AT10300U1 - Kit zur gewinnung und aufbereitung zellulärer proben - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft einen Analysekit zur Gewinnung und Vorbereitung einer biologischen Probe mit Zellen zur Bestimmung der intrazellulären Konzentration zumindest eines Mikro-nutrienten enthaltend eine Probenentnahmevorrichtung ausgewählt aus einer Gruppe umfassend eine Spachtel, eine Bürste, ein Stäbchen, eine Kapillare, zumindest ein Probengefäß mit zumindest einem Reagens ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Wasser, eine gepufferte Salzlösung, eine Phosphatlösung, eine 0,9 %-ige NaCI Lösung, und gegebenenfalls einen Thermobehälter zur Aufnahme des Probengefäßes, insbesondere zum Kühlen des Probengefäßes mit den Zellen sowie dessen Verwendung.

In allen industrialisierten Ländern ist die Auswahl an Lebensmitteln vielfältig und ausreichend. Trotz ausreichender Nahrungsversorgung kann es in Einzelfällen zu Mangelerscheinungen bestimmter Nährstoffe sowie Mikronährstoffe kommen. Wichtig ist, nicht erst bei Auftreten bestimmter pathologischer Zeichen eine Umstellung der Ernährung in Erwägung zu ziehen, sondern bereits prophylaktisch darauf zu achten, dass keine durch Mangelernährung induzierte pathologische Zustände auftreten.

Eine hochwertige Ernährung, reich an essenziellen Nahrungsbestandteilen, ist in allen Lebensabschnitten eine wichtige Quelle für Gesundheit, Schönheit und Wohlbefinden. Viele wissenschaftliche Studien der letzten Jahre verweisen auf die Bedeutung einer optimalen Zufuhr von Mikronutrienten, wie zum Beispiel von sekundären Pflanzenstoffen, einfach und mehrfach ungesättigten Fettsäuren sowie von Vitaminen für die Gesunderhaltung.

Trotz des Wohlstandes in den industrialisierten Ländern kann die individuelle Situation beim Einzelnen ein Bild an Unterversorgung von Mikronährstoffen ergeben. Risikofaktoren für eine unzureichende Ernährung sind: freiwillige oder unfreiwillige geringe Nahrungsaufnahme, Nährstoffverluste durch Lagerung und Zubereitung, einseitige Ernährungsgewohnheiten, hoher Genussmittelkonsum (Alkohol, Nikotin) und Erkrankungen des Magen-Darm-Trakts oder Erkrankungen, die mit einem erhöhten Nährstoffbedarf einhergehen, sowie Arzneimittel, die die Vitaminversorgung einschränken.

In Studien, welche die Vitaminversorgung Übergewichtiger überprüfte, wurde festgestellt, dass eine hohe Kalorienzufuhr nicht automatisch eine ausreichende Versorgung an Mikronährstoffen einschließt. Ursachen für eine tendenzielle Unterversorgung trotz eines reichen Nahrungsmittelangebotes und hoher Qualität der Nahrungsmittel können u. a. sein, • ungünstige Lebensstil-Cluster (fast-living-, fast-food- oder lazy-lifestyle) • einseitige Ernährungsgewohnheiten durch ständige Verfügbarkeit der Lieblingsnahrung • unzureichendes Wissen über die Zusammensetzung gesunder Ernährung • pseudorationale Überzeugung von der Wirkung verschiedener Nahrungsmittel. Änderungen im Essverhalten mit dem Ziel einer Optimierung der Nahrungszusammensetzung bei Verdacht auf bestehende Mikronutrientendefizite, sind immer ein langer Trainingsprozess.

In bestimmten Lebensphasen, in denen aus unterschiedlichen Gründen eine optimale Ernährung nur schwer zu realisieren ist, können Nahrungsergänzungen eine sinnvolle Unterstützung sein. Üblicherweise werden zur Beurteilung des Vitaminstatus Blutuntersuchungen durchgeführt. Diese Werte geben zwar einen Hinweis auf die allgemeine Vitaminzufuhr des Körpers, sagen aber wenig darüber aus, inwieweit Zellen oder einzelne Gewebe mit den Mikronährstoffen versorgt werden. Dies ist von Mensch zu Mensch unterschiedlich und hängt vom allgemeinen körperlichen Zustand ab.

