CN102393365B - 一种测定金属蛋白中金属离子含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金属蛋白中金属离子含量的测定方法，该方法将样品进行前处理，用酸性物质配制或处理样品，使样品溶液的pH值小于5，然后通过金属元素测定光谱（原子吸收光谱仪或原子发射光谱仪）进行测定。该方法解决了目前金属蛋白中金属离子含量测定准确度低、精密度差、重现性差、专属性差等问题，还可缩短检测时间、提高分析效率、降低分析成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定金属蛋白中金属离子含量的方法，确切地说，是关于一种通过样品的前处理来准确定量金属蛋白中金属离子含量的方法。
背景技术
金属蛋白是由蛋白质和金属离子结合形成的。其中多数金属离子仅和蛋白质连接；少数除和蛋白质相连外，还和一个较小的分子相连，如血红蛋白中的铁（Ⅱ）除和蛋白质相连外，还和卟啉环相连。金属蛋白质有重要的生理功能，如血红蛋白为运送氧所必需；铜蓝蛋白能催化铁（Ⅱ）的氧化，以利于铁（Ⅲ）和蛋白质结合形成运铁蛋白，运铁蛋白用于运送铁等。 金属蛋白中金属离子的含量对生物体功能具有至关重要的作用，近年来的研究表明许多神经退行性疾病与金属离子（Cu、Fe、Zn、Mn）和金属蛋白紧密相关。这可能是与在大脑中这些所谓的“微量元素”有较高的含量密切相关。近年来发现家族性肌萎缩性脊髓侧索硬化症与含铜锌的超氧化物歧化酶SOD氧化抗坏血酸能力的提高有关，由于SOD的蛋白突变使得Cu/Zn-SOD中Zn2+的结合能力降低，使其Zn2+丢失，导致SOD1的氧化抗坏血酸的能力要比正常的SOD高3000倍，因此，能够准确定量出金属蛋白中的金属离子含量对于生物医药的发展和研究具有重要的意义。
目前，金属蛋白中金属离子含量的测定方法是按照2010年版中国药典附录三部ⅡB原子吸收分光光度法进行的，该方法对样品溶液直接进样，通过雾化器雾化成气溶胶后，再与燃气混合，进入燃烧灯头产生的火焰中，以干燥、蒸发、离解供试品，使待测元素形成基态原子。通过绘制标准曲线，计算出金属元素的含量。由于对供试品进行分析的仪器目前主要为原子吸收光谱仪和电弧光源发射光谱仪，样品在仪器中雾化的时间比较长，而且不能保证金属蛋白中离子完全脱落，金属离子的不完全脱落会造成每次进行样品分析时的重复性和准确度比较低；由于不同仪器之间雾化能力的差异导致同一样品在不同型号，甚至是相同型号的仪器中分析结果差异很大；直接进样的样品在雾化器及燃烧灯头中雾化时金属离子脱落的过程耗时长，对气态流动相的消耗量大、加快了仪器中精密部件的损耗，对研究开发带来不便的同时也增加科研项目的开发成本。
发明内容
为了提高金属蛋白中金属离子定量的准确度和方法的重复性，同时缩短分析时间，降低科研成本，本发明人经过潜心的研究发现，通过将供试品的金属蛋白样品溶液经过酸性物质处理，使其供试品溶液的pH值小于5时再进样分析，可以克服目前金属蛋白中金属离子测定的缺点，对生物领域中分析技术的提高起到了促进作用。
本发明的目的是提供一种测定金属蛋白中金属离子含量的方法。
为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：
一种测定金属蛋白中金属离子含量的方法，该方法是将样品进行前处理后再通过原子吸收光谱仪或原子发射光谱仪进行测定。
样品的前处理方法为用酸性物质配制或处理样品，使样品溶液的pH值小于5。
其中，前处理方法使用的酸性物质由硝酸、硫酸、醋酸、三氟乙酸、盐酸、亚硫酸、亚硝酸中的一种或一种以上组合而成。
所测定的金属蛋白为含有过渡金属元素或碱土金属元素的金属蛋白。
