KR20010089165A

KR20010089165A - 표피에서 생물학적 인자를 검출하는 방법

Info

Publication number: KR20010089165A
Application number: KR1020017002069A
Authority: KR
Inventors: 레인스로렌스에이.; 모르헨베라비.
Original assignee: 추후보정; 덤테크 인터내셔널
Priority date: 1998-08-18
Filing date: 1999-08-17
Publication date: 2001-09-29
Also published as: CA2340673A1; US6949338B2; ES2358175T3; AU5575499A; PT1112077E; US20020115086A1; IL141481A; US20020110822A1; JP4476488B2; AU754471B2; DK1112077T3; US20020197604A1; EP1112077B1; US20020119471A1; KR100689725B1; EP1112077A1; JP2007029106A; US20020150918A1; EP1112077A4; ATE491462T1

Abstract

본 발명은 피부로부터 폴리뉴클레오티드를 제거하는 방법에 관한 것이다. 이 폴리뉴클레오티드는 피부염을 검출하고, 자극성 반응과 알레르기성 반응을 구별하는데 이용할 수 있는데, 이는 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 폴리펩티드에 따라 상기 폴리뉴클레오티드를 특정화함으로써 이루어진다. 따라서, 본 발명은 피부로부터 샘플을 비침입성으로 분리하는 방법 및 이 방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다.

Description

표피에서 생물학적 인자를 검출하는 방법{METHOD FOR DETECTION OF BIOLOGICAL FACTORS IN EPIDERMIS}

세포 및 조직은 내인성 및 외인성 제제에 의하여 영향을 받아 생물학적 활성의 캐스케이드 방식으로 반응하여 이러한 제제에 대한 반응을 매개한다. 피부는 예를 들어, 피부가 외인성 제제에 노출됨으로 인하여 유발되는 다수의 피부학적 반응이 일어나는 장소이다. 또한, 피부는 신체중에서 가장 민감한 기관이다. 그러므로, 상기 피부는 그 자체로서 단백질 반응 뿐만 아니라, 특정 반응과 관련되어 있거나 또는 특정 반응을 일으키는 유전자 및 유전자 생성물을 측정하는 수단을 제공한다.

표피는 피부의 가장 바깥쪽에 존재하는 층이다. 상기 층은 4개의 세포 유형을 함유한다. 표피에 가장 많이 존재하는 세포는 분화 과정중 다수의 단계에 관여하는 케라틴 세포이다. 표피는 기저 세포층, 즉 표피의 최저층 세포들의 유사 분열에 의하여 상기 케라틴 세포 푸울을 유지시킨다. 이와는 대조적으로, 표피층을 덮고 있는 최상부는, 정상 세포의 경우 핵을 보유하는 세포들을 함유하지 않는 각질층을 의미한다. 케라틴 세포는, 인터루킨(IL) IL-1, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12를 포함하는 다수의 시토킨과 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 생성한다[참조: Kupper, M.,Am. J. Dermatopathol.11:69-73 (1993)]. 상기 기저 세포층의 상부에는, 골수 근원의 면역 적합성 세포인, 랑게르한스 세포가 존재한다. 상기 랑게르한스 세포는 대식 세포의 특성 뿐만 아니라 T 세포의 특성도 보유하고 있으며, 접촉성 피부염과 같은 피부내 면역 반응을 유발시키는 일련의 현상들을 개시하는 것으로 생각된다. 멜라닌 세포는 피부의 색소 형성 세포이다. 상기 세포는 또한 일반적으로 표피의 보다 내부층에 존재한다. 표피에 존재하는 네번째 세포는 메르켈 세포이다.

표피의 바로 아래에는 주로 섬유 아세포, 림프구, 비만 세포, 내피 세포 및 신경 말단부를 포함하는 피부층이 존재한다. 섬유 아세포는 외세포성 매트릭스 물질 및, 예를 들어 콜라겐과 같은 피부의 구조 단백질이 축적된 세포 유형이다. 내피 세포는 피부의 모세 혈관 강을 덮고 있는 세포이며 상기 비만 세포는 피부의 염증 반응시 방출될 수 있는 히스타민을 함유한다.

피부의 염증은 피부에 도포된 다양한 종류의 외부 제제로 인하여 유발될 수 있다. 접촉성 피부염의 군으로는 자극성, 알레르기성, 광알레르기성 및 광독성 그리고 준임상적 기작을 포함한다. 임상학적으로, 상기 반응들은 홍반, 부종 및 소포 형성으로 대표되는 습진 진행시 나타나는 증상과 실질적으로 동일하다[참조: Hoefakker 등,Contact Dermat.33:258-266 (1995) ; Krasteva, M.,Int.J.Dermatol.32:547-560 (1993)]. 접촉성 유리카리아(uricaria)는 다수의 제제를 피부에 적용시킬때 유발되는 추가의 잠재성 반응인데, 피부와 접촉시 즉각적으로 부스럼을 유발시킨다는 점에서 상이하다. 상기 접촉성 반응의 기작을 분류하는 것은 환자들에 있어서 매우 중요한 일이다. 이는 감작후 피부가 다시 노출됨에 따라 점점 더 심각한 염증을 유발하는 알레르기성 반응 또는 면역 반응의 면역학적 결과에 기인한다. 예를 들어, 제제에의 노출에 따른 염증 반응 유형의 특성 규명은 환자 및 제조자에게 장래의 염증 반응을 피하기위한 제품을 구입 및 재고안할 수 있는 능력을 제공할 수 있다.

접촉성 피부염이 빈번하고 오랜 기간 동안 지속적으로 유발되어 오고 있기 때문에, 모든 신규의 국소성 약물 또는 모든 화장약제(cosmaceuticals)에 대한 인간 피부 시험을 수행하는 동기를 제공해 오고 있다. 현재 비소에 대하여 잘 규명되어 있는 피부 안전성 시험은 피부와 접촉될 임의의 제품이 다수의 국가의 시장에 출시되기 이전에 수행될 필요가 있다. 보호성 피부 패취 시험은 상기 제품으로 수행되고 있으며 이의 성분들은 이러한 시험 방법에서 그 결과를 좌우할 수 있는 물질이 되고 있다. 이러한 보호성 피부 패취 시험이 실시된 이래, 주된 문제점은 알레르기성 접촉 피부염(ACD)과 자극성 접촉 피부염(ICD)을 명확히 구별해 낼 수 없다는 점이었다. 뿐만 아니라, 상기 패취 시험은 단지 홍반, 부종 및 소포 형성에 관한 정성적인 시각 판다에 따라서 반응의 심각성을 정량적으로 측정하는데에는 충분하지 않다.

본 발명은 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화되는 폴리펩티드, 또는 지질일 수 있는 생물학적 인자를 표피로부터 검출하는 방법에 관한 것이다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 전술한 바와 같은 한계점들을 극복하는 것이다. 그러므로, 본 발명은 피부 각질층 하부 세포에서 생물학적 인자들을 비침입성으로 검출하는 방법을 제공한다. 상기 생물학적 인자의 특성 규명은 예를 들어, 전신성 반응 및 접촉성 피부염과 같은 국소 반응의 구별, 더욱 구체적으로는 자극성 접촉성 피부염(ICD)과 알레르기성 접촉성 피부염(ACD)을 구별하는데에 유용하다.

다른 구체예에 있어서, 본 발명은 접촉성 피부염에 대한 샘플의 후속 시험을 위한 폴리뉴클레오티드 샘플을 얻는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에 있어서는, 단단한 표면으로 스크랩핑하는 것과 같은 방법으로 피부의 표피 각질층을 제거한다. 다른 바람직한 구체예에서는 표피를 1회 이상 접착성 표면과 접촉시킨다.

다른 구체예에서, 본 발명은 피험자로부터 얻은 하부 각질층 세포내에서 IL-8 을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 정량하여 피험자에서 ICD를 진단하는 방법을 제공하는데, 이때 IL-13중 IL-4의 상대적인 부재하에서, IL-8 mRNA의 존재를 ICD의 징후로 이용한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 피험자로부터 얻은 하부 각질층 세포에서 IL-4 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 정량하여 피험자에서 ACD를 진단하는 방법을 제공하는데, 이때 IL-4 mRNA의 존재를 ACD의 징후로 이용한다.

또한, 본 발명은 피험자의 피부 각질층 하부 세포로부터 폴리뉴클레오티드를 얻는 방법을 제공하는데, 이 방법은 각질층을 제거하여 살아있는 표면에 노출시키는 단계 및 상기와 같이 노출된 표면으로부터 폴리뉴클레오티드를 수집하는 단계를 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 피험자로부터 얻은 피부 세포내에서 IL-13을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 정량하는 단계를 포함하는, 피험자내에서의 IL-13의 발현을 검출함으로써 ACD를 진단하는 방법을 제공하는데, 여기서 IL-13 폴리뉴클레오티드의 증가된 양을 ACD의 징후로 이용한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 단단한 표면 또는 접착성 테이프와 같은 세포 수집 장치 및 피부 샘플내의 핵산을 보존하는데에 적당한 세포 용해 완충액 또는 컴퓨터 칩을 포함하는, 피부로부터 샘플을 비침입성으로 얻는 키트를 제공한다.

