CN106033081A - 一种粮食样品中硒形态的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种粮食样品中硒形态的测定方法，包括如下步骤：1）检测的前期准备；2）粮食样品硒形态的提取；3）建立HPLC-HGAFS联用技术；4）上机测试与结果计算。该方法成本低，操作简便，提取效率高，可同时准确测定硒代胱氨酸（SeCys₂）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、亚硒酸钠（Na₂SeO₄）、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒酸钠（Na₂SeO₄）五种硒形态和含量。

Description

一种粮食样品中硒形态的测定方法

技术领域

本发明涉及一种粮食样品中硒形态的测定方法，属于分析化学领域。

背景技术

硒是人体必须的微量元素之一，是谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的组成成分，具有清除体内自由基、抗细胞脂膜过氧化、抗衰老、抗癌防癌、拮抗重金属毒性等生物学功能。硒缺乏会导致克山病、白肌病、地方性癌症等疾病的发病率增高。我国有2/3的地区缺硒，其中1/3地方严重缺硒。根据我国13省份普查显示，人均每日硒摄入量仅为36微克，低于世界卫生组织推荐的日常摄入量50微克的标准，也达不到中国营养学院建议的50-200微克的摄入量，我国居民普遍缺硒。提高我国居民的日常硒摄入量，对于改善国民健康有重大意义。

但是，科学、合理地补硒不但要提高人体摄入硒的总量，也要关注人体对于硒的可吸收利用性。研究表明，不同形态硒的吸收利用性、安全性有较大差异。无机硒的吸收效果和安全性远远不及有机硒。

我国居民的膳食结构以植物性食品为主，且植物性食品也是居民摄入硒的主要来源。因此，测定植物中的硒形态，对于指导居民科学补硒，开发安全高效的富硒食品，具有指导意义。

目前，测试主要硒形态的主要技术为气相色谱（GC）、电泳（CE）高效液相色谱（HPLC）等与HGAFS（高压液相色谱一氢化物发生原子荧光分析）、ICP-MS（电感耦合等离子体质谱）联用技术。但是GC对于硒代氨基酸和硒代蛋白等非挥发性的硒化物的检测存在较多的困难；CE在与ICP-MS联用时，所需流速不同，限制其发展应用；现在主要采用HPLC技术。如：富硒植物材料中硒形态的测定方法（中国专利申请号201110428248.4）中利用HPLC-HGAFS检测富硒植物中硒代胱氨酸（SeCys₂）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）和亚硒酸钠（Na₂SeO₄）四种硒态。但由于所用试剂的差异，该方法无法检测出硒的六价形态。植物硒形态的检测方法（中国专利申请号201210215457.5）中采用HPLC-ICP-MS联用技术分析植物样品中的硒代胱氨酸（SeCys₂）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）、亚硒酸钠（Na₂SeO₄）和硒酸钠（Na₂SeO₄）五种硒态。水产品中硒形态的检测方法（中国专利申请号201310376921.3）利用HPLC-HGAFS联用技术分析水产品中的硒代胱氨酸（SeCys₂）、硒代蛋氨酸（SeMet）、亚硒酸钠（Na₂SeO₄）和硒酸钠（Na₂SeO₄）四种硒态，该方法主要用于对水产品中硒形态的测定，没有探讨对粮食样品中硒形态测定的适用性。但是，目前ICP-MS价格昂贵，检测成本高，不易推广；而采用HGAFS技术的方法检测硒形态种类又不完善，并且这些方法中都没有提到样品中硒的提取率，有可能检出硒仅为样品中总硒的少部分。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种成本相对较低、硒形态种类检测完备且操作简便、提取效率高的粮食样品中硒形态的测定方法。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明所述粮食样品中硒形态的测定方法，包括如下步骤：

1）检测的前期准备：

i）设备：HPLC-HGAFS（型号为LC20AB-SAP-10-AFS9230，色谱柱Hamilton PRP-X100）、天平、粉碎机、烘箱、超声清洗器（型号KQ-610）、摇床、离心机；

ii）试剂：Tris-HCl、蛋白酶K、蛋白酶XIV、纤维素酶、KI、NaOH、NaBH₄、盐酸、甲酸、(NH₄)₂HPO₄、硒代胱氨酸（SeCys₂）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）、亚硒酸钠（Na₂SeO₄）和硒酸钠（Na₂SeO₄）标准物质、18.2 MΩ水。

