CN103923149B

CN103923149B - 绞股蓝皂苷XLV Ed及其制备方法

Info

Publication number: CN103923149B
Application number: CN201410149616.5A
Authority: CN
Inventors: 明艳林; 郑志忠; 张树峰; 童庆宣; 刘韶松; 陈良华; 郑国华
Original assignee: XIAMEN OVERSEAS CHINESE SUBTROPICAL PLANT INTRODUCTION GARDEN
Current assignee: XIAMEN TASMAN BIO-TECH Co.,Ltd.
Priority date: 2014-04-15
Filing date: 2014-04-15
Publication date: 2017-02-15
Anticipated expiration: 2034-04-15
Also published as: CN103923149A

Abstract

绞股蓝皂苷XLV Ed及其制备方法，涉及绞股蓝。所述绞股蓝皂苷XLV Ed的名称为2‑羟基‑3‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖‑20(S)‑原人参二醇‑20‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷，分子式为C₄₂H₇₂O₁₄，分子量800。所述绞股蓝皂苷XLV Ed的制备方法：1)制备绞股蓝总皂苷；2)用酶法转化绞股蓝总皂苷；3)制备绞股蓝皂苷XLV Ed。利用酶法转化法制备绞股蓝皂苷XLV Ed，以绞股蓝为原料，在我国分布广种植面积大，价廉易得，资源丰富，是生物药物和功能性食品开发应用的良好材料。酶法转化制备方法设备要求简单，工艺简单，容易控制和扩大规模，且制备的绞股蓝皂苷XLV Ed纯度高，副产物少。

Description

绞股蓝皂苷XLV Ed及其制备方法

技术领域

本发明涉及绞股蓝，尤其是涉及一种绞股蓝皂苷XLV Ed及其制备方法。

背景技术

绞股蓝[Gynostemma Pentaphyllum(Thunb)Makino.]为葫芦科绞股蓝属植物，其主要药效成分为绞股蓝皂苷(gypenoside，GYP)。绞股蓝皂苷具有与人参皂苷相同的达玛烷型四环三萜的骨架，显示抗肿瘤、防止衰老、降低血糖血脂、镇静止痛及抗溃疡等药理活性，且毒副作用小，是近年来国内外研究的热点。

对人参皂苷药理活性、构效关系及代谢动力学的研究表明，人参皂苷的药理活性与其糖链有密切的关系，低糖链皂苷及苷元的活性较多糖链皂苷有大幅度提高，因此目前国内外很多学者都致力于低糖链绞股蓝皂苷XLV Ed的研究开发。由多糖链原生皂苷制备低糖链绞股蓝皂苷XLV Ed的方法有化学方法的酸碱水解、乙酰解和生物方法的微生物转化、酶法转化等多种方法，化学水解条件剧烈易导致苷元结构发生变化，微生物转化所需步骤多不易控制，因此反应条件温和易控、副产物少的酶水解更容易进行。

人参皂苷的转化研究早期多选用人参和三七，提取总皂苷进行转化来获得Rh₁、Rh₂和H901等稀有皂苷做进一步的研究，如中国专利CN101139562公开利用弗氏链霉菌菌株规模化发酵转化各种三七皂苷制备Conpound K(IH901)技术，中国专利CN101928671A公开利用链格孢属菌发酵人参茎叶制备人参皂苷Rg₃的方法等。绞股蓝是五加科外唯一富含人参皂苷的植物，在我国长江流域以南有大面积分布和种植，相对于人参和三七来源更为丰富，且价廉易得，对大规模的研究和生产制备更为便利。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绞股蓝皂苷XLV Ed及其制备方法。

所述绞股蓝皂苷XLV Ed的名称为2-羟基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-20(S)-原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子式为C₄₂H₇₂O₁₄，分子量800，结构式为：