Um die individuelle Versorgungssituation eines Einzelnen erfassen zu können, muss der Ernährungszustand analysiert werden. Dem Arzt stehen neben der klinischen Untersuchung Frage- 3 AT010 300U1 bögen, die die Nahrungszufuhr erfassen, Scores und Laborwerte zur Verfügung. Modernere Methoden, sind die bioelektrische Impedanzanalyse und die Vitaminanalyse im Blut.

Der Vitaminspiegel im Gewebe und im Blut wird durch eine Umverteilung lange durch den 5 Körper selbst stabil gehalten. Unterversorgungen machen sich deshalb erst sehr spät bemerkbar.

Aus der W02003/069338 des Anmelders ist ein Verfahren zur Bestimmung des Versorgungsprofils zumindest eines Mikronutrienten in einer biologischen Probe bekannt. Aus der biologi-10 sehen Probe, insbesondere nach der Bestimmung der Anzahl und/oder Menge der darin enthaltenen Zellen, werden durch Lyse der Zellen, gegebenenfalls nach deren Isolation, Zellproteine, insbesondere Zellmembranproteine, freigesetzt und dadurch, erforderlichenfalls nach einer Denaturierung, Mikronutrienten aus dem Lysat gewonnen und deren Anteil an der Probe, insbesondere deren Gewicht, als Maß für die intrazelluläre Konzentration gemessen. 15

Ein ähnliches Verfahren ist auch aus der W02006/066804 des Anmelders bekannt. Hier wird ein Verfahren zur Probenvorbereitung für eine anschließende qualitative und/oder quantitative Bestimmung eines oder mehrerer intrazellulärer Analyten aus einer biologischen Probe beschrieben. Die biologische Probe wird durch nicht-invasive Methoden von einer organischen 20 Oberfläche gewonnen, falls erforderlich, angereichert, gegebenenfalls an ein Labor weitergeleitet, lysiert und durch zumindest ein Reduktionsmittel chemisch reduziert und die Bestimmung und/oder Konzentrationsbestimmung des Analyten wird aus der Probe, insbesondere aus Epithelzellen einer Mukosa, in einem kompetitiven Immunoassay, gegebenenfalls unter Anwendung einer direkten Chemilumineszenz-Technologie, durchgeführt. 25

In Studien wurde gezeigt, dass das Mundschleimhaut-Gewebe geeignet ist, um Supplementati-onsprogramme wiederzuspiegeln und Therapieeffekte abzubilden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher einen Kit zur Probengewinnung und 30 -Vorbereitung zur Mikronutrientenprofilanalyse zur Verfügung zu stellen.

Die Aufgabe der Erfindung wird eigenständig durch einen Analysekit gelöst, wobei als Stabilisierungslösung Tris-(2-Carboxy-ethyl)-Phosphin-Hydrochlorid enthalten ist. Mit dem erfindungsgemäßen nicht-invasiven Verfahren werden Mikronutrientenprofile in der Zelle, dem Ort des 35 Geschehens, direkt bestimmt. Die Mundschleimhaut bietet sich als ideales Gewebe zur Gewinnung von Zellen an, weil sie eine sehr hohe Erneuerungsrate aufweist. Die Wangenschleimhaut wird circa alle sieben Tage regelmäßig erneuert. Die Mikronutrientenanalytik in der Wangenschleimhaut bietet deshalb den Vorteil, dass sie die konkrete, aktuelle und individuelle Versorgungssituation der Vergangenheit widerspiegelt. Bei der Verwendung des erfindungsgemäßen 40 Kits zur Bestimmung der Mikronutrientenversorgung bezeichnet Vergangenheit konkret einen Zeitraum von etwa einer Woche. Das ist der Zeitraum, den die Zellen benötigen, um von den Basalzellen, die noch vom Blut versorgt werden, bis in die oberste Schleimhautschicht zu wandern. Dann werden die Zellen durch einfaches Abbürsten mit Hilfe einer speziellen Zahnbürste bzw. Abspachteln gewonnen. Da die Methode nicht-invasiv erfolgt sind keine Risiken bekannt. 45 Der Vorteil ist, dass sich kurzfristige Schwankungen in der Zufuhr von Vitaminen oder Mikronährstoffe unmittelbar vor der Probennahme nicht nachteilig auf die Messgenauigkeit auswirken. Gleichzeitig ist der Turn over von 7 Tagen aber schnell genug, um einen aktuellen Status zu liefern. so Nach Reinigung der Zellen werden diese mit der Stabilisatorlösung vor einem unspezifischen Abbau geschützt. Tris-(2-Carboxy-ethyl)-Phosphin-Hydrochlorid ist zur Stabilisierung von Zellen geeignet.

