CN111610263A - 富硒木耳中硒形态的检测方法 - Google Patents

富硒木耳中硒形态的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种富硒木耳中硒形态的检测方法，包括:步骤1，样品处理：富硒干木耳反复磨碎，以得到木耳粉末；步骤2，样品酶解：称取木耳粉末作为待测样品，装于离心管中，向该离心管中加入浓度不低于0.0033g/ml的蛋白水解酶溶液，以得到样品溶液，其中，待测样品与蛋白水解酶的质量比为1：(40‑80)；步骤3，样品提取：将上述样品溶液采取超声波提取，在超声波期间，每间隔预设时间内摇晃所述离心管；步骤4，样品离心：将经过超声波提取的样品溶液离心，以得到上清液；步骤5，过滤：将所述上清液通过滤膜过滤后，得到待测样液；步骤6，仪器测定：对步骤5中得到的待测样液采用高效液相色谱法与氢化物发生‑原子荧光光谱法测定样品中的硒形态。

Description

富硒木耳中硒形态的检测方法
技术领域
本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种富硒黑木耳中硒形态的检测方法。
背景技术
作为人及动物机体必需微量元素，硒(Se)是谷胱甘肽过氧化物酶等30多种酶的活性中心，在清除各种氧自由基的生化过程中无可替代！
基于抗氧化功能，硒在多种人类疾病的预防和治疗中都可能发挥重要作用，如防治克山病、大骨节病、关节炎；预防和治疗心脑血管疾病、糖尿病；增强免疫、抗衰老；防癌、抗癌，提高放化疗效果并减轻放化疗副作用；解重金属毒等。
作为人体必需微量元素，硒(Se)的摄入不足将给人类健康带来危害，中国72％的人口存在不同程度的硒摄入不足。美国食品与营养委员会推荐人均摄取量50-200μg/d；国际硒学会推荐人均摄取量60μg/d；中国营养学会推荐成人摄取量60μg/d(2013年)。中国营养学会对部分城市进行的营养膳食调查结果表明，我国成人摄硒量不足27μg/d。
中国人口摄硒不足，缘于我国为缺硒国，1094个县市土壤硒背景值调查，达到国际公认临界值(0.1mg/kg)的只有1/3，其中含量≤0.02mg/kg的占29％。从东北三省起斜穿至云贵高原，为一条低硒地带，占国土面积的70％。吉林省为特别严重缺硒地区！处在这条缺硒带上，居民易患缺硒病。
对缺硒的认识，促进了我国硒强化食品开发热潮。富硒茶、富硒谷物制品、富硒豆制品、富硒乳制品、富硒食用菌、富硒饮料和矿泉水等层出不穷。有的是以添加剂的形式在加工环节加入食品中，有的是在有限的几个富硒地区种植食品原料，还有的非富硒地区在栽培基质(土壤)中添加无机硒或叶面喷施硒化物意图达到农产品富硒的效果。畜禽产品强化硒则是在饲料中添加硒化物或注射含硒药物。
目前，市面可见的富硒农产品有：富硒蒜、富硒大米、富硒小麦、富硒绿豆、富硒马铃薯、富硒花生、富硒南瓜、富硒芝麻、富硒菜籽、富硒萝卜、富硒食用菌等。我省富硒农产品见有富硒大米、富硒木耳、富硒苹果等。
因普遍缺硒，我国废除了GB13105-1991《食品中硒限量卫生标准》等所有食品中硒的限量。
然而，在所有食品中无节制强化硒，将会导致国人硒摄入过量，硒在体内的安全含量存在一个较小的范围，硒元素有益和有毒主要取决于该元素存在的化学形态和含量，因此，建立灵敏度高、稳定性好、准确可靠的硒形态检测方法尤为重要。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种富硒黑木耳中硒形态检测方法，灵敏度高、稳定性好、准确可靠，是测定富硒黑木耳中硒形态含量的有效方法。
根据本发明提供实施例的一种富硒黑木耳中硒形态检测方法，包括以下步骤：
步骤1，样品处理：富硒干木耳反复磨碎，以得到木耳粉末；