다른 구체예에 있어서, 본 발명은 세포 수집 장치, 세포 용해 완충액 및, 예를 들어 하이브리드화 시약과 같은 검출 시약을 포함하는 키트를 제공한다.

추가의 구체예에 있어서, 본 발명은 피부 절편과 시험 화합물을 접촉시킨후 시토킨 또는 시토킨 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 존재 여부를 검출함으로써, 피부염을 유발시키는 화합물을 확인하는 방법을 제공하는데, 여기서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 존재는 피부염을 시사하는 것인 방법을 제공한다. 3차원적 유기체형의 피부 구성물을 이용하는 단계를 포함하는, 상기 구체예의 방법은 생체내 또는 시험관내에서 수행될 수 있다.

본 발명의 하나 이상의 구체예에 대한 상세한 설명을 이하 첨부된 도면 및 상세한 설명을 통하여 제시해 놓았다. 본 발명의 다른 특성, 목적 및 이점들은 이하의 상세한 설명 및 도면과 청구항을 통하여 명확하게 파악될 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 동일한 피험자의 상박의 3개의 상이한 부위를 테이프로 스트립핑하여얻은 RNA로 수행하는 리보뉴클레아제 보호 분석법(RPA) 결과를 나타내는 겔의 노출사진이다. 상기 3개의 부위는 12회 스트립핑하였다. 이후 상기 피험자로부터 얻은 RNA 샘플을 하이브리드화시키는데에 4개의 상이한 RNA 프로브(IL-4, IL-8, L32, GADPH)를 사용하였다. 1 레인은 임상학적으로 2+ 홍반으로서 평가되며, 스쿠아레이트(squarate)(ACD)에 의하여 유발된 피부의 홍반 부위로부터 분리된 RNA를 나타낸다. 3 레인은 0.5% 나트륨 라우릴 설페이트(SLS)에 의하여 유발된 ICD 홍반성 지역(2+로 평가함)으로부터 분리한 RNA를 나타낸다. 상기 양 레인은 IL-8에 대한 밴드를 나타낸다. 2 레인은 동일한 피험자의 비염증성이며, 정상적인 외형을 나타내는 피부로부터 얻은 샘플을 나타낸다. 시토킨 IL-4에 대한 밴드는 알레르기 반응으로부터 얻어지는 1 레인에서 확인할 수 있다.

도 2는 4명의 추가 피험자의 상박의 3개의 상이한 부위를 테이프로 스트립핑하여 얻은 RNA로 수행한 RPA에 대한 결과이다. 상기 겔에는 6개의 상이한 RNA에 대한 리보프로브들(IL-4, IL-8, IL-9, IL-13, IL-14 및 산화질소 합성 효소(iNOS)의 동형체)과 2개의 가계(housekeeping) 유전자가 모두 포함되어 있다. 상기 '+'는 피험자로부터 얻은 피부가 SLS(도면의 밑부분의 두번째 화살표) 또는 스쿠아레이트(도면의 밑부분의 세번째 화살표)로 처리되었음을 시사하는 것이다.

상세한 설명

본 발명은 피부 각질층 하부 세포로부터 폴리뉴클레오티드와 같은 생물학적 인자를 수집하는 방법을 제공한다. 이어서, 이들 생물학적 인자들의 특성으 규명하여 피험자의 국소 또는 전신 반응의 존재를 확인할 수 있다. 더욱이, 본 발명은,준임상적 피부염을 포함하는, 모든 유형의 접촉성 피부염을 구별하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 예를 들어, 피부로부터 얻은 시토킨을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 같은 생물학적 인자를 검출함으로써 자극성 반응을 알레르기성 반응과 구별하는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에서, 핵산을 함유하는 샘플은 비침입성으로 얻는다.

염증 반응은 종종 유사한 임상학적 증상을 나타낸다. 염증성 반응을 나타내는 환자를 적절히 치료하기 위해서는 이런 반응의 실체를 적절히 확인해야 한다. "유사한 임상학적 증상"이란 일반적으로 2 이상의 반응이 전체적으로 유사한 임상학적 및/또는 조직학적 외형을 보유하는 것을 의미한다. 예를 들어, 피부에서의 접촉성 피부염은 피부와 접촉하게 되는 다양한 종류의 외부 제제로부터 유발될 수 있다. 접촉성 피부염의 군으로는 자극성, 알레르기성, 광알레르기성 및 광독성 및 잠재성 기작을 포함한다. 임상학적으로, 상기 반응은 홍반, 부종 및 소포 형성으로 대표되는 습진 진행시 나타나는 증상과 실질적으로 동일하다. ICD 및 ACD의 홍반, 부종 및 수포 형성은 구별이 되지 않을 수 있다. 조직학적으로도 조차, 상기 2 가지 경우의 진행 과정은 미묘한 차이점만을 나타내며, 이는 상기 반응 초기의 24 시간 동안에만 나타난다.

본원에서 사용한 용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산 서열"은 분리된 단편의 형태 또는 보다 큰 구성물의 성분으로서의, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 서열에는 DNA, mRNA를 포함하는 RNA 및 cDNA 서열을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"는 분리된 단편의 형태 또는 보다 큰 구성물의 성분인, 아미노산 잔기들의 중합체를 의미한다. 이러한 폴리펩티드의 예로서는 시토킨 또는 이의 단편들을 암호화하는 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩티드는 기능성 단백질 또는 단백질의 단편을 암호화할 수 있다. 예를 들어, IL-4 폴리펩티드는 아미노산 중합체로 구성된 IL-4의 전체 길이 단백질 서열 및 이의 단편을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "시토킨"은 세포 조절 및 세포 분화에서 작용을 하는 다수의 인자들을 의미한다. 예를 들어, 시토킨은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-13, IL-14를 포함하는 인터루킨과 변형성 성장 인자(TGF-β) 상과에 속하는 인자들, GM-CSF 및 인터페론을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "생물학적 인자"는 생물학적 활성을 보유하거나 또는 생물학적으로 작용성인 다수의 인자들을 의미한다. 예를 들어, 생물학적 인자들로서는 DNA, RNA, mRNA 및 cDNA와 같은 폴리뉴클레오티드, IL-4, IL-8 및 IL-13 단백질과 같은 폴리펩티드 및 이의 단편 뿐만 아니라, 콜레스테롤, 지방산과 같은 지질 및 루코트리엔, 프로스타글란딘등과 같은 염증성 매개체를 포함한다.

"피부"는 하나 또는 수개의 층 두께를 갖는, 세포로 구성된 시이트로서 조직화된 상부 기저 단층을 포함하며, 종종 기계적 보호 작용 또는 능동 수송을 담당하는 조직을 의미하기도 한다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 피부는 포유 동물의 피부이다. 더욱 바람직한 구체예에 있어서, 상기 피부는 인간 피부이다. 인간 피부의 표피는 몇몇 피부 조직의 뚜렷한 층을 포함한다. 가장 하부에 존재하는 층은 기저 세포층으로서, 이는 주상 구조 세포(columnar cell)를 포함한다. 그 위를 덮고 있는 층은 극상층으로서, 이는 다면형 세포로 이루어져 있다. 상기 극상층으로부터 분리해 낸 세포들을 편평화시킨후 케라토하이알린 과립체를 합성하여 과립층을 형성하였다. 상기 세포들이 외측으로로 움직임에 따라, 이들은 핵을 상실하게 되며, 상기 케라토하이알린 과립체는 장원 섬유와 융합되어 합체된다. 이로써 맑은 층(stratum lucidum)이라 불리우는 투명층이 형성된다. 상기 맑은 층들을 밀접하게 패킹시켰다. 상기 맑은 층으로부터 상향으로 세포가 움직임에 따라서, 이들은 다수의 불투명한 비늘 구조로 압축된다. 이들 세포들은 모두 케라틴으로 완전히 채워져 있으며 핵을 포함하는 기타의 모든 내부 구조물을 상실한, 세포의 편평형 잔류물이다. 이들 비늘 구조는 표피의 최외각층인, 각질층을 이룬다. 상기 각질층의 저부에서는, 세포들이 가까이 밀집되어 서로 단단히 부착하게 되지만, 상기 층의 보다 상부에서는 느슨하게 패킹되어, 결국에는 표면으로부터 분리된다.

