CN108088925A - 一种浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法，属于化学成分的检测技术领域。该方法包括以下步骤：于溶于溶剂的浓缩饲料样品加入叔丁基对苯二酚，超声，过滤，浓缩，得待测液；用脂溶性维生素标准品代替浓缩饲料样品，经相同处理，得标准溶液。采用高效液相色谱法对待测液和标准溶液分别进行检测，根据所得的高效液相图谱计算浓缩饲料样品中脂溶性维生素的含量。脂溶性维生素包括维生素A、维生素D3和维生素E。该测定方法一方面过程简单易操作，样品制备时间短，有效避免了前处理过程中脂溶性维生素被氧化，取消了有毒有害的乙醚的使用，安全环保，另一方面其检测精度高，效果好，实现了短时间内对上述维生素同时分离和检测。

Description

一种浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法
技术领域
本发明涉及化学成分的检测技术领域，且特别涉及一种浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法。
背景技术
脂溶性维生素是由长的碳氢链或稠环组成的一类高度疏水的聚戊二烯化合物，包括维生素A、维生素D、维生素E和维生素K。脂溶性维生素，是动物生长发育中必不可少的营养物质，在自然环境中动物主要通过食物获取，但是在人工养殖中，动物单纯通过摄取食物中的脂溶性维生素无法满足其生长发育以及繁殖的需求。
缺乏脂溶性维生素的动物会产生一系列的疾病。例如缺乏维生素A会导致动物产生增重下降，运动失调，失明，母猪繁殖障碍，生畸形仔猪，受孕困难等问题；缺乏维生素D3会导致动物钙磷代谢紊乱，骨胳钙化不全，幼龄佝偻病，成年骨软化；缺乏维生素E会引起胳肌、心肌变性，胃溃疡，贫血，肝坏死，脂肪组织黄染，猝死等问题，因此需在动物的饲料中人工添加维生素。
但是由于脂溶性维生素可在体内大量贮存，过量添加的脂溶性维生素也会带来一定的副作用，维生素A过量摄取会引起中毒，可引发骨痛、肝脾肿大、恶心腹泻及鳞状皮炎等症状。维生素D3过量会发生迁移性钙化，导致肾、心、胰、子宫及滑膜粘蛋白钙化。高血钙也会导致肾结石，而骨骼却因钙被抽走而疏松软化。
因此控制好动物饲料中的脂溶性维生素的含量对现代养殖中预防动物的维生素缺乏及过量至关重要。
现有的饲料检测中对浓缩饲料的维生素A、维生素D3和维生素E的检测方法是将待测样品经过皂化处理后，分别按照下列的国家标准进行检测：标准GBT 17817-2010《饲料中维生素A的测定高效液相色谱法》、标准GBT 17818-2010《饲料中维生素D3的测定高效液相色谱法》、GBT 17812-2008《饲料中维生素E的测定高效液相色谱法》。
以上的浓缩饲料脂溶性维生素的检测方法存在以下的不足之处：
(1)前处理过程繁琐，耗时长，试剂消耗量大；
(2)皂化完成后，需要将反应后的固体残渣等一并转入分液漏斗中，易造成漏斗堵塞；
(3)前处理过程中，需要使用乙醚进行液液萃取，易乳化，且缺乏理想的破乳方法，需要消耗大量时间来静置等待其分层；
(4)乙醚微溶于水，水洗乙醚提取液之后，提取液中的水不易去除，需要通过的无水硫酸钠进行除水，无水硫酸钠会吸附一定量的乙醚造成维生素的损失；
(5)浓缩饲料脂溶性维生素含量较低，已有国标中的直接提取法无法对浓缩饲料脂溶性维生素含量进行检测。
(6)已有国标中采用的抗氧化剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚只有一个活性基团，只能提供一个氢离子，抗氧化能力弱，且受热不稳定，具有生理毒性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法，该测定方法一方面过程简单易操作，样品制备时间短，有效避免了前处理过程中脂溶性维生素被氧化，取消了有毒有害的乙醚的使用，安全环保，另一方面其检测精度高，效果好，实现了短时间内对上述维生素同时分离和检测。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：
本发明提出一种浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法，其包括以下步骤：
于溶于溶剂的浓缩饲料样品加入叔丁基对苯二酚，超声，过滤，浓缩，得待测液；用脂溶性维生素标准品代替浓缩饲料样品，经相同处理，得标准溶液；
采用高效液相色谱法对待测液和标准溶液分别进行检测，根据所得的高效液相图谱计算浓缩饲料样品中脂溶性维生素的含量；
脂溶性维生素包括维生素A、维生素D3和维生素E。
本发明实施例的浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法的有益效果是：
(1)样品制备时间短，过程简单易操作，并且检测精度高，效果好，实现了短时间内对维生素A、维生素D3和维生素E的同时分离和检测。
(2)样品制备过程中添加了叔丁基对苯二酚作为抗氧化剂，其抗氧化作用、热稳定性、安全性均优于已有国标中采用的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚。
