CN105153271B

CN105153271B - 两个新的达玛烷型三萜类化合物及其制备方法和用途

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Publication number: CN105153271B
Application number: CN201510624253.0A
Authority: CN
Inventors: 史琳; 檀德宏; 孟宪军
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2015-09-17
Filing date: 2015-09-17
Publication date: 2018-03-02
Anticipated expiration: 2035-09-17
Also published as: CN105153271A

Abstract

本发明公开了通过酸水解法对绞股蓝总皂苷进行水解得到的两个达玛烷型三萜类化合物gypensapogenin H和gypensapogenin I，其制备方法简单，重现性好，提取纯度高，具有较好的抗肿瘤活性，它们对体内外肿瘤细胞的抑制作用均优于人参皂苷‑Rg3和PPD，gypensapogenin H和gypensapogenin I的结构式如下：。

Description

两个新的达玛烷型三萜类化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药、功能食品技术领域，涉及绞股蓝总皂苷酸水解产物中两个新的三萜类化合物及其制备方法，本发明还涉及两个新化合物在抗肿瘤生物活性方面的用途。

背景技术

绞股蓝为葫芦科(Cucurbitaceae)绞股蓝属植物绞股蓝[Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino]的干燥全草，为多年生攀缘草本，主要分布于中国、日本、朝鲜等国。绞股蓝是五加科外具有人参皂苷资源的植物之一，具有滋补保健、抗癌防衰、增强体质和改善脂质代谢等多种功能，被誉为“南方人参”。绞股蓝为我国常用中药和药食同源品，又名七胆草、小苦药、遍地生根等。具有清热解毒，止咳化痰，补气生津，健脾安神之功效。临床用于治疗咳嗽、痰喘、老年慢性气管炎、传染性肝炎及劳伤虚损等。现代药学研究表明，其主要药效成分是绞股蓝皂苷(Gypenoside，Gyp)，与人参皂苷的结构一样或十分接近。绞股蓝皂苷有明显的体内外抗肿瘤作用，其直接的细胞毒作用可抑制肿瘤细胞生长繁殖。

随着研究的深入，对人参皂苷和人参皂苷元抗肿瘤作用的构效关系研究发现，苷元的活性强于皂苷。绞股蓝皂苷元对肿瘤细胞同样具有很强的细胞毒活性。在对体外多种人肿瘤细胞的抗癌实验研究中，我们研发了具有抗肿瘤活性的gypensapogenin H和gypensapogenin I，研究证明，它们对体内外肿瘤细胞的抑制作用均优于人参皂苷-Rg3和PPD。

发明内容

本发明的目的是旨在从绞股蓝中寻找新的具更强活性的抗肿瘤前体药物，采用了酸水解法对绞股蓝总皂苷进行水解，得到达玛烷型三萜类化合物gypensapogenin H和gypensapogenin I，并且研究它们的抗肿瘤生物活性和医药用途。

达玛烷型三萜类化合物gypensapogenin H和gypensapogenin I，是通过酸水解法对绞股蓝总皂苷进行水解得到的，其结构式如下：

达玛烷型三萜类化合物gypensapogenin H和gypensapogenin I的制备方法如下：

(1)选用绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino)的干燥全草6000-8000g为原料，用30-95％工业乙醇回流提取3次(8倍量、8倍量、6倍量，质量倍数)，每次2h，合并提取液，减压浓缩得乙醇提取物；

(2)将上述提取物上大孔树脂柱(HPD100)，依次用水、70％乙醇和95％乙醇进行洗脱，减压回收溶剂后得到70％乙醇洗脱物和95％乙醇洗脱物(10-15g)；其中70％乙醇洗脱物为绞股蓝总皂苷部分；

(3)对步骤(2)得到的绞股蓝总皂苷部分进行酸水解，即绞股蓝总皂苷溶解于酸性有机溶液中进行超声酸水解，然后加水沉淀，水洗得到中性的沉淀；

(4)对步骤(3)所得的中性沉淀经硅胶柱层析，分离后得到gypensapogenin H和gypensapogenin I。

所述柱层析用的硅胶粒度为100-400目，柱层析的流动相为石油醚-丙酮系统(石油醚沸程为60-90℃)100∶1-2∶1(V/V)混合溶剂梯度洗脱，每250-400mL体积为一个流分，共收集100-150个流分。经薄层层析硅胶检识，合并得到A1-A7七个流分；

