CN117288867A - 一种富硒松辽黑猪肉中硒的形态的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种富硒松辽黑猪肉中硒的形态的检测方法，包括步骤1，样品处理：称取松辽黑猪肉和富硒松辽黑猪肉，均质，定容配置0.1g/ml的样品溶液；步骤2，样品酶解：将所述样品溶液中加入蛋白酶水解，孵化，离心，取上清液；步骤3，样品提取和浓缩：向所述上清液中加入乙腈，再通过氮吹制使溶液浓缩至所述步骤2中所述上清液的60％以下；步骤4，过滤：再用流动相定容至所述步骤3中的浓缩液的2倍，经0.22μm有机系膜过滤，得到待测样液；步骤5，仪器测定：对所述步骤4中得到的待测样液采用高效液相色谱法与电感耦合等离子体质谱法测定样品中的硒形态，以得到富硒松辽黑猪肉的硒形态。该方法可以测量得到富硒松辽黑猪肉中硒的形态，测量精准度高。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种富硒松辽黑猪肉中硒的形态的检测方法。
背景技术
硒元素是典型的“双面型”元素，摄入不足或过量均会对人体健康不利，硒元素的生物活性不仅仅取决于其含量，与其化学形态密切相关。
硒是人体必需的微量元素，具有多种形态，主要分为无机硒和有机硒，无机硒主要包括硒酸盐[Se(Ⅵ)]和亚硒酸盐[Se(Ⅳ)]等，有机硒主要包括硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)和硒代蛋氨酸(SeMet)等硒代氨基酸，研究表明，有机硒具有较高的生物活性和生物利用度，对健康有益。因此，在硒的营养效应受到日益关注的同时，硒和硒形态的分析研究越来越受到重视。由于硒形态分析与样品基质密切相关，硒形态自身不稳定以及提取试剂的影响，目前尚无统一的食品中硒形态分析检测标准。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种富硒松辽黑猪肉中硒的形态的检测方法，灵敏度高、稳定性好、准确可靠，可以或作为检测标准对肉质中的硒形态进行测定。
根据本发明提供实施例的一种富硒松辽黑猪肉中硒的形态的检测方法，包括以下步骤：
步骤1，样品处理：称取松辽黑猪肉和富硒松辽黑猪肉，均质，定容配置0.1g/ml的样品溶液；
步骤2，样品酶解：将所述样品溶液中加入蛋白酶水解，孵化，离心，取上清液；
步骤3，样品提取和浓缩：向所述上清液中加入乙腈，再通过氮吹制使溶液浓缩至所述步骤2中所述上清液的40％-60％；
步骤4，过滤：再用流动相定容至所述步骤3中的浓缩液的2倍，经0.22μm有机系膜过滤，得到待测样液；
步骤5，仪器测定：对所述步骤4中得到的待测样液采用高效液相色谱法与电感耦合等离子体质谱法测定样品中的硒形态，以得到富硒松辽黑猪肉的硒形态。
根据本发明的一个实施例，所述步骤5中所用仪器检测条件为：色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：A 20mmol/L柠檬酸和5.0mmol/L己烷磺酸钠，含1％甲醇，pH＝4.4，B甲醇，A:B 99:1(v:v)；流速：1mL/min；进样量：10μL。
根据本发明的一个实施例，质谱条件：RF入射功率1600W；载气：高纯氩气；雾化气流速为0.94L/min；KED模式；载气流速3.0L/min；补偿气流速3L/min；采样锥、截取锥：镍锥；射频电压1.80V；采样深度8.0mm；泵速0.3r/s；检测同位素78Se。
根据本发明的一个实施例，所述富硒松辽黑猪肉的硒形态的测定包括对富硒松辽黑猪肉中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、亚硒酸、硒代蛋氨酸和硒酸的测定。
根据本发明的一个实施例，所述步骤3中的提取条件采用超声或加热的方式，且提取时间为24小时。
根据本发明的一个实施例，所述蛋白酶为蛋白酶E。
根据本发明的一个实施例，所述蛋白酶E的浓度为200mg/mL，所述蛋白酶E的加入量与所述样品溶液的比值为1:90。
根据本发明的一个实施例，所述样品酶解中的孵化温度为37℃孵化24h。
根据本发明的一个实施例，所述样品酶解中的离心条件为10000r/min离心10min。
根据本发明的一个实施例，所述提取中，加入的乙腈的的量与所述上清液的体积比为3:1。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