步骤2，样品酶解：称取木耳粉末作为待测样品，装于离心管中，向该离心管中加入浓度为0.002-0.004g/ml的蛋白水解酶溶液，以得到样品溶液，其中，待测样品与蛋白水解酶的质量比为1：(40-80)，优选为，1:60；
步骤3，样品提取：将上述样品溶液采取超声波提取，在超声波期间，每间隔预设时间内摇晃所述离心管；
步骤4，样品离心：将经过超声波提取的样品溶液离心，以得到上清液；
步骤5，过滤：将所述上清液通过滤膜过滤后，得到待测样液；
步骤6，仪器测定：对步骤5中得到的待测样液采用高效液相色谱法与氢化物发生-原子荧光光谱法测定样品中的硒形态。
优选地，所述步骤6中所用仪器检测条件为：
色谱条件：HamiltonPRP-X100离子交换色谱柱(250mm*4.1mm，10μm)，流动相为40mmol/L磷酸氢二铵，用20％甲酸调节pH值为5.8-6.0，流量1.0mL/min，进样体积100μL；
原子荧光光谱条件：负高压300V，灯总电流90mA，载气流量400mL/min，屏蔽气流量600mL/min，原子化器高度8mm；
氢化物发生条件：碘化钾0.4％+氢氧化钾0.35％(氧化剂)，硼氢化钾2％+氢氧化钾0.35％(还原剂)，盐酸7％(载流)，泵转速80r/min。碘化钾的作用在于可将硒酸还原为亚硒酸，硼氢化钾的作用为与盐酸反应产生活性氢，将硒还原成气态氢化物，但硼氢化钾只能与亚硒酸根反应，而不能与硒酸根反应，因此要检测硒酸，需要使用碘化钾，碘化钾的浓度直接影响硒酸的荧光强度。
优选地，所述蛋白水解酶溶液为链酶蛋白酶溶液。
优选地，所述链酶蛋白酶溶液为将0.01g链酶蛋白酶E溶于3ml水配置而成。
优选地，所述步骤3中，将装有样品溶液的所述离心管放入超声波清洗器中，超声提取时间为45min，每间隔10min摇晃所述离心管。
优选地，所述超声波提取时，所述清洗器中的水温设定在37℃。
优选地，所述步骤4中，将样品溶液的离心条件为，转速8000r/min，离心时间20min。
优选地，所述步骤5中，上清液通过0.45um微孔水系滤膜过滤。
优选地，所述步骤1中，富硒干木耳反复磨碎，经过80-120目筛，以得到木耳粉末。
优选地，所述木耳粉末为黑木耳粉末。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
根据本申请实施例的富硒黑木耳中硒形态检测方法，建立了超声波辅助酶法提取-原子荧光光谱法测定富硒黑木耳中5种硒形态的新方法。该方法在16min内使硒代胱氨酸、甲基-硒代半胱氨酸、亚硒酸、硒代蛋氨酸、硒酸完全达到基线分离，5种硒形态的检出限为硒代胱氨酸0.68μg/L、甲基-硒代半胱氨酸0.85μg/L、亚硒酸0.39μg/L、硒代蛋氨酸1.22μg/L、硒酸23.21μg/L；线性范围0.9990-0.9999；将该方法应用于富硒黑木耳中硒形态的分析，加标回收率为79.78％-105.26％；检测方法灵敏度高、稳定性好、准确可靠，是测定富硒黑木耳中硒形态含量的有效方法。
附图说明
图1为本发明的加入水溶液前不同料液比木耳粉末状态图；
图2为本发明的不同料液比木耳粉末加入水溶液后木耳粉末泡发状态图；
图3为本发明的不同料液比木耳粉末加入水溶液后木耳粉末泡发状态图；
图4为发明的不同料液比木耳粉末加入水溶液后间隔15min木耳粉末泡发状态图；
图5为发明的不同料液比木耳粉末加入水溶液后间隔15min木耳粉末泡发状态图；
图6为发明的不同料液比木耳粉末加入水溶液后间隔30min木耳粉末泡发状态图；
图7为发明的不同料液比木耳粉末加入水溶液后间隔30min木耳粉末泡发状态图；
图8为发明的料液比1/10木耳粉末泡发状态图；
图9为发明的料液比1/20木耳粉末泡发状态图；
图10为发明的不同料液比木耳粉末加入水溶液后间隔45min木耳粉末泡发状态图；