过渡金属蛋白中含有的金属元素包括Cu离子、Zn离子、Mn离子、Fe离子、Co离子、Mo离子中的一种或多种，优选为含有Cu离子和Zn离子的金属蛋白，例如Cu-ZnSOD蛋白、乙醇脱氢酶、血红蛋白。
碱土金属蛋白中含有的金属元素包括Mg离子或Ca离子中的一种或两种，优选为含有Ca离子的金属蛋白，例如钙调素蛋白等。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
（1） 提高了目前金属蛋白中金属离子定量的准确度；
（2） 酸性物质使金属蛋白中金属离子完全脱落，提高了样品分析的精密度和重现性；
（3） 缩短了样品溶液在仪器中的雾化处理时间，提高了分析效率；
（4） 减少了样品分析对仪器精密部件的损耗，减少了气态流动相的用量，节省了项目研究开发的成本。
附图说明：
图1为Cu标准液与吸光度曲线。
图2为Zn标准液与吸光度曲线。
具体实施方式:
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想的前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1： Cu/Zn-SOD中Cu离子含量的测定
【实验材料/器具】
| 实验材料 | 仪器材料 |
| Cu标准品 | 原子吸收光谱仪AA-400 |
| 硝酸 | 空压机 |
| ddH2O | 乙炔气瓶 |
| 气体管路 | |
| Cu灯 |
【实验方法】
（1）线性和范围
分别制备空白对照溶液（1mM稀硝酸溶液）和1μg/ml，2μg/ml，3μg/ml，4μg/ml，5μg/ml的Cu标准溶液，测定其吸光度，绘制吸光度与Cu标准液浓度的一阶曲线，评价线性。
试验结果：如表1所示。
表1：Cu标准曲线试验结果
| Cu浓度（μg/ml） | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 吸光度 | 0 | 0.0275 | 0.0547 | 0.0812 | 0.1080 | 0.1349 |
Cu标准液浓度与吸光度成一阶线性，r≥0.99，线性符合规定；
（2）准确度
依次配制下列溶液各三份，按照分析方法测定，计算回收率。
未添加对照溶液：精密量取SOD原液100μl置于10ml容量瓶中，加1mM稀硝酸溶液定容至刻度，作为未添加对照溶液。
低浓度添加溶液：精密量取未添加对照溶液和2μg/ml的Cu标准液各5ml混匀，作为低浓度添加溶液。
中浓度添加溶液：精密量取未添加对照溶液和3μg/ml的Cu标准液各5ml混匀，作为中浓度添加溶液。
高浓度添加溶液：精密量取未添加对照溶液和4μg/ml的Cu标准液各5ml混匀，作为高浓度添加溶液。
试验结果：如表2所示。
表2：回收率实验结果
回收率的结果在90.0%-110.0%的范围内，准确性符合规定。
（3）精密度
精密量取SOD原液100μl置于10ml容量瓶中，加1mM稀硝酸溶液定容至刻度，作为样品溶液。平行制备6份样品溶液，按照Cu分析方法进行检测，计算结果的相对标准偏差（RSD）值（n=6）。
试验结果：如表3所示。
表3：精密度实验结果
6份样品溶液的RSD%<2.0%，精密度符合规定。
（4）样品溶液测定
精密量取硝酸0.267ml，加水定容至4000mL，混匀得到1mM的稀硝酸溶液（pH值为3）。精密量取Cu标准液1ml，加1mM稀硝酸定容至10ml，作为A液（100ppm），取A液加1mM稀硝酸稀释，分别配制5ppm、 4ppm、3ppm、 2ppm、 1ppm的标准溶液。精密量取待检的SOD溶液100μl（100mg/ml），加1mM稀硝酸定容至10ml，平行制备三份样品。采用原子吸收光谱仪AAS系统测定，打开相应的Cu灯，等待电流稳定，检查乙炔和空气压力，点火，等待火焰稳定测定空白溶液（1mM稀硝酸溶液），测定标准溶液、检查标准曲线线性R2值是否合格（R2>0.995）测定样品。结果处理： SOD样品中Cu含量（%）=测定平均值（ppm）×（10/0.1）/1000/样品浓度×100%，三份供试品的结果分别为0.381%、0.383%、0.386%。
