多种病毒和细菌引起的反复发热和高烧不退症有确切的疗效，对目前流行的“猪高热病”、蓝耳病等热症型病毒病有很好的预防和治疗作用。然而在集约化养殖模式下，中药散剂存在拌料不均且质量难以控制等缺点，无法满足市场需求。在普济消毒散的配方的基础上，将其开发成口服溶液制剂更加适应现代集约化养殖模式的用药需求，具有广阔的应用前景。

在开发过程中，其质量控制尤其是有效成分含量控制是普济消毒口服液开发的重中之重。《中国兽药典》(2020年版)二部收载了普济消毒散方剂，并规定了通过显微镜镜检药材和盐酸小檗碱薄层鉴别的方法对产品进行质量监控。上述鉴别方法可作为普济消毒口服液早期药材选择的检测依据，但由于缺少有效成分的含量测定，故不能作为普济消毒口服液最终质量控制方法。普济消毒口服液为多组分复杂体系，发挥疗效作用的成分复杂，主要有效成分有黄芩苷(黄酮类)、牛蒡苷(木脂素类)和盐酸小檗碱(生物碱类)等，采用高效液相色谱法检测目标成分的含量较薄层鉴别更直观简单。但现有的高效液相检测方法大多针对某单一成分或某单一种类成分进行研究，对整体相关成分研究较少，且应用到某一制剂时专属性差。张慧月等人采用乙腈-0.1％磷酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱，出现盐酸小檗碱保留时间不稳定，且峰出现拖尾，峰型差，当盐酸小檗碱的含量升高时与未知成分分离度不够，无法保证含量结果的准确性(张慧月,孙磊,吴记勇.基于高效液相色谱法测定普济消毒饮主要有效成分含量的方法学研究[J].抗感染药学,2023,20(04):350-354.)。另外，也有文献报道采用不同的检测方法分别检测各组分，此操作会导致频繁更改色谱条件，工作量大且检测周期过长(石征蓉,糖肾清毒颗粒的制备工艺及质量控制研究,2018,成都中医药大学.；牟英迪与林吉茂,HPLC程序波长法测定牛黄上清丸中黄芩苷、连翘苷和盐酸小檗碱.中成药,2013.35(09):第1933-1936页.)。由于可获取检测方法的局限性，普济消毒口服液本身制剂成分的复杂性，以及黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱主要成分极性的相似性，因此，如何提供一种能够有效把控研究普济消毒口服液的主要成分，监控其质量，成为了亟待解决的问题。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法及应用，能同时对普济消毒复方制剂中含有的黄芩、黄连和牛蒡子等多味药同时进行检测，对普济消毒复方制剂质量进行全面评价。

第一方面，本发明提供了一种普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法，其特征在于，所述普济消毒复方制剂中至少包含黄芩、黄连和牛蒡子，所述检测方法采用高效液相色谱法，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相A为乙腈-水溶液或甲醇-水溶液，流动相B为含有十二烷基硫酸钠的磷酸水溶液或含有十二烷基硫酸钠的磷酸二氢钾溶液，所述高效液相色谱法采用梯度洗脱，洗脱程度为：

0～20min，流动相A的体积分数为22％，流动相B的体积分数为78％；

20～24min，流动相A的体积分数由22％匀速变为50％，流动相B的体积分数由78％匀速变为50％；

24～43min，流动相A的体积分数为50％，流动相B的体积分数为50％；

43～44min，流动相A的体积分数由50％匀速变为22％，流动相B的体积分数由50％匀速变为78％；

第44～45min，流动相A的体积分数为22％，流动相B的体积分数为78％；

高效液相色谱法的检测波长为210～350nm；

进一步地，所述检测波长设定程序为：0～30min：275nm～285nm，30～55min：340nm～350nm。

进一步地，所述流动相A中乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的体积分数为50％～100％，包括但不限于选择体积分数为50％、60％、70％、80％、90％或100％的乙腈-水溶液或甲醇-水溶液；

优选地，所述乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的体积分数为90％～100％。

进一步地，所述流动相B为含有十二烷基硫酸钠的磷酸水溶液或含有十二烷基硫酸钠的磷酸二氢钾溶液的配制方法为：先配制质量百分比浓度为0.05％～0.2％的磷酸水溶液或磷酸二氢钾溶液，然后加入十二烷基硫酸钠溶解，每升磷酸水溶液或磷酸二氢钾溶液中加入0.5g～2g十二烷基硫酸钠。

