CN102520089A - 富硒谷物中硒形态的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富硒谷物中硒形态的测定方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：（
1
）富硒谷物的预处理：使用提取缓冲液
Tris-HCl
对粉碎处理后的富硒谷物样品进行提取，提取处理后先加入有效量的淀粉酶进行水解，然后依次加入有效量的蛋白酶
K
、蛋白酶
XIV
进行水解提取得到待测样品溶液；（
2
）采用氢化物发生——原子荧光光谱法与高效液相色谱法联用分别对标准硒形态溶液和待测样品溶液进行测定。该方法简单易操作，重复性好，所用试剂无毒、无污染。
Description
技术领域
本发明涉及一种富硒谷物硒形态的测定方法，特别是涉及一种富硒谷物进行前处理后进行硒形态的测定方法。
背景技术
硒是人体必需的微量元素之一，是谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的组成成分，具有抗氧化、抗癌、防衰老、提高人体免疫力、保护心脑血管等作用(Rotruck J T，Pope A L，Ganther H E，et al Selenium：biochemicalrole as a component of glutathione peroxidase.Science，1973，179，588-590.)。我国有2/3的地区缺硒，其中有1/3的地区为严重缺硒地区。人和动物体缺硒会导致克山病，大骨节病，动物的白肌病等，除此以外一些癌症，地方性甲状腺障碍等疾病也与低硒环境密切相关(Ip C.Lessons frombasic research in selenium and cancer prevention.Journal Nutrition，1998，128，1845-1854.)。人们日常饮食中的硒包括无机硒和有机硒，其中无机硒毒性较大，中毒量与需要量的界限非常接近，而且吸收和利用率差，生物有效性低，因而被严格限制其使用量。有机硒更利于人体吸收利用，生物活性强，毒性低(卢岚，鲁兵，王春娥.保健食品中有机硒和无机硒的分析探讨.中国卫生检验杂志.2010，20(4)：767-769.)，是更高效、安全的人体补硒形式。硒的生物学功能的发挥主要依赖于其存在形态，特别是有机硒(硒代氨基酸)的形态。因此，准确的检测分析硒代氨基酸的形态具有重大的意义，不仅能指导消费者科学补硒，还能进一步了解硒的生物化学特性和硒在自然界迁移变化的规律。
目前，我国测定有机硒含量的方法主要为差减法(秦昉.植物中有机硒含量的测定.无锡轻工业大学学报.1998，17(4)：74-77.)，差减法的原理是先利用不同的试剂将待测样品中的有机硒和无机硒分离，因无机硒主要以硒酸根(SeO42-)和亚硒酸根(SeO32-)阴离子形式存在，易溶于水。有机硒主要是与蛋白质、纤维素和碳水化合物中的C、N等结合，以大分子的有机物形态存在，所以可利用环己烷或甲苯等有机溶剂萃取出有机硒，再通过测定总硒和无机硒的含量，差减得到有机硒的含量。此方法操作步骤繁琐，重复性差，只能得到有机硒的总量，对于具体的有机硒形态并不清楚，且所用的环己烷、甲苯等有机溶剂存在一定的毒性。硒形态研究属于前沿研究，目前国内、外并无硒形态研究方法的标准。本发明利用温和的提取方式，提取含硒化合物，利用酶水解含硒化合物后再利用液相色谱进行有效分离，最后利用高灵敏度的原子荧光(AFS)进行不同形态硒的测定，最后得到有机硒的含量。此方法的优点是能测定富硒植物中不同形态的硒含量和有机硒含量，能进一步了解植物富集吸收硒的转化规律，此方法简单易操作，重复性好，精确度高，所用试剂无毒、无污染。
国外对硒形态测定的前处理方法也有报道，Selenium species in leavesof chicory，dandelion，lamb’s lettuce and parsley(Darja Mazej，VekoslavaStibilj，et al.Food Chemistry，2008，107：75-83.)公开了一种单独利用蛋白酶水解样品然后进行硒形态测试的方法，该方法蛋白酶用量与样品的比例为1∶2～1∶5，成本很高。
所以，开发一种针对以硒代氨基酸为主要分析目标、低成本高效率的样品前处理及测试方法十分有必要。
发明内容
本发明的目的是克服现有硒形态测定技术特别是提取技术中存在的不足，提供一种操作简便，提取效率高，重复性好，成本低的富硒谷物中硒形态的测定方法。