2）粮食样品硒形态的提取：

i）称取烘干、粉碎、过筛后的粮食样品，加入100 mmol/L Tris-HCl进行提取，超声；

ii）提取后，加入纤维素酶对粮食样品进行破壁处理，恒温振荡；

iii）依次加入蛋白酶K、蛋白酶XIV进行水解提取，恒温振荡，在4℃下，10000转/分，离心30 min，上清液过0.22 μm滤膜，得到待测溶液。

3）建立HPLC-HGAFS（高压液相色谱一氢化物发生原子荧光分析）联用技术：

i）仪器条件：流动相（40 mmol/L(NH₄)₂HPO₄，pH 6.0）；流速1 mL/min；进样体积100 μL；蠕动泵转速65 rpm；灯电流/辅阴极：100mA，45mA；光电倍增管负高压：300V；载气流速：300mL/min；屏蔽气流速：700mL/min；

ii）氢化物发生条件：还原剂成分：0.35wt%NaOH+1.2wt%NaBH₄，流速：6 mL/min；氧化剂成分：0.5wt% NaOH+1wt% KI，流速：6 mL/min；载流：10wt% HCl，流速：6 mL/min；

iii）配制硒代胱氨酸（SeCys₂）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、亚硒酸钠（Na₂SeO₄）、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒酸钠（Na₂SeO₄）混标，建立五种硒形态标准溶液的色谱图。

4）上机测试与结果计算：

样品中待测物硒代胱氨酸（SeCys₂）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、亚硒酸钠（Na₂SeO₄）、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒酸钠（Na₂SeO₄）的含量可由下式计算得：

X=C×V×F/m

式中：

X—样品中待测物质的含量，μg/kg；

C—待测液中该物质的浓度，μg/L；

V—测定液体总体积，mL；

F—稀释倍数；

m—称样质量，g。

作为优选方案，其中所述步骤2）中，称取样品质量为0.1-0.2 g。

作为优选方案，其中所述步骤2）中，样品与提取液Tris-HCl的固液比为1：25-1:100。

作为优选方案，其中所述步骤2）中，超声提取时间为10-30 min，超声功率600 W，超声频率40 KHZ。

作为优选方案，其中所述步骤2）中，纤维素酶与粮食样品的质量比为1:1-1:10，破壁处理温度控制在40-55℃，振荡转速150-200 rpm，振荡时间30 min-2 h。

作为优选方案，其中所述步骤2）中，蛋白酶K与粮食样品的质量比为1：20-1:100，水解温度控制在40-55℃，振荡转速150-200 rpm，振荡时间4 h-12 h。

作为优选方案，其中所述步骤2）中，蛋白酶XIV与粮食样品的质量比为1:20-1:100，水解温度控制在30-45℃，振荡转速150-200 rpm，振荡时间4 h-12 h。

作为优选方案，其中所述粮食样品为小麦或玉米。

相比现有技术，本发明具有以下有益效果：

1、采用超声提取，结合多种酶，硒的提取效率高，提取率可达80%以上，且酶用量少，节约成本，提取过程操作简便，易于重复；

2、相较于现有方法，可以同时准确测定硒代胱氨酸（SeCys₂）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、亚硒酸钠（Na₂SeO₄）、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒酸钠（Na₂SeO₄）五种硒形态和含量，且其最低检出限相当低。

附图说明

图1为各种硒形态的标准分离谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体条件作进一步调整，未说明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实例1：小麦中硒形态的测定

1）检测的前期准备：

i）设备：HPLC-HGAFS（型号为LC20AB-SAP-10-AFS9230，色谱柱Hamilton PRP-X100）、天平、粉碎机、烘箱、超声清洗器（型号KQ-610）、摇床、离心机；

ii）试剂：Tris-HCl、蛋白酶K、蛋白酶XIV、纤维素酶、KI、NaOH、NaBH₄、盐酸、甲酸、(NH₄)₂HPO₄、硒代胱氨酸（SeCys₂）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）、亚硒酸钠（Na₂SeO₄）和硒酸钠（Na₂SeO₄）标准物质、18.2 MΩ水，酶和标准物质均采购于Sigma公司。

