CN102335224A

CN102335224A - 纤维素酶协同超声辅助提取花生壳黄酮类化合物的方法

Info

Publication number: CN102335224A
Application number: CN2011101943377A
Authority: CN
Inventors: 陈蕾蕾; 杜方岭; 裘纪莹; 祝清俊; 王文亮; 孙欣; 刘孝永
Original assignee: Institute of Agro Food Science and Technology of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Agro Food Science and Technology of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-07-12
Filing date: 2011-07-12
Publication date: 2012-02-01

Abstract

本发明涉及花生壳黄酮类化合物的提取方法，具体涉及一种纤维素酶协同超声波辅助提取花生壳黄酮类化合物的方法。一种纤维素酶协同超声波辅助提取花生壳黄酮类化合物的方法，其特征在于，在乙醇水溶液中加入花生壳粉，再加入纤维素酶，加入纤维素酶的同时超声波提取黄酮。本发明的优点是采用纤维素酶和超声波协同作用，在乙醇作为介质和提取剂的条件下对花生壳粉进行提取，采用该方法提取花生壳中的黄酮，不仅大大的缩短了提取时间，提高了其提取效率，极大地降低了提取成本，而且提取条件温和，用酶部分代替了传统提取方式中所采用的有机溶剂来提取花生壳黄酮类化合物，减少了有机溶剂带来的环境污染。

Description

纤维素酶协同超声辅助提取花生壳黄酮类化合物的方法

技术领域

本发明属于涉及花生壳黄酮类化合物的提取方法，具体涉及一种纤维素酶协同超声波辅助提取花生壳黄酮类化合物的方法。

背景技术

花生(Peanut)来源于豆科一年生草本植物花生(Arachis hypogaea L.)的干燥荚果，花生壳(Peanut hull)是其荚果的外壳，花生壳中含有大量的以木犀草素为代表的黄酮类化合物，研究表明，花生壳中所含的黄酮类化合物与其生理活性密切相关，花生壳中含有的黄酮类物质具有降血压、降血脂、扩张冠状动脉、抗氧化、镇咳、祛痰平喘、抗菌抗炎、增强免疫和抗肿瘤等多种药理活性，它们是以黄酮（2-苯基色原酮）为母核，黄酮母核上连有烃基、甲氧基、氢氧基等到取代基，是植物经过光合作用产生的，按结构可分为黄酮类、黄烷醇类、异黄酮类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类、橙酮类、黄烷酮类、花色素类、查耳酮、色原酮等。

花生中含有的黄酮类化合物的生理活性越来越受到人们的普通关注和重视，其生理活性表现在抗氧化、抗癌、抗肿瘤、抗炎、抗心脑血管疾病、免疫调节、抑菌抗病毒、降血糖血脂等作用。

在黄酮类化合物的提取技术上，主要有水提法、醇提法、碱水或碱性稀醇提取法、微波法、超声波法等，但都具有各自的局限性，如水提法提取率低；碱性水或者是碱性稀醇提取法采用了大量的碱，生产过程中的碱性废水造成环境污染，增加了环境治理成本；有机溶剂提取法的不足之处在于该方法中采用了大量的有机溶剂，溶剂消耗量大、操作时间长、有效成分得率不高；超临界萃取法成本较高，不适合大规模的工业化生产。

ZL200910000036.9公开了一种利用超声波辅助化学法浸提花生壳黄酮的新方法，该方法的特征是在花生壳的黄酮类化合物的提取过程中，采用超声波辅助的方法来提取，其优点是利用超声波辅助化学法取代传统的溶剂方法，降低了黄酮的生产成本，缩短了黄酮的提取时间，提高了黄酮的产量，更适合规模化的工业生产；该方法的缺点是，由于花生壳的提取中，是将花生壳与石油醚混合超声提取的，超声波辅助提取的本质还是采用有机试剂提取，有机试剂用量不会减少，还是带来了一定的环境问题，增加了后续的有机溶剂处理的难度和成本。

纤维素酶协同超声波辅助提取法是一种新的辅助提取总黄酮的方法，下述的文献公开了采用该方法提取黄酮的具体步骤，如中国专利公开的CN 101029320 B《纤维素酶协同超声波提取豆粕异黄酮的方法》，该方法先在水介质下采用纤维素酶提取30～50min，再加入85%的酒精提取30～50min，然后进行功率为800～1000W，频率为20～25KHz的条件下超声波提取6～8min；姚超、于海宁等报道的《酶解结合超声波辅助技术提取纯化菊米总黄酮》，该方法先在水介质下酶解6小时，再添加体积分数为50%的乙醇超声波提取30min，上述两种方法的共同特点是纤维素酶的酶解均在水介质下进行，把纤维素酶处理、超声波处理和乙醇提取技术进行了简单的串联，虽然这几种提取方式的叠加能提高提取率，但是以上两种方法缺点是，纤维素酶和乙醇的用量大，而且其提取过程比较复杂，耗能大，耗时长。

