JP2002523145A

JP2002523145A - 表皮中の生物学的因子の検出法

Info

Publication number: JP2002523145A
Application number: JP2000565899A
Authority: JP
Inventors: レインス、ローレンス、エー．; モレーン、ヴェラ、ビー．
Original assignee: ダームテックインターナショナル
Priority date: 1998-08-18
Filing date: 1999-08-17
Publication date: 2002-07-30
Anticipated expiration: 2019-08-17
Also published as: KR100689725B1; JP2007029106A; US6720145B2; WO2000010579A1; ATE491462T1; DE69943048D1; IL141481A; US20020150918A1; US20020110824A1; CA2340673C; US20020127573A1; PT1112077E; JP4476488B2; US20020115086A1; US20020110822A1; CA2340673A1; US6949338B2; EP1112077B1; IL194772A; EP1112077A4

Abstract

(57)【要約】皮膚からポリヌクレオチドを取り出すための方法を開示する。このポリヌクレオチドを、皮膚炎の検出のため、および刺激性反応とアレルギー反応とを該ポリヌクレオチドをそれがコードするポリペプチドに従って特徴づけることにより区別するために用いることができる。さらに、皮膚からのサンプルの非侵襲的単離ならびに本明細書で提供された方法で用いるためのキットを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は表皮中の生物学的因子の検出法に関し、その生物学的因子はポリヌク
レオチドもしくはそのポリヌクレオチドでコードされるポリペプチドまたは脂質
であり得る。

【０００２】発明の背景細胞および組織は内因性および外因性の作用物質によって影響を受け、ある作
用物質に対しての応答をメディエートする生物学的活性のカスケードで応答する
。例えば、皮膚は外因性作用物質への暴露の結果生ずる多数の皮膚反応の部位で
ある。また、皮膚は身体で最もアクセスしやすい器官である。このように、皮膚
は、ある特定の反応に伴って生ずる、またはその反応を引き起こすような遺伝子
および遺伝子産物ならびにタンパク質反応の決定に役に立つものである。

【０００３】表皮は、皮膚の最外層である。この層は4つの主要な細胞型を含んでいる。表
皮で最も多数を占める細胞は分化の種々のステージにあるケラチノサイトである
。表皮は、表皮の最下層である基底細胞層にあるこれらの細胞の有糸分裂によっ
てケラチノサイトのプールを維持している。これに対して、表皮の最上層を覆っ
ている層は角質層で、これは正常な皮膚では、有核細胞を含んでいない。ケラチ
ノサイトは、インターロイキン(IL)-1、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10
、IL-12、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を含む多数の
サイトカインを産生する(Kupper, M., 1993, Am. J. Dermatopathol. 11:69-73)
。基底細胞層の上部にはランゲルハンス細胞があり、これは骨髄由来の免疫応答
能のある細胞である。ランゲルハンス細胞はマクロファージとT細胞の特徴を有
し、接触皮膚炎などの皮膚における免疫応答に至る一連のイベントを開始させる
と考えられる。メラノサイトは皮膚における色素産生細胞である。この細胞はま
た、通常は表皮のより深い位置に常在している。表皮の第4の細胞はメルケル細
胞である。

【０００４】表皮の直下には、主として線維芽細胞、リンパ球、肥満細胞、内皮細胞、およ
び神経終末を含んでいる皮膚層がある。線維芽細胞は、皮膚の細胞外マトリック
ス物質および構造タンパク質、例えばコラーゲンなどを貯えている主要な細胞型
である。内皮細胞は皮膚の毛細血管の内腔をコートしており、肥満細胞は皮膚の
炎症反応で遊離されるヒスタミンを含んでいる。

【０００５】皮膚の炎症は広範な外因性作用物質が皮膚に適用されることによって引き起こ
され得る。接触皮膚炎のクラスとしては、刺激性、アレルギー性、光アレルギー
性および光毒性、ならびに不顕性の機作によるものが挙げられる。臨床的には、
反応は実質的に同一で、紅斑、浮腫、および小胞形成を特徴とする湿疹過程の外
観を呈する(Hoefakkerら, 1995, Contact Dermat. 33:258-266; Krasteva, M.,
1993, Int. J. Dermatol. 32:547-560)。接触じんま疹は種々の作用物質の皮膚
への適用に対するものとして起こりうる別の反応で、それは皮膚との接触に対し
て直ちに膨疹が出現することが異なっている。接触反応の機作を分類することは
患者にとって重要である。この分類は、感作後の再暴露にともなって徐々に重篤
な皮膚の炎症に至るアレルギー性または免疫応答の免疫学的な帰結に由来してい
る。例えば、ある作用物質の暴露に対する炎症反応の型を特徴づけることによっ
て、患者および医薬品製造者に、以降の炎症反応を避けるための製品の購入およ
び製品を再デザインする能力を与えることとなる。

【０００６】接触皮膚炎が過去に頻繁に生じていることから、全ての新規局所用医薬品また
はコスメシューティカル(機能性化粧品)についてヒト皮膚での試験の実施を促し
ている。現在では、皮膚への接触が行われるいかなる製品についても、的確に行
われた皮膚安全性試験の蓄積を市場に出す前に行うことが多くの国々で要求され
ている。製品およびその構成成分を用いての皮膚パッチテストによる予測はこの
ような皮膚安全性試験法の柱として行われてきた。この予測的皮膚パッチテスト
の開始以来の主な欠陥は刺激性接触皮膚炎(ICD)とアレルギー性接触皮膚炎(ACD)
とを明確には識別し得ないことである。さらに、パッチテストは紅斑、浮腫、お
よび小胞形成の定性的可視的スコアに依存しており、反応の重症度を定量的に測
定するには不十分である。

【０００７】概要上述の限界を克服することが本発明の1つの目的である。本発明は角質層の下
にある皮膚細胞中の生物学的因子を非侵襲的に検出するための方法を提供する。
生物学的因子の特徴を調べることは、全身的な反応、ならびに接触皮膚炎などの
局所反応を識別するために有用であり、より特定して述べれば、刺激性接触皮膚
炎(ICD)とアレルギー性皮膚炎(ACD)とを識別するために有用である。

【０００８】また別の1実施形態においては、本発明はポリヌクレオチドのサンプルを得る
ための非侵襲的方法を提供し、そのサンプルはその後に行う接触皮膚炎の試験に
用いられる。好ましい1実施形態においては、皮膚の表皮の角質層は硬質表面で
こすり取ることなどによって取り除く。別の好ましい1実施形態においては、表
皮は接着性表面と1回以上接触させる。

【０００９】別の1実施形態においては、本発明は被験体から得た角質層の下にある細胞に
おけるIL-8をコードするポリヌクレオチドを定量することによって、その被験体
がICDであるかを診断する方法を提供するが、ここでIL-13に対してIL-4が相対的
に存在していない状態においてIL-8 mRNAが存在することが、ICDの指標となる。

【００１０】別の1実施形態においては、本発明は被験体から得た角質層の下にある細胞に
おけるIL-4をコードするポリヌクレオチドを定量することによって、その被験体
のACDを診断する方法を提供するが、ここでIL-4 mRNAが存在することがACDの指
標となる。

【００１１】さらに、本発明は被験体の皮膚の角質層の下にある細胞からポリヌクレオチド
を得るための方法であって、角質層を除去して生きた表面を露出させ、その露出
された表面からポリヌクレオチドを採取することを含む方法を提供する。

【００１２】別の1実施形態において、本発明は、被験体の皮膚細胞におけるIL-13をコード
するポリヌクレオチドを定量することを含む、被験体のIL-13の発現を検出する
ことによるACDの診断法であって、IL-13ポリヌクレオチドの量が増大しているこ
とがACDの指標となる方法を提供する。