2）小麦硒形态的提取：

i）称取烘干、粉碎、过100目筛后的0.2g小麦粉于15 mL塑料离心管中，加入5 mL提取缓冲液100 mmol/L Tris-HCl，超声提取20 min，超声功率600 W，超声频率40 KHZ；

ii）加入纤维素酶40 mg，50℃，恒温振荡培养1h，振荡转速为180 rpm；

iii）加入0.5 mg蛋白酶K，50℃，恒温振荡培养8 h，振荡转速为180 rpm，再加入0.5 mg蛋白酶XIV，37℃，恒温振荡培养8 h，振荡转速为180 rpm，然后在 4℃下， 10000转/分，离心30 min，上清液过0.22 μm的滤膜后，制备得到上机待测液；

3）建立HPLC-HGAFS（高压液相色谱一氢化物发生原子荧光分析）联用技术：

i）将液相色谱设置为流动相（40 mmol/L(NH₄)₂HPO₄，pH 6.0）；流速1 mL/min；进样体积100 μL；蠕动泵转速65 rpm；灯电流/辅阴极：100mA，45mA；光电倍增管负高压：300V；载气流速：300mL/min；屏蔽气流速：700mL/min；氢化物发生条件设置为：还原剂成分：0.35 wt %NaOH+1.2 wt %NaBH₄，流速：6 mL/min；氧化剂成分：0.5wt% NaOH+1wt% KI，流速：6 mL/min；载流：10 wt % HCl，流速：6 mL/min；

ii）配制20、40、60、80、100 ng/g混标，待仪器稳定后，做标准曲线，上机测定待测溶液；在上述条件下硒代胱氨酸（SeCys₂）、硒甲基半胱氨酸（MeSeCys）、Se(IV)、硒代蛋氨酸（SeMet）和Se（VI）的保留时间依次为：2.6 min，3.2 min，4.0 min，5.0 min和12.2 min；待测液色谱峰保留时间与标准溶液相比变化范围在±5%之内即认为其为该待测物质；根据检测结果计算得到样品中各种硒形态含量。

结果分析：

1）图1显示标准溶液中五种硒形态的色谱图，表明五种硒形态均能得到有效分离，且峰形良好。

2）仪器的检出限及精密度，见表1。

表1.仪器的检出限及精密度的要求

从表1中可以看出，五种硒形态均具有良好的线性范围、相关系数和检出限，说明本发明检测结果准确可靠，重复性好和精确度高。

3）小麦中硒形态的结果，见表2。

表2.小麦中硒形态的测定结果

从表2中可以看出，小麦中的总硒含量为22.3 ± 0.025 mg/kg，则小麦硒提取率为92%。表明本发明硒的提取效率高。

4）加标回收实验结果，见表3。表3结果显示，五种硒形态的加标回收率在91.1-120%之间，回收效果理想。

表3 五种硒形态加标回收率的测定结果

实例2：玉米中硒形态的测定

1）检测的前期准备：

i）设备：HPLC-HGAFS（型号为LC20AB-SAP-10-AFS9230，色谱柱Hamilton PRP-X100）、天平、粉碎机、烘箱、超声清洗器（型号KQ-610）、摇床、离心机；

ii）试剂：Tris-HCl、蛋白酶K、蛋白酶XIV、纤维素酶、KI、NaOH、NaBH₄、盐酸、甲酸、(NH₄)₂HPO₄、硒代胱氨酸（SeCys₂）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）、亚硒酸钠（Na₂SeO₄）和硒酸钠（Na₂SeO₄）标准物质、18.2 MΩ水，酶和标准物质均采购于Sigma公司。

2）玉米硒形态的提取：

i）称取烘干、粉碎、过100目筛后的0.2g玉米粉于15 mL塑料离心管中，加入5 mL提取缓冲液100 mmol/L Tris-HCl，超声提取20 min，超声功率600 W，超声频率40 KHZ；

ii）加入纤维素酶40 mg，50℃，恒温振荡培养1h，振荡转速为180 rpm；

iii）加入0.5 mg蛋白酶K，50℃，恒温振荡培养8 h，振荡转速为180 rpm，再加入0.5 mg蛋白酶XIV，37℃，恒温振荡培养8 h，振荡转速为180 rpm，然后在 4℃下， 10000转/分，离心30 min，上清液过0.22 μm的滤膜后，制备得到上机待测液；