(3)取消了有毒有害的乙醚的使用，更加安全环保。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为试验例中待测浓缩饲料中脂溶性维生素的色谱图；
图2为试验例中脂溶性维生素标准溶液的色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法进行具体说明。
本发明实施例提供的浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法主要包括以下步骤：于溶于溶剂的浓缩饲料样品加入叔丁基对苯二酚，过滤，浓缩，得待测液；用脂溶性维生素标准品代替浓缩饲料样品，经相同处理，得标准溶液。
作为可选地，本发明实施例中用于溶解浓缩饲料样品的溶剂优选为甲醇，该溶剂价格便宜且容易获取。此外，也可以选择其它能使浓缩饲料样品溶解度较高的溶剂。
为提高检测结果的准确度，本发明实施例中的浓缩饲料样品的取样量优选为8-12g。
具体地，可参照以下方式进行溶解：称取浓缩饲料样品，精确至0.0001g，置于250mL的容器，如具塞三角烧瓶中，然后加入100mL的甲醇，使浓缩饲料样品完全分散、浸润。
由于现有国标中采用的抗氧化剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚只有一个活性基团，其只能提供一个氢离子，抗氧化能力弱，且受热不稳定，具有生理毒性。而叔丁基对苯二酚的抗氧化作用、热稳定性、安全性均优于2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚。故本发明实施例中通过加入叔丁基对苯二酚以有效避免浓缩饲料样品中的脂溶性维生素在提取过程中被氧化。
由于叔丁基对苯二酚的加入量过低达不到理想的抗氧化效果，加入量过高会导致试剂浪费，故本发明实施例中叔丁基对苯二酚的加入量优选控制为0.2-0.4g。
较佳地，过滤前，将加有叔丁基对苯二酚的浓缩饲料样品溶液进行超声提取，一方面可提高脂溶性维生素的提取率，另一方面可使叔丁基对苯二酚与浓缩饲料样品溶液混合均匀，提高抗氧化效果。优选地，超声提取于60-70℃的条件下处理20-40min。更优地，超声提取于65℃的条件下处理30min。
超声处理后，将所得的提取液冷却至室温，然后过滤，将过滤所得的滤液于50-52℃的条件下蒸发浓缩，得到待测液。具体地，例如可以将50mL过滤所得的滤液于50-52℃的条件下蒸发至干，残渣用5mL甲醇溶解，并过滤，得到待测液。
标准溶液即是用混合后的维生素A标准品溶液、维生素D3标准品溶液和维生素E标准品溶液代替上述浓缩饲料样品，然后经相同处理，得到维生素A、维生素D3和维生素E的混合标准溶液。
采用高效液相色谱法对上述待测液和标准溶液分别进行检测，根据所得的高效液相图谱计算浓缩饲料样品中脂溶性维生素的含量。具体地，通过高效液相色谱检测得到脂溶性维生素标准品和待测浓缩饲料中各组分的保留时间和峰面积，然后绘制脂溶性维生素标准品的浓度与峰面积的对应曲线，将待测浓缩饲料各组分的保留时间和峰面积代入标准曲线，即可计算得到待测饲料中脂溶性维生素的含量。
本发明实施例中高效液相色谱法中的色谱条件为：色谱柱为Agilent Porosle11120EC-C18(2.7μm，2.1mm×100mm)；流动相为甲醇浓度为90-95vt％的甲醇水溶液；洗脱方式采用等度洗脱。优选地，上述流动相为甲醇浓度为95vt％的甲醇水溶液。
由于不同的维生素在不同的检测波长下的响应信号不同，而普通紫外检测器只能使用单波长检测，为提高检测限，本发明实施例中的洗脱时间及洗脱时间内的检测波长优选如下：0-3.4min，324-328nm；3.4-6.0min，262-266nm；6.0min，283-287nm。更优地，洗脱时间及洗脱时间内的检测波长如下：0-3.4min，326nm；3.4-6.0min，264nm；6.0min，285nm。
作为可选地，上述检测过程中的柱温可以为30-40℃，优选地，柱温为35℃。检测过程中待测液的进样量可以为2-10μL，优选地，进样量为5μL。
因进样溶液中可能含有其它非纯液体物质或杂质，故在进样前，可对其进行过滤操作，一方面可避免上述非纯液体物质或杂质对色谱柱造成影响导致待测成分出峰不准，另一方面可较大程度延长色谱柱的使用期限。可选地，待测液和标准溶液在进样前，均经滤径为0.22μm的微孔滤膜过滤。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
准确称取10g(精确至0.0001g)的待测浓缩饲料，置于250mL的具塞三角烧瓶中，加入100mL纯甲醇摇匀，再加入0.3g的叔丁基对苯二酚，摇匀后，于65℃超声波水浴中超声提取30min。冷却至室温后将所得提取液用滤纸过滤，取滤液50mL置于旋转蒸发瓶中，在部分真空，水浴温度50℃的条件下蒸发至干，残渣用5mL甲醇溶解后过0.22μm针头有机微孔滤膜，然后按色谱条件进行上机检测，得到待测浓缩饲料中脂溶性维生素的色谱图。
