CN107987046A - 一种花生壳中木犀草素的提取及纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种花生壳中木犀草素的提取及纯化方法。本发明利用合理量的纤维素酶、有机溶剂提取结合的方法提取花生壳中的木犀草素，提取率显著提高，结合利用针对性的柱层析技术从花生壳粗提取液分离到木犀草素，纯度达到92.5%。本发明提取工艺精确，操作简单易行、条件温和，易实现工业化，为花生壳的变废为宝以及木犀草素的应用提供有力的技术支持，具有较大的市场开发前景。

Description

一种花生壳中木犀草素的提取及纯化方法
技术领域
本发明涉及中药提取及分离技术领域，更具体地，涉及一种花生壳中木犀草素的提取及纯化方法。
背景技术
花生(Peanut或Earthnut学名：Arachis hypogaea Linn)，一年生草本豆科植物，属蔷薇目，又称落花生、长生果等，适合种植在雨量适中、气候温暖的沙质土地区，具有抗老化、促进发育、增强记忆、滋血通乳等作用，我国是一个农业大国，是世界花生主产国之一，年产量1500万吨以上，位居世界第一，但是目前主要价值是利用是花生仁、花生红衣、花生根以及用来制造天然安眠药的花生叶，对于其他的附加值没有更多利用。在花生的加工中，每年产生近450万吨的花生壳，这些花生壳大部分都被用来做燃料或废弃物，浪费了大量的花生附加值，造成资源的浪费。
孙丰文等研究表明花生壳含有65.7～79.3％的粗纤维、4.8～7.2％的粗蛋白、1.2～2.7％的粗脂肪、10.6～21.2％的碳水化合物、3.0～4.0％的矿物质、1.9～4.6％的灰分、1.2％的其他成分等各种成分，可用于做食品原料和保健品开发，也可用于做培养食用菌，提取膳食纤维等，应用前景十分广阔，如若利用好不仅能够充分利用废物资源，又能保护环境创造更高的经济效益。
花生壳中木犀草素含量较高,是木犀草素的理想来源之一，开发利用花生壳中的木犀草素，可以提高花生的综合利用价值。木犀草素在人类保健和植物抗逆方面具有双重应用价值，引起了国内外研究者的广泛重视。木犀草素(3',4',5,7-四羟基黄酮)，别名黄色黄素、黄示灵、毛地黄黄酮。其分子结构式如式(Ⅰ)所示。
木犀草素是一种弱酸性的四羟基黄酮类物质，具有较高的医药价值，具有抗氧化性、抗肿瘤、抗动脉硬化、降血糖、增强免疫能力、抑菌性等保健功能及药理活性。因此，如能合理开发利用废弃物花生壳，从中提取木犀草素，提高其利用率，不仅能减少资源浪费，还能产生较大的经济效益和社会价值。
但是现有方法从花生壳中提取黄酮成分木犀草素的方法存在不少缺陷,如提取能耗太大、耗时过长、提取率偏低、纯度偏低、回收率不高、产品质量难以保证，目前缺乏高效可行的提取分离方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有花生壳中木犀草素的分离提取纯化技术不足，提供一种花生壳中木犀草素的提取及纯化方法。
本发明另一要解决的技术问题是提供所述方法制备得到的花生壳木犀草素。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
提供一种花生壳中木犀草素的提取及纯化方法，包括以下步骤：
S1.将花生壳粉碎成粉末，加入纤维素酶和酶解液，酶解；
S2.酶解结束后，抽滤，取滤液；将滤渣加入乙醇提取，提取后抽滤，取滤液，合并滤液；
S3.将合并后的滤液旋转蒸发，用甲醇溶解得到总黄酮提取液；
S4.将步骤S3所得总黄酮提取液过硅胶层析柱，洗脱，经高效液相色谱仪将收集木犀草素的流分合并，用少量溶剂溶解，放置析晶，得木犀草素纯品。
优选地，步骤S1所述花生壳粉碎至少过150～300目筛。
优选地，步骤S1所述纤维素酶的加入量按照花生壳粉末质量的0.10％～0.45％加入，进一步优选按照花生壳粉末质量的0.35％加入。
优选地，步骤S1所述酶解液是通过在去离子水中加入氢氧化钠溶液和盐酸溶液进行调节pH后的溶液；所述pH值为4.2～5.2；进一步优选所述pH值为4.8。