所述绞股蓝皂苷XLV Ed的制备方法，包括以下步骤：

1)制备绞股蓝总皂苷；

2)用酶法转化绞股蓝总皂苷；

3)制备绞股蓝皂苷XLV Ed。

在步骤1)中，所述制备绞股蓝总皂苷的具体方法可为：将绞股蓝粉末用乙醇溶液水浴提取，提取液减压浓缩至浸膏状得到绞股蓝提取物，将绞股蓝提取物用蒸馏水分散悬浮，石油醚萃取脱脂脱色后再用正丁醇萃取至正丁醇层无色，合并正丁醇层减压浓缩干，水分散后上样到大孔树脂，用乙醇溶液洗去杂质并洗脱总皂苷，洗脱液浓缩干燥得到绞股蓝总皂苷；

所述将绞股蓝粉末用乙醇溶液水浴提取的具体方法可为：将绞股蓝粉末用乙醇溶液在水浴锅中提取，乙醇溶液采用70%～95%乙醇溶液，乙醇溶液的用量按质量比为绞股蓝粉末的10～20倍，所述水浴锅的温度为45℃；所述提取提取2～4次，每次提取时间为12～24h；

所述大孔树脂可采用DM-130大孔树脂、AB-8大孔树脂、D-101大孔树脂、HP-20大孔树脂等中的一种；所述用乙醇溶液洗去杂质并洗脱总皂苷，可先用低浓度乙醇溶液洗去杂质，再用高浓度乙醇溶液洗脱总皂苷；所述先用低浓度乙醇溶液洗去杂质可采用10%～30%乙醇溶液洗脱3～5个柱体积，所述高浓度乙醇可采用40%～80%乙醇溶液。

在步骤2）中，所述用酶法转化绞股蓝总皂苷的具体方法可为：取绞股蓝总皂苷置于三角瓶中，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解后，加入转化酶，恒温水浴反应后，加入正丁醇萃取，萃取液减压浓缩得到酶法转化产物；

所述绞股蓝总皂苷、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配比可为1.5g∶150mL，其中绞股蓝总皂苷以质量计算，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液以体积计算，所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液pH可为3～7，所述转化酶可选自蜗牛酶、橙皮苷酶、果胶酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、柚皮苷酶等中的至少一种；所述转化酶的用量按质量百分比可为转化底物的3%～10%；所述恒温水浴反应的温度可为45℃，恒温水浴反应的时间可为36～60h；所述萃取可萃取至少2次。

在步骤3）中，所述制备绞股蓝皂苷XLV Ed的具体方法可为：将步骤2）得到的酶法转化产物用正相硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇∶水梯度洗脱，收集洗脱的组分，再用凝胶柱层析，有机溶剂洗脱，所得组分用反相硅胶柱层析，甲醇-水进行梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得到绞股蓝皂苷XLV Ed；所述正相硅胶柱收集氯仿∶甲醇∶水的体积比可为（150～80）∶35∶10洗脱的组分；所述有机溶剂可选自乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇等中的至少一种；所述甲醇-水进行梯度洗脱，收集洗脱液，是收集40%～80%甲醇洗脱的部分。

本发明具有如下的突出特点和技术效果：

(1)本发明利用酶法转化法制备绞股蓝皂苷XLV Ed，以绞股蓝为原料，在我国分布广种植面积大，价廉易得，资源丰富，是生物药物和功能性食品开发应用的良好材料。

(2)酶法转化制备方法设备要求简单，工艺流程简单，容易控制和扩大规模，且制备的绞股蓝皂苷XLV Ed纯度高，副产物少。

附图说明

图1为绞股蓝皂苷XLV Ed的HPLC图谱。在图1中横坐标为时间(min)，纵坐标为吸光度(mAU)。

图2为绞股蓝皂苷XLV Ed的¹H-NMR结构鉴定图。在图2中横坐标为化学位移(ppm)，纵坐标为峰强度。

图3为绞股蓝皂苷XLV Ed的¹³C-NMR结构鉴定图。在图3中横坐标为化学位移(ppm)，纵坐标为峰强度。

具体实施方式

以下给出本发明制备方法的实施例，对本发明作进一步描述。

本发明利用酶法转化法制备绞股蓝皂苷XLV Ed，主要包括绞股蓝总皂苷的制备、总皂苷的酶法转化和绞股蓝皂苷XLV Ed的制备。以下提供用橙皮苷酶和蜗牛酶制备绞股蓝皂苷XLVEd的实施例，同时提供转化产物分离纯化，化合物结构鉴定。