根据本申请实施例的富硒松辽黑猪肉中硒的形态的检测方法，采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP/MS)联用技术分析研究了富硒松辽黑猪肉中硒形态进行测定，该方法的线性范围为5ng/mL-100ng/mL，线性相关系数(r)均大于0.999，检出限在4.5ng/mL-5.0ng/mL(以Se计)。对松辽黑猪肉样品进行低、高浓度进行加标回收试验，加标回收率为74.5％-122％，相对标准偏差(RSD)均小于8.8％，可以满足检测需求。该方法不仅检测方法灵敏度高、稳定性好、准确可靠。
附图说明
图1为本发明的采用超声的方式提取样本是的硒形态图；
图2为本发明的采用加热的方式提取样本是的硒形态图；
图3为本发明的硒代胱氨酸标准曲线图；
图4为本发明的甲基-硒代半胱氨酸标准曲线图；
图5为本发明的硒代蛋氨酸标准曲线图；
图6为本发明的亚硒酸标准曲线图；
图7为本发明的硒酸标准曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例具体的描述本申请的技术方案。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
由于目前无统一的对肉质中硒形态分析检测标准，因此本发明提供一种富硒松辽黑猪肉中硒的形态的检测方法，该方法采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱仪，以C18反相色谱柱为分析柱，对富硒松辽黑猪肉中的硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)和硒代蛋氨酸(SeMet)等硒代氨基酸共5种硒形态进行研究，为富硒强化产品质量与安全提供技术支撑。
下面结合具体实施例对本发明实施例的富硒黑木耳中硒形态检测方法进行描述。
本发明采用的仪器：
Flexar液相色谱-NexION 350X电感耦合等离子体质谱联用仪(美国Perkin Elmer公司)；Milli-Qreference超纯水处理系统(法国Milipore)；KQ-500DB超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；3-30K冷冻离心机(德国SIGMA)。
本发明的样品与主要试剂
供试样品：松辽黑猪肉和富硒松辽黑猪肉，吉林省农业科学院畜牧兽医研究所养猪试验场提供。
标准物质：亚硒酸根离子溶液(GBW10032)、硒酸根离子溶液(GBW10033)、甲基硒代半胱氨酸溶液(GBW10088)、硒代蛋氨酸(GBW10034)、硒代胱氨酸(GBW10087)购于中国计量科学研究院。
主要试剂：超纯水(电阻率18.2MΩ·cm，由超纯水处理系统制备)；一水合柠檬酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；己烷(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；氢氧化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；甲醇(色谱纯，Fisher)；链霉蛋白酶E：(上海源叶生物科技有限公司)；乙酸铵(西陇科学化工股份有限公司)。
实施例
1.仪器条件
(1)色谱条件：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：A20mmol/L柠檬酸和5.0mmol/L己烷磺酸钠(含1％甲醇，pH＝4.4)B甲醇，A:B 99:1(v:v)；流速：1mL/min；进样量：10μL。
(2)质谱条件：
RF入射功率1600W；载气：高纯氩气；雾化气流速为0.94L/min；KED模式；载气流速3.0L/min；补偿气流速3L/min；采样锥、截取锥：镍锥；射频电压1.80V；采样深度8.0mm；泵速0.3r/s；检测同位素78Se。
(3)氢化物发生条件：
碘化钾0.4％+氢氧化钾0.35％(氧化剂)，硼氢化钾2％+氢氧化钾0.35％(还原剂)，盐酸7％(载流)，转速80r/min。
2.待测样液的制备
1)样品处理：称取均质富硒松辽黑猪肉0.500g，加水定容至4.5mL，涡旋30min，，定容配置0.1g/ml的样品溶液。
2)样品酶解：加500μL蛋白酶E(200mg/mL)，37℃孵化24h，10000r/min离心10min,取上清液2mL；
3)样品提取和浓缩：加入6mL乙腈，氮吹至剩余1mL，在一些实施例中，也可以是1mL、0.8mL、0.5mL；
4)过滤：再用流动相定容至所述步骤3中的浓缩液的2倍，经0.22μm有机系膜过滤，得到待测样液。同时以松辽黑猪肉作空白样。
3.上机检测：采用高效液相色谱法与电感耦合等离子体质谱法对所述待测样液进行测定。其中，测试的色谱条件和质谱条件如上述条件。
4.测试过程与分析
1)提取方式的选择