更进一步地，所述的每升磷酸水溶液或磷酸二氢钾溶液中可选择加入质量为0.5g～2g，如0.5g、1g、1.5g或2g等的十二烷基硫酸钠，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

更进一步地，所述质量百分比浓度为0.05％～0.2％的磷酸水溶液或磷酸二氢钾溶液的质量百分比浓度可选择为0.05％、0.1％、0.15％或0.2％等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

进一步地，所述高效液相色谱法的色谱柱温为20～40℃。

优选地，所述高效液相色谱法的色谱柱温可以是20℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃或40℃等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

进一步地，所述高效液相色谱法的流动相流速为0.5～1.5mL/min。

优选地，所述高效液相色谱法的流动相流速可以是0.5mL/min、0.7mL/min、0.9mL/min、1.1mL/min、1.3ml/min或1.5mL/min等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

进一步地，所述高效液相色谱法的进样体积为5～10μL。

进一步地，所述普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法至少包含同时检测黄芩苷、牛蒡苷和盐酸小檗碱；

所述普济消毒复方制剂还包含连翘、薄荷、荆芥、柴胡、升麻、马勃、板蓝根、青黛、玄参、陈皮、滑石、大黄、桔梗、甘草等中药材；但不限于以上所列举的中药材，例如其他未列举的普济消毒复方制剂中含有的中药材同样适用。

进一步地，所述普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法多还可检测连翘、薄荷、荆芥、柴胡、升麻、马勃、板蓝根、青黛、玄参、陈皮、滑石、大黄、桔梗、甘草等中药材的有效药用成分；但不限于以上所列举的中药材的有效药用成分，例如其他未列举的普济消毒复方制剂中的中药材有效药用成分同样适用。

第二方面，本发明还提供了普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法的具体步骤如下：

S1、供试品溶液的制备

精密量取普济消毒复方制剂与溶剂混合溶解，过滤取滤液得到供试品溶液；

S2、对照品溶液的制备

精密称定黄芩苷、牛蒡苷和盐酸小檗碱对照品适量，加溶剂制成混合对照品溶液；

S3、高效液相色谱检测

将对照品溶液和供试品溶液进行高效液相检测，记录色谱图，计算供试品样品中黄芩苷、牛蒡苷和盐酸小檗碱的含量。

第三方面，本发明的普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法可应用在普济消毒散、普济消毒口服液、普济消毒饮的质量控制中的应用，但不限于以上所列举的剂型。

第四方面，本发明的普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法在包含黄芩、黄连和牛蒡子3味药的中药材原料或者固体药物制剂的质量控制中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)本发明首次建立高效液相含量测定方法用于普济消毒口服液等相关制剂的检测，也可用于普济消毒散相关制剂工艺开发过程中中间产品的监控。确立了与临床发挥疗效作用相关的黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱作为指标成分，打破了普济消毒口服液未有指标成分反映整体含量的壁垒，可以从整体上、宏观上控制普济消毒口服液的内在质量，保证了产品的疗效，使普济消毒口服液得到了更为正规的质量控制。本发明方法专属性强，重现性好、精密度高、可操作强，易于应用。

(2)本发明建立的方法能够采用统一检测方法，同时检测黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱三个成分的含量，能够将三个极性相似的成分稳定的分离开，且不受其他成分的干扰，避免了采用三种不同检测方法分别检测上述3个成分的繁琐过程，大大的缩短了检测时间，提高了检测效率。

附图说明

图1为专属性试验液相色谱图，图中序号1、供试品溶液；序号2、混合对照品溶液；序号3、缺黄芩药材阴性对照溶液；序号4、缺黄连药材阴性对照溶液；序号5、缺牛蒡子药材阴性对照溶液；序号6、缺黄芩药材阴性对照溶液加黄芩苷对照品；序号7、缺黄连药材阴性对照溶液加盐酸小檗碱对照品；序号8、缺牛蒡子药材阴性对照溶液加牛蒡苷对照品。

图2为混合对照品溶液液相色谱图。

图3为供试品溶液色谱图。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

实施例1普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测

本实施例的普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法的具体步骤如下：

S1、供试品溶液的制备

精密量取普济消毒口服液(由广东温氏大华农生物科技有限公司动物保健品厂生产，成分为：是由普济消毒散提取浓缩制备而成，主要含有黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱等有效成分，本品每1mL含黄芩以黄芩苷(C₂₁H₁₈O₁₁)计，不得少于2.80mg；含牛蒡子以牛蒡苷(C₂₇H₃₄O₁₁)计，不得少于3.60mg；含黄连以盐酸小檗碱(C₂₀H₁₇NO₄·HCl)计，不得少于0.80mg。)与溶剂混合溶解，用0.22μm滤膜过滤取滤液得到供试品溶液；