"샘플"은 피험자의 피부로부터 얻은 임의의 제조물을 의미한다. 예를 들어, 전술한 바와 같은 비침입성 방법으로 얻은 세포 샘플들은 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 지질을 분리하는데에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 예를 들어, 고체 또는 반고체 지지체상에서 배양된 피부 세포 및 유기체형의 피부 구성물을 사용하여 시험관내에서 수행할 수 있다. 이 경우, 상기 피부 세포들은 임의의 공급원으로부터 얻을 수 있다. 정제된 형태 또는 정제되지 않은 형태의 임의의 시험관내 또는 생체내 표본으로부터 얻은 생물학적 인자가 목적하는 생물학적 인자를 포함하는 경우, 피부염과 같은 생물학적 활성을 검출하기 위한 출발 물질로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 샘플이 피부염의 징후인, 시토킨과 같은 폴리펩티드를 암호화하는 특정 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하고 있거나 또는 함유하고 있을 것으로 추측되는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드를 검출함으로써 피부염을 확인하는데에 사용될 수 있다.

조직으로부터 얻은 샘플들은 당 업계에 널리 공지된 여러가지 방법으로 분리할 수 있다. 상기 샘플을 분리하는 침입성 방법으는 예를 들어, 채혈중 및 다양한 조직들의 생검시에 바늘을 사용하는 방법을 포함한다. 이러한 기술들의 침입성으로 인하여 사멸 및 발병의 위험성이 증가된다. 본 발명은 다양한 질병, 질환 또는 염증성 반응의 검출, 진단 또는 예측에 관여하는 생물학적 인자들을 얻기 위한 공급원으로서 사용될 수 있는 샘플을 비침입성으로 얻는데에 유용한 방법 및 키트를 제공한다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 피부염 반응을 검출하기 위하여, 예를 들어 핵산 및/또는 폴리펩티드와 같은 생물학적 인자들을 분리하는데에 사용되는 피부 샘플을 얻는 비침입성 방법을 제공한다. 이와 같은 구체예에서, 상기 피부의 표피 세포들을, 예를 들어 멸균된 15호 메스와 같은 단단한 기구로 스크랩핑하지만, 피부의 표면층(즉, 각질층)만을 분리할 수 있는 다수의 단단한 기구가 사용될 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다. 또한, 피부를 스크랩핑하는 대신에, 예를 들어 덕트 테이프(333 덕트 테이프, 나슈아 테이프 프로덕츠) 또는 스카치(등록상표) 테이프(3M 스카치 810, 세인트 폴, 미네소타)와 같은 접착성 테이프를 사용하여 피부의 표피층을 분리해 낼 수 있다. 그러나, 바람직한 방법은 디-스쿠암(D-SQUAME : 등록상표)(쿠뎀, 달라스 텍사스)를 사용하여 피부 세포층을 스트립핑하는것이다. 이러한 구체예에서, 테이프로 피부를 스트립핑하고, 스트립핑된 세포들과 세포성 물질들을 이후 매스, 테이프 또는 기타 기구로부터 회수한다. 예를 들어, 피부 세포 및 세포성 물질을 얻는데에 사용되는 테이프는 용해 완충액을 함유하는 멸균 원심분리 튜브내에서 원심분리할 수 있다. 매스를 사용하는 경우에는 세포 및 세포성 물질은 멸균 페트리 접시로 운반되며 이때 임의의 세포들은 상기 용해 완충액으로 용해될 수 있다. 단일의 피부 부위에 사용된 테이프 또는 매스의 각각의 조각에 대해서 이와 동일한 용해 완충액을 재사용할 수 있다. 이러한 용도로서, 테이프 스트립핑 방법은 피부로부터 세포 또는 세포성 물질들을 분리해 내는 스크랩핑 방법을 병용하여 수행할 수 있다. 이후 얻어진 샘플을 더 처리하여 예를 들어, 핵산, 폴리펩티드 또는 지질을 분리할 수 있다. 상기와 같은 방법은 측정될 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 또는 지질 수준에 좋지않은 영향을 미치지않는 것이 바람직하다. 본 발명은 피부 세포의 합성 패턴의 변화를 입증하는데에 도움이 되는, mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드를 얻기 위하여 신속하고, 비침입성인 방법을 제공한다. 상기 테이프 스트립핑 방법 자체는 상기 방법이 수행된 이후 초기 수 시간 동안 피부 시토킨 프로필에 영향을 주지 않는 것으로 보인다. 본 발명의 스크랩핑 및 스트립핑 방법을 사용할 경우 유전병을 포함하여, 국소 또는 전신의 질병, 질환 또는 염증 반응을 확인, 구별 및 진단할 수 있다. 본 발명에 있어서, 전사 및 폴리펩티드 합성을 유발시키는 임의의 반응, 질병 또는 질환이 본 발명의 방법을 통하여 검출될 수 있다.

폴리뉴클레오티드는 당업자에게 널리 공지된 여러가지 방법으로써 용해된 세포 및 세포성 물질로부터 분리할 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 분리하기 위해, 예를 들어 트리리에이전트(몰레큘라 리서치 센터, 인크. 신시네티, 오하이오)를 포함하는 - 이에 한정되는 것은 아님 - 다수의 제품들을 사용할 수 있다. 이후 분리된 폴리뉴클레오티드는 시토킨을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 특정 핵산 서열에 대하여 시험하거나 또는 분석할 수 있다.

다른 구체예에서, 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 샘플로부터 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 비침입성 기술을 사용하여 얻어진 세포의 전체 제조물은 폴리펩티드를 함유한다. 또한, 상기 폴리펩티드는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 포함하는 예비 크로마토그래피 및 면역학적 분리 방법을 포함하는 종래의 방법으로써 추가로 분리 또는 정제할 수 있다. 이후 상기 폴리펩티드의 특성을 규명하여 피부학적 반응의 존재에 대한 징후로 이용한다.

한 구체예에서, 본 발명은 시토킨을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 검출하여 피부 샘플에서의 알레르기 반응과 자극성 반응을 구별하는 방법을 제공한다. 정상적인 또는 표준적인 조직 샘플에 관한 임의의 시토킨의 상대적인 양으로써 반응의 유형 및/또는 반응의 심각성을 구별하게 된다.

기존의 임상학적 시험 방법이 자극성 반응과 알레르기 반응을 구별할 수 없었던 반면에, 본 발명의 비침입성 방법은 이들의 상대적 시토킨 발현 프로필을 통하여 상기 양 반응을 구별할 수 있다. 자극성 접촉성 피부염은 시토킨 또는 시토킨 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 검출함으로써 알레르기성 접촉성 피부염과 구별할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 있어서, ICD로부터 얻어진 세포들의IL-4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 수준은 ACD 병변 세포로부터 얻어진 폴리뉴클레오티드에 비하여 검출이 불가능할 정도의 수준이었다. 결과적으로, 상기 방법은 예를 들어, 조직으로부터 분리된 DNA 또는 전령 RNA(mRNA)를 포함하는 RNA를 사용할 수 있다. 상기 DNA 또는 RNA는 1본쇄 또는 2본쇄일 수 있다. RNA가 얻어졌을 경우, 당 업계에 널리 공지된 바와 같이, RNA 주형을 DNA로 역전사시키는 최적의 효소 및 조건을 사용할 수 있다. 이와는 달리, 상기 RNA로 RNAse 보호 분석법을 수행할 수도 있다. 각각 1본쇄씩 함유하고 있는 DNA-RNA 하이브리드를 사용할 수도 있다. 또한 폴리뉴클레오티드의 혼합물을 사용하거나, 또는 동일한 또는 상이한 프라이머를 사용하여 선행 증폭 반응으로부터 합성된 폴리뉴클레오티드를 사용할 수도 있다. 특정 서열이 전체 핵산이면, 폴리뉴클레오티드 서열이 증폭될 경우, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 더욱 큰 분자의 분획이거나, 또는 처음부터 독립적인 분자일 수 있다. 증폭될 서열이 처음부터 순수한 형태로 존재할 필요는 없으며; 전체 인간 DNA 내에 포함되어 있는 것과 같이, 복합적 혼합물중의 소량의 분획일 수 있다.