为考察提取条件对提取效果的影响，选择了超声(100HZ,40min)和加热(55℃，120min)两种提取方式对基质加100ng/mL混标中5种硒形态的提取效果进行研究，结果见表1和图1-图2。
从表1和图1-图2中可以看出，采用超声和加热两种提取方式对5种硒形态提取，以峰面积作为评价，实验结果表明，两种提取方式对5种硒形态提取效果无差异。因此，本方法中提取方式选择加热提取。
表1提取方式对5种硒形态提取效果的影响
2)提取时间的选择
为考察提取时间对提取效果的影响，以峰面积作为评价，选择提取时间为2h、4h、6h、24h对5种硒形态提取效果的研究，结果见表2。
从表2中可以看出，提取时间为24h时，硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的峰面积比较大，而甲基硒代半胱氨酸的峰面积，随着提取时间延长，差异不大。因此，本方法中提取时间选择24h。
表2提取时间对5种硒形态效果的影响
3)蛋白酶种类选择
为考察蛋白酶种类对5种硒形态提取效果的影响，以峰面积作为评价，开展蛋白酶K和蛋白酶E对5种硒形态提取效果进行研究，结果见表3。
从表3可以看出，蛋白酶E对硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的提取效果优于蛋白酶K；而蛋白酶K对甲基硒代半胱氨酸的提取效果优于蛋白酶E。综合分析，本方法中选择蛋白酶E。
表3蛋白酶种类对5种硒形态效果的影响
4)蛋白酶用量的优化
为考察蛋白酶E用量对5种硒形态提取效果的影响，以峰面积作为评价，开展加入10μL、50μL、100μL、500μL和1000μL的蛋白酶E对5种硒形态提取效果进行研究，结果见表4。
从表4可以看出，随着蛋白酶E用量的增加，对硒酸盐的提取效果逐步增加，对甲基硒代半胱氨酸的提取效果先增加再降低，对硒代蛋氨酸的提取效果缓慢增加。当加入500μL和1000μL的蛋白酶E对硒酸盐和硒代蛋氨酸提取效果差异不大，而对甲基硒代半胱氨酸提取效果最好。从经济角度分析，本方法蛋白酶E加入量选择500μL。
表4蛋白酶加入量对5种硒形态效果的影响
5.结果分析
1)方法线性范围
准确吸取5种硒形态混合标准溶液浓度为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、100μg/mL，用上述仪器条件依次测定，5种硒形态在10min内全部出峰，顺序依次为硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、亚硒酸和硒酸。
从图3-图7中可以看出，硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、亚硒酸和硒酸标准曲线的相关系数分别为0.9999、0.9997、0.9999、0.9998和0.9991。
2)检出限和定量限试验
按照上述仪器条件，以试剂空白溶液为测试基准，连续测定11次，采用信噪比方法，将标准溶液逐步稀释计算检出限和定量限，结果见表5。以3倍信噪比计算出5种硒元素形态检出限依次为：硒代胱氨酸5μg/L、甲基硒代半胱氨酸5μg/L、硒代蛋氨酸5μg/L、亚硒酸5μg/L和硒酸5μg/L；以10倍信噪比计算出5种硒元素形态检出限依次为：硒代胱氨酸20μg/L、甲基硒代半胱氨酸20μg/L、硒代蛋氨酸20μg/L、亚硒酸20μg/L和硒酸20μg/L。
表5检出限与定量限考察结果
3)精密度试验
连续测定相同浓度标准溶液6针，计算各组分峰面积的相对标准偏差(RSD)。5种硒元素形态RSD为别为2.84％、2.50％、3.08％、3.39％、3.59％。参见表6。
表6精密度考察结果
4)稳定性试验
同一份样品溶液(溶液中5种硒形态本底值约为硒代胱氨酸100μg/L、甲基硒代半胱氨酸100μg/L、硒代蛋氨酸100μg/L、亚硒酸100μg/L和硒酸100μg/L)分别在0、2、4、8、12h时上机测定，测定结果计算RSD。5种硒形态RSD为别为4.63％、3.00％、4.18％、4.81％、4.34％。参见表7，结果表明，该方法测定富硒猪肉中5种硒形态稳定性良好。
表7稳定性考察结果
5)加标回收试验
取已知硒形态含量的富硒猪肉6份，分别添加适量5种硒形态浓度，按上述样品制备并定容至10mL，使得添加浓度为30、60、120μg/L(已知猪肉中硒代蛋氨酸上机液浓度约为Xμg/L)，上机测定并计算回收率及RSD。结果表明，5种硒形态的加标回收率在74.5％-122％，RSD值均小于8.8％，结果见表8。
表8回收率考察结果
6)样品分析
将富硒松辽黑猪肉样品经前处理，采用所建的方法，对其硒形态进行测定7次，结果见表9。从表9中可以看出，富硒松辽黑猪肉中硒的存在形态主要为硒代蛋氨酸(59.8％)、硒代胱氨酸(26.8％)和甲基硒代半胱氨酸(13.5％)。推测经富硒强化后，硒在动物体内富集，转化为不同形态的有机硒。