王新、肖凯军报道的《纤维素酶-超声辅助提取麦麸总黄酮的工艺研究》是通过优化工艺，将纤维素酶、超声波和乙醇在提取总黄酮中的作用结合起来进行一步提取，在超声波条件下，在乙醇/水介质中进行纤维素酶处理。这种方法相对于上一种方法的优点在于提取过程一步到位，乙醇和酶用量少，超声功率低，提取时间短，且提取物得率和抗氧化活力高。难点在于工艺并不是简单的叠加，在参数优化过程中需要考虑的影响因素非常复杂，所需的技术含量要求更高。

因此需要针对上述的对花生壳中黄酮的提取方法进行改进，使其克服以上方法中的缺点，缩短提取时间，提高其提取率和提取效率，降低成本。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种反应条件温和、提取率高、无污染、提取时间短、提取效率高的纤维素酶协同超声波辅助提取花生壳黄酮类化合物的方法。

一种纤维素酶协同超声波辅助提取花生壳黄酮类化合物的方法，该方法与CN 101029320 B中公开的方法不同之处在于，CN 101029320 B在水作为介质的条件下先采用纤维素酶解一段时间，再在乙醇中提取一段时间，然后进行超声波处理；本发明突出的特点是，在粉碎后的花生壳粉中加入乙醇水溶液，再加入纤维素酶，同时超声波提取黄酮类化合物，也就是说本发明的方法是以乙醇水溶液为介质，在乙醇水溶液中加入纤维素酶的同时协同超声波提取花生壳黄酮类化合物。

本发明的纤维素酶超声辅助提取花生壳黄酮类化合物的方法，包括下述的步骤：

a. 将花生壳清洗、除杂，在40～70℃下烘30～60min，粉碎至细度为 40～80目，得花生壳粉；

b. 将步骤a中的花生壳粉加入到30%～60%的乙醇水溶液中，混合料液比为1:10～30，搅拌均匀并加热至40～60℃，调节溶液pH值为4.5～6.0，加入占花生壳粉重量0.4%～0.7%的纤维素酶水解花生壳粉，设定超声功率40～100W，恒温50℃下保持30～50min后沸水浴灭酶5～8min，得浸提液料混合物；

c. 将步骤b中的浸提液料混合物真空抽滤，对滤液进行浓缩，并回收溶剂，将浓缩液冷冻干燥，得黄酮类化合物的粗品。

优选的，以上的乙醇水溶液浓度为30%～50% ；最优选的乙醇水溶液的浓度为40%。

优选的，以上的超声功率40～80W；最优选的超声功率60W。

优选的，纤维素酶的用量为花生壳粉重量的0.4%～0.6%；最优选的纤维素酶的用量为花生壳粉重量的0.5%。

以上所说的步骤b中，将经过步骤a粉碎至60目的花生壳粉加入到40%的乙醇水溶液中，料液比为1：20，搅拌均匀并加热至50℃，调节溶液pH值为5.5，添加占花生壳重量0.5%的纤维素酶，设定超声功率60W，恒温50℃下保持40min后沸水浴灭酶6min，得浸提液料混合物。

本发明克服的技术难题是，由于在乙醇中酶的活性远远低于其在水中的活性，因此以乙醇为介质和提取剂，在其中加入纤维素酶来对花生壳粉物料进行酶解，纤维素酶的活性会受到影响，从而影响到提取率，因此要使酶在乙醇中能很好的发挥其作用，将其受到乙醇的影响降至最低。本发明采用的方法是将乙醇的体积分数控制在一定的范围内，在该范围下，纤维素酶受到乙醇的影响较小，能很好的发挥其酶解的作用，而且乙醇也能很好的发挥其作为提取剂的作用。

本发明克服的另外一个难题是，由于超声波的功率会对酶的活性产生影响，超声波功率太大，不仅增加了提取过程中的能耗，还会使酶的活性降低，从而影响纤维素酶提取黄酮类化合物的效率；超声波功率太小，则不能很好的发挥超声波作为提取方式的作用，因此本发明得到了一个合适的超声波功率的范围，在该范围内，纤维素酶的活性能很好的发挥其作用，而且超声波也能发挥其作用，提高提取率。