또한, 샘플로부터 얻은 폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우, RNase 보호 분석법을 사용할 수 있다. 상기 방법에서, 표지된 안티센스 RNA 프로브는 샘플내 상보적 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화된다. 잔류하는 비하이브리드화된 1본쇄 프로브는 리보뉴클레아제로 처리하여 분해시킨다. 하이브리드화된 2본쇄 프로브는 RNAse 분해로부터 보호된다. 시간이 적당히 경과한 후, 상기 분해 반응의 결과물을 수집하여 겔상에서 분석할 수 있다[예를 들어, Ausubel 등의 문헌, CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY, 섹션 4.7.1 (1987) 참조]. 본원에서 사용한 용어 "RNA 프로브"는 목적 샘플내의 RNA와 하이브리드화될 수 있는 리보뉴클레오티드를 의미한다. 당업자는 측정될 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 변형 가능한 프로브 특이성, 하이브리드화 온도, 핵산의 양 등에 특이적인 RNase 보호 분석법을 확인 및 변형시킬 수 있을 것이다. 또한, 예를 들어 리보퀀트TM 다중프로브 RNAse 보호 분석 시스템(파밍겐 인크., 샌디에고, 캘리포니아)과 같은 시판중인 다수의 키트를 사용할 수 있다.

다른 구체예에서, 샘플내 폴리뉴클레오티드는 노던 블럿 또는 서던 블럿으로 분석할 수 있다. 상기 기술에서 폴리뉴클레오티드는 겔상에서 분리되어 목적 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 프로브된다. 예를 들어, RNA는 니트로셀룰로즈로 운반된 겔 상에서 분리된후 목적 서열에 상보적인 DNA로 프로브된다. 상기 상보적 프로브는 방사성 또는 화학적 방법으로 표지할 수 있다. 상기 프로브의 하이브리드화는 목적 폴리뉴클레오티드 존부에 관한 지표가 된다.

시토킨을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 검출 방법은 핵산의 크기 분별 방법과 같은 표준 방법으로 수행할 수 있다. DNA 및 RNA의 크기 분별 방법은 당업자에게 널리 공지된 방법으로, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(PAGE)을 포함하는, 겔 전기 영동법과 같은 방법이 있다. 예를 들어, 상기 겔은 7 M 또는 8 M의 우레아-폴리아크릴아미드-포름아미드 겔일 수 있다. 핵산의 크기 분별법은 또한 당업자에게 공지된 크로마토그래피법으로 수행할 수 있다.

폴리뉴클레오티드의 검출 방법은 필요에따라 방사성 표지된 프로브를 사용하여 수행할 수 있다. 적당한 신호를 제공하는 임의의 방사성 표지를 사용할 수 있다. 기타의 표지로는 리간드, 착색 염료 및 형광 분자가 포함될 수 있는데, 이들은 표지된 리간드 등에 대한 특이적 결합 쌍의 일원으로서 사용할 수 있다. 표지된 제조물은, 예를 들어 서던 또는 노던 하이브리드화 기술에 의하여 폴리뉴클레오티드에 대한 프로브로서 사용할 수 있다. 샘플로부터 얻어진 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드와 결합하는 필터로 운반된다. 표적 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오티드 절편과 하이브리드화될 표지된된 폴리뉴클레오티드 프로브에 노출시킨 이후, 표적 핵산 단편에 방사성 프로브가 결합하였는지의 여부는 방사선 사진법으로 확인할 수 있다 [참조:Genetic Engineering, 1st ed., Robert Williamson, Academic Press, pp72-81 (1981)]. 특정 하이브리드화 기술이 본 발명에 필수적인 것은 아니다. 하이브리드화 기술은 당 업계의 통상의 숙련자에게 널리 공지된 것이거나 또는 용이하게 확인될 수 있는 것이다. 하이브리드화 기술이 개선됨에 따라서, 상기 기술들은 본 발명의 방법에 용이하게 사용될 수 있다.

목적 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 검출 이전에 증폭할 수 있다. "증폭된"이란 용어는 1본쇄 폴리뉴클레오티드 분자로부터 얻은 핵산의 다수의 사본을 제조하는 방법을 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 당업자에게 공지된 생화학적 방법으로 시험관내에서 수행할 수 있다. 상기 증폭 제제는 효소를 포함하여, 프라이머 증폭 생성물을 합성시키는 기능을 보유할 임의의 화합물 또는 시스템일 수 있다. 이러한 목적에 적당한 효소들로서는, 예를 들어 이.콜리 DNA 중합효소 I, Taq 중합효소, 이.콜리 DNA 중합효소 I의 클리나우 단편, T4 DNA 중합효소, 기타 유용한 DNA 중합 효소, 중합 효소 뮤테인(polymerase mutein), 역전사효소, 리가아제 및 열 안정성 효소(즉, 변성이 일어나기에 충분한 정도로 온도를 승온시킨 이후에 프라이머를 증폭시키는 효소)를 포함하는 기타 효소가 있다. 적당한 효소들은 적당한 방법으로 뉴클레오티드를 조합시켜 각각의 돌연변이 뉴클레오티드 사슬에 상보적인 프라이머 증폭 생성물을 형성할 수 있다. 일반적으로, 상기 합성은 합성이 종결될 때까지 각각의 프라이머의 3' 말단에서 개시되어 주형 사슬을 따라서 5' 방향으로 진행되어 상이한 길이의 분자들을 합성시키게 된다. 그러나, 전술한 바와 동일한 방법을 사용하여 5' 말단에서 합성을 개시하여 다른 방향으로 진행되는 증폭 제제도 존재할 수 있다. 어떠한 경우에는, 본 발명의 방법이 본원에 기술된 증폭 방법의 구체예에 한정되지는 않는다.

본 발명에 따라 사용할 수 있는 시험관내 증폭 방법중의 하나로는 미국 특허 제4,683,202호 및 동 제4,683,195호에 기술되어 있는 중합효소 연쇄 반응(PCR)이 있다. "중합효소 연쇄 반응" 이란, 열 안정성 DNA 중합효소와 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 DNA 염기 서열을 증폭시키는 방법을 의미하는 것으로서, 한 가닥은 증폭될 서열의 한쪽 말단의 (+) 사슬에 상보적이며 다른 가닥은 다른 쪽 말단의 (-) 사슬에 상보적이다. 새로이 합성된 DNA 사슬은 차후에 동일 프라이머 서열에 대하여 추가의 주형으로 사용할 수 있기 때문에, 프라이머 어닐링, 사슬 증폭 및 해리 단계로 이루어진 연속적인 단계를 통하여 목적 서열에 매우 특이적으로 신속하게 증폭시킨 증폭 생성물을 생성할 수 있다. 상기 중합효소 연쇄 반응은 동일 샘플내에 시토킨을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 존부를 검출하는데에 사용할 수 있다. 다수의 중합효소 연쇄 반응이 당업자에게 공지되어 있으며, 본 발명의 방법에도 사용할 수 있다. 예를 들어, DNA를 다음과 같이 열순환기에서 30 ∼ 35 회 증폭 순환시킬 수 있다. 즉, 95℃ 에서 30초, 52℃ ∼ 60℃ 에서 1 분, 및 72℃ 에서 1 분 그리고 최종적으로는 72℃에서 5분 동안 증폭시킨다. 다른 실시예에 있어서, DNA 는 변성 온도인 95℃에서 30초 동안 35회의 중합효소 연쇄 반응 순환을 열순환기내에서 수행시킨후, 54℃ ∼ 58℃ 사이의 온도 범위에서 1 분 동안 어닐링시키고, 다시 70℃ 에서 1 분 동안 증폭시키며, 최종적으로 70℃ 에서 증폭시키게 된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는데에 사용되는 프라이머는, 상기 프라이머가 목적 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화될 수 있는 한, 종래의 포스포트리에스테르 및 포스포디에스테르 방법 또는 이를 자동화시킨 방법과 같은 임의의 적당한 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 변형된 고체 지지체상에서 올리고뉴클레오티드를 합성하는 하나의 방법에 관해서는 미국 특허 제4,458,066호에 기술되어 있다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 완충액 및 뉴클레오티드 조성물을 포함하는, 여러가지 요인에 의해서 좌우될 것이다. 프라이머는 증폭 유도 제제의 존재하에서 증폭 생성물의 합성을 프라이밍시켜야 한다.

본 발명의 방법에 의하여 사용되는 프라이머는 증폭될 뉴클레오티드 서열의 각각의 사슬에 상보적이다. "상보적"이란 용어는 중합시킬 수 있는 제제가 존재하는 조건하에서, 프라이머들이 이들 각각의 사슬과 하이브리드화되어야 하는 것을 의미한다. 다시 말하면, 인접하는 서열에 상보적인 프라이머들은 인접 서열들과 하이브리드화되어 뉴클레오티드 서열을 증폭시키게 된다. 증폭되는 프라이머의 3' 말단은 상보적인 인접 사슬과 상보성을 보유하여 완벽하게 염기쌍을 형성하는 것이 바람직하다.

