JP2007531529A - 皮膚疾患および病的皮膚状態を分析するためのテープ剥ぎ取り法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、一般的には、非侵襲的診断方法に、ならびにより具体的には、皮膚試料由来の拡散を単離および分析するための方法に関する。
皮膚疾患は、今日、大きな保健医療課題を示している。例えば、5百万人を超える米国人および世界中で1億人を超える人々が、乾癬を患っている。皮膚疾患の検出、診断およびステージングは、それの管理の重要な局面である。現在の診断方法は、主に、可視的観察および生検に頼っている。しかしながら、可視的観察に頼る皮膚疾患についての検出方法は、多くの皮膚疾患を診断することに効果的ではなく、臨床症状後までには疾患を検出しない。生検のような侵襲的方法は、検査されることになっている被験体にとって外傷性であるだけでなく、それらはまた、感染のリスクを増加させる。さらに、侵襲的方法は、表面反応に関与する細胞である皮膚の表面上の細胞の濃縮試料を供給しない。
本発明は、バイオマーカーの直接的な定量的および定性的評価を可能にする簡単なテープ剥ぎ取り手順により皮膚表面からDNAまたはメッセンジャーRNAのような核酸を回収するための非侵襲的アプローチに基づいている。方法は、可視的検出方法を用いて得ることができない、価値のある遺伝的情報を提供する。さらに、テープ採取されたRNAは、生検により回収されたRNAに質および有用性において匹敵することが示されているが、方法は、生検試料を用いて得られない皮膚の最外層の細胞に関する情報を提供する。最後に、方法は、生検よりはるかに外傷性が少ない。
本発明は、病理学的および生理学的バイオマーカーの直接的な定量的ならびに定性的評価を可能にする簡単なテープ剥ぎ取りによる皮膚表面からDNAまたはRNAのような核酸を回収または分析するための非侵襲的アプローチに基づいている。テープ採取されたRNAは、生検により回収されたRNAに、質および有用性において匹敵することが示されている。本方法は、患者へ、ほとんどまたは全く、不快を引き起こさない。それゆえに、それは、医師の診療所において日常的に、例えば、ケア試験の点について、行われうる。従って、テープ剥ぎ取りを用いる表皮試料からの核酸の非侵襲的単離および/または検出のための方法ならびにマーカーが本明細書に提供されている。
*乾癬についてU.S. Food and Drug Administration (FDA)にまだ認可されていない。
IL-12B、IL-23A、Krt-16、Krt-17から選択される2つまたはそれ以上のタンパク質をコードする2つまたはそれ以上の標的核酸分子が検出される。特定の局面において、GAPDHおよび
は、例えば-Ct計算における、対照として用いられる。特定の局面において、生検材料は、皮膚の部位において採取され、核酸試料は、生検材料から得られる。例えば、生検を行われた試料において、TNFI、CD2、IFNγ、IL-12B、IL-23A、Krt-16またはKrt-17から選択されるタンパク質をコードする標的核酸分子の発現が検出される。これらの遺伝子のすべての発現は、生検が行われた試料において上昇していることが知られている。
皮膚試料から核酸を単離するための優れたテープ特性の同定
この実験の目的は、皮膚の表面から表皮および付随した全RNAを取り出す能力について異なる剛性の接着フィルムを比較することであった。
1]6人の被験体における、各テープについて小部位あたり回収されたナノグラムでの全RNAの平均質量。RNAは、標準曲線方法による定量的RT-PCRを用いて定量化された。
1]部位あたり回収された全RNAの平均質量は、ナノグラムで示されている;特に断りのない限り、各値は、3つの小部位の平均である;NDはRNAが検出されなかったことを示す;*は、RNAがすべての部位で検出されるとは限らないため、値が3つ未満の部位の平均であることを示す。
正常および炎症性皮膚の非侵襲的テープ採取により回収されたRNAを特徴付けるためのRT-PCRおよびDNAマイクロアレイの使用