图11为发明的样品溶液离心后料液比状态图；
图12为发明的5个浓度梯度的混合标准溶液，流出曲线的外标校准多普图；
图13为本发明的硒代胱氨酸标准曲线图；
图14为本发明的甲基-硒代半胱氨酸标准曲线图；
图15为本发明的亚硒酸标准曲线图；
图16为本发明的硒代蛋氨酸标准曲线图；
图17为本发明的硒酸标准曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例具体的描述本申请的技术方案。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
黑木耳中富含硒，由于木耳在泡发过程中，膨胀率较高，粘稠度高，常规的硒形态的检测并不适用于木耳中硒的检测。
本发明利用超声波辅助酶法提取-原子荧光光谱法测定富硒黑木耳中5种硒形态的新方法。该方法具体包括：样品的处理，酶解、提取、离心、过滤及测定等步骤。
下面结合具体实施例对本发明实施例的富硒黑木耳中硒形态检测方法进行描述。
本发明的化学试剂；
93.5μg/g硒代胱氨酸溶液(Selenocystine,Se-Cys)，GBW10087：中国计量科学研究院。
96.6μg/g甲基-硒代半胱氨酸溶液(Se-methylselenocysteine，MSeC)，GBW10088：中国计量科学研究院。
68.9μg/g亚硒酸根溶液(SeO32-)，GBW10032：中国计量科学研究院。
97.9μg/g硒代蛋氨酸溶液(Selenomethionine,Se-Met)，GBW10034：；中国计量科学研究院。
75.1μg/g硒酸根溶液(SeO42-)，GBW10033：中国计量科学研究院。
链酶蛋白酶E(Cat.NoP8360)生化试剂，Solarbio生命科学公司。
木瓜蛋白酶(CAS:9001-73-4)，Solarbio生命科学公司。
氢氧化钾(KOH)：优级纯，天津市光复精细化工研究所。
硼氢化钾(KBH4)：分析纯，天津市光复精细化工研究所。
磷酸氢二胺((NH4)2HPO4)：优级纯，天津市光复精细化工研究所。
四丁基溴化铵(C16H36BrN)：分析纯，麦克林。
甲醇(CH3OH)：色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司。
盐酸(HCL)：优级纯，西陇化工股份有限公司。
碘化钾(KI)：分析纯，天津市福晨化学试剂厂。
甲酸(HCOOH)：分析纯，天津市光复精细化工研究所。
实验用水均为实验室超纯水。
本发明的仪器和设备：
SA-10原子荧光形态分析仪：北京吉天仪器有限公司；
硒原子荧光空心阴极灯：北京有色金属研究总院；
KQ-500DE数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；
BT124S电子天平；
Multifuge×3R高速冷冻离心机：赛默飞世尔科技有限公司；
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明制备方法中未提及的方法均为常规的方法。
实施例
1.仪器条件
(1)色谱条件：
HamiltonPRP-X100离子交换色谱柱(250mm*4.1mm，10μm)，流动相为40mmol/L磷酸氢二铵，用20％甲酸调节pH值为5.8-6.0。流量1.0mL/min，进样体积100μL。
(2)原子荧光光谱条件：
负高压300V，灯总电流90mA，载气流量400mL/min，屏蔽气流量600mL/min，原子化器高度8mm。
(3)氢化物发生条件：
碘化钾0.4％+氢氧化钾0.35％(氧化剂)，硼氢化钾2％+氢氧化钾0.35％(还原剂)，盐酸7％(载流)，转速80r/min。
2.标准溶液配制