S2、混合对照品溶液的制备

精密称定黄芩苷对照品(批号：Z0271705，含量：96.8％，购自中国兽医药品监察所)、牛蒡苷对照品(批号：110819-201812，含量：95.0％，购自中国兽医药品监察所)、盐酸小檗碱对照品(批号：Z0221507，含量：96.8％，购自中国兽医药品监察所)，加溶剂制成混合对照品溶液；

S3、高效液相色谱检测

将对照品溶液和供试品溶液进行高效液相检测，记录色谱图，计算供试品样品中黄芩苷、牛蒡苷和盐酸小檗碱的含量。

本实施例中检测条件的确定方法如下：

(1)高效液相色谱的检测波长确定

《中国兽药典》中牛蒡子、黄芩药材含量测定项下牛蒡苷、黄芩苷的检测波长为280nm，黄连药材中含量测定项下盐酸小檗碱的检测波长为345nm；本发明发采用全波长280nm和280nm、345nm分段波长检测样品，根据盐酸小檗碱的峰面积响应值来判定供试品的适宜检测波长；

结果如表1，表明在280nm、345nm分段波长(0～30min：285nm，30～55min：345nm)的检测条件下，盐酸小檗碱的响应值最高，最终选用280nm、345nm分段波长作为含量检测波长。

表1：不同检测波长下的黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱的平均峰面积

(2)高效液相色谱的色谱流动相确定

研究选用最常见的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6μm，粒径为5μm)的柱子、在柱温30℃，进样量10μL的色谱条件下进行流动相的筛选，以表2的流动相进行梯度洗脱，为达到含量检测要求，以分离度高，峰型好的流动相为最优动选择；

根据表2的试验结果表明，最终以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液(每升加1g十二烷基硫酸钠)溶液为流动相B，进行梯度洗脱，具体如表3；

表2：流动相的优化及结果

表3：流动相的洗脱程序

(3)供试品制备方法的优化

选择乙腈、50％乙腈、甲醇、50％甲醇作为提取溶剂，分别精密取供试品1mL，分别用提取溶剂定容至100mL，摇匀后过滤上机检测黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱三个指标成分的峰面积，结果如表4所示，不同溶剂提取的三个指标成分的峰面积相差较大，其中甲醇作为提取溶剂获得黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱的峰面积最高，提取效果最好；最终确定供试品溶液制备的方法为精密量取供试品1mL，置于100mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

表4：不同提取溶剂获得的黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱的峰面积

(4)溶液准备

供试品溶液：精密量取供试品1mL，置于100mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

对照品溶液：分别取黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇适量，稀释成每1ml分含0.9、0.9、0.2mg/mL的一级储备液；

混合对照溶液：精密量取黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱一级储备液适量，加甲醇稀释，制备成1mL分别约含黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱0.045、0.045、0.01mg/mL的混合对照品溶液；

阴性对照溶液：按照普济消毒口服液中药味比例，分别制备缺黄芩、黄连、牛蒡子药材的阴性样品，按照供试品溶液的制备方法制备各阴性对照溶液。

实施例2普济消毒复方制剂中多种有效成分的含量检测方法学验证

(1)系统适用性

按实施例1中的溶液准备方法制得混合对照溶液以及最佳色谱条件，将混合对照溶液重复进样测定6次，色谱图见图2，并进行分析，以《中国兽药典》2020版黄芩、黄连、牛蒡子药材含量测定项下的理论塔板数要求为判定依据，试验结果见表5、表6：

表1：系统适用性试验理论塔板数结果

表6：系统适用性保留时间、峰面积试验结果

由表5、表6结果可知，黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱峰理论塔板数分别不低于2500、1500、5000，三个指标成分均满足要求；黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱峰保留时间的相对标准偏差分为0.50％、0.70％，0.15％；黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱峰面积测量值的相对标准偏差分别为1.31％、1.46％、1.38％；综上，黄芩苷、牛蒡苷和盐酸小檗碱峰的保留时间以及峰面积的相对标准偏差均小于2.0％，理论塔板数满足要求。所以系统适用性试验表明该色谱条件可以满足分析要求。