为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案如下：
一种富硒谷物中硒形态的测定方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(1)富硒谷物的预处理：使用提取缓冲液Tris-HCl对粉碎处理后的富硒谷物样品进行提取，提取处理后先加入有效量的淀粉酶进行水解，然后依次加入有效量的蛋白酶K、蛋白酶XIV进行水解提取得到待测样品溶液；
(2)采用氢化物发生——原子荧光光谱法与高效液相色谱法联用分别对标准硒形态溶液和待测样品溶液进行测定；用峰高或峰面积进行定量，用数据处理中的外标法，绘制标准工作曲线后保存，然后将样品峰积分处理，利用外标法校正，按照公式(1)可计算得到待测样品溶液中硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的含量；
X＝C×V/m (1)
其中：X为样品中待测物质的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；C为待测液中该物质的浓度，单位为微克每升(μg/L)；V为测定液体总体积，单位为毫升(mL)；F为稀释倍数；m为称样质量(体积)，单位为克(g/mL)。
优选的，所述方法中提取缓冲液Tris-HCl的浓度为100mmol/L，pH7.5，谷物样品与提取液的比例(m∶V)为1∶25～1∶100。
优选的，所述方法中提取方法采用超声提取，提取时间为10～30min。
优选的，所述方法中淀粉酶与谷物样品的重量比例为1∶10～1∶40。
优选的，所述方法中蛋白酶K与固体谷物样品的比例(m∶m)为1∶20～1∶100；水解温度控制在40～55℃。
优选的，所述方法中蛋白酶XIV与谷物样品的比例(m∶m)为1∶20～1∶100；水解温度控制在30～45℃。
优选的，所述方法中水解处理后样品溶液在0～10℃下，离心处理后上清液过0.2～0.5μm的滤膜，制得待测上清液。
优选的，所述方法中高效液相色谱法和氢化物发生——原子荧光光谱法联用时液相色谱及原子荧光条件为：
流动相(40mmol/L(NH4)2HPO4，pH 6.0)；流速1mL/min；进样体积100μL；蠕动泵转速65rpm；灯电流/辅阴极：100mA，45mA；光电倍增管负高压：300V；载气流速：300mL/min；屏蔽气流速：700mL/min。
优选的，所述方法中高效液相色谱法和氢化物发生——原子荧光光谱法联用时氢化物发生条件是：
还原剂成分：0.35％NaOH+1.2％NaBH4，流速：6mL/min；氧化剂成分：0.35％NaOH+0.8％H2O2，流速：6mL/min；载流：10％HCl，流速：6mL/min。
优选的，所述方法开机后对液相色谱及原子荧光进行设置，待仪器稳定后，先做标准曲线，然后测定处理好的样品溶液，在上述条件下硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的保留时间依次为：2.6min，3.2min，4.0min，5.0min，待测样品中的硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的色谱峰保留时间与标准溶液相比变化范围在±5％之内即认为为该待测定物质。
本发明涉及一种富硒谷物中硒形态的测定方法，是利用超声提取后，再结合温和的酶水解，使富硒植物中的含硒化合物充分水解并利用仪器进行硒形态的测定。所述的以硒代氨基酸为主要硒形态指标的测定方法方法，步骤描述如下：
(1)先称取粉碎过筛的富硒谷物于塑料离心管中，加入提取缓冲液Tris-HCl(100mmol/L，pH7.5)，混匀。两者的比例(m∶V)为1∶25～1∶100；
(2)将混合液放入超声清洗器超声提取10～30min；
(3)再先加入淀粉酶水解1h后，再加入蛋白酶K，50℃，一并恒温振荡(转速150～200rpm，使塑料离心管中的液体能充分振荡)提取4～12h。淀粉酶与秤取的富硒谷物的比例(m∶m)为1∶10～1∶40，蛋白酶K与秤取的样品的比例(m∶m)为1∶20～1∶200；
(4)再加入蛋白酶XIV，37℃，恒温振荡(转速150～200rpm，使塑料离心管中的液体能充分振荡)提取4～12h，蛋白酶XIV与秤取的样品的比例为1∶20～1∶200；
(5)1～4步中获得的溶液在4℃下，每分钟转速10000转，离心30min，取上清液过0.22μm的滤膜，得到待测溶液。
(6)设定液相色谱及原子荧光条件：