优选地，所述酶解液的用量为按照花生壳粉末质量g:酶解液体积mL的液料比为1：3～1：9的比例加入，进一步优选按照1:7的比例加入。
优选地，步骤S1所述酶解的温度为35～60℃，酶解的时间为0.5～3h；进一步优选，所述酶解温度为40℃，酶解时间为1.5h。
优选地，步骤S2所述乙醇的加入量是按照液料比为1：10～1：35的比例向滤渣中加入，进一步优选按照1：20的比例加入。
优选地，步骤S2所述乙醇的体积比百分比浓度为60～95％，进一步优选80％。
优选地，步骤S2所述提取的温度为40～80℃；所述提取的时间为1.5～5h。进一步优选提取的温度为70～80℃；优选提取的时间为3.5h。
优选地，步骤S4所述硅胶层析柱的硅胶体积为150mL，总黄酮过层析柱前用甲醇溶解，并进样到硅胶层析柱中。
优选地，步骤S4所述洗脱采用的洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯：甲酸的体积比＝8:6:0.3的混合物。洗脱时，收集速度为每秒1～2滴的速度，前面先流出的100mL弃去，然后每10mL收集一次洗脱液，并按1～100编号。
优选地，步骤S4所述高效液相色谱仪的色谱条件为：
色谱柱：CNW Athena C18-WP，100A，4.6mm*250mm，5μm；流动相：乙腈:水＝30:70；流速：1.000mL/min；柱温：28℃；紫外检测波长：UV-350nm；进样量：20μL。
本发明同时提供采用所述方法制备得到的木犀草素。
本发明的有益效果如下：
本发明基于花生壳的再利用，提供了一种从花生壳中分离提纯的木犀草素方法，采用合理量的纤维素酶对花生壳粉进行水解处理，工艺环境温和，能一定程度地降低随后溶剂提取的难度，有助于保持药效成分的天然药理性质，提高有效成分的提取效率，初总黄酮提取产率为0.42％，本发明利用纤维素酶、有机溶剂提取结合的方法提取花生壳中的木犀草素，比一般现有的纯有机溶剂提取率提高了7％以上。在此基础上，本发明利用针对酶解提取物设计的柱层析技术从花生壳粗提取液分离到木犀草素，得到的木犀草素纯度比较高，达到92.5％，回收率达到75.87％，本发明过程简单、条件温和，易实现工业化，具有重要的推广应用价值。
附图说明
图1木犀草素标准品HPLC色谱图。
图2花生壳粗提取液HPLC色谱图。
图3硅胶柱层析纯化后HPLC色谱图。
图4木犀草素液相标准曲线。
图5木犀草素标样标准曲线图。
图6酶解液液料比对木犀草素提取效果的影响结果。
图7酶用量对木犀草素提取效果的影响结果。
图8酶解温度对木犀草素提取效果的影响结果。
图9酶解液PH对木犀草素提取效果的影响结果。
图10酶解时间对木犀草素提取效果的影响结果。
图11乙醇浓度对木犀草素提取效果的影响结果。
图12乙醇液料比对木犀草素提取效果的影响结果。
图13乙醇提取温度对木犀草素提取效果的影响结果。
图14乙醇提取时间对木犀草素提取效果的影响结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂为常规市购或商业途径获得的试剂，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。
为方便说明，以下实施例中用到的主要试剂和仪器为：乙醇(AR天津市大茂化学试剂厂)、甲醇(AR天津市大茂化学试剂厂)、石油醚(AR天津市北联精细化学品开发有限公司)、乙酸乙酯(AR天津市大茂化学试剂厂)、甲酸(AR广州化学试剂厂)、旋转蒸发器(RE-52，上海亚荣生化仪器厂)；低温冷却液循环泵(DLSB-5L/25，巩义市予华仪器有限责任公司)；循环水式真空泵(SHZ-D(III)，巩义市予华仪器有限责任公司)；超声波清洗器(KQ-250B，昆山市超声波仪器有限公司)；微孔滤膜(0.22μm，天津市津藤实验设备有限公司)；高效液相色谱仪(Agilent 1200s，美国安捷伦科技有限公司)。
实施例1花生壳中提取分离木犀草素