3）建立HPLC-HGAFS（高压液相色谱一氢化物发生原子荧光分析）联用技术：

i）将液相色谱设置为流动相（40 mmol/L(NH₄)₂HPO₄，pH 6.0）；流速1 mL/min；进样体积100 μL；蠕动泵转速65 rpm；灯电流/辅阴极：100mA，45mA；光电倍增管负高压：300V；载气流速：300mL/min；屏蔽气流速：700mL/min；氢化物发生条件设置为：还原剂成分：0.35 wt %NaOH+1.2 wt %NaBH₄，流速：6 mL/min；氧化剂成分：0.5wt% NaOH+1wt% KI，流速：6 mL/min；载流：10 wt % HCl，流速：6 mL/min；

ii）配制20、40、60、80、100 ng/g混标，待仪器稳定后，做标准曲线，上机测定待测溶液；在上述条件下硒代胱氨酸（SeCys₂）、硒甲基半胱氨酸（MeSeCys）、Se(IV)、硒代蛋氨酸（SeMet）和Se（VI）的保留时间依次为：2.6 min，3.2 min，4.0 min，5.0 min和12.2 min；待测液色谱峰保留时间与标准溶液相比变化范围在±5%之内即认为其为该待测物质；根据检测结果计算得到样品中各种硒形态含量。

结果分析：

1）玉米中硒形态的测定结果，见表4。表4结果显示，玉米中的总硒含量为12.81 ± 1.56 mg/kg，则硒的提取率为91%，表明本发明硒的提取效率高。

表4.玉米中硒形态的测定结果

2）加标回收实验结果，见表5。表5结果显示，五种硒形态的加标回收率在90-107.4%之间，回收效果理想。

表5. 五种硒形态加标回收率的测定结果

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种粮食样品中硒形态的测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1）粮食样品硒形态的提取：

i）称取烘干、粉碎、过筛后的粮食样品，加入100 mmol/L Tris-HCl进行超声提取；

ii）提取后，加入纤维素酶对粮食样品进行破壁处理，恒温振荡；

iii）依次加入蛋白酶K、蛋白酶XIV进行水解提取，恒温振荡，在4℃下，10000转/分，离心30 min，上清液过0.22 μm滤膜，得到待测溶液；

2）建立HPLC-HGAFS联用技术：

i）仪器条件：流动相：40 mmol/L(NH₄)₂HPO₄，pH 6.0；流速1 mL/min；进样体积100 μL；蠕动泵转速65 rpm；灯电流/辅阴极：100mA，45mA；光电倍增管负高压：300V；载气流速：300mL/min；屏蔽气流速：700mL/min；

ii）氢化物发生条件：还原剂成分：0.35wt%NaOH+1.2wt%NaBH₄，流速：6 mL/min；氧化剂成分：0.5wt% NaOH+1wt% KI，流速：6 mL/min；载流：10wt% HCl，流速：6 mL/min；

iii）配制硒代胱氨酸SeCys₂、甲基硒代半胱氨酸MeSeCys、亚硒酸钠Na₂SeO₄、硒代蛋氨酸SeMet和硒酸钠Na₂SeO₄混标，建立五种硒形态标准溶液的色谱图；

3）上机测试与结果计算：

样品中待测物硒代胱氨酸SeCys₂、甲基硒代半胱氨酸MeSeCys、亚硒酸钠Na₂SeO₄、硒代蛋氨酸SeMet和硒酸钠Na₂SeO₄的含量由下式计算得：

X=C×V×F/m

式中：

X—样品中待测物质的含量，μg/kg；

C—待测液中该物质的浓度，μg/L；

V—测定液体总体积，mL；

F—稀释倍数；

m—称样质量，g。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，称取样品的质量为0.1-0.2 g。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，样品与提取液Tris-HCl的固液比为1：25-1:100。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，超声提取时间为10-30 min，超声功率为600 W，超声频率40 KHZ。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，纤维素酶与粮食样品的质量比为1:1-1:10，破壁处理温度控制在40-55℃，振荡转速150-200 rpm，振荡时间30 min-2 h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，蛋白酶K与粮食样品的质量比为1：20-1:100，水解温度控制在40-55℃，振荡转速150-200 rpm，振荡时间4 h-12 h。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，蛋白酶XIV与粮食样品的质量比为1:20-1:100，水解温度控制在30-45℃，振荡转速150-200 rpm，振荡时间4 h-12 h。

8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述粮食样品为小麦或玉米。