流动相(40mmol/L(NH4)2HPO4，pH 6.0)；流速1mL/min；进样体积100μL；蠕动泵转速65rpm；灯电流/辅阴极：100mA，45mA；光电倍增管负高压：300V；载气流速：300mL/min；屏蔽气流速：700mL/min。
氢化物发生条件：
还原剂成分：0.35％NaOH+1.2％NaBH4，流速：6mL/min；氧化剂成分：0.35％NaOH+0.8％H2O2，流速：6mL/min；载流：10％HCl，流速：6mL/min。
(7)开机后按上述条件对液相色谱及原子荧光进行设置，待仪器稳定后，先做标准曲线，然后测定处理好的样品溶液，在上述条件下硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的保留时间依次为：2.6min，3.2min，4.0min，5.0min，待测样品中的硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的色谱峰保留时间与标准溶液相比变化范围在±5％之内即认为为该待测定物质。
(8)用峰高或峰面积进行定量，用数据处理中的外标法，绘制标准工作曲线后保存，然后将样品峰积分处理，利用外标校正，即可得到待测溶液中硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的浓度。
(9)按照公式(1)可计算得到待测样品中硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的浓度。
X＝C×V/m………………(1)
式中：
X-样品中待测物质的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
C-待测液中该物质的浓度，单位为微克每升(μg/L)；
V-测定液体总体积，单位为毫升(mL)；
F-稀释倍数；
m-称样质量(体积)，单位为克(g/mL)。
相比现有技术，本发明具有以下有益效果：
1、选择温和的提取试剂：pH近中性的Tris-HCl，使含硒化合物在提取过程中形态保持稳定。
2、提取过程中采用超声提取，使含硒化合物更多的溶入提取液中，提高了提取效率。
3、超声提取在加酶之前，一是不破坏酶的结构，影响酶的活性，二是使含硒化合物更多的溶入提取液后，更利于酶的水解。
4、先加入淀粉酶能促进蛋白酶水解含硒化合物。
5、使用两种蛋白酶水解，含硒化合物水解更彻底，与一种蛋白酶水解相比，提取效率提高且均可达85％以上，所需使用的蛋白酶的量更少，节约了成本。
6、本发明方法简单易操作，重复性好，所用试剂无毒、无污染。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1为硒形态标准分离谱图；谱图中揭示了硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的依次出峰顺序、保留时间及浓度梯度。
图2为本发明实施例1富硒玉米的测定结果图；由图2可知，采用本发明的提取条件及利用高灵敏度的形态分析仪器可测定富硒玉米中仅存在硒蛋氨酸，根据峰面积计算可得到硒蛋氨酸的含量及占总硒的比例。
图3为本发明实施例2富硒大米的测定结果图；由图3可知，采用本发明的提取条件及利用高灵敏度的形态分析仪器可测定富硒大米中仅存在硒蛋氨酸。
图4为本发明实施例3富硒小麦的测定结果图；由图4可知，采用本发明的提取条件及利用高灵敏度的形态分析仪器可测定富硒小麦中仅存在硒甲基半胱氨酸和硒代蛋氨酸两种硒氨基酸形态。
具体实施方式：
以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件作进一步调整，未说明的实施条件通常为常规实验中的条件。
人体补充硒的主要来源是食物，谷物是人体补充硒的主要来源之一，富硒谷物因生产的方式不同，其中硒的含量及存在形式也存在很大的差别，因此对富硒谷物中硒及硒的存在形式，特别是硒代氨基酸的测定有利于消费者选择安全、有效的富硒食品进行补硒，本发明实施例选择了富硒玉米、富硒大米及富硒小麦进行前处理及硒形态的测定。
实施例1富硒玉米中硒形态测定
对富硒玉米中的硒形态测定前处理方法步骤进行了优化，优化过程及结果如下：
称取0.2g富硒玉米样品于15mL塑料离心管中，加入5mL提取缓冲液Tris-HCl，超声提取20min，加入淀粉酶10mg，再加入0.5mg蛋白酶K，50℃，恒温振荡培养8h后加入0.5mg蛋白酶XIV，37℃，恒温振荡培养8h，接着4℃下，每分钟转速10000转，离心30min，上清液过0.22μm的滤膜后，制备得到上机待测液。