S1.将花生壳粉碎成粉末，过150目筛，称取过筛后的粉末2g，加入纤维素酶0.007g，按照液料比(花生壳粉末质量g:酶解液体积mL)1:7加入pH为4.8的酶解液，密封(可以用锡纸密封反应容器口)，置于调好酶解温度为40℃的恒温振荡水浴器中酶解1.5h；所述酶解液是用盐酸和氢氧化钠调节去离子水的pH，用pH计测定，得到相应的pH值的酶解液。
S2.酶解结束后，抽滤，收集滤液1；按照液料比1:20往滤渣中加入体积比浓度为80％乙醇提取，80℃恒温振荡水浴条件下提取3.5h后抽滤，取滤液2；
合并滤液1和滤液2；
S3.将合并后的滤液旋转蒸发，用甲醇溶解得到总黄酮提取液；
S4.将步骤S3所得总黄酮提取液过硅胶层析柱，所述硅胶层析柱的硅胶体积为150mL，洗脱，采用的洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯：甲酸的体积比＝8:6:0.3的混合物。洗脱时，收集速度为每秒1～2滴的速度，前面先流出的100mL弃去，然后每10mL收集一次洗脱液，并按1～100编号。经高效液相色谱仪将收集木犀草素的流分合并，用少量溶剂溶解，放置析晶，得木犀草素纯品。
色谱条件：色谱柱：CNW Athena C18-WP，100A，4.6mm*250mm，5μm；流动相：乙腈:水＝30:70；流速：1.000mL/min；柱温：28℃；紫外检测波长：UV-350nm；进样量：20μL；
木犀草素液相标准曲线实验：准确称量标准的木犀草素0.0040g，用色谱级甲醇定容至100mL。分别吸取0.5、1、2、3、4、5、7、10mL到10mL容量瓶，用甲醇定容，分别获得标浓度为2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，12μg/mL，16μg/mL，20μg/mL，28μg/mL，40μg/mL的标准溶液，再分别进样，得到相应的峰面积，以峰面积为纵坐标y、浓度为横坐标x作图得出标准曲线。图1所示为木犀草素标准品HPLC色谱图，图4所示为木犀草素液相标准曲线。表1所示为木犀草素液相标准曲线数据。
表1木犀草素液相标准曲线数据
标准曲线方程为：y＝72.802x+6.3075，相关系数R2＝0.9996式中：y为峰面积，x为木犀草素浓度(μg/mL)。
A为HPLC谱图峰面积(mAU)；c为木犀草素的浓度(μg/mL)。
本实施例初总黄酮提取产率为0.42％，木犀草素纯度为92.5％，回收率达到75.87％。
实施例2花生壳中提取分离木犀草素
S1.将花生壳粉碎成粉末，过300目筛，称取过筛后的粉末2g，加入纤维素酶0.008g，按照液料比(花生壳粉末质量g:酶解液体积mL)1:(5～9)加入pH为4.8的酶解液，密封(可以用锡纸密封反应容器口)，置于调好酶解温度为45℃的恒温振荡水浴器中酶解1h；所述酶解液是用盐酸和氢氧化钠调节去离子水的pH，用pH计测定，得到相应的pH值为4.8的酶解液。
S2.酶解结束后，抽滤，收集滤液1；按照液料比1:20往滤渣中加入体积比浓度为80％乙醇提取，70～90℃恒温振荡水浴条件下提取3h后抽滤，取滤液2；合并滤液1和滤液2；
S3.将合并后的滤液旋转蒸发，用甲醇溶解得到总黄酮提取液；
S4.将步骤S3所得总黄酮提取液过硅胶层析柱，所述硅胶层析柱的硅胶体积为150mL，洗脱，采用的洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯：甲酸的体积比＝8:6:0.3的混合物。洗脱时，收集速度为每秒1～2滴的速度，前面先流出的100mL弃去，然后每10mL收集一次洗脱液，并按1～100编号。经高效液相色谱仪将收集木犀草素的流分合并，用少量溶剂溶解，放置析晶，得木犀草素纯品。色谱条件和木犀草素液相标准曲线实验同实施例1。本实施例初总黄酮提取产率为0.40％，木犀草素纯度为92.1％，回收率达到75.86％。
实施例3花生壳中提取分离木犀草素
S1.将花生壳粉碎成粉末，过200目筛，称取过筛后的粉末2g，加入纤维素酶0.006g，按照液料比1:(5～9)加入pH为4.8的酶解液，密封(可以用锡纸密封反应容器口)，置于调好酶解温度为40℃的恒温振荡水浴器中酶解2h；所述酶解液是用盐酸和氢氧化钠调节去离子水的pH，用pH计测定，得到相应的pH值的酶解液。
