CN113358796A - 一种测定牛奶中两种β-内酰胺类抗菌药物残留的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定牛奶中两种β‑内酰胺类抗菌药物残留的方法，取1 mL牛奶于2 mL塑料离心管中，沿管壁轻轻加入0.1 mL三氯乙酸水溶液，旋涡混合30 s以上，6600 r/min离心10 min，吸取上清液于10 mL螺口刻度试管中；再加入三氯乙酸水溶液0.2 mL和7%甲醛水溶液0.2 mL，漩涡混匀30 s，加盖拧紧后水浴中加热；取出冷却至室温，用20%乙腈水溶液定至2 mL混匀，经0.22μm微孔滤膜过滤后高效液相色谱法测定分析。本发明准确、可靠、回收率高、重现性好，检测限低于我国规定的兽药残留最高检测限(10 ng/mL)，不仅提高了兽药残留检测的效率，为乳品企业和质量监督部门对AMX和AMP药物多残留分析提供理论依据和技术参考。
Description
技术领域
本发明属于食品检测领域，具体地是牛奶中2种β-内酰胺类抗菌药物分析方法的构建，即牛奶中阿莫西林(AMX)和氨苄西林(AMP)的残留分析。
背景技术
β-内酰胺类抗菌药物被广泛应用于治疗食源性动物疾病，但是长期使用或者使用不当，动物体内就会残留大量的青霉素类药物。对于动物来说体内会产生耐药性，影响药物的临床疗效。对青霉素(Penicillins，PENs)过敏的人若食用残留有β-内酰胺类抗菌药物的食品，则会产生健康危害，它会破坏人体内正常的菌群环境，导致人体免疫力的降低。而对于长期食用残留有β-内酰胺类抗菌药物的食品，相当于长期摄入低剂量的抗生素。造成的主要危害有：(1)使人体产生耐药菌株，影响临床疗效，给疾病的治愈带来不利影响；(2)对抗生素过敏的人会出现过敏反应；(3)破坏人体内正常菌群的平衡状态，使菌群发生失调，甚至会造成“二重感染”。因此各国兽药管理部门、食品卫生检疫部门、进出口贸易口岸都将β-内酰胺类抗菌药物的残留检测作为主要监控对象。
我国规定青霉素类抗菌药物在奶制品中的最高残留量为10ng/mL。阿莫西林(AMX)和氨苄西林(AMP)(中华人民共和国农业部235号公告，2002)作为治疗奶牛疾病的常用抗菌药物，奶制品中如残留此类药物不仅能引起人类不良反应，也给乳品加工业带来重大经济损失。因此，牛奶中青霉素的检测便成为我国乳品加工业中至为关注的问题。
国内常用的方法是液质联用技术、荧光HPLC法及微生物法等。但是液质联用技术其成本高昂，使用易耗品价格不易控制，使其使用和推广得到限制。为了克服以上局限性，建立一种使用简单、准确性好、灵敏度高且易于推广，价格低廉适合基层奶站和乳品加工层使用的方法显得尤为重要。
目前，残留检测的方法主要有三类，第一类是微生物检测法(TTC法、BSDA等)。第二类是理化检测方法(高效液相色谱法(HPLC)、液-质联用法(LC-MS/MS)、高效薄层色谱法(HPTLC)等)。第三类是免疫检测法(免疫检测器传感法、在线免疫亲和色谱法、间接竞争ELISA等)。这些方法各有优缺点，但总的来说抗菌药物残留检测将按3个方向发展：(1)灵敏度高的联用技术；(2)多残留组分同时检测技术；(3)现场大规模、快速筛选的免疫检测技术。
高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法是目前进行动物源性食品中抗菌药物残留检测较为常用的方法，国内外关于这2种检测方法报道较多。牛奶中PENs抗菌药物多残留检测主要采用高效液相色谱荧光检测法和液相-质谱联用法。PENs没有特定的紫外吸收需要经过衍生化，导致国内关于PENs药物残留分析的报道不多，但是国外相关的报道较多。目前检测PENs常用的是液相-质谱联用法，我国出入境检验检疫行业标准可以检测到动物源食品中的14种β-内酰胺类抗菌药物(SN/T2050-2008)，国家标准方法则可以检测到牛奶及奶粉中的9种β-内酰胺类抗菌药物(GB/T 22975-2008)。
目前采用柱前衍生HPLC紫外法同时检测牛奶中AMX和AMP残留量的分析方法还未见报告。
发明内容
本发明的目的在于建立一种基于HPLC-UV测定牛奶中2种β-内酰胺类抗菌药物残留的方法，该方法在前人研究的基础上(中国农业部第236号文件，2004)通过柱前衍生HPLC紫外法，同时检测牛奶中AMX和AMP残留，以方便没有配备质朴和荧光检测器的单位更好的监控牛奶中AMX和AMP残留情况，为乳品企业鲜乳收储以及产品质量监控提供技术支持，也为有关部门对于兽药多残留检测分析方法提供一定的参考价值，对于保障消费者身体健康和安全有着重要意义。
本发明的目的是采取以下技术方案达到的：
一种测定牛奶中两种β-内酰胺类抗菌药物残留的方法，包括以下步骤：