당업자는 표적 핵산의 사본수를 증가시키는 데에도 사용할 수 있는 다양한 증폭 방법에 관하여 알 수 있을 것이다. 본 발명의 방법에서 검출된 폴리뉴클레오티드는, 용액내에서 또는 고체 지지체상에 결합된 이후, 다른 중합효소 연쇄 반응, 올리고머 제한 방법[참조: Saiki 등의 문헌,Bio/Technology3:1008-1012 (1985)], 대립 형질 특이적 올리고뉴클레오티드(ASO) 프로브 분석법[참조: Conner 등의 문헌,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 80:278 (1983)], 올리고뉴클레오티드 결찰 분석법(OLAs)참조: Landegren 등의 문헌,Science241:1077 (1988)], RNAse 보호 분석법등과 같은 특정 핵산 서열의 검출법에 일반적으로 적용되는 임의의 방법으로 추가로 평가, 검출, 클로닝, 서열결정등을 수행할 수 있다. DNA 분석을 위한 분자 생물학적 기술에 관한 논의가 이루어지고 있다[참조: Landegren 등, Science, 242:229-237 (1988)]. DNA를 증폭시킨 이후, 상기 반응 생성물은 방사성 프로브를 사용하지 않고, 서던 블롯 분석법으로 검출할 수 있다. 이 방법에서, 예를 들어 조직 또는 피험자로부터 얻은 폴리뉴클레오티드를 함유하는 소량의 DNA 샘플을 증폭시켜, 서던 블롯 기술로 분석할 수 있다. 비방사성 프로브 또는 표지의 사용 방법은 고수준의 증폭된 신호에 의하여 촉진된다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 하나의 뉴클레오시드 트리포스페이트는 방사성으로 표지되며, 이로써 방사선 사진술을 통하여 직접 눈으로 증폭 여부를 확인할 수 있다. 다른 구체예에서, 증폭 프라이머는 형광에 의하여 표지되어 전기영동 시스템상에서 이동하게 된다. 증폭된 생성물은 방사성 신호에 의하지 않고도, 레이저 검출법을 수행한 이후 컴퓨터 보조 그래픽 디스플레이에 의하여 시각적으로 확인할 수 있다.

분리된 생성물을 함유하는 겔의 단순 시각화는 피부염 반응의 존재 또는 심각성을 결정하는데에 사용할 수 있다. 예를 들어, 분리된 폴리뉴클레오티드를 시각화하는 겔을 염색하는 방법들 중 다수의 방법들은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 그러나, 예를 들어 스캐닝 농도계, 컴퓨터 보조 스캐닝 및 정량법 등과 같이, 당업자에게 공지된 기타의 방법들을 사용할 수도 있다.

그러므로, 전술한 바와 같은 방법들은 자극성 또는 알레르기성 반응과 같은 피부염을 보유할 것으로 예측되는 피험자로부터 조직 샘플을 비침입성으로 얻고, 상기 샘플로부터 폴리뉴클레오티드를 분리하는데에 사용할 수 있다. 이어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 전술한 방법과 같은 방법(이에 한정되는 것은 아님)으로 분석할 수 있다. 임의의 수의 시토킨 수준은 얻어진 샘플내에서 이들의 상대적인 발현량을 측정하고 이들 수준을 정상적인 표준 샘플의 경우와 비교함으로써 정량화할 수 있다. 예를 들어, 세포 변형시 mRNA 수준은 피부의 단백질이 생성될 경우, 증가하거나 또는 감소한다. 그러므로, RNA, 특히 mRNA의 측정값에 의하여 피부에서 발생하는 염증성 반응 또는 국소 또는 전신 반응의 결과와 같은 증상들을 모니터할 수 있다. 본 발명의 비침입성 기술이 피부, 더욱 구체적으로 피부의 각질층 하부에 생물학적 인자가 존재하는 경우, 임의의 반응, 질환 또는 질병을 검출할 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 발명자들은 시토킨 IL-4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 수준이 정상 피부 또는 ICD 병변으로부터 얻은 피부의 경우보다 알레르기성 접촉성 피부염(ACD) 병변으로부터 얻은 피부의 경우가 더욱 높다는 사실을 발견하였다. 더욱이, 본 발명자들은 IL-13을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 농도는 정상 피부 또는 ICD 병변으로부터 얻은 피부의 경우보다 ACD 피부의 경우가 더욱 높다는 사실을 발견하였다. 이와는 대조적으로, IL-8을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 수준은 정상적인 피부의 경우에 비하여 ACD 및 ICD 모두의 경우에서 더욱 높았다. 그러므로, IL-8 폴리뉴클레오티드의 높은 수준은 일반적인 접촉성 피부염을 진단학적으로 검출하는데에 활용될 수 있다. 본 발명의 방법을 사용함으로써, 정상적인 표준 샘플과 비교하였을때 시토킨을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 수준을 측정하여 반응의 심각성을 정량화할 수 있다.

피부염 반응들을 구별하기 위하여 시토킨을 검출하는 방법은 임의로 시토킨 폴리펩티드를 검출하는 방법을 이용할 수도 있다. 세포내에서 시토킨 폴리펩티드를 검출하는 방법은 피부염 반응을 보유할 것으로 예측되는 피험자로부터 얻은 특정 시토킨, 예를 들어 IL-4, IL-8 및/또는 IL-13의 수준을 측정함으로써 반응을 구별하는데에 유용하다. 유사한 조직에서 정상적이거나 또는 표준적인 시토킨 폴리펩티드의 프로필과 비교했을때, 이러한 시토킨의 수준은 반응의 징후가 된다. 따라서, 시토킨 폴리펩티드의 발현 패턴은 피부염 반응의 유형 및 정도에 따라서 상이할 것이다. 이러한 점에서, 본원에 기술된 바와 같이 얻어진 샘플은 폴리펩티드를 분리하기 위한 공급원으로서 사용될 수 있다. 특정 폴리펩티드, 예를 들어 IL-4는 ACD를 확인하는 방법으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 전술한 바와 같은 방법을 사용하는 피부 스크랩 또는 피부 스트립을 수행한 이후, 각질층으로부터 분리한 세포들, 및 상기 세포들로부터 얻어진 폴리펩티드들은 여러가지 방법을 통하여 용해시킬 수 있다. 이후 이들 폴리펩티드는 예를 들어, ELISA와 같은 당 업계의 공지된 방법을 통하여 정량화할 수 있다.

피부염과 같은 질환과 관련된 폴리펩티드를 검출하기 위한, 예를 들어 IL-4, IL-8, IL-13 등과 같은, 특정 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체는 액체상에서의 , 또는 고체상 담체와 결합하는, 면역 분석법에서 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 면역 분석법의 모노클로날 항체들은 다양한 방식으로 검출 가능하도록 표지될 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 이용할 수 있는 면역 분석법의 유형의 예로는 직접 방식 또는 간접 방식의 경쟁적 및 비경쟁적 면역 분석법이 있다. 이러한 면역 분석법의 예로서는 방사성 면역분석법(RIA) 및 샌드위치(면역 측정) 분석법이 있다. 본 발명의 모노클로날 항체들을 사용하여 폴리펩티드 항원들을 검출하는 방법은 생리적 샘플상에 대한 면역 조직화학적 분석법을 포함하는, 전방향, 역방향 또는 동시 수행 방식으로 수행되는 면역분석법으로 수행할 수 있다. 당업자는 엄격한 실험적 제한을 가하지 않고서도 다른 면역분석법을 수행할 수 있다는 사실을 알 수 있으며, 이를 용이하게 구분할 수 있을 것이다. 더욱이, 목적 시토킨에 대해 시판중인 항체들이 다수 존재한다.

"면역분석법" 또는 "샌드위치 면역분석법" 이란 용어에는 동시 수행 샌드위치, 전방향 샌드위치 및 역방향 샌드위치 면역분석법을 포함한다. 상기 용어들은 당 업자에게는 잘 알려져 있는 것이다. 숙련자들은 또한 본 발명에 의한 항체들이 이미 공지되어 있거나 또는 장래에 개발될 수 있는 분석법 및 그의 변형 방법에 유용할 것이라는 사실을 알 수 있을 것이다. 이것들은 본 발명의 범위내에 포함될 것이다.

모노클로날 항체는 다수의 상이한 담체와 결합할 수 있고, 시토킨 폴리펩티드의 존재를 검출하는데 사용할 수 있다. 널리 공지된 담체들로는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라아제, 천연 및 변형 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 아가로즈 및 자철광을 포함한다. 본 발명의 목적을 위한 상기 담체의 성질은 가용성이거나 또는 불용성일 수 있다. 당업자는 모노클로날 항체 를 결합하기 위한 기타 적당한 담체, 또는 이러한 담체들을 통상의 실험에 사용하는 방법을 알 수 있을 것이다.

시토킨 폴리펩티드가 생물학적 유체 및 조직내에 존재하는 경우, 이는 모노클로날 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 검출 가능한 양의 시토킨을 함유하는 임의의 샘플을 사용할 수 있다. 샘플은 혈액, 혈청등과 같은 액체, 또는 조직, 피부 샘플과 같은 고체 또는 반고체, 또는 임의로 조직학적 진단 방법에 일반적으로 사용되는 것과 같은 고체 조직일 수 있다.