S2.酶解结束后，抽滤，收集滤液1；按照液料比1:20往滤渣中加入体积比浓度为80％乙醇提取，70～90℃恒温振荡水浴条件下提取3.5h后抽滤，取滤液2；合并滤液1和滤液2；
S3.将合并后的滤液旋转蒸发，用甲醇溶解得到总黄酮提取液；
S4.将步骤S3所得总黄酮提取液过硅胶层析柱，所述硅胶层析柱的硅胶体积为150mL，洗脱，采用的洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯：甲酸的体积比＝8:6:0.3的混合物。洗脱时，收集速度为每秒1～2滴的速度，前面先流出的100mL弃去，然后每10mL收集一次洗脱液，并按1～100编号。经高效液相色谱仪将收集木犀草素的流分合并，用少量溶剂溶解，放置析晶，得木犀草素纯品。色谱条件和木犀草素液相标准曲线实验同实施例1。本实施例初总黄酮提取产率为0.40％，木犀草素纯度为92.1％，回收率达到75.81％。
将实施例1至3所得产物，利用高效液相色谱仪(HPLC)进行分析检测的检测结果如图2所示，硅胶柱层析纯化后产物的HPLC色谱图见附图3所示，其液相检测结果与图1所示木犀草素标准样品的液相检测结果极其相近。
对比例1花生壳中提取分离木犀草素
S1.将花生壳粉碎成粉末，过150目筛，称取过筛后的粉末2g，按照液料比1:20往滤渣中加入体积比浓度为80％乙醇提取，70～90℃恒温振荡水浴条件下提取3.5h后抽滤，收集滤液；
S2.将收集的滤液旋转蒸发，用甲醇溶解得到总黄酮提取液；
S3.将步骤S2所得总黄酮提取液过硅胶层析柱，所述硅胶层析柱的硅胶体积为150mL，洗脱，采用的洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯：甲酸的体积比＝8:6:0.3的混合物。洗脱时，收集速度为每秒1～2滴的速度，前面先流出的100mL弃去，然后每10mL收集一次洗脱液，并按1～100编号。经高效液相色谱仪将收集木犀草素的流分合并，用少量溶剂溶解，放置析晶，得木犀草素纯品。色谱条件和木犀草素液相标准曲线实验同实施例1。本对比例初总黄酮提取产率为0.39％，木犀草素纯度为92.3％，回收率为到75.30％。
表2实施例1与对比例1提取实验对比结果
名称 实施例1 对比例1
体积(mL) 250 250
峰面积 634.81775 591.24451
浓度(μg/mL) 8.6331 8.0346
含量(μg) 2158.28 2008.65
提取率％ 0.107914 0.100432
由上述实验例和表2对比结果计算可了解，本发明采用合理量的纤维素酶辅助乙醇提取花生壳中的木犀草素，相比于单独用乙醇提取花生壳中的木犀草素，提取率提高了7.45％，具有很明显的优势。
在此基础上，本发明利用针对酶解提取物设计的柱层析技术从花生壳粗提取液中分离到木犀草素，得到的木犀草素纯度比较高，为92.5％左右，回收率为75.87％左右，本发明过程简单、条件温和，易实现工业化，具有重要的推广应用价值。
实施例4木犀草素优化提取条件的验证实验
为进一步验证本发明总结得到的木犀草素提取条件的优越性，设计以下验证实验。
一、酶辅助提取的实验流程
(1)称量：用电子天平准确称量M克花生壳粉末和N克纤维素酶，置于烧杯中。
(2)调酶解液pH：用盐酸和氢氧化钠调节去离子水的pH值，用pH计测定，得到相应的pH酶解液。
(3)混合密封、酶解：向已加入花生壳和纤维素酶的烧杯中按照适当的液料比加入调好pH值的酶解液，将其搅拌均匀，用锡纸密封，置于调好酶解温度的恒温振荡水浴器中，反应适当时间。
(4)抽滤：将步骤(3)酶解反应后的花生壳溶液取出，抽滤，收集滤液，将滤渣用玻璃棒刮下置于原烧杯中。
(5)乙醇提取：将乙醇按适当的液料比加入装有滤渣的烧杯中，搅拌均匀，用锡纸密封,再将其放置于已调好提取温度的恒温振荡水浴器中，提取适当时间。
(6)再抽滤：再将(5)中提取后烧杯取出抽滤，弃去滤渣，收集滤液。