Wegen der vielfältigen Einflussmöglichkeiten bzw. den zugrunde liegenden physiologischen 55 Regulationsmöglichkeiten kann ein erhöhter Bedarf an Vitaminen und Mikronährstoffen gut auf 4 AT 010 300 U1

Zellebene bestimmt werden. Im Blut wird der Spiegel vieler Vitamine und Mikronährstoffe mit dem Ziel reguliert, möglichst lange stabile und konstante Werte sicherzustellen. In den Zellen werden die Vitamine und Mikronährstoffe, abhängig von den äußeren Umständen, unterschiedlich verbraucht. Ein erhöhter Verbrauch oder ein lokaler bzw. partieller Mangel kann durch den erfindungsgemäßen Kit festgestellt werden. Weiterhin wirken sich hier unterschiedliche genetische Grundlagen auf die zelluläre Aufnahme von Mikronährstoffen aus dem Blut (= Verfügungsdimension) direkt aus. Unterschiedliche Zeit- und Dosisabhängigkeiten in der zellulären Versorgung können detektiert werden. Es kann ein Versorgungsprofil über einen Zeitraum, beispielsweise bei unterschiedlichsten Vorerkrankungen oder besonderen Lebensstilen, erstellt werden bzw. kann aktuell ein Ernährungsstatus erstellt werden.

Der Analysekit kann eine Pipette enthalten um Aliquots der Probe zu entnehmen und gegebenenfalls späteren und/oder anderen Analysen zur Verfügung zu stellen.

Der Analysekit kann auch Etiketten und eine Gebrauchsanleitung enthalten, um die Proben sicher identifizieren zu können.

Die Konzentration der Stabilisierungslösung ist aus einem Bereich mit einer unteren Grenze 1 mM, vorzugsweise 2 mM, insbesondere 3 mM, und einer oberen Grenze von 10 mM, vorzugsweise 8 mM, insbesondere 7 mM, ausgewählt, um den Abbau der Analyten gesichert zu verhindern.

Das Stabilisierungsreagens Tris-(2-Carboxy-ethyl)-Phosphin-Hydrochlorid ist in einer Kaliumdi-hydrogenphosphatlösung gelöst und wird bei -80°C bis Raumtemperatur gelagert, wobei es sehr vorteilhaft ist das Stabilisierungsreagens bei -20°C bis +4°C zu lagern um die Gesamthaltbarkeit zu verbessern.

Die Konzentration der Kaliumdihydrogenphosphatlösung ist aus einem Bereich mit einer unteren Grenze 0,1 M, vorzugsweise 0,2 M, insbesondere 0,5 M, und einer oberen Grenze von 1 M, vorzugsweise 0,8 M, insbesondere 0,7 M, ausgewählt.

In einer Weiterbildung ist vorgesehen, dass ein weiteres Probengefäß mit einem Waschpuffer ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Wasser, eine gepufferte Salzlösung, eine 0,9 %-ige NaCI Lösung enthalten ist, um Zellen von der Wangenschleimhaut zu gewinnen bzw. die Zellen zu waschen.

Ein zusätzliches Probengefäß dient zur Aufnahme der biologischen Probe nach deren Gewinnung. Von Vorteil ist, dass sämtliche Komponenten die zur Vorbereitung der Probe, insbesondere der Zellen, erforderlich sind, bereits im Analysekit enthalten sind und somit mit einem Minimalaufwand die biologische Probe zur Bestimmung eines Mikronutrientenprofils vorbereitet werden kann.