本发明所选用的材料为福建三明市种植区的绞股蓝，为公开的生物材料。

主要利用的试剂为乙醇、甲醇、氯仿等，均为分析纯试剂。

一、绞股蓝皂苷XLV Ed的制备过程如下：

1.绞股蓝总皂苷的制备：绞股蓝以20倍量(v/w)95%乙醇于45℃水浴提取3次，每次提取时间24h，合并提取液减压浓缩至浸膏状得绞股蓝总提取物。将总提取物用蒸馏水分散悬浮，先用石油醚萃取脱脂脱色至石油醚层颜色不再改变，水层用正丁醇萃取至正丁醇层无色。合并正丁醇层减压浓缩干，适量水分散后上样于预处理好的DM-130大孔吸附树脂，先用20%乙醇溶液洗去杂质，再用70%乙醇溶液洗脱总皂苷。洗脱液浓缩干燥后得到绞股蓝总皂苷。

2.酶法转化绞股蓝总皂苷：

以下为橙皮苷酶和蜗牛酶的转化实施例：

橙皮苷酶法转化绞股蓝总皂苷：取绞股蓝皂苷1.5g置于250mL三角瓶中，加入pH4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液150mL溶解；加入橙皮苷酶50mg，45℃恒温水浴酶解60h。酶法转化结束后加入正丁醇多次萃取，萃取液减压浓缩得到酶法转化产物。

蜗牛酶法转化绞股蓝总皂苷：取绞股蓝皂苷1.5g置于250mL三角瓶中，加入pH3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液150mL溶解；加入蜗牛酶100mg，45℃恒温水浴酶解48h。酶法转化结束后加入正丁醇多次萃取，萃取液减压浓缩得到酶法转化产物。

3.绞股蓝皂苷XLV Ed的分离纯化：酶法转化产物5g用正相硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇∶水（150～80）∶35∶10梯度洗脱，收集氯仿∶甲醇∶水的体积比为100∶35∶10洗脱的组分，再用凝胶柱层析，甲醇洗脱，所得组分用反相硅胶柱层析，先用50%甲醇洗脱10个柱体积，然后用70%甲醇洗脱，洗脱液减压浓缩干燥得到化合物绞股蓝皂苷XLV Ed。

二、绞股蓝皂苷XLV Ed的纯度鉴定

绞股蓝皂苷XLV Ed为白色无定性粉末，易溶于甲醇和乙醇，微溶于丙酮，水，不溶于氯仿。

1.薄层色谱鉴定将得到的化合物做薄层层析，每个样品用三种不同的展开剂展开，经紫外线、碘和硫酸显色均显示为单一斑点可初步确定为单一化合物。

2.HPLC鉴定将分离的化合物通过高效液相色谱(HPLC)鉴定其纯度。HPLC的条件为：色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×150mm,5μm)；柱温度：25℃；检测波长：203nm；流动相流速：1mL/min；流动相：水(A)/乙腈(B)溶剂系统梯度洗脱；洗脱条件为：0～8min，A，80%，B，20%；8～20min，A，80%～65%，B，20%～35%；20～35min，A，65%～30%，B，35%～70%；35～40min，A，30%，B，70%；40～50min，A，30%～0%，B，70%～100%。HPLC图谱显示绞股蓝皂苷XLVEd为纯化合物，纯度达98%(参见图1)。