분석시 항온처리 배지(통상 표지된 가용성 항체가 첨가됨)는 임의의 "차단제(blocker)"를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 "차단제"는 실험 샘플내에 존재하는 비특이적 단백질, 단백질 분해효소, 또는 항 시토킨 면역 글로블린에 대한 항 이종 친화성 면역 글로블린이 고형 지지체상의 항체들, 또는 방사성 표지된 지표 항체를 가교 결합시키지 않거나 또는 이들 항체들을 파괴시키지 않도록하여 가양성(false positive) 또는 가음성(false negative) 결과를 얻을 수 있도록하기 위해 첨가한다. 따라서, "차단제"의 선택이 상기 분석법의 특이성에 실질적으로 부가될 수 있다.

상기 분석법에 사용된 다수의 동일군 또는 하위군(이소타입)의 비상관성(즉, 비특이적) 항체(예를 들어, IgG1, IgG2a, IgM 등)들이 "차단제"로서 사용될 수 있다는 사실을 확인하였다. 표본내에서 교차 반응성 단백질을 상호 발생시킴으로써 임의의 원하지않는 간섭을 억제하는 적절한 감수성을 유지시키기 위해, 상기 "차단제"의 농도(일반적으로 1∼ 100 ㎍/㎕)가 중요할 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 단단한 표면, 접착성 테이프 또는 상기 모두와 피부 샘플내 핵산을 보존하는데에 적당한 세포 용해 완충액을 포함하는 군으로부터 선택된 세포 수집 장치를 포함하는, 피부로부터 비침입성으로 샘플을 얻는 키트를 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 세포 수집 장치, 세포 용해 완충액 및 조직내에서 자극성 반응과 알레르기성 반응을 구별하기 위한 mRNA 검출 시약을 제공한다. 상기 키트는, 예를 들어 IL-4 와 같은 시토킨을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머와 같은 폴리뉴클레오티드 검출 시약을 포함한다. 이러한 키트는 또한 바이알, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기로 이루어진 조밀한 구획의 형태로 수용하도록 구획화된 운반 수단을 포함하며, 여기서 상기 각각의 용기는 본 발명에 사용될 독립적인 요소들을 포함한다. 제2의 용기가 존재할 경우, 상기 제2의 용기는 용해 완충액을 포함할 수 있다. 임의로 상기 키트는 전류에 의하여 세포를 용해시킬 컴퓨터형의 칩을 포함한다.

상기 키트는 또한 표지될 수 있거나 또는 표지될 수 없는 표적 핵산 서열의증폭 또는 이에 대한 하이브리드화를 위한 뉴클레오티드를 포함하는 용기, 또는 효소, 형광 분자, 또는 방사성 핵종 표지와 같은 리포터 분자에 결합된 비오틴 결합 단백질, 예를 들어 아비딘 또는 스트렙타비딘과 같은 리포터를 보유할 수도 있다. "검출 가능하도록 표지된 데옥시리보뉴클레오티드"란 데옥시리보뉴클레오티드를 확인하는 방법을 의미한다. 예를 들어, 검출 가능한 표지는 소분자가 특성 규명이 잘된 더욱 큰 분자에 의하여 인지되는 경우, 방사성 표지된 핵종 또는 상기 핵종에 공유적으로 결합되는 소분자일 수 있다. 이러한 소분자들로는 아비딘에 의하여 결합되는 비오틴, 항 티록신 항체에 의하여 결합되는 티록신을 들 수 있다. 효소, 형광성 화합물, 화학 발광성 화합물, 인광성 화합물 및 생체 발광 화합물을 포함하는 기타 표지 수단들은 당업자에게 공지되어 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 화합물의 스크리닝 방법 또는 피부염을 유발시킬 수 있는 화합물의 확인 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, 케라틴 세포, 멜라닌 세포를 포함하는 표피 세포와 같은 피부 세포, 또는 섬유 아세포와 같은 피부 세포들은 피부염 반응을 유발시키는 조건하에서 시험 화합물과 접촉시킨다. 접촉을 수행하는 조건은 다양하여 화합물 유형, 시험할 피부내 세포 유형과 양, 시험할 샘플내 화합물의 농도 및 화합물에의 노출 시간에 따라서 달라질 수 있다. 화합물이 피부염을 일으킬 수 있는 적당한 조건을 결정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 만일의 경우 통상적인 실험을 필요로 할 수도 있다. 예를 들어 스크랩핑 또는 테이프 스트립핑 방법과 같은, 세포들을 시험관내에서 시험 화합물에 노출시킬 수 있는 기술들을 사용하여 피부 세포를 분리할 수 있다. 이와는 달리, 배양된 피부 세포 또는 피부 구성물을 사용할 수 있다. 예를 들어, 피부 세포들은 이들이 충분히 융합성으로 될때까지 표준 세포 배양 조건하에서 임의의 공급원으로부터, 고체 또는 반고체지짖체 상에서 배양할 수 있다. 상기 세포들이 융합성으로 되거나 또는 거의 융합성으로 되었을때, 상기 세포들을 시험 화합물에 노출시킨다. 이어서, 상기 시험 화합물에 노출시킨 세포로부터 폴리뉴클레오티드를 분리하고, 상기한 바와 같이 정량화한다. 예를 들어, 상기한 테이프 스트립핑 또는 스크랩핑 방법으로 세포를 분리하고, mRNA를 분리할 수 있으나, 이러한 방법으로 한정되는 것은 아니다. 이어서, 상기 mRNA는 특정 시토킨에 대한 프로브를 사용하여 정량화한다. 다른 방법으로, 상기 mRNA는 RT-PCR을 먼저 수행한 다음, 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있다. 전술한 바와 같이, 시토킨을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 정량화는 피부염의 징후가 되는데, 예를 들어 표준 샘플샘플교하여 IL-4가 증가하는 것은 ACD의 징후가 되며, IL-4 또는 IL-13이 증가하지 않고 IL-8이 증가하는 것은 ICD의 징후징후다.

본 발명의 범위는 이하에 제시된 특정 실시예에 의하여 제한되지는 않으며, 이하의 실시예들은 본 발명의 각각의 측면을 예시하는 것이 불과하고, 기능적으로 균등한 방법과 구성 요소들은 본 발명의 범위내에 포함된다.

실시예 1

각질 하층 세포의 비침입성 회수

A. 단단한 표면을 이용한 회수

피부 세포는 멸균 15호 메스를 이용하여 피부를 벗겨내어 비침입성으로 회수하였다. 상기 메스는 수평으로부터 약 15°로 유지하고, 약 1 x 1 cm 크기의 피부를 반복하여 그러나 부드럽게 벗겨냈다. 표피 세포는 멸균 조직 배양 웰의 내벽에 칼날을 문지르는 방법으로 상기 웰로 이전하였다. 반짝이는 내피층에 도달하면, 출혈이 생기기 전에 벗기는 작업을 중단하여 긁어모은 세포가 혈액으로 오염되는 것을 예방하였다. 이 세포들은 멸균 1 cm 페트리접시에 침착시키고, 용해 완충액 약 300 ml를 상기 배양 웰에 첨가하였다. 상기 용해 완충액은 내피 세포가 완전히 용해될 때까지 피펫으로 끌어올렸다 내렸다를 반복하였다.

RNA 용해 완충액은 벗겨내기 시작한지 10분 내에 첨가하였다. 상기 멸균 조직 배양 웰은 드라이 아이스상에서 유지하였다. 상기 세포들을 RNA 용해 완충액에 용해시키고, RNAse를 함유하지 않은 원심분리 튜브에 이전하고, 전체 RNA를 추출하였다.

B. 접착 표면을 이용한 회수

피부 세포는 덕트 테이프(333 덕트 테이프, 내슈아 테이프 프로덕츠), 스카치(등록상표) 테이프(3엠 스카치(등록상표) 810, 세인트폴 미네소타) 또는 디-스쿠암(등록상표)(쿠뎀, 달라스 텍사스)를 이용하여 비침입성으로 회수하였다. 피부는 최대 25회까지 벗겨냈다. 또한, 테이프의 접착력이 강할수록, 스트립핑 횟수가 감소된다는 사실을 확인할 수 있었다. 피부 세포는 용해 완충액을 함유하고, RNAse는 함유하지 않는 에펜도르프 튜브 내에서 상기 테이프를 교반하고, 원심분리하여 회수하였다. 단일 피부 부위에서 사용한 각 테이프 조각에 대해 동일한 용해 완충액을 사용하였다. 전체 과정은 90분 미만 동안 수행하였다. 테이프 스트립핑 방법 자체는 과정이 개시된후 처음 몇 시간 동안 피부 시토킨 프로필에 영향을 미치지 않았다. 또한, 스트립핑후 초기 몇시간 동안은 순환계에서 진피 또는 표피로 이동하는 염증성 세포는 없었다.