(7)合并滤液量体积：将两次收集得到的滤液合并摇匀，用量筒测量合并后的滤液体积V。
(8)旋转蒸发：从合并后的滤液中用10mL量筒量取5mL合并后的滤液于旋转蒸发瓶中用旋转蒸发仪蒸至膏状。
(9)超声波清洗：向蒸发后的旋转蒸发瓶中加入3mL乙醇试剂用超声波清洗器清洗干净，再将溶液移至10mL的容量瓶中用乙醇试剂定容至10mL，充分摇匀。
(10)离心：将定容好的溶液倒入10mL的离心管中，在3000转/分的转速下离心30秒。
(11)再定容稀释：用移液管移取1mL离心后的上清液于另一10mL容量瓶中用乙醇试剂定容至10mL，摇匀。
(12)测吸光度：以乙醇试剂作参比液调零，用紫外分光光度计在最佳吸收波长测(11)得到的溶液的吸光度，平行测三次取平均值。
(13)计算提取率：用标准曲线方程算出对应的总黄酮的浓度C后，再根据稀释倍数算出产率。
C：稀释后的总黄酮浓度(mg/mL)
V：两次滤液合并后的总体积(mL)
M：花生壳粉末的质量(g)
二、酶辅助提取单因素试验
(1)酶解液液料比(花生壳质量g/酶解液体积mL)
按照前述实验流程做7组实验，控制7组实验的单一变量因素为酶解液液料比，按液料比为1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9的比例在7个烧杯中分别加入PH为5.62的去离子水6mL、8mL、10mL、12mL、14mL、16mL、18mL，其他相同提取因素为2g的花生壳粉末、0.0040g纤维素酶、酶解温度50℃、酶解时间1.5h、95％乙醇25mL、在65℃的恒温振荡水浴器中提取2h,，最后以率提取作为主要评价指标，综合考虑选出最佳酶解液液料比。
(2)酶用量
按照前述的实验流程做6组实验，控制6组实验的相同提取因素为2g花生壳粉末、(1)得出的最佳酶解液液料比、酶解液pH为5.62、酶解温度50℃、酶解时间1.5h、95％乙醇25mL、在65℃的恒温振荡水浴器中提取2h，单一变量因素为酶用量，按酶与花生壳粉末质量比为0.1％、0.2％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％的比例在6个烧杯中分别加入0.0020g、0.0040g、0.0060g、0.0070g、0.0080g、0.0090g纤维素酶，最后以提取率作为主要评价指标，综合考虑选出最佳酶用量。
(3)酶解温度
按照前述的实验流程做6组实验，控制6组实验的单一变量因素为酶解温度，分别为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，相同提取因素为花生壳粉末2g，(1)得出的最佳酶解液液料比、(2)得出的最佳酶用量、酶解液pH为5.62、酶解时间1.5h、95％乙醇25mL、在65℃的恒温振荡水浴器中提取2h，最后以率提取作为主要评价指标，综合考虑选出最佳酶解温度。
(4)酶解液pH
取去离子水6份，每份20mL分别放置于烧杯中用用盐酸和氢氧化钠调节去离子水的pH，用pH计测定得到PH为4.20、4.40、4.60、4.80、5.00、5.20的6份酶解液。按照前述的实验流程做6组实验，控制6组实验的单一变量因素为酶解液PH，分别为上述配置的pH为4.20、4.40、4.60、4.80、5.00、5.20，其他相同提取因素为花生壳粉末2g，(1)得出的最佳酶解液液料比、(2)得出的最佳酶用量、(3)得到的最佳酶解温度、酶解时间1.5h、95％乙醇25mL、在65℃的恒温振荡水浴器中提取2h，最后以率提取作为主要评价指标，综合考虑选出最佳酶解液pH。
(5)酶解时间
按照前述的实验流程做6组实验，控制6组实验的单一变量因素为酶解时间，分别为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h，其他相同提取因素为花生壳粉末2g，(1)得出的最佳酶解液液料比、(2)得出的最佳酶用量、(3)得到的最佳酶解温度、(4)得出的最佳酶解时间、95％乙醇25mL、在65℃的恒温振荡水浴器中提取2h，最后以率提取作为主要评价指标，综合考虑选出最佳酶解时间。