(1)准确量取1mL牛奶于2mL塑料离心管中，沿管壁轻轻加入0.1mL三氯乙酸水溶液(750mg/mL)，旋涡混合30s以上，6600r/min离心10min，吸取上清液于10mL螺口刻度试管中；
(2)在盛有1.0mL离心上清液的螺口刻度试管中，加入三氯乙酸水溶液(200mg/mL)0.2mL和7％甲醛水溶液0.2mL，漩涡混匀30s，加盖拧紧后置于90℃恒温水浴中加热30min；取出冷却至室温，用20％乙腈水溶液定至2mL混匀，经0.22μm微孔滤膜过滤后高效液相色谱法测定；
(3)使用Agilent 1260高效液相色谱系统进行分析，采用EclipseXDB-C18色谱柱作为分析柱，流动相为0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.5)+乙腈(85:15，V/V)，波长选择325nm，流速1.0mL/min，进样量80uL，柱温30℃。
所述牛奶中2种β-内酰胺类抗菌药物是指：阿莫西林(AMX)和氨苄西林(AMP)。
所述EclipseXDB-C18色谱柱为4.6×150mm，5μm。
所述磷酸盐缓冲液和乙腈的体积比为85:15。
本发明旨在建立一种使用简单、准确性好、灵敏度高且易于推广，价格低廉适合基层奶站和乳品加工层使用的检测牛奶中2种抗菌药物的新方法、新手段和新途径。
附图说明
图1空白牛奶样品色谱图。
图2流动相加标准品(50ng/mL)色谱图。
图3空白牛奶加标准品(50ng/mL)色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例和附图对本发明作进一步的说明。
一种测定牛奶中两种β-内酰胺类抗菌药物残留的方法，包括以下步骤：(1)准确量取1mL牛奶于2mL塑料离心管中，沿管壁轻轻加入0.1mL三氯乙酸水溶液(750mg/mL)，旋涡混合30s以上，6600r/min离心10min，吸取上清液于10mL螺口刻度试管中；(2)在盛有1.0mL离心上清液的螺口刻度试管中，加入三氯乙酸水溶液(200mg/mL)0.2mL和7％甲醛水溶液0.2mL，漩涡混匀30s，加盖拧紧后置于90℃恒温水浴中加热30min；取出冷却至室温，用20％乙腈水溶液定至2mL混匀，经0.22μm微孔滤膜过滤后高效液相色谱法测定；(3)使用Agilent1260高效液相色谱系统进行分析，采用EclipseXDB-C18色谱柱作为分析柱，流动相为0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.5)+乙腈(85:15，V/V)，波长选择325nm，流速1.0mL/min，进样量80uL，柱温30℃。
本发明是通过以下实验得出的：
1、溶液及样品制备：
(1)标准储备液(Stock Standars Solutions，SSS)
精密称取AMX和AMP标准品各10mg(精确到0.00001g)，用乙腈水溶液(1:1)溶解并稀释，配制成浓度为1mg/mL标准储备液，-20℃下避光保存不超过1个月，使用液逐级稀释，现用现配。
(2)混合标准工作液(Wokring Standards Solutions，WSS)
分别吸取AMX和AMP标准储备液各1mL于100mL棕色容量瓶中，用水稀释成浓度为1μg/L混合标准工作液，现用现配。
(3)样品的前处理：用750mg/mL三氯乙酸水溶液提取、200mg/mL三氯乙酸水溶液和7％甲醛水溶液衍生化对牛奶样品进行前处理。
2、提取条件的优化
根据文献资料，选用750mg/mL三氯乙酸水溶液作为提取液，200mg/mL三氯乙酸水溶液、7％甲醛水溶液作为衍生化试剂，比较提取液和衍生化试剂不同加入量对2种抗菌药物回收率的影响。结果如表1所示，提取液和衍生化试剂的加入量分别为0.1mL和0.4mL时，AMX和AMP回收率最高，分别为82％和80％；因此确定提取液和衍生化试剂的加入量分别为0.1mL和0.4mL。
表1、不同提取液和衍生化试剂加入量对抗菌药物回收率的影响(n＝3)
3、色谱条件的优化
选用0.02mol/L磷酸盐缓冲液+乙腈作为本试验的流动相，并对流动相配比、流动相pH、检测波长、进样量、流速和柱温进行筛选。最终选择影响较大的3个因素：流速(A)、柱温(B)和流动相pH(C)作为主要研究对象，采用表2条件做正交试验，通过比较回收率的高低确定最终条件，以便进行下一步试验。结果如表3所示，试验号5的回收率最高，2种药物的回收率分别为86％、87％，因此确定色谱条件为：流速1.0mL/min，柱温30℃，pH8.5。
表2、因素水平表
表3、正交试验表及结果(n＝3)
4、特异性和专一性