Zum gekühlten Versenden der Probe im Probengefäß kann ein Thermobehältnis im Kit inkludiert sein. Dieses Thermobehältnis kann eine Isolierbox oder ähnliches sein, worin beispielsweise Eis oder Trockeneis transportiert werden kann.

Der Analysekit kann als Medizinprodukt und/oder in-vitro Diagnostikum verwendet werden, weil damit das Versorgungsprofil von Mikronutrienten in Probanden bestimmt werden kann.

In einer Ausführungsform eignet sich der Analysekit zur Bestimmung des Mikronutrientenprofils umfassend Vitamin C, Vitamin E, ß-Carotin und Lycopin. Die Konzentration an antioxidativ wirksamen Vitaminen in den Zellen gibt einen guten Einblick in den Ernährungsstatus und ist von kurzfristigen Schwankungen weniger betroffen als die Vitaminbestimmung im Blut. Die ausgewählten Messparameter repräsentieren die gesamte Wirkungsbreite der antioxidativ wirksamen Vitamine und Mikronährstoffe. So ist Vitamin C ein Marker für die wasserlöslichen 5 AT 010 300 U1

Vitamine, Vitamin E für die fettlöslichen, ß-Carotin allgemein für den Obst- und Gemüseverzehr und Lycopin für den Anteil an sekundären Pflanzeninhaltsstoffen in der Ernährung.

Festgestellte Defizite können im Rahmen einer gezielten Ernährungstherapie oder mit Mikronährstoffmischungen günstig beeinflusst werden. Sämtliche Angaben zu Wertebereichen in gegenständlicher Beschreibung sind so zu verstehen, dass diese beliebige und alle Teilbereiche daraus mit umfassen, z.B. ist die Angabe 1 bis 10 so zu verstehen, dass sämtliche Teilbereiche, ausgehend von der unteren Grenze 1 und der oberen Grenze 10 mitumfasst sind, d.h. sämtliche Teilbereich beginnen mit einer unteren Grenze von 1 oder größer und enden bei einer oberen Grenze von 10 oder weniger, z.B. 1 bis 1,7, oder 3,2 bis 8,1 oder 5,5 bis 10.

Probengewinnung

Der Mund und die Zahnzwischenräume werden mehrmals kräftig mit Leitungswasser gespült um Essensreste aus dem Mundraum zu entfernen.

Die Zahnbürste bzw. Spachtel, Bürste, Stäbchen, Kapillare aus dem Analysekit wird mit Wasser befeuchtet und eine Wangeninnenseite vielmals (ca. 25-mal) von oben nach unten mit mittlerem Druck gebürstet. Es lösen sich einige Zellen und werden mit Hilfe der Bürste aufgenommen. Die Zahnbürste wird in der Spüllösung des Analysekits, welche Wasser, eine gepufferte Salzlösung, eine 0,9 %-ige NaCI Lösung ist, gespült und am Rand des Probengefäßes mit der Spüllösung abgestreift.

Anschließend wird die andere Wangeninnenseite mehrmals gebürstet um Buccalmukosazellen zu gewinnen und die Bürste ebenfalls in der Spüllösung gut abgespült. Zudem kann der Mundraum mit etwas Spüllösung gespült werden, wodurch die einzelnen Zellen an der Wangeninnenseite besser gelöst werden und in die Flüssigkeit abgegeben werden. Die Flüssigkeit wird in das dafür vorgesehene Probengefäß gespuckt.

Durch die Trübung der Spüllösung kann vorab festgestellt werden, dass zelluläres Material gewonnen wurde. Gegebenenfalls kann der Bürstvorgang bzw. das Abschaben der Wangenschleimhaut wiederholt werden.

Die Spüllösung mit den Zellen wird in ein neues Probengefäß überführt und bei 300 g bis 1500 g, vorzugsweise 500 g, für mindestens 1 Minute zentrifugiert. Der Überstand wird abgegossen und es bildet sich ein gut sichtbares Zellsediment. Der Zentrifugationsschritt kann gegebenenfalls zumindest einmal wiederholt werden.