(6)乙醇浓度(花生壳质量g/乙醇体积mL)
按照前述的实验流程做8组实验，控制其相同提取因素为花生壳粉末2g，(1)得出的最佳酶解液液料比、(2)得出的最佳酶用量、(3)得到的最佳酶解温度、(4)得出的最佳酶解时间、(5)得出的最佳酶解时间、加入乙醇25mL、在65℃的恒温振荡水浴器中提取2h，单一变量因素为乙醇浓度，分别为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，最后以率提取作为主要评价指标，综合考虑选出最佳酶解时间。
(7)乙醇液料比
按照前述的实验流程做6组实验，控制6组实验的单一变量因素为乙醇液料比，液料比为1：10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35的比例分别往6个烧杯中往里加入乙醇20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL，其他相同提取因素为(1)得出的最佳酶解液液料比、(2)得出的最佳酶用量、(3)得到的最佳酶解温度、(4)得出的最佳酶解时间、(5)得出的最佳酶解时间、(6)得出的乙醇最佳乙醇浓度、在65℃的恒温振荡水浴器中提取2h，最后以率提取作为主要评价指标，综合考虑选出最佳乙醇液料比。
(8)乙醇提取温度
按照前述的实验流程做5组实验，控制5组实验的单一变量因素为乙醇提取温度，分别为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，其他相同提取因素为(1)得出的最佳酶解液液料比、(2)得出的最佳酶用量、(3)得到的最佳酶解温度、(4)得出的最佳酶解时间、(5)得出的最佳酶解时间、(6)得出的乙醇最佳乙醇浓度、(7)得出的最佳乙醇液料比，乙醇提取时间为2h，最后以率提取作为主要评价指标，综合考虑选出最佳乙醇提取温度。
(9)乙醇提取时间
按照前述的实验流程做5组实验，控制5组实验的单一变量因素为乙醇提取时间，分别为1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h，其他相同提取因素为(1)得出的最佳酶解液液料比、(2)得出的最佳酶用量、(3)得到的最佳酶解温度、(4)得出的最佳酶解时间、(5)得出的最佳酶解时间、(6)得出的乙醇最佳乙醇浓度、(7)得出的最佳乙醇液料比，(8)得出的最佳乙醇提取温度，最后以率提取作为主要评价指标，综合考虑选出最佳乙醇提取时间。
三、正交实验验证
本发明同时设计正交试验进行验证。在固定液料比为1:7和酶用量比为0.35％的条件下，对酶解液PH、酶解时间、酶解温度、乙醇浓度、乙醇液料比、乙醇提取时间、乙醇提取温度进行正交实验，确定纤维素酶辅助提取法的最佳工艺，在单因素实验的因素最佳条件下选取因素，因素水平如2.4正交实验结果与讨论中的因素水平表所示，实验设计采用正交设计法中L18(37)设计。
四、验证结果与分析
1.木犀草素标准曲线
表3不同波长对应的吸光度
波长nm 330 335 340 344 346 348 350 352 355 360
吸光度A 0.456 0.49 0.517 0.548 0.56 0.584 0.582 0.58 0.569 0.552
由表3可得用紫外分光光度计测木犀草素浓度时的最佳吸收波长为348nm。
由图5所示的木犀草素标样标准曲线图计算得木犀草素的标准曲线方程为：
y＝38.943x+0.0343 R2＝0.9991
2.单因素提取条件结果与讨论
(1)酶解液液料比对提取率影响：
由实验得到的结果(图6所示)可知，随着酶解液液料比的增大，花生壳中木犀草素的提取率出现先增加后减少的趋势，当酶解液液料比为1:7时，此时取得最大提取率。出现上升趋势的原因是随着酶解液液料比的增加，体系状态经历由固体状到液体状的变化，花生壳的浓度降低，酶分子在体系中活动收到的阻力降低，更有利于其与更多花生壳粉末发生酶促反应，还有就是降低了酶促反应的产物浓度，降低了产物对反抑制作用。后面出现下降的原因是当酶解液液料比太大时，造成花生壳浓度和酶的浓度太低，彼此结合发生反应的机率降低，因此纤维素酶辅助提取花生壳中的木犀草素的酶解液液料比选择1:7最优。