特异性和专一性考察是采用空白样品进行试验，如果空白牛奶样品色谱图中在待测物附近没有干扰峰存在或者杂质，能够与待测物很好的分离，且不影响药物的定性和定量，即可说明该方法的特异性和专一性良好。空白牛奶样品、混合标准工作液、空白牛奶样品添加混合标准工作液色谱图，见图1～3，从色谱图中可以看出空白样品在待测物附近没有明显的干扰峰存在，虽然有些小峰存在，但对2种药物的定量和定性没有干扰，且待测2种药物之间能够在15min内有效的分离，说明方法的特异性和专一性良好，能够满足β-内酰胺类抗菌药物残留分析要求。
5、标准曲线的制备
吸取一定体积空白牛奶样品加入塑料离心管中，加入适当体积混合标准工作液，对牛奶进行前处理，制成所需浓度加标样品，经0.22μm微孔滤头过滤上机检测。AMX、AMP线性关系和相关系数见表4，2种药物在10～200ng/mL范围内线性关系良好，r2均大于0.99。
表4、2种药物的线性关系和相关系数(n＝3)
6、方法检测限和定量限的确定
牛奶中添加不同浓度的混合标准工作液，按上述步骤进行测定，以S/N>3为最低检测限，以S/N>3且变异系数和回收率均符合检测要求的最低浓度作为样品中AMX和AMP的最低定量限。按外标法计算含量，并进行多点或单点校正。本方法对牛奶中AMX和AMP分离效果较好，色谱图见图3。检测限和定量限分别为5ng/mL和10ng/mL。
7、准确度与精确度测定
精密量取空白牛奶样品2mL，加入适量体积的混标标准工作液，制得浓度为10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL阳性添加样品(农业部规定AMX和AMP在牛奶中的最高残留限量(MRL)为10ng/mL)，样品经前处理后经HPLC测定，同一天内每个浓度分别进样测定5次，取平均值，每种样品重复5天，计算日内变异系数和回收率，即方法的准确度和精确度。AMX和AMP在牛奶中的提取回收率和变异系数见表5，从表中结果显示AMX和AMP的回收率分别为80％、85％、91％、90％、101％；82％、84％、90％、83％、100％，变异系数为1.5％、1.6％、1.2％、1.5％、1.3％；1.4％、1.3％，1.2％、1.8％、1.7％。
表5、牛奶中2种药物的回收率和变异系数测定结果(n＝5)
8、稳定性试验
取混合标准工作液，用水稀释成浓度为10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL混标溶液，按照上述色谱条件，每个浓度分别进样测定5次，每周测定一次，取平均值，考察方法的稳定性。取混合标准工作液，用水稀释成浓度为10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL，按照上述色谱条件，每个浓度分别进样测定5次，每周测定一次，记录图谱，所得图谱中的峰面积相对标准差均小于5％。
本发明通过液-液萃取技术结合HPLC-UV直接用于牛奶中2种β-内酰胺类抗菌药物残留检测，前处理方法简单、分析速度快、普及性强，为牛奶中的抗菌药物残检测提供了新方法、新手段和新途径。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (4)
1.一种测定牛奶中两种β-内酰胺类抗菌药物残留的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）准确量取1 mL牛奶于2 mL塑料离心管中，沿管壁轻轻加入0.1 mL、浓度750 mg/mL的三氯乙酸水溶液，旋涡混合30 s，6600 r/min离心10 min，吸取上清液于10 mL螺口刻度试管中；
（2）在盛有1.0 mL离心上清液的螺口刻度试管中，加入浓度200mg/mL的三氯乙酸水溶液0.2 mL和7%甲醛水溶液0.2 mL，漩涡混匀30 s，加盖拧紧后置于90℃恒温水浴中加热30min；取出冷却至室温，用20%乙腈水溶液定至2 mL混匀，经0.22 μm微孔滤膜过滤后高效液相色谱法测定；
（3）使用Agilent 1260高效液相色谱系统进行分析，采用EclipseXDB-C18色谱柱作为分析柱，磷酸盐为流动相缓冲液，波长选择325nm，流速1.0mL/min，进样量80 uL，柱温30℃。
2.如权利要求1所述的一种测定牛奶中两种β-内酰胺类抗菌药物残留的方法，其特征在于：所述牛奶中残留2种β-内酰胺类抗菌药物指阿莫西林AMX和氨苄西林AMP。
3.如权利要求1所述的一种测定牛奶中两种β-内酰胺类抗菌药物残留的方法，其特征在于：EclipseXDB-C18色谱柱为4.6×150 mm，5 μm。
4.如权利要求1所述的一种测定牛奶中两种β-内酰胺类抗菌药物残留的方法，其特征在于：所述流动相缓冲液磷酸盐pH8.5，浓度0.02 mol/L，磷酸盐与乙腈体积比为85:15。
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