상기 테이프를 0.5 ml내의 트리리에이전트(몰레큘라 리서치 센터, 인크., 신시네티, 오하이오) 내에서 강하게 교반하여 상기 스트립에 부착되어 있는 세포로부터 RNA를 즉시 추출하였다. 이어서, 전체 RNA를 제조자의 지시에 따라 분리 및 정제하기 전에 담체 RNA로서 효모 전이 RNA(4 ㎍)를 첨가하였다. 각각의 샘플로부터 분리된 전체 RNA는 OD값 측정에 의해 RNA의 양을 측정하지 않고 RNAse 보호 분석법(리보퀀트(등록상표) 다중프로브 RNAse 보호 분석 시스템, 파밍겐, 인크., 샌디에고, 캘리포니아)에 사용하였다. 분석은 표준 아크릴아미드 서열결정 겔 상에서 샘플을 이용하여 수행하였으며, 분해된 시토킨 메세지를 확인하기 위해 실시하였다. 분해된 RNA 밴드를 함유하는 겔은 포스포 스크린(몰레큘라 다이나믹스, 인크., 서니베일, 캘리포니아)에 일차로 노출시켰다. 이어서, 노출된 스크린은 포스포이메져 스톰 860(몰레큘라 다이나믹스, 인크.)을 이용하여 스캐닝하였다. 각각의 샘플에서 밴드의 강도는 이미지퀀트TM(몰레큘라 사이나믹스, 인크.) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

샘플의 RNAse 오염을 예방하기 위해 적합한 조치를 취해야만 하는데, 그 이유는 피부는 손상된 표피 세포로부터 방출된 RNA를 신속하게 분리할 수 있는 RNAse가 풍부하기 때문이다. 본 명세서에 기술한 샘플 수집 및 추출 기법으로 예시되는바와 같이, 실제로 피부 RNA는, RPA에 의한 mRNA를 검출할 수 있는 능력으로 확인할 수 있는 바와 같이, 현저한 분해없이 얻을 수 있다.

실시예 2

테이프 스트립핑으로 얻은 세포의 분석

증류수중의 0.5% 나트륨 라우릴 설페이트(SLS)를 상박에 72시간 동안 도포하여 자극성 접촉성 피부염(ICD)을 유발시켰다. 노출후, 홍반은 표준 평가 방법(참조: Fisher's Contact Dermatitis. 4th ed. Rietschel, R.L. 및 Fowler, J. F. Jr. eds. Williams & Wilkins, Baltimore, p 29, 1995)에 따라 등급별로 분류하였다. 아세톤중의 디부틸 스쿠아레이트를 폐색하에서 동일한 피험자의 상박에 48시간 동안 도포하여 알레르기성 접촉성 피부염(ACD)을 유발시켰다. 동일한 피험자(피험자 #1)의 상박에 대해 테이프 스트립핑 과정을 12회 실시하였으며, 실시예 2에 기술한 바와 같이 처리하였다.

도 1에서 1 레인은 스쿠아레이트에 의해 유발된 피부의 ACD 홍반 부위로부터 분리된 RNA를 나타내며, 임상적으로 3+ 홍반이라 평가하였다. 3 레인은 0.5% SLS에 노출시킨후에 유발된 ICD 홍반성 피부로부터 분리된 RNA를 나타내며, 임상적으로 2+ 홍반이라 평가하였다. X-선 필름의 노출후, 시토킨 IL-4에 대한 밴드는 1 레인에서 명확히 확인할 수 있었으나, ICD 세포로부터 분리한 RNA를 함유하는 3 레인에서는 확인할 수 없었다. 따라서, ACD 반응에서의 시토킨 패턴은 2 레인에서 나타나는 바와 같이 ICD 반응 및 정상적인 피부에서의 그것과는 명백히 상이하였다. 후속 실험에서, 피부염이 있는 모든 피험자는 ACD 반응을 나타내는 부위의 피부로부터취한 세포내에 시토킨 IL-4를 암호화하는 mRNA를 보유하였다(도 2의 8, 11 및 13 레인). 대조적으로, 동일한 피험자로부터 얻은 ICD 처리한 부위에서 얻은 피부 샘플 또는 정상 피부 샘플에서는 IL-4는 확인되지 않았다. 또한, 5명의 피험자중 4명(도 2의 피험자 2, 3, 4 및 5)에서는, 피부의 홍반 부위에 IL-8이 존재하였는데, 이는 접촉성 또는 알레르기성 반응에 의해 유발된 홍반에서 확인되었으나, 정상 피부로부터 얻은 RNA 내에서는 확인되지 않았다. 따라서, IL-8 mRNA는 피부염의 일반적인 징후였다.

활성화된 T 세포에 의해 분비되는 시토킨인 IL-13을 암호화하는 mRNA는 알레르기성 염증이 스쿠아레이트에 의해 유발된 피부의 4개의 홍반 부위중 3개의 부위에 존재하였다. 근접한 부위(들)에서 확인할 수 있는 희미한 밴드는 감마 인터페론(IFN-γ)과 관련된 분자량을 갖는 mRNA를 함유할 것으로 생각된다(도 2의 8 및 11 레인). 이들 밴드는 5개의 스쿠아레이트(ACD) 처리한 피부 샘플중 2개의 피부 샘플에서 추출한 mRNA 내에 존재하였다. IL-13의 경우에서와 같이, IFN-γ mRNA에 대한 불확실한 밴드는 IL-4에 대한 mRNA도 보유하는 동일한 레인에서 확인되었다.

B 세포 성장 인자인 IL-14는 스쿠아레이트 처리한 피부 샘플중 일부와 SLS 처리한 피부 샘플중 일부에 존재하였다(도 2). 다기능성 시토킨인 IL-9는 본 실험에서 육안 관찰할 수 있는 13개의 샘플 모두에서 검출되었다. 또한, 산화 질소 신타제의 유도성 동형체(iNOS)와 IL-9에 대한 mRNA는 명백하게 육안 관찰할 수 있는 모든 레인에서 확인되었다(15개의 샘플중 13개)(도 2).

IL-13과 같이 동일한 레인에서 IL-4의 존재로부터 명백히 확인할 수 있는 것은 이들 2개의 시토킨 제조자가 이러한 샘플을 얻은 피부에서 알레르기 반응에 의해 유도된다는 것이다.

여러가지 피부 반응에서 관찰되는 홍반의 임상적인 정량화는 표 1 및 표 2에 나타냈다.

ACD 반응

피험자	피부 반응	IL-4	IL-8	IL-9	IL-13	iNOS	IFN-γ
#1	0	검출되지않음	검출되지 않음	+	검출되지 않음	+	검출되지 않음
#2	2+	+	+	시험하지 않음	시험하지 않음	시험하지 않음	시험하지 않음
#3	2+	+	+	+	+	+	+
#4	2+	+	+	겔 판독 불능	+	겔 판독 불능	+
#5	2+	+	+	+	+	+	+

2+ = 보통 홍반(적색)

ICD 반응

피험자	피부 반응	IL-4	IL-8	IL-9	IL-13	iNOS	IFN-γ
#1	0	검출되지 않음	검출되지 않음	+	검출되지 않음	+	검출되지 않음
#2	2+	+	+	시험하지 않음	시험하지 않음	시험하지 않음	시험하지 않음
#3	1+	검출되지 않음	+	+	+	+	검출되지 않음
#4	1+(낮음)	검출되지 않음	검출되지 않음	+	검출되지 않음	검출되지 않음	검출되지 않음
#5	3+	겔 판독 불능	+	겔 판독 불능	겔 판독 불능	겔 판독 불능	겔 판독 불능

1+ = 가벼운 홍반(분홍색)

2+ = 보통 홍반(적색)

3+ = 강한 홍반(진한 적색)

실시예 3

피험자 # 3 - 5에서 시토킨과 염증의 정도 사이의 관계를 더 규명하기 위해, IL-4, IL-8 및 IL-13 RNA 수준을 상응하는 가계 유전자 수준으로 표준화하였다(표 3). 분석한 3명의 환자중에서, RNA 수준과 반응의 중함간에는 관계가 있었다. 표 2의 자료로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 가장 강한 피부 반응으로부터 취한 샘플은 ACD 반응에서 IL-8의 상대적인 양이 가장 큰 샘플이었다. 예를 들어, ACD 부위에서 2+ 반응 및 ICD 부위에서 단지 약한(낮은 +1) 반응을 가진 피험자 #4는, 상기한 RPA 방법을 이용하여 ICD 반응과 ACD 반응을 비교하는 경우, IL-8/GAPDH 비에서 약 2배의 차이를 나타냈다. 또한, 겔 상에 IL-4에 대한 밴드가 존재하고, IL-4/GAPDH 값이 약 0.001 이상이 경우, ACD 반응임을 예상할 수 있다. 또한, IL-13/GAPDH 값이 약 0.13 이상인 IL-13 밴드가 존재하는 경우, ACD 반응임을 확인할 수 있다(표 3).