本发明的有益效果是：

（1）在提取的过程中，以乙醇水溶液为介质，在含有花生壳粉物料的该介质中加入酶的同时采用超声波提取，协同作用于花生壳粉，与分段式提取方法相比，也就是与先以水为介质酶解提取、再用乙醇提取、然后再超声波提取的方法相比，本发明的方法要节省2～3h，大大的缩短了其提取时间，提高了提取率；

（2）本发明使用的乙醇水溶液其浓度较分段式提取方法的要低，而本发明的提取效果却与分段式方法的大致相同，减少了乙醇水溶液的用量，节约了成本；

（3）本发明与分段式的提取方法相比，其超声功率较低，减少了能源的消耗，却能达到相同的效果；

另外，与传统的有机溶剂提取方法相比，本发明采用纤维素酶提取花生壳黄酮类化合物，其反应条件温和，无毒副作用，不会带来污染环境。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。

实施例1

挑选无虫、无霉烂的花生壳，用水清洗干净，于55℃下烘干至水分含量为5%左右，再用粉碎机粉碎，将粉碎后的花生壳过60目筛，收集筛下花生壳粉作为原料；取10g过筛后的花生壳粉加入到200mL 40%乙醇水溶液中，搅拌均匀并加热至50℃，调节溶液pH5.5，加入占花生壳粉重量0.5%的纤维素酶混匀，同时启动超声波提取，超声波功率设置为60W，恒温50℃下保持提取40min，后沸水浴灭活5min，得浸提液料混合物；将上述液料混合物真空抽滤，滤液经真空旋转蒸发浓缩，回收溶剂，将浓缩液冷冻干燥，得花生壳黄酮类化合物粗品。

经测定，花生壳黄酮类化合物的提取率为2.05%，该提取率是指从100g花生壳粉中可以提取出2.05g总黄酮，以下实施例中所说的提取率均同此计算方法。

对照例1

挑选无虫、无霉烂的花生壳，用水清洗干净，于55℃下烘干至水分含量为5%左右，再用粉碎机粉碎，将粉碎后的花生壳过60目筛，收集筛下花生壳粉作为原料；取10g花生壳粉加入到120mL水溶液中，加入占花生壳粉重量0.5%的纤维素酶，调节溶液pH5.5，搅拌均匀并加热至50℃，提取1.5h后沸水浴灭活5min;

再加入80mL 无水乙醇，混合均匀，在室温下保持1h;

启动超声波发生器提取，将超声波功率设置为60W，恒温50℃下保持提取40min，得浸提液料混合物；将上述液料混合物真空抽滤，滤液经真空旋转蒸发浓缩，回收溶剂，将浓缩液冷冻干燥，得花生壳黄酮类化合物粗品。

经测定，花生壳黄酮类化合物的提取率为1.96%。

对照例2

再加入无水乙醇80mL，混合均匀，同时启动超声波发生器提取，将超声波功率设置为60W，恒温50℃下保持提取40min，得浸提液料混合物；将上述液料混合物真空抽滤，滤液经真空旋转蒸发浓缩，回收溶剂，将浓缩液冷冻干燥，得花生壳黄酮类化合物粗品。

经测定，花生壳黄酮类化合物的提取率为1.90%。

对照例3

挑选无虫、无霉烂的花生壳，用水清洗干净，于55℃下烘干至水分含量为5%左右，再用粉碎机粉碎，将粉碎后的花生壳过60目筛，收集筛下花生壳粉作为原料；取10g花生壳粉加入到200mL 40%乙醇水溶液中，搅拌均匀并加热至50℃，调节溶液pH5.5，加入占花生壳粉重量0.5%的纤维素酶混匀，恒温50℃下保持提取1.5h后沸水浴灭活5min；

启动超声波发生器提取，将超声波功率设置为60W，恒温50℃下保持提取40min，后沸水浴灭活5min，得浸提液料混合物；将上述液料混合物真空抽滤，滤液经真空旋转蒸发浓缩，回收溶剂，将浓缩液冷冻干燥，得花生壳黄酮类化合物粗品。