流分A2经石油醚-丙酮10∶1-2∶1混合溶剂梯度洗脱，得到A2-1～A2-6的六个流分，流分A2-1经过重结晶得到白色粉末，即化合物gypensapogenin H。流分A2-2经过重结晶后得到白色粉末，即化合物gypensapogenin I。

gypensapogenin H，白色针晶(丙酮)，易溶于氯仿、丙酮。Liebermann-Barchard反应呈阳性、Molish反应呈阴性，提示为三萜皂苷元化合物。gypensapogenin I，白色粉末(丙酮)，易溶于氯仿、丙酮。Liebermann-Barchard反应呈阳性、Molish反应呈阴性，提示为三萜皂苷元化合物。

本发明所述的三萜类化合物(gypensapogenin H和gypensapogenin I)具有较好的抗肿瘤活性，它们对体内外肿瘤细胞的抑制作用均优于人参皂苷-Rg3和PPD。本发明化合物的制备方法简单，重现性好，提取纯度高，并且获得的化合物具有较好的抗肿瘤活性。

附图说明

图1为化合物gypensapogenin H的¹H NMR

图2为化合物gypensapogenin H的¹³C NMR

图3为化合物gypensapogenin H的HSQC

图4为化合物gypensapogenin H的HMBC

图5为化合物gypensapogenin H的IR

图6为化合物gypensapogenin H的HR-TOF-MS

图7为化合物gypensapogenin I的¹H NMR

图8为化合物gypensapogenin I的¹³C NMR

图9为化合物gypensapogenin I的HSQC

图10为化合物gypensapogenin I的HMBC

图11为化合物gypensapogenin I的IR

图12为化合物gypensapogenin I的HR-TOF-MS

具体实施方式

实施例1

制备gypensapogenin H和gypensapogenin I

制备步骤如下：

(1)选用绞股蓝的干燥全草8000g为原料，用70％工业乙醇回流提取3次(8倍量、8倍量、6倍量，质量倍)，每次2h，合并提取液，减压浓缩得乙醇提取物约270g；

(2)将提取物上大孔树脂柱(HPD100)，依次用水、70％乙醇和95％乙醇进行洗脱，减压回收溶剂后得到70％乙醇洗脱物，即绞股蓝总皂苷部分120g和95％乙醇洗脱物15g；

(3)将上述绞股蓝总皂苷部分进行酸水解，即绞股蓝总皂苷溶解于酸性有机溶液中进行超声酸水解，然后加水沉淀，水洗得到中性的沉淀；

(4)将步骤(3)得到的中性沉淀经硅胶柱层析，柱层析用硅胶粒度为300目，柱层析的流动相为石油醚-丙酮系统(石油醚沸程为60-90℃)100∶1-2∶1(V/V)混合溶剂梯度洗脱，每250mL体积为一个流分，共收集150个流分。经薄层层析硅胶检识，合并得到A1-A7七个流分；流分A2经石油醚-丙酮10∶1～2∶1(V/V)混合溶剂梯度洗脱，得到A2-1～A2-6的六个流分，流分A2-1经过重结晶得到白色针晶，即化合物gypensapogenin H。流分A2-2经过重结晶后得到白色粉末，即化合物gypensapogenin I。

实施例2

制备gypensapogenin H和gypensapogenin I

制备步骤如下：

(1)选用绞股蓝的干燥全草7000g为原料，用70％工业乙醇回流提取3次(8倍量、8倍量、6倍量，质量倍)，每次2h，合并提取液，减压浓缩得乙醇提取物约240g；

(2)将提取物上大孔树脂柱(HPD100)，依次用水、70％乙醇和95％乙醇进行洗脱，减压回收溶剂后得到70％乙醇洗脱物，即绞股蓝总皂苷部分100g和95％乙醇洗脱物12g；

(4)将步骤(3)得到的中性沉淀经硅胶柱层析，柱层析用硅胶粒度为200目，柱层析的流动相为石油醚-丙酮系统(石油醚沸程为60-90℃)100∶1-2∶1(V/V)混合溶剂梯度洗脱，每200mL体积为一个流分，共收集120个流分。经薄层层析硅胶检识，合并得到A1-A7七个流分；流分A2经石油醚-丙酮10∶1～2∶1(V/V)混合溶剂梯度洗脱，得到A2-1～A2-6的六个流分，流分A2-1经过重结晶得到白色针晶，即化合物gypensapogenin H。流分A2-2经过重结晶后得到白色粉末，即化合物gypensapogenin I。