将液相色谱条件设置为流动相(40mmol/L(NH4)2HPO4，pH 6.0)；流速1mL/min；进样体积100μL；蠕动泵转速65rpm；灯电流/辅阴极：100mA，45mA；光电倍增管负高压：300V；载气流速：300mL/min；屏蔽气流速：700mL/min。氢化物发生条件设置为还原剂成分：0.35％NaOH+1.2％NaBH4，流速：6mL/min；氧化剂成分：0.35％NaOH+0.8％H2O2，流速：6mL/min；载流：10％HCl，流速：6mL/min。
开机后按上述条件对液相色谱及原子荧光进行设置，待仪器稳定后，先做标准曲线，然后测定处理好的样品溶液，在上述条件下硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的保留时间依次为：2.6min，3.2min，4.0min，5.0min，待测样品中的硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的色谱峰保留时间与标准溶液相比变化范围在±5％之内即认为为该待测定物质。
用峰高或峰面积进行定量，用数据处理中的外标法，绘制标准工作曲线后保存，然后将样品峰积分处理，利用外标校正，即可得到待测溶液中硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的浓度。并根据公式计算样品硒形态数据。
表1优化条件筛选及效果
由表1可知，富硒玉米硒形态测定前处理方法中选择超声时间为20min，淀粉酶加入量为10mg，两种蛋白酶的加入量分别为0.5mg，以及培养时间为8h，含硒化合物的提取效率非常理想，提取效率可达85％以上，比一种蛋白酶水解效率提高了15％以上。
测定结果：
表2仪器的检出限及精密度的要求
表2为硒形态测定仪器的性能的要求。图1为硒形态标准分离谱图。
表3富硒玉米测定结果
注：样品数量n＝3
图2为富硒玉米测定结果。由表3，图2可知，富硒玉米中硒主要以硒蛋氨酸形式存在，且有机硒占总硒的比例在70％以上。
表4富硒玉米的加标回收率的测定结果
由表4可知，我们加标的4种硒形态的回收率在86％～98％，回收效果非常理想，说明前处理方法及测定方法准确可靠。
实施例2富硒大米中硒形态测定
称取0.2g样品于15mL塑料离心管中，加入5mL提取缓冲液Tris-HCl，超声提取30min，加入淀粉酶5mg和1mg蛋白酶K，50℃，恒温振荡培养12h，再加入1mg蛋白酶XIV，37℃，恒温振荡培养12h后4℃下，每分钟转速10000转，离心30min，上清液过0.22μm的滤膜后，上机测定有机硒含量。其他条件与实施例一中相同，对最优提取条件的筛选和样品的测定、加标回收结果如下表。
表5优化条件筛选及效果
由表5可知，富硒大米有机硒测定方法测试步骤中选择超声时间为30min，淀粉酶加入量为5mg，两种蛋白酶的加入量分别为1mg，以及培养时间为8h，含硒化合物的提取效率非常理想，提取率可达85％以上，比一种蛋白酶水解效率提高20％以上。
表6富硒大米测定结果
注：样品数量n＝3
图3为富硒大米样品测定结果。由表6，图3可知，富硒大米中硒主要以硒蛋氨酸形式存在，且有机硒占总硒的比例在65％以上。
表7富硒大米加标回收测定结果
由表7可知富硒大米的加标回收率在86％～93％，回收效果非常理想，说明前处理方法及测定方法准确可靠。
实施例3富硒小麦中硒形态测定
称取0.2g样品于15mL塑料离心管中，加入5mL提取缓冲液Tris-HCl，超声提取20min，加入淀粉酶5mg和1mg蛋白酶K，50℃，恒温振荡培养12h，再加入1mg蛋白酶XIV，37℃，恒温振荡培养12h后4℃下，每分钟转速10000转，离心30min，上清液过0.22μm的滤膜后，上机测定有机硒含量。其他条件与实施例一中相同，对最优提取条件的筛选和样品的测定、加标回收结果如下表。
表8优化条件筛选及效果
由表8可知，富硒小麦有机硒测定方法测试步骤中选择超声时间为20min，淀粉酶加入量为5mg，两种蛋白酶的加入量分别为1mg，以及培养时间为12h，含硒化合物的提取效率非常理想，提取率可达85％以上，比一种蛋白酶水解效率提高15％以上。
表9富硒小麦测定结果
注：样品数量n＝3
图4为富硒小麦样品测定结果。由表9，图4可知，富硒小麦中硒以硒甲基半胱氨酸和硒蛋氨酸形式存在，且有机硒占总硒的比例在42％以上，无机硒中四价硒未检出。
表10富硒小麦加标回收测定结果
由表10可知富硒小麦的加标回收率在88％～96％，回收效果非常理想，说明前处理方法及测定方法准确可靠。