【００１３】別の1実施形態においては、本発明は硬質表面および接着テープなどの細胞採
取装置、接着テープ、ならびに皮膚サンプル中の核酸の保存に適した細胞溶解バ
ッファーまたはコンピューターチップを含む、皮膚からサンプルを非侵襲的に得
るためのキットを提供する。

【００１４】別の1実施形態においては、本発明は細胞採取装置、細胞溶解バッファー、お
よびハイブリダイゼーション試薬などの検出試薬を含むキットを提供する。

【００１５】さらなる1実施形態においては、本発明は皮膚の1区画を被験化合物と接触させ
、その後にサイトカインまたはサイトカインポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドの存在を検出することによって皮膚炎の原因となる化合物を同定する方
法を提供し、その方法では該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの存在が皮膚
炎の指標となる。この実施形態の方法は、in vivoまたはin vitroで行うことが
でき、そのようなものとしては3次元の器官型皮膚構築物を用いるものを含んで
いる。

【００１６】本発明の1つ以上の実施形態の詳細は付属の図面および下記の説明に示してい
る。本発明のその他の特徴、目的、および利点についてはそれらの説明および図
面から、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。

【００１７】図面の説明図1はある同一の被験体の上腕の3カ所の異なる領域をテープで剥ぎ取ることに
よって得られたRNAでRNaseプロテクションアッセイ(RPA)を行った結果を示すゲ
ルの像を示している。その3カ所のテープ引き剥がしはそれぞれ12回行った。4種
類の異なるRNAプローブ(IL-4、IL-8、L32、GAPDH)を被験体から得たRNAサンプル
にハイブリダイズさせるために用いた。レーン1は皮膚の紅斑の領域から単離さ
れたRNAを示しており、その紅斑はスクアレート(squarate)で誘発させたもの(AC
D)で臨床的には2＋の紅斑と判定されるものである。レーン3に示したものは0.5%
のラウリル硫酸ナトリウム(SLS)で誘発させたICD紅斑部位(2＋のスコアのもの)
から単離されたRNAである。2つのレーンの双方ともIL-8のバンドを示している。
レーン2は、同じ被験体の非炎症性の正常な外観の皮膚から得たサンプルを示し
ている。アレルギー反応から誘導されたサイトカインIL-4の1本のバンドが、レ
ーン1に認められる。

【００１８】図2はさらに4名の上腕の3カ所の異なる領域のテープによる剥ぎ取りによって
得られたRNAを用いて行ったRPAの結果である。このゲル中には6種の異なるRNA (
IL-4、IL-8、IL-9、IL-13、IL-14、および酸化窒素合成酵素のアイソフォーム(i
NOS))と、さらに2つのハウスキーピング遺伝子のためのリボプローブを含有させ
た。「＋」は被験体から集めた皮膚をSLS(図の下部の第2列)またはスクアレート
(図の下部の第3列)のいずれかで処理したことを示すものである。

【００１９】発明の説明本発明は角質層の下の皮膚細胞から、ポリヌクレオチドなどの生物学的因子を
採取するための非侵襲的方法を提供する。これらの生物学的因子の特徴を調べて
被験体中における局所または全身の反応の存在を示すことができる。さらに、本
発明は不顕性のものを含む全ての型の接触皮膚炎を識別する方法を提供する。好
ましい1実施形態においては、本発明は、皮膚から得られた例えばサイトカイン
をコードするポリヌクレオチドなどの生物学的因子を検出することによって、刺
激性反応とアレルギー反応とを識別するための方法に関する。1実施形態におい
ては、核酸を含んでいるサンプルは非侵襲的に得られる。

【００２０】炎症反応はその臨床的症状発現がしばしば類似している。炎症反応を示してい
る患者を適正に治療するためにはその反応の適正な同定がなされねばならない。
「類似の臨床的症状発現」とは2つ以上の反応が全体的に類似の臨床的および/ま
たは組織学的な外観を有していることを意味する。例えば、皮膚の接触皮膚炎は
、皮膚と接触した広範な外因性作用物質からもたらされる可能性のあるものであ
る。接触皮膚炎のクラスとしては、刺激性、アレルギー性、光アレルギー性およ
び光毒性、ならびに不顕性の機作によるものが挙げられる。臨床的には、反応は
実質的に同一で、紅斑、浮腫、および小胞形成を特徴とする湿疹過程の外観を呈
する。ICDとACDの紅斑、浮腫、および小胞形成は見分けることができない。組織
所見ですら、これら2つの過程は非常に小さな相異を示すのみで、しかも反応の
最初の24時間の間にのみ認められる。

【００２１】本明細書で用いている「核酸」、「ポリヌクレオチド」、または「核酸配列」
という用語は、分離した断片の形またはより大きな構築物の構成成分としてのデ
オキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを意味する。本発明
のポリヌクレオチドまたは核酸配列としては、mRNAおよびcDNA配列を含むDNA、R
NAが挙げられる。

【００２２】本明細書で用いている「ポリペプチド」という用語は、分離した断片の形また
はより大きな構築物の構成成分としてのアミノ酸残基のポリマーを意味する。ポ
リペプチドの1例としてはサイトカインまたはその断片をコードするアミノ酸配
列が挙げられる。ポリペプチドは、機能性のタンパク質またはタンパク質の断片
をコードしうる。例えば、IL-4ポリペプチドには、アミノ酸のポリマーからなる
IL-4のタンパク質の完全長の配列ならびにその断片が含まれる。

【００２３】本明細書で用いている「サイトカイン」とは、細胞性の調節または分化におい
て役割を果たしているいかなる因子をも意味する。例えば、サイトカインとして
は、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-13、IL-14を含むイ
ンターロイキン(IL)のファミリーならびにトランスフォーミング増殖因子β(TGF
-β)スーパーファミリーに属する因子、GM-CSF、およびインターフェロンが挙げ
られる。

【００２４】本明細書で用いている「生物学的因子」という用語は、生物活性を有する、ま
たは生物学的な役割を果たす多数の因子を意味する。例えば、生物学的因子とし
ては、DNA、RNA、mRNA、およびcDNAなどのポリヌクレオチド、IL-4、IL-8、およ
びIL-13タンパク質およびそれらの断片などのポリペプチド、ならびにコレステ
ロールなどの脂質、脂肪酸、およびロイコトリエンなどの炎症メディエーター、
プロスタグランディン、およびその他のものが挙げられる。

【００２５】「皮膚」という用語は、1または数層の厚さの、基底層の上に構築された、し
ばしば機械的防護または能動輸送に特化される細胞のシートを含んでなる組織で
ある。好ましい1実施形態においては、皮膚は哺乳動物の皮膚である。より好ま
しい1実施形態においては、皮膚はヒトの皮膚である。ヒトの皮膚の表皮は数種
の異なる皮膚組織層を含む。最も深い層は基底層で、それは柱状細胞からなる。
その上の層は有棘層で、それは多面体細胞からなる。有棘層から押し上げられて
いる細胞は平らになっており、ケラトヒアリン顆粒を合成して顆粒層を形成する
。これらの細胞は外部へと移動するにつれて核を失い、ケラトヒアリン顆粒は張
原線維と融合し一緒になる。このことによって淡明層と呼ばれる透明な層が形成
される。淡明層の細胞は密に詰め込まれている。淡明層から細胞が上昇して行く
につれて、多層状の不透明な鱗屑へと圧縮されるようになる。これらの細胞は全
て平らな細胞残遺物であり、それはケラチンで完全に充填され、核を含む他の内
部構造を全て失っている。これらの鱗屑は表皮の外層である角質層を構成する。
角質層の底部では、細胞は密に詰め込まれており、お互いが強く接着されている
が、その層の上部へ行くほど粗く詰め込まれるようになり、やがては表面で薄片
となってはげ落ちる。