准确移取各标准物质2mL，分别置于50mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，即得硒酸根(SeO42-)1.660μg/mL、亚硒酸根(SeO32-)1.716μg/mL、硒代胱氨酸(Se-Cys)1.768μg/mL、甲基-硒代半胱氨酸(SeMC)1.392μg/mL、硒代蛋氨酸(Se-Met)1.576μg/mL的标准储备液，4℃储存。
分别精密移取硒代胱氨酸标准储备液、甲基-硒代半胱氨酸标准储备液、亚硒酸标准储备液、硒代蛋氨酸标准储备液、硒酸标准储备液如表1中体积，至5ml容量瓶中，用超纯水定容至刻度，即得浓度为40μg/L、80μg/L、120μg/L、160μg/L、200μg/L混合标准系列。具体参见表1：
表1标准曲线配制浓度
Figure BDA0002508343870000061
Figure BDA0002508343870000071
3.样品制备
待测木耳用粉碎机粉碎成粉末状，过100目筛。未过筛部分再次放入粉碎机中粉碎，直至木耳粉末全部过筛，混匀。
4.待测液制备
准确称取样品0.1g于5ml离心管中，按料液比(1:60)加入链酶蛋白酶E溶液6mL,于超声波清洗器中，水温设定37℃(链酶蛋白酶E在37℃时效率最稳定)，提取45min，每隔10min摇晃一次离心管。8000r/min离心20min，上清液经0.45μm微孔水系滤膜过滤，得样品待测液，备上机检测。同时做试剂空白。
在实验过程中，为了得到最佳的实验结果，对提取剂的选择、提取方式、料液比及超声提取时间进行大量的实验和对比，并对结果进行分析。下面具体描述结果的分析过程。
1.前处理条件优化
(1)提取剂的选择
以富硒木耳为样品，分别考察了50％甲醇溶液、0.1mol/L柠檬酸溶液、0.1mol/L氢氧化钠溶液和100g/L木瓜蛋白酶溶液对5种硒形态的提取效果，具体参见表2。
表2不同提取剂对硒形态提取加标回收率(％)
Figure BDA0002508343870000072
木耳中所含硒形态为硒代蛋氨酸，本底值约为60μg/L。5种硒形态添加浓度均为100μg/L。结果表明，50％甲醇溶液、0.1mol/L柠檬酸溶液可以提取亚硒酸与硒酸，对于有机硒形态无法提取。0.1mol/L氢氧化钠溶液在提取木耳中硒形态过程中，使木耳上清液更加粘稠，无法通过滤膜，达不到提取效果。木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，对木耳中甲基-硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸提取效果较好，而其它三种形态无法提取。
(2)提取方式、料液比及超声提取时间的确定
木耳在质地上与其它农产品有所不同，木耳遇水溶液体积膨胀数倍，上清液粘稠，且粘稠的溶液易将未泡发的木耳粉末包裹住形成结块，附着在容器壁上，使泡发不充分，在提取过程中会造成浪费、提取不完全等情况，影响实验结果，如图1-3所示。从木耳泡发状态上比较，振荡提取方式比超声提取方式更容易使木耳充分的泡发，在振荡过程中，木耳粉末容易散开不形成结块。但是振荡提取时间比超声提取时间长，有机形态通常不稳定，尤其是硒代胱氨酸与硒代蛋氨酸之间容易转化(通过检测证明，木耳中主要硒形态为硒代蛋氨酸)，在长时间振荡过程中容易发生分解或转化。
因此，经过发明人大量的实验研究，发现采用超声提取方式，时间控制在60min以内，5种形态可以保持稳定。在超声的过程中，每间隔10min,摇晃一次离心管，防止木耳粉末长时间沉淀在离心管下层，附着在管壁上。