(2)酶用量对提取率影响：
由图7所示的实验结果可知，随着酶用量的增加，木犀草素提取率出现先上升后下降的趋势，当酶与花生壳质量比为0.35％时，此时的提取率达到最高，出现这种趋势的原因是在低酶浓度时，酶对花生壳细胞的细胞壁降解效果差，辅助作用有限，随着酶浓度的增加，酶与底物的接触机会增大，对细胞壁的纤维素水解效果明显，使木犀草素更易浸出。但当酶浓度达到饱和时，继续增加酶浓度反而会抑制酶活性，降低提取率。因此用纤维素酶辅助提取花生壳中的木犀草素时，选择酶质量比为0.35％最优。
(3)酶解反应温度对提取率的影响
由图8所示结果可以看出酶解温度对木犀草素提取效果的影响显著，在35℃到45℃之间提取率提高了0.2％，在45℃之后出现下降趋势，出现这种趋势的原因是温度升高为酶催化反应提供能量，加快了反应的速率，还有温度升高使酶分子与花生壳分子的扩散速率加快这些都有助于酶促反应进行，提高木犀草素的提取率。但当酶解温度超过酶的最适温度时，反而会使酶蛋白质变性，抑制酶活性甚至使酶丧失活性，从而影响酶促反应的进行，降低提取效果。因此用纤维素酶辅助提取花生壳中的木犀草素时，最佳的酶解温度为45℃。
(4)酶解液pH值对提取率的影响
由图9可以看出木犀草素的提取最适宜酶解液的pH值在4.5～4.8之间，差距相差0.01％，酶解液pH对木犀草素提取的影响趋势呈现先上升后下降趋势，说明纤维素酶在酸性条件下活性较高，更适应酶促反应进行，降解纤维素的效率更高，出现这种趋势的原因是因为不同的酶的最佳PH不同，当PH太低会使酶结构的活性部位发生基团离子化，太高又会是酶的蛋白质发生变性甚至失活，因此本实验所用纤维素选用pH为4.6的酶解液最适合。
(5)酶解反应时间对提取率的影响
由图10可以看出在1.5h之前，随着酶解时间的增加，木犀草素的提取率显著上升，在1.5h之后上升缓慢，增加有限。出现这种趋势的原因是在反应刚开始随着反应时间的增加，酶有足够的时间降解细胞壁的纤维素，破坏传质壁垒，活性得到充分的利用，木犀草素不短浸出，提取率显著上升。但花生壳中的木犀草草素含量有限，当其已经基本提取出来，此时在增加酶解时间，提取效果上升得非常有限，反而浪费能源和时间，得不偿失，因此综合考虑，本实验的酶解时间为1.5h最合适。
(6)乙醇浓度对提取率的影响
由图11可得随着乙醇浓度的增高，木犀草素的提取率逐渐上升，但乙醇浓度对木犀草素的提取效果影响并不显著，总体变化幅度在0.04％之间，当乙醇浓度为80％时，再增加乙醇浓度，木犀草逇的提取率提升的非常有限，且溶液的颜色会变深，有新的非黄酮类杂质产生，故乙醇浓度定位80％最佳。
(7)乙醇液料比对提取率的影响
由图12可得，乙醇液料比对木犀草素提取率的影响呈先上升后下降的趋势，在液料比为1:20之前，随着木犀草素提取率随乙醇的增加而增加，但在液料比为1：20之后又逐渐下降。出现这种趋势的是刚开始随着液料比的增加，溶剂与花生壳之间的木犀草素浓度差变大，更加有于木犀草素浸出。后面出现下降的趋势可能是提取液中的某些杂质浓度增大，对黄酮类物质的提取产生抑制作用。因此选择80％的乙醇最合适。
(8)乙醇提取温度对提取率的影响
由图13可以看出乙醇提取温度对木犀草素的提取效果显著，在40～80℃间总体呈现上升趋势，出现这种趋势的原因是温度升高，乙醇分子与木犀草素分子的扩散速率加快，进出细胞壁的阻力降低，提高了木犀草草素的浸出率，从而提高乙醇的提取效率，从实际考虑，当温度大于80℃时，80％的乙醇溶剂中的乙醇会被蒸出来且可能溶剂可能发生沸腾，大大增加气密性的困难，又可能破坏木犀草素的分子结构，而且又消耗能源故选择80℃的提取温度最为合适。
(9)乙醇提取时间对提取率的影响
由图14可知随着乙醇提取时间的增加，木犀草素的提取率逐渐上升，但在3.5h之后上升的趋势效果并不明显，出现这种趋势的原因可能是在本实验条件下用乙醇3.5h后，花生壳中木犀草素基本已被提出，故后面变化范围不大，在工业大规模提取中，为了后面提高后面的0.005％提取率而要多维持80℃的提取温度半小时有点得不偿失，耗时又耗能，故选择3.5h提取时间最适合。