【００２６】「サンプル」という用語は被験体の皮膚に由来するいかなる標品をも意味する
。例えば、上述の非侵襲的方法を用いて得られた細胞のサンプルは、ポリヌクレ
オチド、ポリペプチド、または脂質を単離するために用いることができる。さら
に、本発明の方法はin vitroで、例えば、固形または半固形の支持体、および器
官型の皮膚構築物上で培養した皮膚細胞を用いることができる。そのような場合
には、皮膚細胞はどのようなソースからのものでもよい。任意のin vitroまたは
in vivoの検体から得られた精製または非精製形態の生物学的因子を、その生物
学的因子が目的の因子を含むことを条件として、皮膚炎などの生物活性の検出用
の出発材料として用いることができる。例えば、サンプルは、それが皮膚炎の指
標となるサイトカインなどのポリペプチドをコードする特異的なポリヌクレオチ
ド配列を含有しているか、または含有していることが疑われるものであれば、ポ
リヌクレオチドを検出することによって皮膚炎を検出するために用いることがで
きる。

【００２７】組織からのサンプルは当業界でよく知られている多数の方法のいかなるものに
よっても単離することができる。サンプルを単離するための侵襲的方法には、注
射針を例えば血液サンプリングの際に使用すること、ならびに種々の組織の生検
が挙げられる。これらの方法は侵襲的であるので、死亡率および罹患率が上昇す
る危険性がある。本発明は種々の疾患、障害、または炎症反応の検出、診断、ま
たは予後において生物学的因子を得るためのソースとして用いることのできるサ
ンプルを非侵襲的に得るために有用な方法およびキットを提供する。好ましい1
実施形態においては、本発明は皮膚炎反応を検出するために、生物学的因子例え
ば核酸および/またはポリペプチドなどの単離に用いる皮膚サンプルを得るため
の非侵襲的方法を提供する。この実施形態においては、皮膚の表皮細胞は硬い器
具、例えば滅菌済の#15メスでこすり取られるが、皮膚の表面の層(すなわち角質
層)のみを取り除くことのできる硬い器具であればいずれも用いることができる
ことは理解されるであろう。あるいはまた、皮膚をこすり取る代わりに、皮膚の
表皮層を接着テープ、例えばDuctテープ(333 Duct tape, Nashua tape products
)またはScotch(登録商標)テープ(3M Scotch 810, St Paul, 米国ミネソタ州)を
用いて除去することができる。しかし好ましい方法は、皮膚細胞層を引き剥がす
ためにD-SQUAME(登録商標)(CuDerm, Dallas, 米国テキサス州)を用いることであ
る。この実施形態においては、皮膚をテープで引き剥がし、次いでその引き剥が
された細胞および細胞性物質を次いでメス、テープまたはその他のものから回収
する。例えば、皮膚細胞および細胞性物質を得るために用いたテープを、溶解バ
ッファーを入れた滅菌マイクロ分離管(microfuge tube)に入れて遠心分離するこ
とができる。メスの場合には、細胞および細胞性物質を滅菌ペトリ皿に移し、そ
こにある細胞を全て溶解バッファーで溶解させる。同じ溶解バッファーを、単一
の皮膚部位で用いられたテープの各ピースまたはメスに再使用することができる
。特定の適用法では、皮膚から細胞および細胞性物質を取り除くためにテープ引
き剥がし法はこすり取り法と組み合わせることができる。次いで、得られたサン
プルをさらに例えば、核酸、ポリペプチド、または脂質を単離するために処理す
ることができる。好ましくは、用いられる方法は、測定しようとするポリヌクレ
オチド、ポリペプチド、または脂質レベルに悪影響を及ぼさないものである。本
発明は、迅速で非侵襲的な、mRNAなどのポリヌクレオチドを得るための方法を提
供し、それは皮膚細胞の合成パターンにおける変化を立証するための助けとなる
ものである。テープによる剥ぎ取り工程それ自体はその工程の実施後最初の2-3
時間は皮膚のサイトカインのプロフィールに影響しないことが示されている。本
発明のこすり取りおよび剥ぎ取り法を用いて、遺伝性疾患を含む局所または全身
の疾患、障害、または炎症反応の存在を同定、識別、または診断することができ
る。本発明においては、転写およびポリペプチド合成の誘導に対応する反応、疾
患、または障害のいかなるものも本発明の方法によって検出することができる。

【００２８】ポリヌクレオチドは、溶解した細胞及び細胞性物質から、当業者に周知のいく
つもの手段によって単離できる。例えば、限定はされないが、TriReagent（Mole
cular Research Center, Inc社製、オハイオ州シンシナティー）を含む多数の商
業的製品がポリヌクレオチドの単離に利用できる。次いで、単離されたポリヌク
レオチドは、サイトカインをコードするポリヌクレオチドを含む特定の核酸配列
に対して試験又はアッセイできる。

【００２９】別の実施態様では、ポリペプチドは、当業者に公知の方法によってサンプルか
ら得られる。例えば、本発明の非侵襲的（non-invasive）な方法を用いて得られ
た全細胞調製物は、ポリペプチドを含む。あるいは、ポリペプチドを、予備的な
クロマトグラフィー及びモノクローナル抗体又はポロクローナル抗体を用いるこ
とを含む免疫学的分離を含む従来の手段を用いてさらに単離又は精製することが
できる。次いで、ポリヌクレオチドを特徴解析し、皮膚反応（dermatatic react
ion）の存在を呈示することができる。

【００３０】ある実施態様では、本発明は、サイトカインをコードするポリヌクレオチドを
検出することによって皮膚サンプル中の刺激反応とアレルギー反応とを識別する
方法を提供する。正常又は標準的な組織サンプルに関するある種のサイトカイン
の相対量で、反応タイプ及び／又は反応の重篤度を識別する。

【００３１】現在の臨床試験は、組織中の刺激反応とアレルギー反応を識別することはでき
ないこともあるが、本発明の非侵襲的方法は、それらの相対的サイトカイン発現
プロフィールによってその二つの反応を識別できる。刺激性接触皮膚炎（irrita
nt contact dermatitis）は、サイトカインをコードするポリヌクレオチド又は
サイトカインポリペプチドの存否によってアレルギー性接触皮膚炎と区別できる
。例えば、本発明では、ICD由来の細胞は、用いた方法によるACD障害を有する細
胞由来のポリヌクレオチドと比べて、検出不可能な濃度のIL-4をコードするポリ
ヌクレオチドを有する。それ故、その方法（process）は、例えば、組織から単
離された、DNA、又はメッセンジャーRNA（mRNA）を含むRNAを利用できる。DNA又
はRNAは、1本鎖又は2本鎖であり得る。RNAが得られると、当業界で周知のDNAに
対する鋳型を逆転写するのに最適な酵素及び条件を用いることができる。あるい
は、RNAをRNAseプロテクションアッセイにかけることができる。それぞれの1本
の鎖を含むDNA−RNAハイブリッドを用いることもできる。ポリヌクレオチドの混
合物を利用することもでき、あるいは同一又は異なるプライマーを用いる予備増
幅反応で生成したポリヌクレオチドを用いることもできる。ポリヌクレオチド配
列を増幅すべき場合には、ポリヌクレオチド配列を、より大きな分子の画分とす
ることもでき、又は分離した分子として最初に存在させて、特定配列が完全な核
酸であるようにすることができる。増幅されるべき配列は純粋な形態で最初に存
在する必要はなく；ヒトの全DNA中に含まれているような、複合混合物の微量画
分であってもよい。