Anschließend wird das Zellsediment gewaschen, vorzugsweise mit einem Waschpuffer, wie Wasser, gepufferte Salzlösung, 0,9 %-ige NaCI Lösung, indem die Zellen aufgeschüttelt werden.

Der Zentrifugationsschritt wird wiederholt und der Überstand dekantiert bzw. möglichst vollständig entfernt, wie z.B. durch Abtropfen lassen oder abpipettieren der Lösung.

Die Stabilisatorlösung umfasst 10 mM Tris-(2-Carboxy-ethyl)-Phosphin-Hydrochlorid in 0,1 M Kaliumdihydrogenphosphatlösung, welche in einem 1,7 ml Reaktionsgefäß im Analysekit enthalten ist. Alternativ wird zum Zellpellet die Stabilisatorlösung, 3 mM Tris-(2-Carboxy-ethyl)-Phosphin-Hydrochlorid in 0,5 M Kaliumdihydrogenphosphatlösung, zugegeben. In einer weiteren alternativen Ausführungsform kann das Zellpellet in einer Stabilisierungslösung umfassend 1 mM Tris-(2-Carboxy-ethyl)-Phosphin-Hydrochlorid in 1 M Kaliumdihydrogenphosphatlösung resuspendiert werden. Die Zellen werden in der Stabilisatorlösung durchmischt und die Zellsuspension mit der Pipette vollständig in das Reaktionsgefäß zurück überführt und mit den Etiket-

Claims (10)