この実施例は、病理学的および生理学的バイオマーカーの直接的な定量的ならびに定性的評価を可能にする簡単なテープ剥ぎ取り手順による皮膚の表面からメッセンジャーRNAを回収するための非侵襲的アプローチを例証する。テープ採取されたRNAは、生検により回収されたRNAと質および有用性において匹敵していることが示されている。モデル系としてSLS刺激を用いて、IL-1βおよびIL-8のmRNAにおける変化を評価することの有用性は、刺激性皮膚反応の表示として試験されており、両方の試料採取方法が、RNAの回収を可能にし、その分析が皮膚の刺激を明らかにすることを示している。生検およびテープ採取されたRNAが異なる細胞集団由来である可能性が高いこと、ならびにテープ採取が、表皮を試料採取することおよび選り抜きの示差的に制御された表皮バイオマーカーを同定することのための効率的な方法であることをデータは示している。DNAマイクロアレイへのハイブリダイゼーションのための、テープ採取されたRNAの増幅の成功が報告されている。これらの実験は、被験体における反復試験部位間の有意な遺伝子発現レベル差を示さず、男性と女性の被験体の間で極微の差を示している。アレイ作成RNAプロファイルはまた、正常と24時間1%SLSで閉塞された皮膚の間で比較され、SLS処理が、結果として、1,700個より多い遺伝子の発現レベルにおいて統計学的に有意な変化を生じたことが観察された。これらのデータは、ヒト皮膚からRNAを捕獲するための非侵襲的方法としてのテープ採取の有用性を確立している。
臨床プロトコール:研究プロトコールは、独立したIRB(BioMed IRB, San Diego)により審査されて承認され、すべての被検者は、インフォームドコンセントにサインした。年齢21〜55歳の10人の健康な女性が研究に登録された。背中中央における傷のない正常な外見の皮膚の領域が、約4 cm x 6.5 cmの包帯の形をとった2つの閉塞パッチの貼り付けのために選択された。包帯は、透明な通気性のないプラスチックの低アレルギー誘発性接着テープを用いて作製された。このテープの中央に、約2 cm x 4.5 cmの大きさであるWebril(不織布綿)パッチがあった。1つのWebrilパッチは、1% 水性ラウリル硫酸ナトリウムの0.6 mlを含み、他方は、媒体対照として滅菌水の0.6 mlを含んだ。パッチは、SLSパッチが水パッチより上で、直接隣接している;正常な対照皮膚の領域が、水パッチより下で、隣接している、ように配置された。貼り付け後24時間目において、SLSおよび水パッチを除去し、皮膚をスコアリングの前に15分間、空気乾燥するようにさせておいた。部位は、下に提供された尺度を用いて訓練された技術者によりスコアリングされた。パッチを当てられる部位は、2つの領域が重複なしにテープ採取され、かつ薄片生検(〜2 x 2 mm)のために余地が残りうるのに十分に大きい。皮膚部位は、4つのテープそれぞれでテープ剥ぎ取りされ、その後、局所麻酔薬(リドカインHCl 1%およびエピネフィリン1:100,000; Abbott Laboratories)下で薄片生検材料が採取された。テープは、円運動しながらの20秒間の強固な圧力を用いて皮膚に当てられた。テープ剥ぎ取りに用いられるテープは、ポリウレタンフィルム上の合成ゴム系接着剤であった(製品No. 90068, Adhesive Research, Glen Rock, PA)。非病変皮膚の領域は、同一の様式で、テープ採取され、かつ薄片生検を行われた。テープは、抽出まで-80で個々のエッペンドルフチューブに保存された;生検試料は、緩衝液RLTに置かれ、抽出まで-80で保存された。各パッチ貼り付けに対する皮膚応答が、調べられ、100ワットの白熱青色電球により供給される光の下で採点された。以下の評点尺度が用いられた:0、可視的反応なし;1、かすかなピンク色の斑状紅斑;2、軽い融合性のピンク色紅斑;3、水腫をもつ中等度の紅斑(明確な赤み);4、水腫をもつ強い紅斑(非常に激しい赤み)。第二研究において、3人の被験体が、1% SLSを含む3つのパッチおよび3つの水パッチを24時間、背中中央に当てられた。上のように、パッチを除去し、スコアリングし、テープ剥ぎ取りした。第三研究において、2人の個体が、上のような3つの隣接部位で、上背の非病変皮膚においてテープ剥ぎ取りされた。これらの最後の2つの研究で採取されたRNAは、下記のDNAマイクロアレイ実験において用いられた。