经测定，花生壳黄酮类化合物的提取率为，1.97%。

	实施例1	对照例1	对照例2	对照例3
					提取率	2.05%	1.96%	1.90%	1.97%
提取时间min	40	190	130	130

实施例1以乙醇水溶液为介质，加入纤维素酶提取，同时启动超声波发生器超声波提取，黄酮类化合物的提取率达2.05%，总提取时间为40min；对照例1是以水为介质加入酶提取1.5h，再加入乙醇提取1h，最后超声提取，其提取率为1.96%，总提取时间为190min；对照例2是以水为介质加入酶提取1.5h，再加入乙醇提取，同时启动超声波进行超声提取40min，其提取率为1.90%，总提取时间为130min；对照例3是以乙醇水溶液为介质，同时加入纤维素酶提取1.5h，之后再启动超声波进行超声提取40min，其提取率为1.97%，总提取时间为130min。从以上的实施例和对照例的比较中可以看出，与以上3个对照例相比，实施例1中采用本发明的方法提取花生壳中的黄酮类化合物，其提取率高，提取时间短，提取效率高。

实施例2

挑选无虫、无霉烂的花生壳，用水清洗干净，于55℃下烘干至水分含量为5%左右，再用粉碎机粉碎，将粉碎后的花生壳过60目筛，收集筛下花生壳粉作为原料；取10g花生壳粉加入到200mL 35%乙醇水溶液中，搅拌均匀并加热至50℃，调节溶液pH5.0，加入占花生壳粉重量0.5%的纤维素酶混匀，同时启动超声波提取，超声波功率设置为60W，恒温50℃下保持提取40min，后沸水浴灭活5min，得浸提液料混合物；将上述液料混合物真空抽滤，滤液经真空旋转蒸发浓缩，回收溶剂，将浓缩液冷冻干燥，得花生壳黄酮类化合物粗品。

对照例1

对照例1与实施例1的不同之处在于，对照例1中乙醇的体积分数为10%，其它完全相同。

对照例2

对照例2与实施例1的不同之处在于，对照例2中乙醇的体积分数为80%，其它完全相同。

	实施例2	对照例1	对照例2
				提取率	2.02%	1.29%	1.90% 。

由以上的表格中的数据可以看出，除了作为介质和提取剂的乙醇其体积分数不同以外，在其它条件完全相同的情况下，实施例2的提取率要大于对照例2，并远远大于对照例1。这说明，乙醇的体积分数对提取的影响较大，只有在最佳体积分数的乙醇中，花生壳中黄酮类化合物的提取率才较高，体积分数太小，则乙醇无法发挥其作为提取剂的作用，乙醇体积分数太大，则会对纤维素酶的活性产生影响，从而降低了提取率。

实施例3

挑选无虫、无霉烂的花生壳，用水清洗干净，于55℃下烘干至水分含量为5%左右，再用粉碎机粉碎，将粉碎后的花生壳过60目筛，收集筛下花生壳粉作为原料；取10g花生壳粉加入到300mL 35%乙醇水溶液中，搅拌均匀并加热至50℃，调节溶液pH5.5，加入占花生壳粉重量0.4%的纤维素酶混匀，同时启动超声波提取，超声波功率设置为60W，恒温50℃下保持提取40min，后沸水浴灭活5min，得浸提液料混合物；将上述液料混合物真空抽滤，滤液经真空旋转蒸发浓缩，回收溶剂，将浓缩液冷冻干燥，得花生壳黄酮类化合物粗品。

对照例1

对照例1与实施例1的不同之处在于，对照例1中超声波提取时设置其功率为20W，其它完全相同。

对照例2

对照例2与实施例2的不同之处在于，对照例2中超声波提取时设置其功率为100W，其它完全相同。

	实施例3	对照例1	对照例2
				提取率	2.01%	1.56%	1.90% 。

由以上的表格中的数据可以看出，除了超声波的功率设置的不同以外，在其它条件完全相同的情况下，实施例2的提取率要大于对照例1和对照例2。这说明，超声波的功率对花生壳中黄酮类化合物的提取影响较大，超声波功率太小，则发挥不了其对提取的作用，超声波功率太大，则会对纤维素酶的活性产生影响，降低纤维素酶的活性，而且超声波功率大，还增加了能耗，因此，只有在最佳的超声波功率下，花生壳中黄酮类化合物的提取率才较高。

实施例4

挑选无虫、无霉烂的花生壳，用水清洗干净，于55℃下烘干至水分含量为5%左右，再用粉碎机粉碎，将粉碎后的花生壳过60目筛，收集筛下花生壳粉作为原料；取10g花生壳粉加入到300mL 40%乙醇水溶液中，搅拌均匀并加热至50℃，调节溶液pH5.5，加入占花生壳粉重量0.5%的纤维素酶混匀，同时启动超声波提取，超声波功率设置为60W，恒温50℃下保持提取40min，后沸水浴灭活5min，得浸提液料混合物；将上述液料混合物真空抽滤，滤液经真空旋转蒸发浓缩，回收溶剂，将浓缩液冷冻干燥，得花生壳黄酮类化合物粗品。