【００３２】さらに、RNAがサンプルから得られるポリヌクレオチドであれば、RNAseプロテ
クションアッセイが使用できる。この方法では、標識アンチセンスRNAプローブ
が、サンプル中の相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズする。残ったハイ
ブリダイズしない1本鎖プローブは、リボヌクレアーゼ処理によって分解される
。ハイブリダイズした2本鎖プローブはRNAse消化から保護される。適当な時間の
後、消化反応の生成物を回収し、ゲル上で分析する（例えば、Ausubelら, 分子
生物学の最新プロトコール（CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY）, 4.7.
1節(1987)を参照されたい）。本明細書中で用いる「RNAプローブ」とは、対象と
なるサンプル中のRNAにハイブリダイズできるリボヌクレオチドをいう。当業者
であれば、測定すべきポリヌクレオチドに特異的なRNAseプロテクションアッセ
イを特定し、そして、例えば、プローブ特異性、ハイブリダイゼーション温度、
核酸の量などについて改変できるであろう。さらに、多数の市販キット（例えば
、RiboQuantTM Multi-Probe RNAse Protection Assay System（Pharmingen, Inc
.社製、カリフォルニア州サンディエゴ））を用いることができる。

【００３３】別の実施態様では、サンプル中のポリヌクレオチドをノーザンブロット又はサ
ザンブロットによって分析することができる。この技術では、ポリヌクレオチド
をゲル上で分離し、次いで、目的の配列に相補的ポリヌクレオチドをプローブに
して探索する。例えば、RNAをゲル上で分離し、ニトロセルロースに転写し、目
的の配列に相補的なDNAをプローブにして探索する。相補的プローブは、放射性
標識、科学標識等されている場合もある。プローブのハイブリダイゼーションは
、目的のポリヌクレオチドの存在を示す。

【００３４】サイトカインをコードするポリヌクレオチドの検出は、核酸のサイズ分画など
の標準的方法によって行うことができる。DNA及びRNAのサイズ分画法は、当業者
に周知であり、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を含むゲル電
気泳動などである。例えば、ゲルは変性7 M又は8 M尿素−ポリアクリルアミド−
ホルムアミドゲルであってもよい。核酸のサイズ分画は、当業者に周知のクロマ
トグラフィー方法によって達成されてもよい。

【００３５】ポリヌクレオチドの検出は、任意に放射性標識プローブによって行うことがで
きる。適当なシグナルを与える任意の放射性標識を用いることができる。他の標
識は、リガンド、着色染料、及び蛍光分子を含み、標識リガンドなどの特異的結
合対のメンバーとして作用ことができる。標識調製物は、サザンハイブリダイゼ
ーション法又はノーザンハイブリダイゼーション法（例えば、サンプルから得ら
れたヌクレオチドをポリヌクレオチドが結合するフィルターに転写する）による
ポリヌクレオチドへのプロービングに用いられる。標識ポリヌクレオチドプロー
ブへの暴露によって、標識ポリヌクレオチドプローブは、標的核酸配列を含むヌ
クレオチド断片にハイブリダイズし、放射性プローブの標的核酸断片への結合は
、オートラジオグラフィーによって同定される（遺伝子工学（Genetic Engineer
ing）, 1, Robert Williamson編, Academic Press社 (1981), 72-81頁を参照さ
れたい）。特定のハイブリダイゼーション法は本発明に必須ではない。ハイブリ
ダイゼーション法は、周知であるか、又は当業者には容易に確かめられる。ハイ
ブリダイゼーション法は改良を施されるが、それらは本発明の方法に容易に適用
できる。

【００３６】所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを増幅してから検出するこ
とができる。語句「増幅」とは、たった１つのポリヌクレオチド分子から複数の
核酸のコピーを作成する過程をいう。ポリヌクレオチドの増幅は、当業者に公知
の生化学的工程によってin vitroで行うことができる。増幅試薬は、酵素を含む
プライマー伸長産物の合成を達成するために機能するあらゆる化合物又はシステ
ムであってよい。この目的に適した酵素としては、例えば、大腸菌DNAポリメラ
ーゼI、Taqポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、T4
DNAポリメラーゼ、他の利用可能なDNAポリメラーゼ、ポリメラーゼムテイン、
逆転写酵素、リガーゼ、及び熱安定性酵素（すなわち、変性を起こさせるのに十
分高い温度に付した後にプライマー伸長を行う酵素）が挙げられる。好適な酵素
は、それぞれの突然変異ヌクレオチド鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成す
るのに適切な方法でヌクレオチドの結合を促進するだろう。一般に、合成は各プ
ライマーの3'末端で開始され、合成が終結するまで鋳型鎖に沿って5'方向に進行
し、異なる長さの分子を生成する。それらは、5'末端で合成を開始し、上記と同
じ工程を用いて反対の方向に進行する増幅試薬が存在しうる。いずれの場合も、
本発明の方法は、本明細書中に記載した増幅の態様に限定されない。

【００３７】本発明に用いることができるin vitro増幅の１つの方法は、米国特許第4,683,
202号及び第4,683,195号に記載したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。語句
「ポリメラーゼ連鎖反応」とは、熱安定性DNAポリメラーゼ及び2つのオリゴヌク
レオチドプライマー（一方は増幅されるべき配列の一方の末端で(+)鎖に相補的
であり、他方は他方の末端で(-)鎖に相補的である）を用いるDNA塩基配列の増幅
方法をいう。新たに合成されたDNA鎖は、続いて、同じプライマー配列のさらな
る鋳型となり、プライマーのアニーリング、鎖伸長、及び解離からなる連続的な
繰り返しで、所望の配列の迅速で特異性の高い増幅が得られる。ポリメラーゼ連
鎖反応は、サンプル中のサイトカインをコードするポリヌクレオチドの存在を検
出するのに用いられる。多くのポリメラーゼ連鎖方法は当業者に公知であり、本
発明の方法で用いることができる。例えば、DNAを、以下のようにサーマルサイ
クラー中で30〜35サイクルの増幅にかけることができる：95℃30秒、52℃〜60℃
1分、及び72℃1分、最終伸長ステップでは72℃5分。別の例としては、DNAを、95
℃の変性温度で30秒、次いで、54〜58℃の範囲の可変のアニーリング温度で1分
、伸長ステップ7として0℃1分及び最終伸長ステップとして70℃でのサーマルサ
イクラー中で35サイクルのポリメラーゼ連鎖反応に付すことができる。

【００３８】本発明のポリヌクレオチドを増幅するのに用いるプライマーは、目的のポリヌ
クレオチドにハイブリダイズできさえすれば、従来のリン酸トリエステル法及び
リン酸ジエステル法又はその自動化態様などの任意の好適な方法を用いて調製で
きる。改良された固相支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する１つの方法は、
米国特許第4,458,066号明細書に記載されている。プライマーの的確な長さは、
温度、バッファー、及びヌクレオチド組成を含む多くの因子に依存するだろう。
プライマーは、増幅を誘導する試薬の存在下で伸長産物の合成を開始させなけれ
ばならない。

【００３９】本発明の方法に従って用いられるプライマーは、増幅されるべきヌクレオチド
配列のそれぞれの鎖に相補的である。語句「相補的」は、プライマーが、重合の
ための試薬が機能する条件下でそれらのそれぞれの鎖にハイブリダイズしなけれ
ばならないことを意味する。言い換えれば、隣接する配列に相補的なプライマー
は、その隣接する配列とハイブリダイズし、ヌクレオチド配列を増幅させる。伸
長されるプライマーの3'末端は、相補的な隣接する鎖と完全に塩基対形成する相
補性を有することが好ましい。