三、绞股蓝皂苷XLV Ed的结构鉴定

对分离得到的化合物进行NMR测试，包括¹H-NMR，¹³C-NMR(图2和3)以及二维NMR(未附图)，根据NMR数据确定绞股蓝皂苷XLV Ed为2-羟基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-20(S)-原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子式为C₄₂H₇₂O₁₄，分子量800。

Claims

1.绞股蓝皂苷XLV Ed的制备方法，其特征在于所述绞股蓝皂苷XLV Ed的名称为2-羟基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-20(S)-原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，分子式为C₄₂H₇₂O₁₄，分子量800，结构式为：

所述制备方法，包括以下步骤：

1)制备绞股蓝总皂苷；所述制备绞股蓝总皂苷的具体方法为：将绞股蓝粉末用乙醇溶液水浴提取，提取液减压浓缩至浸膏状得到绞股蓝提取物，将绞股蓝提取物用蒸馏水分散悬浮，石油醚萃取脱脂脱色后再用正丁醇萃取至正丁醇层无色，合并正丁醇层减压浓缩干，水分散后上样到大孔树脂，用乙醇溶液洗去杂质并洗脱总皂苷，洗脱液浓缩干燥得到绞股蓝总皂苷；所述将绞股蓝粉末用乙醇溶液水浴提取的具体方法为：将绞股蓝粉末用乙醇溶液在水浴锅中提取，乙醇溶液采用70％～95％乙醇溶液，乙醇溶液的用量按质量比为绞股蓝粉末的10～20倍，所述水浴锅的温度为45℃；所述提取提取2～4次，每次提取时间为12～24h；所述大孔树脂采用DM-130大孔树脂、AB-8大孔树脂、D-101大孔树脂、HP-20大孔树脂中的一种；所述用乙醇溶液洗去杂质并洗脱总皂苷，先用低浓度乙醇溶液洗去杂质，再用高浓度乙醇溶液洗脱总皂苷；所述先用低浓度乙醇溶液洗去杂质采用10％～30％乙醇溶液洗脱3～5个柱体积，所述高浓度乙醇采用40％～80％乙醇溶液；

2)用酶法转化绞股蓝总皂苷；所述用酶法转化绞股蓝总皂苷的具体方法为：取绞股蓝总皂苷置于三角瓶中，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解后，加入转化酶，恒温水浴反应后，加入正丁醇萃取，萃取液减压浓缩得到酶法转化产物；

3)制备绞股蓝皂苷XLV Ed。

2.如权利要求1所述绞股蓝皂苷XLV Ed的制备方法，其特征在于所述绞股蓝总皂苷、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配比为1.5g∶150mL，其中绞股蓝总皂苷以质量计算，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液以体积计算，所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液pH为3～7。

3.如权利要求1所述绞股蓝皂苷XLV Ed的制备方法，其特征在于所述转化酶选自蜗牛酶、橙皮苷酶、果胶酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、柚皮苷酶中的至少一种；所述转化酶的用量按质量百分比为转化底物的3％～10％；所述恒温水浴反应的温度为45℃，恒温水浴反应的时间为36～60h；所述萃取是萃取至少2次。

4.如权利要求1所述绞股蓝皂苷XLV Ed的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述制备绞股蓝皂苷XLV Ed的具体方法为：将步骤2)得到的酶法转化产物用正相硅胶柱层析，以氯仿∶甲醇∶水梯度洗脱，收集洗脱的组分，再用凝胶柱层析，有机溶剂洗脱，所得组分用反相硅胶柱层析，甲醇-水进行梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得到绞股蓝皂苷XLV Ed。

5.如权利要求4所述绞股蓝皂苷XLV Ed的制备方法，其特征在于所述正相硅胶柱收集氯仿∶甲醇∶水的体积比为(150～100)∶35∶10洗脱的组分；所述有机溶剂选自乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇中的至少一种；所述甲醇-水进行梯度洗脱，收集洗脱液，是收集40％～80％甲醇洗脱的部分。