上述色谱条件如下：色谱柱为Agilent Porosle11 120EC-C18(2.7μm，2.1mm×100mm)；流动相为甲醇浓度为95vt％的甲醇水溶液，洗脱方式为等度洗脱。洗脱时间及洗脱时间内的检测波长如下：0-3.4min，326nm；3.4-6.0min，264nm；6.0min，285nm。检测过程中的柱温为35℃，检测过程中待测液的进样量为5μL。
维生素A标准储备液：准确称取维生素A乙酸酯标准品0.1g(精确至0.0001g)，于100mL棕色容量瓶中，用纯甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，得到维生素A标准储备液。
维生素D3标准储备液：准确称取维生素D3标准品0.01g(精确至0.0001g)，按照维生素A标准储备液的配置方法配置，得到维生素D3标准储备液。
维生素E标准储备液：准确称取维生素E标准品0.01g(精确至0.0001g)，按照维生素A标准储备液的配置方法配置，得到维生素E标准储备液。
维生素A、维生素D3、维生素E混合标准工作液的配置：分别准确移取10mL维生素A标准储备液、10mL维生素D3标准储备液和10mL维生素E标准储备液于100mL棕色容量瓶中，用纯甲醇稀释至刻度，混匀，得到维生素混合标准工作液。
将制备好的维生素混合标准液过0.22μm针头有机微孔滤膜，然后于与待测样品相同的液相条件下进行液相色谱分析，分别进样1.0μL，2.0μL，3.0μL，4.0μL，5.0μL，记录各维生素的保留时间和色谱峰面积，得到标准溶液的色谱图。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程。
将待测浓缩饲料各组分的保留时间和峰面积代入标准曲线，即可计算得到待测饲料中各脂溶性维生素的含量。
实施例2
本实施例与实施例1在测定方法上区别在于：
浓缩饲料样品的取样量为8g，叔丁基对苯二酚的加入量为0.2g。
超声提取于60℃的条件下处理40min。
提取液于52℃的条件下蒸发浓缩。
色谱条件：流动相为甲醇浓度为90vt％的甲醇水溶液。洗脱时间及洗脱时间内的检测波长如下：0-3.4min，324nm；3.4-6.0min，262nm；6.0min，283nm。检测过程中的柱温为30℃，检测过程中待测液的进样量为2μL。
实施例3
本实施例与实施例1在测定方法上区别在于：
浓缩饲料样品的取样量为12g，叔丁基对苯二酚的加入量为0.4g。
超声提取于70℃的条件下处理20min。
提取液于51℃的条件下蒸发浓缩。
色谱条件：流动相为甲醇浓度为92.5vt％的甲醇水溶液。洗脱时间及洗脱时间内的检测波长如下：0-3.4min，328nm；3.4-6.0min，266nm；6.0min，287nm。检测过程中的柱温为40℃，检测过程中待测液的进样量为10μL。
实施例4
本实施例与实施例1在测定方法上区别在于：过滤前，加有叔丁基对苯二酚的浓缩饲料样品溶液无超声提取操作。
试验例
以实施例1为例，其所得的待测浓缩饲料中脂溶性维生素的色谱图如图1所示，脂溶性维生素标准溶液的色谱图如图2所示。图2中共含有5组色谱图，其由靠近横坐标到远离横坐标的方向依次代表标准溶液在进样为1.0μL、2.0μL、3.0μL、4.0μL和5.0μL五种条件下所得的五组色谱图。同一组色谱图中的色谱峰由靠近纵坐标到远离纵坐标的方向依次代表维生素A、维生素D3和维生素E的色谱峰。
对图2进行保留时间的相对标准偏差(RSD)分析，其结果如表1所示。图2中维生素A标准溶液、维生素D3标准溶液和维生素E标准溶液的检测结果分别如表2-4所示。
表1维生素A、维生素D3和维生素E保留时间的RSD分析
表2维生素A标准溶液的检测结果
保留时间(min) 含量(IU/mL) 峰面积 矫正计算值 相对偏差(％)
2.227 23.527 753.970 22.967 2.379
2.229 47.144 1577.100 45.950 2.533
2.226 70.716 2409.700 70.208 0.718
2.229 94.288 3242.500 94.472 -0.195
2.228 117.860 4077.700 118.806 -0.803
表3维生素D3标准溶液的检测结果
保留时间(min) 含量(IU/mL) 峰面积 矫正计算值 相对偏差(％)
4.619 75.636 76.825 74.101 2.030
4.624 151.270 160.900 146.817 2.944
4.622 226.910 246.020 224.487 1.068
4.619 302.540 332.710 303.590 -0.347
4.625 378.180 418.300 381.688 -0.928
表4维生素E标准溶液的检测结果
保留时间(min) 含量(IU/mL) 峰面积 矫正计算值 相对偏差(％)
9.307 14.256 46.943 14.284 -0.196
9.314 28.521 97.256 28.521 -0.002