如图4至图11所示，从料液比的选择上，分别对1/10、1/20、1/40、1/60、1/80进行比较。称取木耳0.2g(木耳称取量是检测时的2倍，方便观察木耳在溶液中是否泡发充分)，依次加入纯水2ml、4ml、8ml、12ml、16ml，每隔15分钟，观察木耳泡发状态，如图4和5所示。过少的提取液致使木耳遇水膨胀，上清液分离不完全，硒元素形态提取不充分，而使用过多的提取液导致最终硒元素形态含量检测较少，结果不准确。如图8-9所示，1/10、1/20的料液比时，木耳无法泡发完全，有明显的结块，如图10所示，1/40、1/60、1/80在30min内能将木耳泡发完全，如图6和7所示。1/40在离心过后，上清液过少(木耳上清液在过滤膜时，会有一部分浪费，上清液不易过少)，最终经过多次实验确定采取1/60的料液比效果较好，如图11所示。
2.检测条件优化
(1)碘化钾浓度的确定
碘化钾可将硒酸还原为亚硒酸(硼氢化钾的作用为与盐酸反应产生活性氢，将硒还原成气态氢化物，但硼氢化钾只能与亚硒酸根反应，而不能与硒酸根反应，因此要检测硒酸，需要使用碘化钾，碘化钾的浓度直接影响硒酸的荧光强度。
试验考察了碘化钾的质量浓度为0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、时氢化物发生的影响。当碘化钾的质量浓度依次升高时，只有硒酸的荧光强度会随着碘化钾浓度升高，其它标准物质变化不大。当碘化钾的质量浓度大于0.4％时，硒酸根的荧光强度变化不大，因此选择碘化钾浓度为0.4％，硒酸根的出峰效果最好，具体参见表3。
表3不同KI质量浓度对测定结果的影响
Figure BDA0002508343870000091
(2)流动相的选择
考察了磷酸氢二铵的浓度为30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L时5种硒元素形态的出峰情况。流动相的浓度对亚硒酸与硒酸出峰时间有影响，对硒代胱氨酸、甲基-硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸无影响。随着流动相浓度升高，亚硒酸与硒酸出峰时间缩短。当流动相浓度为30mmol/L时，5种硒形态在30min全部出峰，亚硒酸与硒代蛋氨酸有重叠。当流动相浓度为50mmol/L，5种硒形态在12min内全部出峰，但亚硒酸与前面的甲基-硒代半胱氨酸峰有重叠。
表4不同流动相浓度对测定结果的影响
Figure BDA0002508343870000092
同上考察了添加甲醇或添加四丁基溴化铵对分离度和流出效率的影响。加入甲醇的流动相，可缩短亚硒酸根出峰时间，5种硒形态整体出峰时间不变。加入四丁基溴化铵的流动相，提高了甲基-硒代半胱氨酸与亚硒酸的分离度，其它三种形态出峰时间不变。甲基-硒代半胱氨酸出峰提前，使得与硒代胱氨酸重叠，亚硒酸出峰时间延后使得与硒代蛋氨酸重叠，具体参见表5。
表5流动相中添加甲醇与四丁基溴化铵对测定结果的影响
Figure BDA0002508343870000101
从经济角度，流动相确定为40mmol/L磷酸氢二铵，流速：1.0mL/min。
本发明从方法学的角度对五种组分的测定结果进行考查。
1.线性关系
用上述仪器条件，依次测定5个浓度梯度的混合标准溶液，流出曲线如下图。从图中可以看出，硒代胱氨酸、硒代半胱氨酸、亚硒酸、硒蛋氨酸、硒酸标准曲线的相关系数分别为0.9997、0.9995、0.9993、0.9995、0.9999，具体参见图12。其保留时间及峰的面积信息参见表6。
表6保留时间及峰面积信息表
Figure BDA0002508343870000102
Figure BDA0002508343870000111
5种标准物质线性方程和相关系数，如图12至图16所示。
2.检出限
以试剂空白溶液为测试基准，连续测定11次，求得空白值的标准偏差，由DL＝3SD/K(DL为检出限，K为校正曲线斜率)，参见表7.