实施例3

制备gypensapogenin H和gypensapogenin I

制备步骤如下：

(1)选用绞股蓝的干燥全草6000g为原料，用70％工业乙醇回流提取3次(8倍量、8倍量、6倍量，质量倍)，每次2h，合并提取液，减压浓缩得乙醇提取物约200g；

(2)将提取物上大孔树脂柱(HPD100)，依次用水、70％乙醇和95％乙醇进行洗脱，减压回收溶剂后得到70％乙醇洗脱物，即绞股蓝总皂苷部分83g和95％乙醇洗脱物10g；

(4)将步骤(3)得到的中性沉淀经硅胶柱层析，柱层析用硅胶粒度为400目，柱层析的流动相为石油醚-丙酮系统(石油醚沸程为60-90℃)100∶1～50∶1～30∶1～10∶7～5∶10～2∶1(V/V)混合溶剂梯度洗脱，每400mL体积为一个流分，共收集100个流分。经薄层层析硅胶检识，合并得到A1-A7七个流分；流分A2经石油醚-丙酮10∶1～2∶1(V/V)混合溶剂梯度洗脱，得到A2-1～A2-6的六个流分，流分A2-1经过重结晶得到白色针晶，即化合物gypensapogenin H。流分A2-2经过重结晶后得到白色粉末，即化合物gypensapogenin I。

采用核磁共振等光谱法对所得gypensapogenin H和gypensapogenin I进行结构鉴定。

图1为化合物gypensapogenin H的¹H NMR(600MHz，pyridine-d5)，有6个甲基的特征吸收0.80(3H，s，18-CH₃)，0.82(3H，s，29-CH₃)，0.95(3H，s，30-CH₃)，1.26(3H，s，28-CH₃)，1.69(3H，s，27-CH₃)，1.72(3H，s，26-CH₃)；图1还给出4个连氧碳上的质子信号δ3.93(1H，d，J＝5.4Hz)，4.27(1H，d，J＝8.4Hz)，4.56(1H，d，J＝3.6Hz)，4.63(1H，m)以及一个叔碳上的质子信号2.70(1H，dd，J＝5.4，8.4Hz)。图2为化合物gypensapogenin H的¹³C NMR(150MHz，pyridine-d5)谱，共给出30个碳信号，推测其可能为达玛烷型三萜皂苷元，其中包括6个连氧碳信号δ84.0，83.8，77.2，74.0，71.5，71.5；2个烯碳信号δ133.8，130.2，结合不饱和度推测化合物有一个双键和六个环。另外，有6个角甲基信号δ29.3，29.1，27.4，22.5，15.7，12.8；19位角甲基特征信号消失，取而代之的是δ33.1的CH₂碳信号，1位和3位的信号分别为δ74.0和84.0，推测2位和19位的碳连接成桥。将本化合物的碳谱数据与文献中的化合物gypensapogenin A的数据进行对照，二者母核数据基本一致，即母核拥有3个六元环和2个五元环。

图3为化合物gypensapogenin H的HSQC谱，通过对除季碳以外的所有碳氢信号进行了直接相关的归属，图4为gypensapogenin H的HMBC谱，在图4中甲基质子信号δ0.82(δC22.5)与δC84.0(C-3)，δC39.4(C-4)，δC130.2(C-5)，δC27.4(C-28)有远程相关，连氧质子信号δ3.03(δC84.0)与δC74.0(C-1)，δC130.2(C-5)，δC33.1(C-19)有远程相关，质子信号δ4.56(δC74.0)与δC130.2(C-5)有远程相关，提示存在结构片段1，说明双键位置在C-4和C-5位之间。甲基质子信号δ1.72(δC29.3)与δC64.5(C-24)，δC71.5(C-25)，δC29.1(C-27)有远程相关，δ4.27(δC77.2)与δC42.1(C-22)，δC71.5(C-23)，δC64.5(C-24)，δC71.5(C-25)有远程相关，提示存在结构片段2，说明侧链具有一个五元环的结构。甲基质子信号δ0.80(δC15.7)与δC32.2(C-7)，δC38.5(C-8)，δC44.1(C-13)，δC48.6(C-14)有远程相关。甲基质子信号δ0.95(δC12.8)与δC38.5(C-8)，δC48.6(C-14)，δC31.2(C-15)有远程相关。质子信号δ4.63(δC46.5)与δC83.8(C-20)，δC77.2(C-21)，δC71.5(C-23)有远程相关。图5为gypensapogenin H的IR谱，图5显示在3422cm^-1有多组吸收，提示有多个羟基。图6为高分辨质谱给出准分子离子峰m/z 511.3386[M+Na]⁺(计算值为511.3399)。由以上推导可确定化合物的结构，分子式为C₃₀H₄₈O₅与图6给出的分子式一致，是一未见报道的新化合物，命名为gypensapogenin H。该化合物的¹H NMR、¹³C NMR谱信号归属及HMBC相关详见表1。结合¹H、¹³CNMR谱，确定分子式为C₃₀H₄₈O₅，显示不饱和度为7。