(2)专属性

按实施例1中的溶液准备方法以及最佳色谱条件，取配制好的普济消毒口服液供试品溶液、普济消毒口服液中缺黄芩药材、缺牛蒡子药材、缺黄连药材的阴性对照溶液、含黄芩苷、盐酸小檗碱、牛蒡苷的混合对照溶液进样测定；结果表明供试品在黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱出峰位置均无杂峰干扰(见图1)，说明普济消毒口服液中黄芩苷、牛盐酸小檗碱、牛蒡苷与其它杂峰均能有效分离、专属性强。

(3)检测限、定量限

精密称量适量的黄芩苷、牛蒡苷和盐酸小檗碱对照品，分别配制成含有0.04495、0.0454、0.01mg/mL的混合对照品，精密量取5、3.33、2.5、1.25、1、0.5、0.25mL倍到50mL量瓶中，黄芩苷的上机浓度为0.225～4.50μg/mL、牛蒡苷的上机浓度为0.227～4.54μg/mL、盐酸小檗碱的上机浓度为0.05～1μg/mL，取10μL进样，取相应保留值附近的基线，测量噪音峰高，以S/N为3的浓度为检测限，以S/N为10的浓度为定量限；经测定，黄芩苷的检测限0.225μg/mL与定量限为0.450μg/mL；牛蒡苷的检测限1.135μg/mL与定量限3.027μg/mL；盐酸小檗碱的检测限0.05μg/mL与定量限为0.1μg/mL。

(4)线性范围

分别精密称黄芩苷、盐酸小檗碱和牛蒡苷对照品至量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含黄芩苷、盐酸小檗碱和牛蒡苷终浓度分别为0.1349mg/mL、0.1364mg/mL、0.0302mg/mL的混合对照品溶液，并精密量取25mL、12.5mL、8.33mL、6.25mL、5mL、4.17mL到50mL容量瓶，用甲醇稀释定容，摇匀，得黄芩苷的浓度范围为0.0112～0.1349mg/mL、牛蒡苷的浓度范围为0.0114～0.1364mg/mL、盐酸小檗碱的浓度范围0.0025～0.0302mg/ml，取10μL进行上机测定，记录色谱图重复三次，以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得到回归方程，结果见表7说明在该线性范围内，黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱相关性好(R2＞0.999)，可以满足含量检测的要求。

表7：黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱标准曲线以及相关性

(5)准确度

取已知含量的普济消毒口服液9份，每份1mL，置于100mL的容量瓶中，分别精密称取黄芩苷对照品、牛蒡苷、盐酸小檗碱各3份，加入含有普及普济消毒口服液的容量瓶中，制备成3个不同添加浓度的添加样品。

按实施例1中的溶液准备方法配制供试品溶液，另取黄芩苷、盐酸小檗碱和牛蒡苷对照品配制混合对照品溶液，进样检测，计算添加样品中黄芩苷、盐酸小檗碱和牛蒡苷含量，并计算回收率，结果见表8～10；

表8：黄芩苷的添加回收率结果

表9：牛蒡苷的添加回收率结果

表10：盐酸小檗碱的添加回收率结果

(6)重复性

按实施例1中的溶液准备方法，取普济消毒口服液配制6份供试品溶液，同时制备混合对照品溶液，进样测定，记录色谱图见图3，结果见表11，样品中黄芩苷、盐酸小檗碱、牛蒡苷含量的RSD分别为1.21％、1.49％、0.74％、均小于2％，表明本方法的重复性良好。

表11：黄芩苷、盐酸小檗碱、牛蒡含量检测的重复性试验结果

(7)中间精密度

在不同的试验条件下，不同的试验人员在不同的时间，按实施例1中的溶液准备方法各配制6份相同浓度的供试品溶液，同时制备混合对照品溶液，进样测定，记录色谱图，结果见表12，结果显示，RSD均小于2％，表明含量检测方法的中间精密度好。

表12：黄芩苷、盐酸小檗碱、牛蒡含量检测的中间精密度试验结果

(8)稳定性

按实施例1中的溶液准备方法以及最佳色谱条件，分别在0、2、4、8、12、48h进样，并计算供试品含量，结果见表13，表明供试品溶液在48h内，黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱的含量变化不大，供试品溶液在48h内稳定性良好。