表7检出限(μg/L)
Figure BDA0002508343870000112
3.精密度
连续测定相同浓度样品6针，计算各组分峰面积的相对标准偏差(RSD)。5种硒元素形态RSD为别为2.41％、1.93％、0.90％、0.91％、2.01％。参见表8。
表8精密度考察结果
Figure BDA0002508343870000113
4.重现性
将同一样品平行制成8份样品溶液，按上述样品制备方法制备。为确保检测数据的稳定，离心前将上机液体积用超纯水定容至5ml，后离心、过滤膜、上机测定，间隔24h再次上机测定同一样品，计算RSD。木耳中主要硒元素形态为硒代蛋氨酸，RSD值为2.48％。参见表9。
表9重现性考察结果
Figure BDA0002508343870000121
5.稳定性
同一份样品溶液(溶液中5种硒形态本底值约为硒代胱氨酸60μg/L，甲基硒代胱氨酸120μg/L，亚硒酸120μg/L，硒代蛋氨酸180μg/L,硒酸120μg/L)分别在0h、2h、4h、8h、12h时上机测定，测定结果计算RSD。五种硒元素形态RSD依次为1.65％、2.19％、2.72％、1.70％、1.58％。参见表10。
表10稳定性考察结果
Figure BDA0002508343870000122
6.加标回收
向已知硒形态含量的富硒木耳中加入不同量的标准溶液，使加入的标准品量约为本底值的0.5、1和2倍，上述样品制备和测定方法计算加标回收率，根据添加浓度对照标准中规定回收率范围，若在范围表明该方法准确可行。
取已知硒形态含量的富硒木耳6份，分别添加适量5种硒形态浓度，按上述样品制备并定容至5ml，使得添加浓度为30μg/L、60μg/L、120μg/L(已知木耳中硒代蛋氨酸上机液浓度约为60ppb)，上机测定并计算回收率及RSD。结果表明，5种硒元素形态的加标回收率在76.11％～107.80％之间，RSD值均小于3.9％。结果见表11。
表11回收率考察结果
Figure BDA0002508343870000131
由此，根据本申请实施例的富硒黑木耳中硒形态检测方法，建立了超声波辅助酶法提取-原子荧光光谱法测定富硒黑木耳中5种硒形态的新方法。该方法在16min内使硒代胱氨酸、甲基-硒代半胱氨酸、亚硒酸、硒代蛋氨酸、硒酸完全达到基线分离，5种硒形态的检出限为硒代胱氨酸0.68μg/L、甲基-硒代半胱氨酸0.85μg/L、亚硒酸0.39μg/L、硒代蛋氨酸1.22μg/L、硒酸23.21μg/L；线性范围0.9990-0.9999；将该方法应用于富硒黑木耳中硒形态的分析，加标回收率为79.78％-105.26％；检测方法灵敏度高、稳定性好、准确可靠，是测定富硒黑木耳中硒形态含量的有效方法。
本发明的技术内容及技术特征已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示而作种种不背离本发明精神的替换及修饰，因此，本发明保护范围应不限于实施例所揭示的内容，而应包括各种不背离本发明的替换及修饰，并为本专利申请权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种富硒木耳中硒形态的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，样品处理：富硒干木耳反复磨碎，以得到木耳粉末；
步骤2，样品酶解：称取木耳粉末作为待测样品，装于离心管中，向该离心管中加入浓度不低于0.0033g/ml的蛋白水解酶溶液，以得到样品溶液，其中，待测样品与蛋白水解酶的质量比为1：(40-80)；
步骤3，样品提取：将上述样品溶液采取超声波提取，在超声波期间，每间隔预设时间内摇晃所述离心管；
步骤4，样品离心：将经过超声波提取的样品溶液离心，以得到上清液；
步骤5，过滤：将所述上清液通过滤膜过滤后，得到待测样液；
步骤6，仪器测定：对步骤5中得到的待测样液采用高效液相色谱法与氢化物发生-原子荧光光谱法测定样品中的硒形态。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤6中所用仪器检测条件为：
色谱条件：Hamilton PRP-X100离子交换色谱柱(250mm*4.1mm，10μm)，流动相为40mmol/L磷酸氢二铵，用20％甲酸调节pH值为5.8-6.0，流量1.0mL/min，进样体积100μL；
原子荧光光谱条件：负高压300V，灯总电流90mA，载气流量400mL/min，屏蔽气流量600mL/min，原子化器高度8mm；
氢化物发生条件：碘化钾0.4％+氢氧化钾0.35％(氧化剂)，硼氢化钾2％+氢氧化钾0.35％(还原剂)，盐酸7％(载流)，泵转速80r/min。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白水解酶溶液为链酶蛋白酶溶液。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述链酶蛋白酶溶液为将0.01g链酶蛋白酶E溶于3ml水配置而成。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3中，将装有样品溶液的所述离心管放入超声波清洗器中，超声提取时间为45min，每间隔10min摇晃所述离心管。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述超声波提取时，所述清洗器中的水温设定在37℃。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤4中，将样品溶液的离心条件为，转速8000r/min，离心时间20min。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤5中，上清液通过0.45um微孔水系滤膜过滤。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1中，富硒干木耳反复磨碎，经过80-120目筛，以得到木耳粉末。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述木耳粉末为黑木耳粉末。
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