【００４０】当業者であれば、標的核酸のコピー数を増加させるのにも利用できる種々の増
幅方法論を知っているであろう。本発明の方法で検出されるポリヌクレオチドは
、別のポリメラーゼ連鎖反応、オリゴマー制限（oligomer restriction）（Saik
iら, Bio/Technology 3:1008-1012 (1985)）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオ
チド（ASO）プローブ分析（Connerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278 (19
83)）、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（OLA）（Landegrenら, Science 241:1
077 (1988)）、RNAseプロテクションアッセイなどの特定核酸配列の検出に通常
適用される任意の方法によって、溶液中又は固体支持体に結合してのいずれかで
、さらに評価、検出、クローニング、配列決定等され得る。DNA分析のための分
子技術は、総説されている（Landegrenら, Science, 242:229-237(1988)）。DNA
増幅に続いて、反応生成物は、放射性プローブを用いることなく、サザンブロッ
ト分析によって検出できる。この方法では、例えば、組織又は被験体（subject
）から得たポリヌクレオチドを含むDNAの少量のサンプルを増幅し、サザンブロ
ット法によって分析する。非放射性プローブ又は標識の使用は、高レベルに増幅
されたシグナルによって促進される。本発明のある実施態様では、１つのヌクレ
オチド三リン酸を放射性標識し、それによってオートラジオグラフィーで増幅産
物の直接視覚的認識を可能にする。別の実施態様では、増幅プライマーは蛍光標
識され、電気泳動システムにかけられる。増幅産物の視覚化は、放射性シグナル
を用いずに、レーザー検知され、次いでコンピューターを使って図示される。

【００４１】分離された生成物を含むゲルの簡単な視覚化を利用して、皮膚炎反応の存在又
は重篤度を測定できる。例えば、分離されたポリヌクレオチドを視覚化するため
のゲルの染色法として、多数の染色が当業者に周知である。しかしながら、当業
者に公知の他の方法（例えば、スキャニング・デンシトメトリー、コンピュータ
ーを使ったスキャニング及び定量など）も用いることができる。

【００４２】すなわち、上記の方法は、刺激性反応又はアレルギー反応などの皮膚炎を有す
ると疑われる被験体から非侵襲的に組織サンプルを得るため及びそのサンプルか
らポリヌクレオチドを単離するのに用いることができる。次いで、ポリヌクレオ
チドは、以下に限定されないが、上記の方法などの方法を用いて分析できる。幾
つものサイトカインのレベルは、得られたサンプル中のそれらの相対的な発現を
測定し、それらの濃度を正常な標準サンプルと比較することによって定量できる
。例えば、皮膚中のタンパク質の製造が増加又は低減されると、細胞中のmRNA濃
度が変化する。従って、RNA、特にmRNAの測定は、皮膚中で、又は局所性又は全
身性応答の結果として起きる炎症反応などのイベントのモニターを提供する。こ
の非侵襲的方法が、生物学的因子が皮膚中、より特定的には皮膚の角質層の下に
存在しさえすれば、任意の反応、障害、又は疾病を検出できることが認識できる
だろう。例えば、本発明者らは、サイトカインIL-4をコードするポリヌクレオチ
ドは、正常皮膚又はICD障害を受けた皮膚よりもアレルギー性接触皮膚炎（ACD）
障害でより高いレベルで検出できることを発見したが、これに限定するわけでは
ない。さらに、本発明者らは、IL-13をコードするポリヌクレオチドが、正常又
はICDの皮膚よりもACDの皮膚でより高濃度であることを発見した。これに対し、
IL-8をコードするポリヌクレオチドは、正常皮膚と比べてACD及びICDの両者でよ
り高レベルである。つまり、IL-8ポリヌクレオチドの高いレベルは、一般的な接
触皮膚炎を検出することにより診断的に用いることができる。本発明の方法を用
いることによって、サイトカインをコードするポリヌクレオチドのレベルを測定
し、正常−標準サンプルと比較して反応の重篤度を決定することができる。

【００４３】皮膚炎反応を識別するためのサイトカインの検出方法は、代わりに、サイトカ
インポリペプチドの検出を用いることができる。細胞中のサイトカインポリペプ
チドの検出方法は、皮膚炎反応を有すると疑われる被験体から得た細胞中の特定
のサイトカイン（例えば、IL-4、IL-8及び／又はIL-13）のレベルを測定するこ
とによる反応の識別に有用である。そのようなサイトカインのレベルは、同種組
織の正常又は標準サイトカインポリペプチドプロフィールと比較することによっ
て、反応の指標となる。従って、サイトカインポリペプチドの発現パターンは、
皮膚炎反応のタイプ及び程度に依存して変動するだろう。これについては、本明
細書中に記載のように、得られたサンプルはポリペプチドを単離するための供給
源として用いることができる。特定のポリペプチド（例えば、IL-4）の測定は、
ACDを同定する方法として役立てることができる。例えば、皮膚のこすり取り（s
craping）又は皮膚の剥ぎ取り（stripping）の後、上記方法を用いて、角質層か
ら単離した細胞を何らかの手段によって溶解し、細胞からポリペプチドを得るこ
とができる。次いで、これらのポリペプチドは、当業者に公知の方法（例えば、
ELISAによって）を用いて定量できる。

【００４４】特定のポリペプチド（例えば、IL-4、IL-8、IL-13など）に対するモノクロー
ナル抗体は、皮膚炎などの障害と関係するポリペプチドを検出するための、液相
中又は固相担体に結合した形でイムノアッセイに用いることができる。さらに、
これらのイムノアッセイ中では、モノクローナル抗体は、種々の方法で検出可能
な標識を付すことができる。本発明のモノクローナル抗体を利用できるイムノア
ッセイのタイプの例にはは、直接的又は間接的方法のいずれかの競合及び非競合
イムノアッセイがある。そのようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセ
イ（RIA）及びサンドイッチ（免疫学的）アッセイである。本発明のモノクロー
ナル抗体を用いるポリペプチド抗原の検出は、順方向（forward）、逆方向（rev
erse）、又は同時様式のいずれかで行われる、生理学的サンプルに関する免疫組
織化学アッセイを含むイムノアッセイを用いて行うことができる。当業者であれ
ば、他のイムノアッセイ方法を知っているか、又は過度の実験をすることなく他
のイムノアッセイ方法を容易に認識できる。さらに、目的のサイトカインに対す
る多数の市販の抗体がある。

【００４５】語句「免疫学的（immunometric）アッセイ」又は「サンドイッチイムノアッセ
イ」は、同時サンドイッチ、順方向サンドイッチ及び逆方向サンドイッチイムノ
アッセイを含む。これらの語句は、当業者であれば十分理解している。当業者で
あれば、本発明による抗体が、現在知られているか又は将来開発されうるアッセ
イの他の変法及び形態においても有用であろうことも十分理解しているだろう。
これらは本発明の範囲内に含まれることを意図する。

【００４６】モノクローナル抗体は、多くの異なる担体に結合でき、サイトカインポリペプ
チドの存在を検出するのに用いることができる。周知の担体の例としては、ガラ
ス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、
アミラーゼ、天然及び改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース並びに
磁鉄鉱が挙げられる。担体の性質は、本発明の目的のためには、可溶性又は不溶
性のいずれであってもよい。当業者であれば、モノクローナル抗体が結合するた
めの他の適当な担体を知っているか、又はそれを日常的な実験を用いて確かめる
ことができるであろう。

【００４７】サイトカインポリペプチドは、生物学的液体及び組織中に存在するときは、モ
ノクローナル抗体によって検出できる。検出可能な量のサイトカインを含む任意
のサンプルを用いることができる。サンプルは、血液、血清等などの液体、又は
組織、皮膚サンプルなどの固体若しくは半固体、あるいは、組織学的診断で一般
に用いられるような固体組織であり得る。