表9富硒猪肉中5种硒形态含量
由此，根据本申请实施例的富硒松辽黑猪肉中硒的形态的检测方法，本试验的样品经过冻干处理、提取条件的选择和优化，选择了蛋白酶E对冻干肉进行处理来提高形态硒的提取效率。建立了高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术测定富硒松辽黑猪肉中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、亚硒酸、硒代蛋氨酸和硒酸的方法。通过对富硒松辽黑猪肉进行分析测定，结果表明，在富硒松辽黑猪肉中硒的存在形态主要为硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸和甲基硒代半胱氨酸为主。该方法检测方法灵敏度高、稳定性好、准确可靠。
本发明的技术内容及技术特征已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示而作种种不背离本发明精神的替换及修饰，因此，本发明保护范围应不限于实施例所揭示的内容，而应包括各种不背离本发明的替换及修饰，并为本专利申请权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种富硒松辽黑猪肉中硒的形态的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，样品处理：称取松辽黑猪肉和富硒松辽黑猪肉，均质，定容配置0.1g/ml的样品溶液；
步骤2，样品酶解：将所述样品溶液中加入蛋白酶水解，孵化，离心，取上清液；
步骤3，样品提取和浓缩：向所述上清液中加入乙腈，再通过氮吹制使溶液浓缩至所述步骤2中所述上清液的60％以下；
步骤4，过滤：再用流动相定容至所述步骤3中的浓缩液的2倍，经0.22μm有机系膜过滤，得到待测样液；
步骤5，仪器测定：对所述步骤4中得到的待测样液采用高效液相色谱法与电感耦合等离子体质谱法测定样品中的硒形态，以得到富硒松辽黑猪肉的硒形态。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤5中所用仪器检测条件为：
色谱条件：色谱柱：Agi lent ZORBAX SB-Aq C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：A 20mmol/L柠檬酸和5.0mmol/L己烷磺酸钠，含1％甲醇，pH＝4.4，B甲醇，A:B 99:1(v:v)；流速：1mL/min；进样量：10μL。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，
质谱条件：RF入射功率1600W；载气：高纯氩气；雾化气流速为0.94L/min；KED模式；载气流速3.0L/min；补偿气流速3L/min；采样锥、截取锥：镍锥；射频电压1.80V；采样深度8.0mm；泵速0.3r/s；检测同位素78Se。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述富硒松辽黑猪肉的硒形态的测定包括对富硒松辽黑猪肉中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、亚硒酸、硒代蛋氨酸和硒酸的测定。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3中的提取条件采用超声或加热的方式，且提取时间为24小时。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白酶为蛋白酶E。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白酶E的浓度为200mg/mL，所述蛋白酶E的加入量与所述样品溶液的比值为1:90。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述样品酶解中的孵化温度为37℃孵化24h。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述样品酶解中的离心条件为10000r/min离心10min。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述提取中，加入的乙腈的的量与所述上清液的体积比为3:1。
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