对照例1

对照例1与实施例1的不同之处在于，对照例1中所加入的纤维素酶占花生壳粉重量的0.3%，其它完全相同。

对照例2

对照例2与实施例2的不同之处在于，对照例2中所加入的纤维素酶占花生壳粉重量的0.8%，其它完全相同。

	实施例4	对照例1	对照例2
				提取率	1.99%	1.75%	1.97% 。

由以上的表格中的数据可以看出，除了纤维素酶的用量不同以外，在其它条件完全相同的情况下，实施例2的提取率要大于对照例1，对照例2和实施例2的提取率相当。这说明，纤维素酶的用量对花生壳中黄酮类化合物的提取也会产生一定的影响，纤维素酶用量少，提取率则较低，纤维素酶的用量达到一定比例以后，花生壳中黄酮类化合物的提取率将不再增加，因此，在一定浓度范围内的纤维素酶用量下，花生壳中黄酮类化合物的提取率高。

实施例5

挑选无虫、无霉烂的花生壳，用水清洗干净，于55℃下烘干至水分含量为5%左右，再用粉碎机粉碎，将粉碎后的花生壳过60目筛，收集筛下花生壳粉作为原料；取10g花生壳粉加入到200mL 40%乙醇水溶液中，搅拌均匀并加热至50℃，调节溶液pH5.5，加入占花生壳粉重量0.5%的纤维素酶混匀，同时启动超声波提取，超声波功率设置为70W，恒温50℃下保持提取40min，后沸水浴灭活5min，得浸提液料混合物；将上述液料混合物真空抽滤，滤液经真空旋转蒸发浓缩，回收溶剂，将浓缩液冷冻干燥，得花生壳黄酮类化合物粗品。

经测定，花生壳黄酮类化合物的提取率为，2.04%。

Claims

1.一种纤维素酶协同超声波辅助提取花生壳黄酮类化合物的方法，其特征在于，在乙醇水溶液中加入花生壳粉，再加入纤维素酶，加入纤维素酶的同时超声波提取黄酮。

2.如权利要求1所述的一种纤维素酶超声辅助提取花生壳黄酮类化合物的方法，包括下述的步骤：

b. 将步骤a中的花生壳粉加入到浓度为30%～60%的乙醇水溶液中，混合料液比为1:10～30，该料液比是指花生壳粉的重量与乙醇水溶液的体积比，以下提到的料液比均同，搅拌均匀并加热至40～60℃，调节溶液pH值为4.5～6.0，加入占花生壳粉重量0.4%～0.7%的纤维素酶水解花生壳粉，设定超声功率40～100W，恒温50℃下保持30～50min后沸水浴灭酶5～8min，得浸提液料混合物；

c. 将步骤b中的浸提液料混合物真空抽滤，对滤液进行浓缩，并回收溶剂，将浓缩液冷冻干燥，得黄酮类化合物粗品。

3.如权利要求1所述的一种纤维素酶超声辅助提取花生壳黄酮类化合物的方法，其特征在于：所述的乙醇水溶液的浓度为30%～50%。

4.如权利要求3所述的一种纤维素酶超声辅助提取花生壳黄酮类化合物的方法，其特征在于：所述的乙醇水溶液的浓度为40%。

5.如权利要求1所述的一种纤维素酶超声辅助提取花生壳黄酮类化合物的方法，其特征在于：所述的超声功率40～80W。

6.如权利要求5所述的一种纤维素酶超声辅助提取花生壳黄酮类化合物的方法，其特征在于：所述的超声功率60W。

7.如权利要求1所述的一种纤维素酶超声辅助提取花生壳黄酮类化合物的方法，其特征在于：所述的纤维素酶的用量为花生壳粉重量的0.4%～0.6%。

8.如权利要求7所述的一种纤维素酶超声辅助提取花生壳黄酮类化合物的方法，其特征在于：所述的纤维素酶的用量为花生壳粉重量的0.5%。

9.如权利要求2所述的一种纤维素酶超声辅助提取花生壳黄酮类化合物的方法，其特征在于：将经过步骤a粉碎至60目的花生壳粉加入到40%的乙醇水溶液中，料液比为1：20，搅拌均匀并加热至50℃，调节溶液pH值为5.5，添加占花生壳重量0.5%的纤维素酶，设定超声功率60W，恒温50℃下保持40min后沸水浴灭酶6min，得浸提液料混合物。