【００４８】アッセイを実行するには、（通常、標識した可溶性抗体が添加されている）イ
ンキュベーション媒体中に、ある種の「ブロッカー」を含ませることが望ましい
。「ブロッカー」は、非特異的タンパク質、プロテアーゼ、又は実験サンプル中
に存在する抗サイトカイン免疫グロブリンに対する抗異種免疫グロブリンは、交
差反応しないか、又は固相支持体上の抗体、若しくは放射性標識指示抗体を破壊
して偽陽性又は偽陰性結果を与えないために添加される。それ故、「ブロッカー
」の選択は、実質的にアッセイの特異性を増加させうる。

【００４９】アッセイで用いられる抗体と同じクラス又はサブクラス（アイソタイプ）（例
えば、IgG1、IgG2a、IgM等）の不適切な（すなわち、非特異的な）抗体を、「ブ
ロッカー」として用いることができることは周知である。適切な感受性を維持す
るが、試料中に相互に生じる交差反応性タンパク質による任意の好ましくない干
渉を抑制するために、「ブロッカー」の濃度（通常1〜100μg/μl）は重要であ
るだろう。

【００５０】別の実施態様では、本発明は、堅い表面、粘着テープ、又はその両方からなる
群から選択される細胞採集デバイス及び皮膚サンプル中の核酸を保護するのに好
適な細胞溶解用バッファーを含む、非侵襲的に皮膚からサンプルを得るためのキ
ットを提供する。別の実施態様では、本発明は、細胞採集デバイス、細胞溶解用
バッファー及び組織中の刺激性反応とアレルギー反応を識別するmRNA検出試薬を
含むキットを提供する。このキットは、ポリヌクレオチド検出試薬（例えば、IL
-4などのサイトカインをコードするポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌク
レオチドプライマー）を含む。このようなキットは、バイアル、チューブなどの
厳重に密封できる1以上の容器中に入れて区分した運搬手段を含んでいてもよく
、その各容器は、この方法で用いられる個々の要素のうちの１つを含む。第２の
容器が存在するならば、それに溶解用バッファーを入れることができる。あるい
は、該キットは、その上で電流を用いて細胞を溶解できるコンピュータータイプ
のチップを含むことができる。

【００５１】キットは、標的核酸配列の増幅又はそれへのハイブリダイゼーションのための
ヌクレオチド(標識されていても標識されていなくてもよい)を含む容器、又はリ
ポーター分子（例えば、酵素、蛍光、又は放射性核種で標識した分子など）に結
合するビオチン結合性タンパク質（例えば、アビジン又はストレプトアビジンな
ど）などのリポーターを含む容器を含んでもよい。語句「検出可能なように標識
したデオキシリボヌクレオチド」とは、デオキシリボヌクレオチドを同定するた
めの手段を指す。例えば、検出可能な標識は、放射性標識ヌクレオチドか、又は
十分に特性のわかっている大きな分子によって認識される小さな分子であって、
ヌクレオチドに共有結合したものであり得る。これらの小さな分子の例は、アビ
チンが結合するビオチン、及び抗チロキシン抗体が結合するチロキシン（甲状腺
ホルモン）である。酵素、蛍光化合物、化学発光化合物、燐光性化合物、及び生
物発光化合物を含む他の標識方法は、当業者に公知である。

【００５２】別の実施態様では、本発明は、皮膚炎の原因となる化合物をスクリーニング又
は同定する方法を提供する。この方法では、皮膚の細胞（例えば、角質細胞及び
メラノサイトを含む表皮細胞、又は線維芽細胞などの真皮細胞など）に、皮膚炎
反応を誘導する条件下で被験化合物を接触させる。接触させる条件は可変的であ
り、化合物のタイプ、試験する皮膚中の細胞のタイプ及び量、試験するサンプル
中の化合物の濃度、並びにその化合物への暴露時間に依存するだろう。ある化合
物が皮膚炎を引き起こす適当な条件を決定する当業界の技術は公知であり、たと
え必要であるとしても、日常的な実験だけであろう。皮膚細胞は、上記の技術（
例えば、こすり取り又はテープによる剥ぎ取り）を用いて単離でき、次いで、細
胞をin vitroで被験化合物に暴露することができる。あるいは、培養された皮膚
細胞又は皮膚構築物を用いることもできる。例えば、皮膚細胞を任意の供給源か
ら得て、十分にコンフルエントになるまで標準的な細胞培養条件下にて固体又は
半固体支持体上で培養してもよい。コンフルエント又はサブコンフルエントにな
ると、細胞を被験化合物に暴露する。次いで、化合物に暴露した細胞からポリヌ
クレオチドを単離して、上記のように定量する。例えば、限定するものではない
が、上記のテープによって、又はこすり取り方法によって、細胞を単離して、mR
NAを単離することができる。次いでこのmRNAを特定のサイトカインに対するプロ
ーブを用いて定量する。あるいは、mRNAをポリヌクレオチドの検出の前にRT-PCR
に供することができる。上記のように、サイトカインをコードするポリヌクレオ
チドの定量は、皮膚炎の指標となり、例えば、標準サンプルと比較してIL-4が増
加していることはACDを示し、IL-4又はIL-13の増加を伴わないIL-8の増加はICD
を示す。

【００５３】本発明は以下に提示する具体的実施例によって範囲を限定されることはなく、
実施例は本発明の個別の態様の１つの例示として意図されており、機能的に同等
な方法及び構成成分は本発明の範囲内に含まれる。

【００５４】実施例１下層角質細胞（sub-stratum corneum cell）の非侵襲的回収 A.硬質表面を用いた回収皮膚細胞は、滅菌したNo. 15外科用メスによって皮膚から削り取ることによっ
て非侵襲的に回収できる。外科用メスは、水平から約15度の角度で持ち、繰り返
し、しかし優しく約1×1 cmのサイズの皮膚の区域を横切って削り取る。滅菌組
織培養ウエルの内壁で刃を擦ることによって表皮細胞をウエルに移す。きらきら
輝く表皮層に達したとき、出血を引き起こす前に削り取りを止め、削り取ったも
のが血液によって汚染されるのを避ける。細胞を滅菌された1 cmのペトリ皿に載
せ、約300 mlの溶解用バッファーを培養用ウェルに添加する。表皮細胞が完全に
溶解するまで、溶解用バッファーをピペットで吸ったり出したりする。

【００５５】削り取りの開始から10分以内にRNA溶解用バッファーを添加する。滅菌組織培
養ウエルをドライアイス上に置いておく。細胞をRNA溶解用バッファー中で溶解
し、RNAseを含まない遠心チューブに移し、全RNAを抽出する。

【００５６】 B. 粘着性表面を用いた回収皮膚細胞は、Ductテープ（333 Duct テープ、Nashua tape products社製）、S
cotch（登録商標）テープ（3M Scotch（登録商標）810、ミネソタ州セントポー
ル）、又はD-SQUAME（登録商標）（CuDerm社製、テキサス州ダラス）を用いて非
侵襲的に回収できる。皮膚を最高25回まで剥ぎ取る。さらに、テープの粘着性が
高ければ高いほど、必要な剥ぎ取りが少ないことが認識されるだろう。皮膚細胞
は、攪拌（vortexing）、及び、続いて溶解用バッファーを含むRNAse不含のエッ
ペンドルフチューブ中でテープを遠心分離することによって回収した。同じ溶解
用バッファーを単一の皮膚部位で用いた各テープ片に再度使用した。全工程は90
分未満で行った。テープ剥ぎ取りプロセス自体は、その工程がなされた後最初の
数時間は皮膚サイトカインプロフィールに影響しない。さらに、剥ぎ取り後早期
の数時間の間、炎症性細胞は血液循環から真皮又は表皮に移動しない。