实施例2： Cu/Zn-SOD中Zn离子含量的测定
【实验材料/器具】
| 实验材料 | 仪器材料 |
| Zn标准品 | 原子吸收光谱仪AA-400 |
| 盐酸 | 空压机 |
| ddH2O | 乙炔气瓶 |
| 气体管路 | |
| Zn灯 |
（1）线性和范围
分别制备空白对照溶液（1mM稀盐酸溶液）和0.2μg/ml，0.4μg/ml，0.6μg/ml，0.8μg/ml，1.0μg/ml的Zn标准溶液，测定其吸光度，绘制吸光度与Zn标准液浓度的一阶曲线，评价线性。
试验结果：如表4所示。
表4：Zn标准曲线试验结果
| Zn浓度（μg/ml） | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
| 吸光度 | 0 | 0.0243 | 0.0468 | 0.0693 | 0.0937 | 0.1160 |
Zn标准液浓度与吸光度成一阶线性，r≥0.99，线性符合规定；
（2）准确度
依次配制下列溶液各三份，按照分析方法测定，计算回收率。
未添加对照溶液：精密量取SOD原液100μl置于50ml容量瓶中，加1mM稀盐酸溶液定容至刻度，作为未添加对照溶液。
低浓度添加溶液：精密量取未添加对照溶液和0.4μg/ml的Zn标准液各5ml混匀，作为低浓度添加溶液。
中浓度添加溶液：精密量取未添加对照溶液和0.6μg/ml的Zn标准液各5ml混匀，作为中浓度添加溶液。
高浓度添加溶液：精密量取未添加对照溶液和0.8μg/ml的Zn标准液各5ml混匀，作为高浓度添加溶液。
试验结果：如表5所示。
表5：回收率实验结果
回收率的结果在90.0%-110.0%的范围内，准确性符合规定。
（3）精密度
精密量取SOD原液100μl置于50ml容量瓶中，加1mM稀盐酸溶液定容至刻度，作为样品溶液。平行制备6份样品溶液，按照Zn分析方法进行检测，计算结果的相对标准偏差（RSD）值（n=6）。
试验结果：如表6所示。
表6：精密度实验结果
6份样品溶液的RSD%<2.0%，精密度符合规定。
（4）样品测定
配制2mM的稀盐酸溶液（pH值为3）。精密量取Zn标准液1ml，加1mM稀盐酸定容至100ml，作为B液（10ppm），取B液加1mM稀盐酸稀释，分别配制1.0ppm、 0.8ppm、0.6ppm、 0.4ppm、 0.2ppm的标准溶液。精密量取待检的SOD溶液100μl（100mg/ml），加1mM稀盐酸定容至10ml，平行制备三份样品。采用原子吸收光谱仪AAS系统测定，打开相应的Zn灯，等待电流稳定，检查乙炔和空气压力，点火，等待火焰稳定测定空白溶液（1mM稀酸酸溶液），测定标准溶液、检查标准曲线线性R2值是否合格（R2>0.995）测定样品。结果处理： SOD样品的Zn含量（%）=测定平均值（ppm）×（50/0.1）/1000/样品浓度×100%，三份供试品的结果分别为0.395%、0.397%、0.395%。
比较例1：采用2010年版中国药典附录三部ⅡB原子吸收分光光度法测定Cu-ZnSOD中Cu离子含量
【实验材料/器具】
| 实验材料 | 仪器材料 |
| Cu标准品 | 原子吸收光谱仪AA-400 |
| ddH2O | 空压机 |
| 乙炔气瓶 | |
| 气体管路 | |
| Cu灯 |
（1）精密度