表1 gypensapogenin H的¹H NMR，¹³C NMR(600MHz，150MHz，pyridine-d₅)，J inHz

图7为gypensapogenin I的¹H NMR(600MHz，pyridine-d5)谱，其有7个甲基的特征吸收0.85(3H，s，19-CH₃)，0.88(3H，s，30-CH₃)，0.97(3H，s，30-CH₃)，1.04(3H，s，29-CH₃)，1.22(3H，s，28-CH₃)，1.70(3H，s，27-CH₃)，1.73(3H，s，26-CH₃)；图7还给出3个连氧碳上的质子信号δ3.43(1H，dd，J＝5.4，11.4Hz)，4.28(1H，d，J＝9.0Hz)，4.64(1H，m)以及一个叔碳上的质子信号2.72(1H，dd，J＝5.4，11.4Hz)。图8为gypensapogenin I的¹³C NMR(150MHz，pyridine-d5)谱，共给出30个碳信号，推测其可能为达玛烷型三萜皂苷元，其中包括5个连氧碳信号δ83.8，78.1，77.1，71.5，71.5。另外，另外，有7个角甲基信号δ29.3，29.1，28.7，16.6，16.5，16.3，15.7。

图9为gypensapogenin I的HSQC谱，图10为gypensapogenin I的HMBC谱，通过HSQC谱对除季碳以外的所有碳氢信号进行了直接相关的归属，在图10中甲基质子信号δ1.73(δC29.3)与δC64.5(C-24)，δC71.5(C-25)，δC29.1(C-27)有远程相关，δ4.28(δC77.1)与δC42.2(C-22)，δC71.5(C-23)，δC64.5(C-24)有远程相关，δ2.72(δC77.1)与δC77.1(C-21)，δC71.5(C-25)，δC29.3(C-26)有远程相关，提示存在结构片段1，说明侧链具有一个五元环的结构。甲基质子信号δ0.85(δC16.6)与δC39.5(C-1)，δC56.4(C-5)，δC51.3(C-9)，δC37.4(C-10)有远程相关；甲基质子信号δ0.97(δC15.7)与δC40.7(C-8)，δC50.3(C-14)，δC16.6(C-19)有远程相关；甲基质子信号δ1.70(δC29.1)与δC64.5(C-24)，δC71.5(C-25)，δC29.3(C-26)有远程相关；甲基质子信号δ1.73(δC29.3)与δC64.5(C-24)，δC71.5(C-25)，δC29.1(C-27)有远程相关；甲基质子信号δ0.88(δC16.5)与δC44.2(C-13)，δC50.3(C-14)，δC31.8(C-15)，δC15.7(C-18)有远程相关。质子信号δ3.43(δC78.1)与δC28.7(C-28)，δC16.3(C-9)有远程相关。图11为gypensapogenin I的HR-TOF-MS谱，该图给出准分子离子峰m/z 515.3740[M+Na]⁺(计算值为515.3712)。图12为gypensapogenin I的IR谱，在3426cm^-1有多组吸收，提示有多个羟基。由以上推导可确定化合物的结构，分子式为C₃₀H₅₂O₅与HR-TOF-MS给出的分子式一致。经scifinder文献检索，为一未见报道的新化合物，命名为gypensapogenin I。

该化合物的¹H NMR、¹³C NMR谱信号归属及HMBC相关详见表2，结合¹H、¹³C NMR谱，确定分子式为C₃₀H₅₂O₅，显示不饱和度为5。

表2gypensapogenin I的¹H NMR，¹³C NMR(600MHz，150MHz，pyridine-d₅)，J in Hz

实施例4

化合物gypensapogenin H和gypensapogenin I用于抗肿瘤药物的应用。

化合物gypensapogenin H和gypensapogenin I均为白色粉末，使用DMSO溶解。分别配制成浓度为100mmol/L的母液，储存于-20℃。临用时用相应的培养液将其稀释为100μmol/L，10μmol/L，1μmol/L进行实验。DMSO配制的样品进行实验时，DMSO的浓度为1‰。文献报道人参皂苷Rg3、PPD具有抗肿瘤活性且母核结构与待测化合物的结构类似，因此选用Rg3、PPD为阳性对照药，浓度为10μmol/L。