【００５７】直ちに0.5 mlのTriReagent（Molecular Research Center, Inc.製、オハイオ
州シンシナティー）中でテープを激しく攪拌することによってストリップに付着
した細胞からRNAを抽出した。次いで、担体RNAとして酵母トランスファーRNA（4
μg）を添加した後、全RNAを単離し、製造業者用指示書に従って精製した。各サ
ンプルから単離された全RNAを、前もって光学濃度（OD）測定によるRNA量測定を
行わずにRNAseプロテクションアッセイ（RiboQuant（登録商標）Multiprobe RNA
se Protection Assay System、PharMingen, Inc.製、カリフォルニア州サンディ
エゴ）に用いた。アッセイは、標準アクリルアミドシーケンシングゲル上でサン
プルを用いて行い、消化されたサイトカインのメッセージを同定するために用い
た。消化されたRNAバンドを含むゲルを、最初にPhosphor Screen（Molecular Dy
namics, Inc.社製、カリフォルニア州サニーベール）に暴露した。次いで、暴露
したスクリーンを燐光体イメージャーStorm 860（Molecular Dynamics, Inc.製
）でスキャンした。各サンプル中のバンド強度をソフトウエアImageQuantTM（Mo
lecular Dynamics, Inc.製）によって分析した。

【００５８】皮膚は損傷された表皮細胞から遊離されるRNAを素早く分解できるRNAseの豊富
な供給源なので、サンプルのRNAse汚染を避けるために適切な注意が払われるべ
きである。本明細書中に記載されたサンプル採集及び抽出技術は、RPAによるmRN
Aの検出能力によって示されるような顕著な分解を伴わずに、皮膚RNAが確かに得
られることを示している。

【００５９】実施例２テープ剥ぎ取りによって得られた細胞の分析蒸留水中の0.5％ラウリル硫酸ナトリウム（SLS）を72時間、上腕に適用するこ
とによって、刺激性接触皮膚炎（ICD）を誘導した。この暴露の後、紅斑標準ス
コアリングスケール（フィッシャーの接触皮膚炎（Fisher's Contact Dermatiti
s）, 第4版, Rietschel, R.L.及びFowler, J.F. Jr.編、Williams & Wilkins社
、ボルティモア1995, 29頁）に従ってランク付けした。アセトン中のジブチルス
クワレートを同じ被験体の上腕に48時間閉塞（occlurion）して適用することに
よってアレルギー性接触皮膚炎（ACD）を誘導した。同じ個体（被験体No. 1）の
上腕を12回テープ剥ぎ取りし、上記実施例2で記載したように処理した。

【００６０】図1のレーン1は、スクワレートによって誘導された臨床的に3+紅斑と読める皮
膚のACD紅斑区域から単離されたRNAを示す。レーン3は、0.5％SLSに暴露するこ
とによって誘導された臨床的に2+紅斑と判定されるICD紅斑皮膚由来のRNAである
。Ｘ線フィルムの暴露後、サイトカインIL-4のバンドは、レーン1では明瞭に見
られるが、ICD細胞由来のRNAを含むレーン3には見られない。このように、ACD反
応におけるサイトカインパターンは、ICD反応及びレーン2で見られる正常皮膚と
は異なっていた。

【００６１】その後の実験で、皮膚炎を有する全ての被験体がACD反応を示した区域の皮膚
由来の細胞中のサイトカインIL-4をコードするmRNAを有していた（図2中のレー
ン8、11、13）。それに対して、IL-4は、任意のICD処理された皮膚区域又は同じ
被験体から得られた正常皮膚サンプル中には見られなかった。さらに、5人の被
験体のうちの4人（図2中の被験体2、3、4及び5）で、紅斑が刺激性反応又はアレ
ルギー反応によって誘導された皮膚の紅斑区域中にIL-8が存在したが、正常皮膚
から得られたRNA中には存在しなかった。すなわち、IL-8のmRNAは、皮膚炎の一
般的な指標であった。

【００６２】活性化されたT細胞によって分泌されるサイトカインであるIL-3をコードするm
RNAは、アレルギー性炎症がスクワレートによって誘導された皮膚の4つの紅斑区
域のうちの3つ（図2中のレーン5、8、11、13）に存在した。γインターフェロン
（IFN-γ）に関連する分子量を有するmRNAを含有していると思われる近傍の位置
に、かすかなバンドが見られた（図2中のレーン8及び11）。これらのバンドは、
スクワレート（ACD）処理した5つの皮膚サンプルのうちの2つから抽出されたmRN
A中に存在した。IL-13の場合のように、IL-4のmRNAを有する同じレーンでも、IF
N-γのmRNAと思われるバンドが見られた。

【００６３】 B細胞成長因子であるIL-14は、スクワレート処理した皮膚サンプルの幾つか並
びにSLS処理した皮膚サンプルの幾つかに存在した（図2）。この実験で視覚化で
きた全13サンプルで、多機能性サイトカインであるIL-9が検出された。さらに、
明瞭に視覚化できた全てのレーン（15サンプル中13サンプル）で、一酸化窒素合
成酵素の誘導性アイソフォーム（iNOS）及びIL-9のmRNAが見られた（図2）。

【００６４】 IL-13と同じレーンのIL-4の存在は、これら2つのサイトカインマーカーがサン
プルを得た皮膚中のアレルギー反応によって誘導されることを強く示唆している
。

【００６５】種々の皮膚反応で見られる紅斑の臨床的定量化は、表1及び表2に記されている
。

【００６６】

【表１】 ACD反応 ND；検出されず＊；ゲルの解読不可能であった。 NT；試験せず 2+；中程度の紅斑（赤）

【００６７】

【表２】 ICD反応 ND；検出されず＊；ゲルの解読不可能であった。 NT；試験せず 1+；軽度の紅斑（淡いピンク） 2+；中程度の紅斑（赤） 3+；重度の紅斑（濃い赤）

【００６８】実施例３被験体No. 3〜5でのサイトカインと炎症の程度との間の関係をさらに試験する
ために、IL-4、IL-8及びIL-13のRNAレベルを、対応するハウスキーピング遺伝子
濃度に対して基準化した（表3）。分析した3つの被験体で、RNAレベルと反応の
重篤度の間に相関関係が存在する。表2は、最も強い皮膚反応由来のサンプルも
、ACD反応を有し、IL-8の最大の相対量を示すものであることを示している。例
えば、ACD部位で2+の反応及びICD部位でわずかな（低い+1）反応のみを有する被
験体No. 4は、上記のRPA法を用いてICDとACDとを比較したとき、IL-8／GAPDH比
において約2倍の差を示した。さらに、もしゲル上にIL-4のバンドが存在し、IL-
4／GAPDHの値が約0.001以上であるなら、ACD反応が想定される。また、約0.13以
上のIL-13／GAPDH値を有してIL-13バンドが存在する場合には、ACD反応が確実視
される（表3）。

【００６９】

【表３】 NC；計算せず本発明の多数の実施態様を記載した。しかしながら、本発明の精神及び範囲か
ら離れることなく種々の改変がなされ得ることは理解されるであろう。従って、
他の実施態様は、以下の特許請求の範囲内である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図1はある同一の被験体の上腕の3カ所の異なる領域をテープで剥ぎ取ることに
よって得られたRNAでRNaseプロテクションアッセイ(RPA)を行った結果を示すゲ
ルの像を示している。