综上所述，本发明能使富硒谷物中的含硒化合物充分水解以利于硒形态的测定分析。分析富硒谷物中硒形态能指导消费者科学补硒，特别是有机硒(硒代氨基酸)形态的测定分析具有重大的意义。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1. 一种富硒谷物中硒形态的测定方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
（1）富硒谷物的预处理：使用提取缓冲液Tris-HCl对粉碎处理后的富硒谷物样品进行提取，提取处理后先加入有效量的淀粉酶进行水解，然后依次加入有效量的蛋白酶K、蛋白酶XIV进行水解提取得到待测样品溶液；
（2）采用氢化物发生——原子荧光光谱法与高效液相色谱法联用分别对标准硒形态溶液和待测样品溶液进行测定；用峰高或峰面积进行定量，用数据处理中的外标法，绘制标准工作曲线后保存，然后将样品峰积分处理，利用外标法校正，按照公式（1）可计算得到待测样品溶液中硒代胱氨酸（Se-Cys2）、硒甲基半胱氨酸（SeMeCys）、Se(IV)、硒代蛋氨酸（SeMet）的含量；
X=C×V/m (1)
其中： X为样品中待测物质的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；C为待测液中该物质的浓度，单位为微克每升（μg/L）；V为测定液体总体积，单位为毫升（mL）； F为稀释倍数；m为称样质量（体积），单位为克（g/mL）。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中提取缓冲液Tris-HCl的浓度为100 mmol/L，pH7.5，谷物样品与提取液的比例（m:V）为1:25~1:100。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中提取方法采用超声提取，提取时间为10~30 min。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中淀粉酶与谷物样品的重量比例为1：10~1：40。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中蛋白酶K与固体谷物样品的比例（m:m）为1：20~1：100；水解温度控制在40～55℃。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中蛋白酶XIV与谷物样品的比例（m:m）为1：20~1：100；水解温度控制在30～45℃。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中水解处理后样品溶液在0～10℃下，离心处理后上清液过0.2～0.5 μm的滤膜，制得待测上清液。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中高效液相色谱法和氢化物发生——原子荧光光谱法联用时液相色谱及原子荧光条件为：
流动相（40 mmol/L(NH4)2HPO4，pH 6.0）；流速1 mL/min；进样体积100 μL；蠕动泵转速65 rpm；灯电流/辅阴极：100mA，45mA；光电倍增管负高压：300V；载气流速：300mL/min；屏蔽气流速：700mL/min。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述方法中高效液相色谱法和氢化物发生——原子荧光光谱法联用时氢化物发生条件是：
还原剂成分：0.35%NaOH+1.2%NaBH4，流速：6 mL/min；氧化剂成分：0.35%NaOH+0.8%H2O2，流速：6 mL/min；载流：10% HCl，流速：6 mL/min。
10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述方法开机后对液相色谱及原子荧光进行设置，待仪器稳定后，先做标准曲线，然后测定处理好的样品溶液，在上述条件下硒代胱氨酸（Se-Cys2）、硒甲基半胱氨酸（SeMeCys）、Se(IV)、硒代蛋氨酸（SeMet）的保留时间依次为：2.6 min，3.2 min，4.0 min，5.0 min，待测样品中的硒代胱氨酸（Se-Cys2）、硒甲基半胱氨酸（SeMeCys）、Se(IV)、硒代蛋氨酸（SeMet）的色谱峰保留时间与标准溶液相比变化范围在±5%之内即认为为该待测定物质。
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