精密量取SOD原液100μl置于10ml容量瓶中，加水定容至刻度，作为样品溶液。平行制备6份样品溶液，按照Cu分析方法进行检测，计算结果的相对标准偏差（RSD）值（n=6）。
试验结果：如表7所示。
表7 精密度实验结果
| N | 检测值 |
| 1 | 3.56 |
| 2 | 3.52 |
| 3 | 3.41 |
| 4 | 3.68 |
| 5 | 3.38 |
| 6 | 3.62 |
| 均值 | 3.528 |
| C.V值 | 0.117 |
| RSD% | 3.32% |
（2）准确度
向样品溶液中分别添加80%、100%、120%样品含有Cu原子的标准溶液，各制备3份，按照Cu分析方法进行检测，计算回收率。
实验结果：如表8所示。
表8 回收率实验结果
比较例2：采用2010年版中国药典附录三部ⅡB原子吸收分光光度法测定Cu/Zn-SOD中Zn离子含量
【实验材料/器具】
| 实验材料 | 仪器材料 |
| Zn标准品 | 原子吸收光谱仪AA-400 |
| ddH2O | 空压机 |
| 乙炔气瓶 | |
| 气体管路 | |
| Zn灯 |
（1）精密度
精密量取SOD原液100μl置于10ml容量瓶中，加水定容至刻度，作为样品溶液。平行制备6份样品溶液，按照Zn分析方法进行检测，计算结果的相对标准偏差（RSD）值（n=6）。
试验结果：如表9所示。
表9精密度实验结果
| N | 检测值 |
| 1 | 4.28 |
| 2 | 4.1 |
| 3 | 4.32 |
| 4 | 4.38 |
| 5 | 4.07 |
| 6 | 4.42 |
| 均值 | 4.26 |
| C.V值 | 0.15 |
| RSD% | 3.41% |
（2）准确度
向样品溶液中分别添加80%、100%、120%样品含有Zn原子的Zn标准溶液，各制备3份，按照Zn离子分析方法进行检测，计算回收率。
实验结果：如表10。
表10收率实验结果
实施例3：血红蛋白中Fe离子含量的测定
【实验材料/器具】
| 实验材料 | 仪器材料 |
| Fe标准品 | 原子吸收光谱仪AA-400 |
| 亚硝酸：三氟乙酸=1:1 | 空压机 |
| ddH2O | 乙炔气瓶 |
| 气体管路 | |
| Fe空心阴极灯 |
样品溶液测定：
以亚硝酸：三氟乙酸=1:1的比例配制1mM的混合酸溶液（pH值为5）。精密量取Fe标准液1ml，加1mM定容至10ml，作为A液（100ppm），取A液加1mM混合酸稀释，分别配制5ppm、 4ppm、3ppm、 2ppm、 1ppm的标准溶液。精密量取待检的血红蛋白水溶液100μl（20mg/ml），加1mM混合酸定容至10ml，平行制备三份样品。采用原子吸收光谱仪AAS系统测定，打开相应的Fe空心阴极灯，等待电流稳定，检查乙炔和空气压力，点火，等待火焰稳定测定空白溶液（1mM混合酸溶液），测定标准溶液、检查标准曲线线性R2值是否合格（R2>0.995）测定样品。结果处理： 血红蛋白样品中Fe含量（%）=测定平均值（ppm）×（10/0.1）/1000/样品浓度×100%，三份供试品的结果分别为0.339%、0.331%、0.335%。
实施例4 钙调素中钙离子含量的测定
【实验材料/器具】
| 实验材料 | 仪器材料 |
| Ca标准品 | ICP光谱仪 |
| 醋酸:三氟乙酸:亚硫酸=2:1:1 | 空压机 |
| ddH2O | 乙炔气瓶 |
| 气体管路 | |
| ICP光源 |
样品溶液测定：