【図２】図2はさらに4名の上腕の3カ所の異なる領域のテープによる剥ぎ取りによって
得られたRNAを用いて行ったRPAの結果である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B029 AA09 BB11 HA02 4B063 QA01 QA19 QQ01 QQ02 QQ42 QQ52 QQ53 QR08 QR42 QR56 QR62 QS25 QS34 QS36 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被験体の皮膚の角質層の下にある細胞から生物学的因子を得
るための方法であって； a)角質層を除去して細胞表面を露出させること、および、 b) 露出させた細胞表面から生物学的因子を抽出すること、を含む方法。
【請求項２】角質層の除去に、 a) 角質層を擦過すること、および、 b) 接着性表面を角質層に接触させること、からなる群から選択される方法を用いる請求項1記載の方法。
【請求項３】生物学的因子が、露出された細胞表面から、 a) 硬質表面を用いてその露出された表面をこすり取ること、および、 b) 接着性表面をその露出された表面に接触させること、からなる群から選択される方法を用いて採取される請求項1記載の方法。
【請求項４】接着性表面が接着テープを含む請求項3記載の方法。
【請求項５】生物学的因子がポリヌクレオチドである請求項1記載の方法
。
【請求項６】ポリヌクレオチドがmRNAである請求項5記載の方法。
【請求項７】 mRNAがサイトカインをコードするものである請求項6記載の
方法。
【請求項８】 mRNAの定量をさらに含む請求項6記載の方法。
【請求項９】生物学的因子が局所における生物学的反応に関連するもので
ある請求項1記載の方法。
【請求項１０】生物学的因子が全身の生物学的反応に関連するものである
請求項1記載の方法。
【請求項１１】被験体における刺激性接触皮膚炎(ICD)とアレルギー性接
触皮膚炎(ACD)とを識別する方法であって、サイトカインをコードするポリヌク
レオチドのレベルを定量することを含み、そのポリヌクレオチドのレベルによっ
てその皮膚炎がICDであるかACDであるかを決定する、方法。
【請求項１２】ポリヌクレオチドがRNAまたはDNAである請求項11記載の方
法。
【請求項１３】 RNAがmRNAである請求項12記載の方法。
【請求項１４】被験体がヒトである請求項11記載の方法。
【請求項１５】ポリヌクレオチドが皮膚の角質層の下にある細胞由来のも
のである請求項11記載の方法であって、 a) 角質層を除去すること、および、 b) 角質層の除去後、露出された表面からポリヌクレオチドを採取するこ
と、をさらに含む、方法。
【請求項１６】角質層の除去に、 a) 角質層を擦過すること、および、 b) 接着性表面を角質層に接触させること、からなる群から選択される方法を用いる請求項15記載の方法。
【請求項１７】ポリヌクレオチドが、角質層除去後に露出された表面から
、 a) 硬質表面を用いてその露出された表面をこすり取ること、および、 b) 接着性表面をその露出された表面に接触させること、からなる群から選択される方法を用いて採取される請求項15記載の方法。
【請求項１８】接着性表面が接着テープを含む請求項17記載の方法。
【請求項１９】 mRNAがサイトカインに特異的なものである請求項13記載の
方法。
【請求項２０】サイトカインがIL-4およびIL-8である請求項19記載の方法
。
【請求項２１】反応は存在するがIL-4は存在しないことがICDの特徴であ
る請求項20記載の方法。
【請求項２２】 IL-8の増加のレベルがICDの重篤度の指標となる請求項20
記載の方法。
【請求項２３】サイトカインがIL-4である請求項19記載の方法。
【請求項２４】 IL-4の増加がACDの特徴である請求項23記載の方法。
【請求項２５】 IL-4の増加のレベルがACDの重篤度の指標となる請求項24
記載の方法。
【請求項２６】ポリヌクレオチドを単離する前に皮膚を因子に暴露させる
ことをさらに含む請求項11記載の方法。
【請求項２７】因子が刺激原、抗原、またはアレルゲンである請求項26記
載の方法。
【請求項２８】被験者がICDであるかを診断する方法であって、被験体か
ら単離した細胞中の、IL-4およびIL-8からなる群から選択されるサイトカインを
コードするポリヌクレオチドを定量することを含み、IL-4またはIL-8の量がICD
の指標となる、方法。
【請求項２９】ポリヌクレオチドがPCRによって検出される請求項28記載
の方法。
【請求項３０】ポリヌクレオチドがポリヌクレオチドプローブとハイブリ
ダイズさせることによって検出される請求項28記載の方法。
【請求項３１】ポリヌクレオチドがRNaseプロテクションアッセイによっ
て検出される請求項28記載の方法。
【請求項３２】細胞が皮膚細胞である請求項28記載の方法。
【請求項３３】被験体が哺乳動物である請求項28記載の方法。
【請求項３４】哺乳動物がヒトである請求項33記載の方法。
【請求項３５】被験体がACDであるかを診断する方法であって、被験体の
細胞中の、IL-4をコードするポリヌクレオチドを定量することを含み、IL-4の量
の上昇がACDの指標となる、方法。
【請求項３６】 IL-4がPCRによって検出される請求項35記載の方法。
【請求項３７】 IL-4がポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる
ことによって検出される請求項35記載の方法。
【請求項３８】 IL-4がRNaseプロテクションアッセイによって検出される
請求項35記載の方法。
【請求項３９】細胞が皮膚細胞である請求項35記載の方法。
【請求項４０】被験体が哺乳動物である請求項35記載の方法。
【請求項４１】哺乳動物がヒトである請求項40記載の方法。
【請求項４２】皮膚炎を引き起こす化合物を同定する方法であって、皮膚
炎を誘発するような条件で皮膚の一区画を化合物と接触させること、および、サ
イトカインをコードするポリヌクレオチドを検出することを含み、そのポリヌク
レオチドの存在が皮膚炎の指標となる、方法。
【請求項４３】化合物がアレルゲンである請求項42記載の方法。
【請求項４４】化合物が刺激物である請求項42記載の方法。
【請求項４５】皮膚炎がアレルギー性接触皮膚炎(ACD)である請求項42記
載の方法。
【請求項４６】皮膚炎が刺激性接触皮膚炎(ICD)である請求項42記載の方
法。
【請求項４７】皮膚がin vivoで接触される請求項42記載の方法。
【請求項４８】皮膚がin vitroで接触される請求項42記載の方法。
【請求項４９】皮膚からポリヌクレオチドを単離することをさらに含む請
求項42記載の方法。
【請求項５０】ポリヌクレオチドがDNAまたはRNAである請求項49記載の方
法。
【請求項５１】 IL-4をコードするポリヌクレオチドを定量することをさら
に含み、IL-4の量の上昇がACDの指標となる、請求項50記載の方法。
【請求項５２】被験体から単離した細胞中の、IL-4およびIL-8からなる群
から選択されるサイトカインをコードするポリヌクレオチドを定量することをさ
らに含み、IL-4またはIL-8の量がICDの指標となる、請求項50記載の方法。
【請求項５３】 IL-4の存在しない状態でのIL-8の増加がICDの指標となる
請求項52記載の方法。
【請求項５４】被験体がACDであるかを診断する方法であって、被験体の
細胞中のIL-13をコードするポリヌクレオチドを定量するを含み、IL-13の量の上
昇がACDの指標となる、方法。
【請求項５５】 IL-13がPCRによって検出される請求項54記載の方法。
【請求項５６】 IL-13がポリヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせ
ることによって検出される請求項54記載の方法。
【請求項５７】 IL-13がRNaseプロテクションアッセイによって検出される
請求項54記載の方法。
【請求項５８】細胞が皮膚細胞である請求項54記載の方法。
【請求項５９】被験体が哺乳動物である請求項54記載の方法。
【請求項６０】哺乳動物がヒトである請求項59記載の方法。
【請求項６１】皮膚からポリヌクレオチドを得るためのキットであって；硬質表面および接着テープからなる群から選択される細胞採取装置、および
、ポリヌクレオチドの保存に適した溶解バッファーまたはポリヌクレオチドの
保存に適したコンピューターチップ、を含むキット。
【請求項６２】 mRNA検出試薬をさらに含む請求項61記載のキット。
【請求項６３】刺激性反応とアレルギー性反応とを識別するためのキット
であって、細胞採取装置、細胞溶解バッファーおよびmRNA検出試薬を含むキット
。