取对数生长期的细胞，调整细胞密度为10×10⁴/mL，接种于96孔板内，100μL/well，培养于37℃，5％CO₂的培养箱内。培养24h后，将各药物稀释为不同浓度，10μL/well，作用72h。分设空白组、给药组，每组设5个复孔。

MTT检验

1)MTT法的基本原理

细胞成活率测定采用MTT分析法，以活细胞代谢还原四甲基偶氮唑盐(3-(4，5-dimethyl-2thiahiazoy1)-3，5-di-phenyl-tetrazolium bromide，MTT)为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下四氮唑环开裂，生成蓝色的Formazan结晶。Formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比。死细胞中此酶消失，不能将MTT还原。还原成生成的Formazan结晶可在二甲基亚砜(DMSO)中溶解，利用酶标仪测定490nm出的光密度OD值，OD值的大小与所生成的Formazan结晶的量成正比，从而反应出药物对细胞成活率的影响。

2)MTT法的测定方法

药物作用72h后，将细胞与0.25mg/mL MTT于37℃下共同孵育4h，吸除培养液后每孔加入100μL DMSO，完全溶解后使用酶标仪于490nm测定其光密度OD值。最后以空白组OD值为100％，计算各组细胞成活率。

统计方法

全部资料采用SPSS(13.0)统计软件包进行检验分析。各组数据用均值±标准误(Mean±S.E.)表示，采用One-Way ANOVA评价整体性差异，并进行Dunnett或Dunnett’sT3检验进行组间比较。

以各浓度所对应的细胞存活抑制率为纵坐标Y，给药浓度的对数为横坐标X，进行线形回归，根据得到的方程求抑制率是50％时的给药浓度，即求得该药物IC50。

实验结果

实验结果显示：化合物gypensapogenin H和gypensapogenin I作用于HepG2(人肝癌细胞株)、A549(人肺癌细胞株)和Du145(人前列腺癌细胞株)肿瘤细胞株72h后对3种细胞株具有一定的杀伤作用，并呈现一定的浓度依赖性。化合物对3种细胞的抑制率与IC₅₀见表3-5。

表3两个化合物对肿瘤细胞HepG2成活的抑制率

注：**P＜0.01有显著性差异，与对照组比较***P＜0.001有显著性差异。

表4两个化合物对肿瘤细胞A549成活的抑制率

表5两个化合物对肿瘤细胞Du145成活的抑制率

两个化合物对HepG2、A549和Du145肿瘤细胞株均具有一定杀伤作用。本发明涉及到的两个化合物对三种细胞株具有显著的细胞毒活性，并且可能对其他肿瘤细胞具有较好的抑制作用，如Hep3B、22R、HeLa等细胞株，可用于抗肿瘤药物的开发。

Claims

1.达玛烷型三萜类化合物的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)选用绞股蓝的干燥全草6000-8000g为原料，用30-95％工业乙醇回流提取3次，每次2h，合并提取液，减压浓缩得乙醇提取物；

(2)将上述乙醇提取物上大孔树脂柱，依次用水、70％乙醇和95％乙醇进行洗脱，减压回收溶剂后得到70％乙醇洗脱物和95％乙醇洗脱物，其中70％乙醇洗脱物为绞股蓝总皂苷部分；

(4)对步骤(3)所得的中性沉淀经硅胶柱层析，分离后得到gypensapogenin H；

所述步骤(4)中的柱层析是采用粒度为100-400目的硅胶，柱层析的流动相为石油醚-丙酮体积比为100∶1-2∶1的混合溶剂梯度洗脱，每250-400mL体积为一个流分，共收集100-150个流分，经薄层层析硅胶检识，合并得到A1-A7七个流分；流分A2经石油醚-丙酮体积比为10∶1-2∶1混合溶剂梯度洗脱，得到A2-1～A2-6的六个流分，流分A2-1经过重结晶得到白色粉末，即化合物gypensapogenin H，其结构式如下：

2.如权利要求1所述的制备方法，所述步骤(1)中3次提取所用的乙醇用量按质量计，分别为绞股蓝质量的8倍、8倍和6倍。

3.如权利要求1所述的制备方法，所述步骤(2)中的大孔树脂柱为HPD100。