		반응 타입
피험자		ICD	ACD
	IL-4/GAPDH	계산하지 않음	계산하지 않음
3	IL-8/GAPDH	0.3495	0.8867
	iNOS/GAPDH	0.2202	0.2652
	IL-13/GAPDH	0.070	0.251

	IL-4/GAPDH	0	0.01559
4	IL-8/GAPDH	0.2879	0.61080
	iNOS/GAPDH	0.07107	0.2661
	IL-13/GAPDH	0.117	0.134

	IL-4/GAPDH	0	0.07255
5	IL-8/GAPDH	0.2541	1.3023
	iNOS/GAPDH	0.05315	0.1951
	IL-13/GAPDH	0.055	0.158

이상과 같이, 본 발명의 다수의 구체예를 기술하였다. 그러나, 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않는 다양한 변형이 가능할 것이다. 따라서, 다른 구체예는 후술하는 특허청구의 범위에 포함될 것이다.

Claims

(a) 세포 표면을 노출시켜 각질층을 제거하는 단계; 및

(b) 노출된 세포 표면으로부터 생물학적 인자를 추출하는 단계

를 포함하는, 피험자의 피부 각질층 하부 세포로부터 생물학적 인자를 수득하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 각질층 제거를 위해 (a) 각질층을 연마하는 방법; 및 (b) 접착성 표면과 각질층을 접촉시키는 방법으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법을 이용하는 방법.
제1항에 있어서, 노출된 세포 표면으로부터 생물학적 인자를 수집하기 위해 (a) 단단한 표면으로 노출된 표면을 스크랩핑하는 방법; 및 (b) 접착성 표면과 노출된 표면을 접촉시키는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 접착성 표면이 접착 테이프를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 생물학적 인자가 폴리뉴클레오티드인 방법.
제5항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 mRNA인 방법.
제6항에 있어서, 상기 mRNA가 시토킨을 암호화하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 mRNA를 정량화하는 단계를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 생물학적 인자가 생물학적 국소 반응과 관련되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 생물학적 인자가 생물학적 전신성 반응과 관련되는 것인 방법.
시토킨을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 수준을 정량화하고, 이 폴리뉴클레오티드 수준으로 피부염이 자극성 접촉성 피부염(ICD)인지, 알레르기성 접촉성 피부염(ACD)인지를 결정하는 단계를 포함하는, 피험자에서 자극성 접촉성 피부염과 알레르기성 접촉성 피부염을 구별하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 RNA 또는 DNA인 방법.
제12항에 있어서, 상기 RNA가 mRNA인 방법.
제11항에 있어서, 상기 피험자가 인간인 방법.
제11항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 피부의 각질층 하부 세포로부터 취한 것이고, (a) 각질층을 제거하는 단계; 및 (b) 각질층의 제거후 노출된 표면으로부터 폴리뉴클레오티드를 수집하는 단계를 더 포함하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 각질층을 제거하기 위해 (a) 각질층을 연마하는 방법; 및 (b) 접착성 표면과 각질층을 접촉시키는 방법으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법을 이용하는 방법.
제15항에 있어서, 각질층 제거후, 노출된 세포 표면으로부터 생물학적 인자를 수집하기 위해 (a) 단단한 표면으로 노출된 표면을 스크랩핑하는 방법; 및 (b) 접착성 표면과 노출된 표면을 접촉시키는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 접착성 표면이 접착 테이프를 포함하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 mRNA가 시토킨에 특이적인 방법.
제19항에 있어서, 상기 시토킨이 IL-4 및 IL-8인 방법.
제20항에 있어서, 임의 반응의 존재 하에서 IL-4의 부재가 ICD의 특징인 방법.
제20항에 있어서, IL-8의 수준 증가가 중증 ICD의 징후인 방법
제19항에 있어서, 상기 시토킨이 IL-4인 방법.
제23항에 있어서, IL-4의 증가가 ACD의 특징인 방법.
제24항에 있어서, IL-4의 수준 증가가 중증 ACD의 징후인 방법.
제11항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 분리하기 전에 임의 인자에 피부를 노출시키는 단계를 더 포함하는 방법.
제26항에 있어서, 상기 인자가 자극제, 항원 및 알레르겐인 방법.
피험자로부터 분리된 세포 중에서 IL-4 및 IL-8로 구성되는 군으로부터 선택되는 시토킨을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 정량화하는 단계를 포함하고, IL-4또는 IL-8의 양을 ICD의 징후로 이용하는 피험자의 ICD를 진단하는 방법.
제28항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 PCR 검출되는 방법.
제28항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 임의의 폴리뉴클레오티드 프로브와의 하이브리드화에 의해 검출되는 방법.
제28항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 RNase 보호 분석법에 의해 검출되는 방법.
제28항에 있어서, 상기 세포가 피부 세포인 방법.
제28항에 있어서, 상기 피험자가 포유동물인 방법.
제33항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
피험자의 세포 중에서 IL-4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 정량화하는 단계를 포함하고, IL-4의 증가된 양을 ACD의 징후로 이용하는 피험자의 ACD를 진단하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 IL-4가 PCR에 의해 검출되는 방법.
제35항에 있어서, 상기 IL-4가 임의의 폴리뉴클레오티드 프로브와의 하이브리드화에 의해 검출되는 방법.
제35항에 있어서, 상기 IL-4가 RNase 보호 분석법에 의해 검출되는 방법.
제35항에 있어서, 상기 세포가 피부 세포인 방법.
제35항에 있어서, 상기 피험자가 포유동물인 방법.
제40항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
피부염을 유발하는 조건하에서 피부염을 일으키는 화합물과 피부의 일정 영역을 접촉시키는 단계; 및 시토킨을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 검출하는 단계를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드의 존재를 피부염의 징후로 이용하는, 피부염을 일으키는 화합물을 확인하는 방법.
제42항에 있어서, 상기 화합물이 알레르겐인 방법.
제42항에 있어서, 상기 화합물이 자극제인 방법.
제42항에 있어서, 상기 피부염이 알레르기성 접촉성 피부염(ACD)인 방법.
제42항에 있어서, 상기 피부염이 자극성 접촉성 피부염(ICD)인 방법.
제42항에 있어서, 상기 피부를 생체 내에서 접촉시키는 방법.
제42항에 있어서, 상기 피부를 시험관 내에서 접촉시키는 방법.
제42항에 있어서, 상기 피부로부터 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계를 더 포함하는 방법.
제49항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 DNA 또는 RNA인 방법.
제50항에 있어서, IL-4를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 정량화하는 단계를 포함하고, IL-4의 양을 ACD의 징후로 이용하는 방법.
제50항에 있어서, 피험자로부터 분리된 세포중에서 IL-4 및 IL-8로 구성되는 군으로부터 선택되는 시토킨을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 정량화하는 단계를더 포함하고, IL-4 또는 IL-8의 양을 ICD의 징후로 이용하는 방법.
제52항에 있어서, IL-4의 부재하에서 IL-8의 증가가 ICD의 징후인 방법.
피험자의 세포 중에서 IL-13을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 정량화하는 단계를 포함하고, IL-13의 증가된 양을 ACD의 징후로 이용하는, 피험자에서 ACD를 진단하는 방법.
제54항에 있어서, 상기 IL-13이 PCR에 의해 검출되는 방법.
제54항에 있어서, 상기 IL-13이 임의의 폴리뉴클레오티드 프로브와의 하이브리드화에 의해 검출되는 방법.
제54항에 있어서, 상기 IL-13이 RNase 보호 분석법에 의해 검출되는 방법.
제54항에 있어서, 상기 세포가 피부 세포인 방법.
제54항에 있어서, 상기 피험자가 포유동물인 방법.
제59항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
단단한 표면 및 접착 테이프로 구성되는 군으로부터 선택되는 세포 수집 장치; 및 폴리뉴클레오티드를 보존하기에 적합한 세포 용해 완충액 또는 폴리뉴클레오티드를 보존하기에 적합한 컴퓨터 칩을 포함하는, 피부로부터 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위한 키트.
제61항에 있어서, mRNA 검출 시약을 더 포함하는 키트.
세포 수집 장치, 세포 용해 장치, mRNA 검출 시약을 포함하는, 자극성 반응과 알레르기성 반응을 구별하기 위한 키트.