表13：供试品溶液放置稳定性试验结果

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(9)耐用性

按实施例1中的溶液准备方法制备混合对照品溶液，上机检测，分别考察流动相乙腈比例±0.5％，流速变化±5％，波长±2nm，进样量±1μL，柱温±5℃，不同色谱柱、不同仪器的色谱行为变化，详见表14，观察基线分离情况、峰面积、杂质峰对黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱的干扰情况。

含量测定耐用性试验结果表明：在流动相乙腈比例±0.5％、流速变化±5％，波长±2nm，进样量±1μL，柱温±5℃，不同色谱柱、不同仪器等色谱条件下进行试验，普济消毒口服液中黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱与其他杂质峰的分离度均符合要求，系统适用性试验结果均符合兽药典高效液相色谱法的规定，计算各条件下样品含量均符合规定。

表14：黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱含量测定方法学验证耐用性试验结果

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(10)样品中黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱的含量测定

按实施例1中的检测方法，6批普济消毒口服液样品中黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱的含量测定结果见表15；

表15：样品中黄芩苷、牛蒡苷、盐酸小檗碱的含量测定

综上所述，本发明提供的一种普济消毒口服液中同时检测3种有效成分的高效液相检测方法具有专属性强、准确度高和重复性良好的优点，可以用于定量分析。所以，本发明有效克服了现有技术中的专属性不强，分离度不高、检测周期长等缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅为本发明的优选实施方式，本发明中所提到的一种普济消毒口服液中同时检测3种有效成分的高效液相检测方法不限于上述几种，因此上述实施例不能看作时对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员在本发明的基础上所作的任何非实质性的变化及替换均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法，其特征在于，所述普济消毒复方制剂中至少包含黄芩、黄连和牛蒡子，所述检测方法采用高效液相色谱法，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相A为乙腈-水溶液或甲醇-水溶液，流动相B为含有十二烷基硫酸钠的磷酸水溶液或含有十二烷基硫酸钠的磷酸二氢钾溶液，所述高效液相色谱法采用梯度洗脱，洗脱程度为：

0～20min，流动相A的体积分数为22％，流动相B的体积分数为78％；

20～24min，流动相A的体积分数由22％匀速变为50％，流动相B的体积分数由78％匀速变为50％；

24～43min，流动相A的体积分数为50％，流动相B的体积分数为50％；

43～44min，流动相A的体积分数由50％匀速变为22％，流动相B的体积分数由50％匀速变为78％；

第44～45min，流动相A的体积分数为22％，流动相B的体积分数为78％；

高效液相色谱法的检测波长设定程序为：0～30min：275nm～285nm，30～55min：340nm～350nm。

2.据权利要求1所述的普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法，其特征在于，所述乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的体积分数为50％～100％。

3.根据权利要求1所述的普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法，其特征在于，所述含有十二烷基硫酸钠的磷酸水溶液或含有十二烷基硫酸钠的磷酸二氢钾溶液的配制方法为：先配制质量百分比浓度为0.05％～0.2％的磷酸水溶液或磷酸二氢钾溶液，然后加入十二烷基硫酸钠溶解，每升磷酸水溶液或磷酸二氢钾溶液中加入0.5g～2g十二烷基硫酸钠。

4.根据权利要求1所述的普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的色谱柱温为20～40℃。

5.根据权利要求1所述的普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的进样体积为5～10μL。

6.根据权利要求1所述的普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的流动相流速为0.5～1.5mL/min。

7.根据权利要求1所述的普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法，其特征在于，所述普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法至少包含同时检测黄芩苷、牛蒡苷和盐酸小檗碱。

8.根据权利要求1所述的普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法，其特征在于，所述检测方法的步骤为：

S1、供试品溶液的制备

精密量取普济消毒复方制剂与溶剂混合溶解，过滤取滤液得到供试品溶液；

S2、对照品溶液的制备

精密称定黄芩苷、牛蒡苷和盐酸小檗碱对照品适量，加溶剂制成混合对照品溶液；

S3、高效液相色谱检测

将对照品溶液和供试品溶液进行高效液相检测，记录色谱图，计算供试品样品中黄芩苷、牛蒡苷和盐酸小檗碱的含量。

9.根据权利要求1～8任一项所述的普济消毒复方制剂中多种有效成分的检测方法在普济消毒散、普济消毒口服液、普济消毒饮的质量控制中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述指纹图谱构建方法在包含黄芩、黄连和牛蒡子3味药的中药材原料或者固体药物制剂的质量控制中的应用。