以醋酸:三氟乙酸:亚硫酸=2:1:1的比例配制1mM的混合酸溶液（pH值为3.5）。精密量取Ca标准液1ml，加1mM混合酸定容至10ml，作为A液（100ppm），取A液加1mM混合酸稀释，分别配制5ppm、 4ppm、3ppm、 2ppm、 1ppm的标准溶液。精密量取待检的钙调素蛋白溶液100μl（15mg/ml），加1mM混合酸定容至10ml，平行制备三份样品。采用原子发射光谱仪ICP光谱仪测定，打开相应的ICP光源，等待电流稳定，检查乙炔和空气压力，点火，等待火焰稳定测定空白溶液（1mM混合酸溶液），测定标准溶液、检查标准曲线线性R2值是否合格（R2>0.995）测定样品。结果处理： 血红蛋白样品中Ca含量（%）=测定平均值（ppm）×（10/0.1）/1000/样品浓度×100%，三份供试品的结果分别为0.961%、0.961%、0.962%。
实施例5 乙醇脱氢酶中锌离子含量的测定
【实验材料/器具】
| 实验材料 | 仪器材料 |
| Zn标准品 | ICP光谱仪 |
| 亚硝酸：醋酸 =1:1 | 空压机 |
| ddH2O | 乙炔气瓶 |
| 气体管路 | |
| ICP光源 |
样品溶液测定：
以亚硝酸：醋酸 =1:1的比例配制1mM的混合酸溶液（pH值为2）。精密量取Zn标准液1ml，加1mM混合酸稀释定容至10ml，作为A液（100ppm），取A液加1mM混合酸稀释，分别配制5ppm、 4ppm、3ppm、 2ppm、 1ppm的标准溶液。精密量取待检的乙醇脱氢酶血溶液100μl（20mg/ml），加1mM混合酸定容至10ml，平行制备三份样品。采用原子发射光谱仪ICP光谱仪测定，打开相应的ICP光源，等待电流稳定，检查乙炔和空气压力，点火，等待火焰稳定测定空白溶液（1mM混合酸溶液），测定标准溶液、检查标准曲线线性R2值是否合格（R2>0.995）测定样品。结果处理： 血红蛋白样品中Fe含量（%）=测定平均值（ppm）×（10/0.1）/1000/样品浓度×100%，三份供试品的结果分别为0.335%、0.333%、0.337%。
Claims (1)
1.一种测定金属蛋白中金属离子含量的方法，其特征在于所述金属蛋白为Cu/Zn-SOD蛋白，其中，Cu/Zn-SOD蛋白中Cu离子的测定方法为：
a. 精密量取硝酸0.267ml，加水定容至4000mL，混匀得到pH值为3、1mM的稀硝酸溶液；
b. 精密量取Cu标准液1ml，加1mM稀硝酸定容至10ml，作为A液，浓度为100ppm；取A液加1mM稀硝酸稀释，分别配制5ppm、4ppm、3ppm、 2ppm、1ppm的标准溶液；
c. 精密量取待检的100mg/ml Cu/Zn-SOD蛋白溶液100μl，加1mM稀硝酸定容至10ml，平行制备三份样品；
d. 采用原子吸收光谱仪AAS系统测定，打开Cu灯，等待电流稳定，检查乙炔和空气压力，点火，等待火焰稳定测定空白溶液即1mM稀硝酸溶液；测定标准溶液；测定样品；
e. 结果处理： Cu/Zn-SOD蛋白样品中Cu含量%=测定平均值ppm×10/0.1/1000/样品浓度×100%；
其中， Cu/Zn-SOD蛋白中Zn离子的测定方法为：
a. 配制pH值为3、1mM的稀盐酸溶液；
b. 精密量取Zn标准液1ml，加1mM稀盐酸定容至100ml，作为B液，浓度为10ppm；取B液加1mM稀盐酸稀释，分别配制1.0ppm、0.8ppm、0.6ppm、 0.4ppm、0.2ppm的标准溶液；
c. 精密量取待检的100mg/ml Cu/Zn-SOD蛋白溶液100μl，加1mM稀盐酸定容至10ml，平行制备三份样品；
d. 采用原子吸收光谱仪AAS系统测定，打开Zn灯，等待电流稳定，检查乙炔和空气压力，点火，等待火焰稳定测定空白溶液即1mM稀盐酸溶液；测定标准溶液；测定样品；
e. 结果处理： Cu/Zn-SOD蛋白样品的Zn含量%=测定平均值ppm×50/0.1/1000/样品浓度×100%。
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