3.正交实验结果与讨论
表4七因素三水平设计表
表5 L18(37)正交试验方案与结果
由表5可知极差RG>RB>RC>RE>RD>RA>RF因此实验考察的七个因素因素对木犀草素提取的影响程度大小为:提取时间>酶解温度>酶解时间>乙醇液料比>乙醇浓度>酶解液pH>提取温度。又由于在水平实验中A:K2>K1＝K3，B:K1>K2>K3，C:K2>K1>K3，D:K3>K2>K1，E:K2>K1>K3，F:K3>K1＝K2，G:K3>K2>K1，所以最最优的提取方案为：A2B1C2D3E2F3G3，即酶用量0.35％、酶解液液料比1:7、酶解液pH4.8、酶解温度40℃、酶解1.5h、80％乙醇浓度、乙醇液料比1:20、乙醇提取温度80℃、乙醇提取时间3.5h，与本发明实施例1至3所示的研究和实验结果吻合。

Claims (10)

1.一种花生壳中木犀草素的提取及纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将花生壳粉碎成粉末，加入纤维素酶和酶解液，酶解；
S2.酶解结束后，抽滤，取滤液；将滤渣加入乙醇提取，提取后抽滤，取滤液，合并滤液；
S3.将合并后的滤液旋转蒸发，用甲醇溶解得到总黄酮提取液；
S4.将步骤S3所得总黄酮提取液过硅胶层析柱，洗脱，经高效液相色谱仪将收集木犀草素的流分合并，用少量溶剂溶解，放置析晶，得木犀草素纯品。
2.根据权利要求1所述花生壳中木犀草素的提取及纯化方法，其特征在于，步骤S1所述花生壳粉碎过150～300目筛。
3.根据权利要求1所述花生壳中木犀草素的提取及纯化方法，其特征在于，步骤S1所述纤维素酶的加入量按照花生壳粉末质量的0.10%～0.45%加入，优选按照花生壳粉末质量的0.35%加入。
4.根据权利要求1所述花生壳中木犀草素的提取及纯化方法，其特征在于，步骤S1所述酶解液是通过在去离子水中加入氢氧化钠溶液和盐酸溶液进行调节pH后的溶液；所述pH值为4.2～5.2；优选所述pH值为4.8；
所述酶解液的用量为按照花生壳粉末质量g:酶解液体积mL的液料比为1：3～1：9的比例加入，优选按照1:7的比例加入。
5.根据权利要求1所述花生壳中木犀草素的提取及纯化方法，其特征在于，步骤S1所述酶解的温度为35～60℃，酶解的时间为0.5～3h；优选酶解温度为40℃，优选的酶解时间为1.5h。
6.根据权利要求1所述花生壳中木犀草素的提取及纯化方法，其特征在于，步骤S2所述乙醇的加入量是按照液料比为1：10～1：35的比例向滤渣中加入，优选按照1：20的比例加入；
步骤S2所述乙醇的浓度为60～95%，优选80%；
步骤S2所述提取的温度为40～80℃；所述提取的时间为1.5～5h，优选提取的温度为70～80℃；优选提取的时间为3.5h。
7.根据权利要求1所述花生壳中木犀草素的提取及纯化方法，其特征在于，步骤S4所述硅胶层析柱的硅胶体积为150mL，总黄酮过层析柱前用甲醇溶解，并进样到硅胶层析柱中。
8.根据权利要求1所述花生壳中木犀草素的提取及纯化方法，其特征在于，步骤S4所述洗脱采用的洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯：甲酸的体积比=8:6:0.3的混合物；洗脱时，收集速度为每秒1～2滴的速度，前面先流出的100mL弃去，然后每10mL收集一次洗脱液，并编号。
9.根据权利要求1所述花生壳中木犀草素的提取及纯化方法，其特征在于，步骤S4所述高效液相色谱仪的色谱条件为：
色谱柱：CNW Athena C18-WP，100A，4.6mm 8* 250 mm；流动相：乙腈:水=30:70；流速：1.000mL/min；柱温：28℃；紫外检测波长：UV-350nm；进样量：20μL。
10.权利要求1至9任一项所述提取及纯化方法分离得到的中木犀草素。
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