9.312 42.768 149.910 42.422 0.810
9.306 57.024 202.410 57.278 -0.445
9.317 71.280 254.010 71.880 -0.841
结合表1-4，得到上述各维生素的标准曲线的方程为：
维生素A的标准曲线方程：y＝34.32226x，R2＝0.99992；
维生素D3的标准曲线方程：y＝1.09592x，R2＝0.99998；
维生素E的标准曲线方程：y＝3.53382x，R2＝0.99996。
将图1中所得的待测浓缩饲料的各组分的保留时间和图2中维生素标准溶液得到的保留时间进行对比得到各个组分峰的归属，并将各组分的峰面积分别带入与其对应的维生素的标准曲线方程，计算得到相应的上机液浓度C，将C带入式(Ι)中计算得到待测浓缩饲料中维生素A、维生素D3和维生素E的含量，其结果如表5所示。
上述式(Ι)为：其中，W代表待测浓缩饲料(样品)中维生素的含量(KIU/kg)；C代表通过样品峰面积以及标准曲线计算得到的上机液中维生素的含量(IU/mL)；V1代表加入超声提取的甲醇的体积(mL)；V2代表过滤后转入旋转蒸发仪的甲醇的体积(mL)；V3代表蒸干后加入的甲醇的体积(mL)；m代表试样的质量(g)。
表5待测饲料样品中脂溶性维生素含量检测结果
从表5可以看出，采用本发明的方法得到的待测浓缩饲料中的脂溶性维生素含量，与国标检测所得到的结果的误差在2％以内，能较为精确的得到浓缩饲料中脂溶性维生素的含量，且相对国标检测，具有操作简便，有时少，安全环保等优点。
综上所述，本发明实施例的浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法过程简单易操作，样品制备时间短，有效避免了前处理过程中脂溶性维生素被氧化，取消了有毒有害的乙醚的使用，安全环保。此外，该检测精度高，效果好，实现了短时间内对上述维生素的同时分离和检测。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
于溶于溶剂的浓缩饲料样品加入叔丁基对苯二酚，超声，过滤，浓缩，得待测液；用脂溶性维生素标准品代替所述浓缩饲料样品，经相同处理，得标准溶液；
采用高效液相色谱法对所述待测液和所述标准溶液分别进行检测，根据所得的高效液相图谱计算所述浓缩饲料样品中脂溶性维生素的含量；
所述脂溶性维生素包括维生素A、维生素D3和维生素E。
2.根据权利要求1所述的浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法中的色谱条件为：色谱柱为Agilent Porosle11 120EC-C18(2.7μm，2.1mm×100mm)；流动相为甲醇浓度为90-95vt％的甲醇水溶液；洗脱方式采用等度洗脱；
优选地，所述流动相为甲醇浓度为95vt％的所述甲醇水溶液。
3.根据权利要求2所述的浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法，其特征在于，洗脱时间及所述洗脱时间内的检测波长如下：0-3.4min，324-328nm；3.4-6.0min，262-266nm；6.0min，283-287nm；
优选地，洗脱时间及所述洗脱时间内的检测波长如下：0-3.4min，326nm；3.4-6.0min，264nm；6.0min，285nm。
4.根据权利要求2所述的浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法，其特征在于，检测过程中的柱温为30-40℃；
优选地，检测过程中的柱温为35℃。
5.根据权利要求2所述的浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法，其特征在于，检测过程中所述待测液的进样量为2-10μL；
优选地，所述进样量为5μL。
6.根据权利要求2所述的浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法，其特征在于，所述待测液和所述标准溶液在进样前，均经滤膜过滤。
7.根据权利要求1所述的浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法，其特征在于，所述浓缩饲料样品的取样量为8-12g。
8.根据权利要求1所述的浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法，其特征在于，所述叔丁基对苯二酚的加入量为0.2-0.4g。
9.根据权利要求1所述的浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法，其特征在于，超声提取是于60-70℃的条件下处理20-40min。
10.根据权利要求1所述的浓缩饲料脂溶性维生素含量的检测方法，其特征在于，将过滤所得的滤液于50-52℃的条件下蒸发浓缩。
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