1. 6 AT 010 300 U1 ten des Kits versehen. Nach Probengewinnung wird die biologische Probe vorzugsweise bei -18°C bis -22°C gelagert. Das Reaktionsgefäß mit der Zellsuspension und weitere Etiketten werden in einen Versandbeutel vorzugsweise auf Trockeneis zum Analyselabor gesandt. Das Reaktionsgefäß mit den Zellen kann im Analyselabor bei -18 bis -80°C für mehrere Monate gelagert werden. Gegebenenfalls kann ein Detergens enthalten sein, welches zur Lyse der Zellen bestimmt ist, um die intrazellulären Mikronutrienten freizusetzen und einer Analyse zugänglich zu machen. Der Zellaufschluss kann durch chemische (Wasser, Lauge, Lysepuffer mit NP-40, SDS, Triton X-100, Guanidiniumsalze) und/oder mechanische (Ultraschall, -80°C) Methoden erfolgen, wodurch die Zugänglichkeit der Analyten ermöglicht bzw. verbessert wird und dennoch Veränderungen des Analyten, die die Analyse beeinflussen könnten, minimiert werden. Vorzugsweise erfolgt dieser Verfahrensschritt erst nach der Übersendung in das Analyselabor. Im Analytiklabor werden die Vitamine aus dem Zellinneren extrahiert und mit Hilfe eines Hoch-leistungs-Flüssig-Chromatographie (HPLC)-Verfahrens bestimmt. Hierbei wird in einer möglichen Ausführungsform das antioxidative Netzwerk mit den Vitaminen C, Vitamin E, ß-Carotin und Lycopin abgebildet. Der erfindungsgemäße Analysekit eignet sich besonders gut zur Vorbereitung von biologischen Proben, die antioxidativ wirkende Mikronutrienten enthalten. Selbstverständlich kann der Analysekit auch zur Vorbereitung biologischer Proben verwendet werden, wo die Bestimmung anderer Mikronutrienten erfolgt. Eine weitere bevorzugte Verwendung des erfindungsgemäßen Analysekits zur Probenvorbereitung stellt die Kombination der Bestimmung von Mikronutrienten mit antioxidativem Potential, wie z.B. Vitamin-C, Vitamin-E, etc. mit diversen anderen Mikronutrienten, wie beispielsweise Mineralstoffe und Spurenelemente, wie Magnesium, Selen, Zink, oder Omega 3/6 Fettsäuren, Coenzym Q10, Glutathion, Homocystein, etc. dar. Um unterschiedliche Zellausbeuten zu berücksichtigen werden die ermittelten Vitamin- bzw. Mikronutrientengehalte auf den DNA-Gehalt bzw. die Zeitzahl bezogen. Die Ausführungsbeispiele zeigen mögliche Ausführungsvarianten des Analysekits, wobei an dieser Stelle bemerkt sei, dass die Erfindung nicht auf die speziell angeführten Ausführungsvarianten derselben eingeschränkt ist, sondern vielmehr auch diverse Kombinationen der einzelnen Ausführungsvarianten untereinander möglich sind und diese Variationsmöglichkeit aufgrund der Lehre zum technischen Handeln durch gegenständliche Erfindung im Können des auf diesem technischen Gebiet tätigen Fachmannes liegt. Es sind also auch sämtliche denkbaren Ausführungsvarianten, die durch Kombinationen einzelner Details der dargestellten und beschriebenen Ausführungsvariante möglich sind, vom Schutzumfang mit umfasst. Die den eigenständigen erfinderischen Lösungen zugrundeliegende Aufgabe kann der Beschreibung entnommen werden. Ansprüche: 1. Analysekit zur Gewinnung und Vorbereitung einer biologischen Probe mit Zellen zur Bestimmung der intrazellulären Konzentration zumindest eines Mikronutrienten enthaltend eine Probeentnahmevorrichtung ausgewählt aus einer Gruppe umfassend eine Spachtel, eine Bürste, ein Stäbchen, eine Kapillare, zumindest ein Probengefäß mit zumindest einem Reagens ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Wasser, eine gepufferte Salzlösung, eine Phosphatlösung, eine 0,9 %-ige NaCI Lösung, und gegebenenfalls einen Thermobehälter zur Aufnahme des Probengefäßes, insbesondere zum Kühlen des Probengefäßes mit den Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass als Stabilisierungsreagens Tris-(2-Carboxy- 7 AT010 300 U1 ethyl)-Phosphin-Hydrochlorid enthalten ist.
2. 2. Analysekit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Stabilisierungsreagens aus einem Bereich mit einer unteren Grenze 1 mM, vorzugsweise 2 mM, insbesondere 3 mM, und einer oberen Grenze von 10 mM, vorzugsweise 8 mM, insbesondere 7 mM, ausgewählt ist.
3. 3. Analysekit nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Tris-(2-Carboxy-ethyl)-Phosphin-Hydrochlorid in einer Kaliumdihydrogenphosphatlösung enthalten ist.
4. 4. Analysekit nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Kaliumdihydrogenphosphatlösung aus einem Bereich mit einer unteren Grenze 0,1 M, vorzugsweise 0,2 M, insbesondere 0,5 M, und einer oberen Grenze von 1 M, vorzugsweise 0,8 M, insbesondere 0,7 M, ausgewählt ist.
5. 5. Analysekit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein weiteres Probengefäß mit einem Waschpuffer ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Wasser, gepufferte Salzlösung, Phosphatlösung, 0,9 %-ige NaCI Lösung enthalten ist.
6. 6. Verwendung des Analysekits nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Medizinprodukt gemäß Richtlinie 93/42/EWG bzw. in-vitro Diagnostikum.
7. 7. Verwendung des Analysekits nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Bestimmung zumindest eines Mikronutrienten, insbesondere eines Mikronutrienten mit antioxidativem Potential.
8. 8. Verwendung des Analysekits nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Bestimmung eines Mikronutrientenprofils umfassend antioxidativ wirkende Mikronutrienten und gegebenenfalls weitere Mikronutrienten.
9. 9. Verwendung des Analysekits nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Bestimmung des Mikronutrientenprofils umfassend Vitamin C, Vitamin E, ß-Carotin, Lycopin.
10. 10. Verwendung des Analysekits nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Bestimmung eines weiteren Mikronutrientenprofils umfassend Coenzym Q10, Glutathion, Vitamin D, Magnesium, Zink, Selen, Omega 3/6-Fettsäuren, Folsäure, Homozystein. Keine Zeichnung