「Exp」は、実験的試料(この場合、SLSまたは水試料)を示す;「Cal」は較正物質試料(非病変皮膚)を示す;およびΔΔCt,x=[ΔCt,Exp−ΔCt,Cal]x;ΔCt,ExpおよびΔCt,Calは、それぞれの試料について(平均Ct,RNAx)−(平均Ct,アクチン)として計算される。Ct値は、mRNAxおよびβ-アクチンmRNAについて閾値蛍光(バックグラウンドに対する蛍光における統計学的に有意な増加)に達するのに必要とされるPCRサイクルの実験的に決定された数である(Gibson, Heid et al. 1996; Heid, Stevens et al. 1996)。
として計算される。初期の反復において、Affymetrixソフトウェアは、各プローブセットについてAD値を計算する時、所定の範囲外であるプローブペアを除去した。この過程において、平均および標準偏差は、プローブセット全体(最高値および最低値を除く)に渡る強度差(PM−MM)について計算され、標準偏差の設定数(デフォルトとして3)内の値は、計算に含まれなかった。利点は、この過程が、各プローブセットに存在するアウトライアーを除去することにより実験的または生物学的エラーにより導入される分散を最小限にすることであった。欠点は、この過程が、GeneChip間のAD値の計算について必ずしも同じプローブペアを除去するとは限らないことであった。これは、GeneChip実験から得られた遺伝子発現プロファイルの誤った解釈へと導いた。この問題を解決するために、dChipと呼ばれるプログラムへ組み入れられたモデルに基づいた方法が、Li & Wong(Li and Wong 2001)により開発された。この方法は、クロスハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション中の汚染、またはプローブセット測定に影響を及ぼす製造欠陥によるアウトライアーを除外すると同時に、すべてのGeneChipに渡って一定のプローブペアセットアイデンティティを維持する。本明細書に報告されたGeneChip実験のすべてについて、*.celファイルからの各プローブペアセットは、統計学的解析の前にdChipソフトウェアによりモデル化された。各遺伝子のdChipモデル化発現測定は、各チップの総シグナルに対して標準化された。任意の与えられた測定について、ゼロより大きい値(発現レベルを示す)またはゼロ(バックグラウンドより低い発現レベルを示す)が得られた。すべての実験においてゼロより大きい発現レベルを示すそれらの遺伝子のみが、統計学的解析に用いられた。データ解析:遺伝子発現プロファイリング実験の多くの実験設計および適用が可能である。しかしながら、実験の目的が何であろうと、各実験は、データの統計学的解析にとって十分な回数を反復されなければならない。これは、基本的に、各遺伝子発現プロファイリング実験が、結果として、何千という遺伝子の発現レベルの測定を生じるからである。そのような高い次元の実験において、任意の個々の遺伝子発現レベルについての誤った測定の確率は高い。従って、高い反復を欠く場合、多くの遺伝子は、実験条件が同じである時でさえも、全く偶然だけで、2つの実験条件間で発現レベルにおける大きな変化を示すだろう。単純t検定は、群内標準偏差に関して標準化された2つの群の平均間の距離を評価する。結果は、任意の与えられた遺伝子についての遺伝子型間の大きな差が、その遺伝子の発現レベルが実験処理内で反復不可能であるならば、有意ではないと宣言されるだろう。逆に、発現における小さな差は、その遺伝子についての発現レベルが処理内で反復可能であるならば、統計学的に有意であると決定されるであろう。要するに、t検定統計値は、遺伝子型内の観察される分散に対して遺伝子型間の遺伝子発現レベルにおける差を計ることにより構築される。t検定統計値に基づくp値は、帰無仮説に関連した同一値をもつ遺伝子発現レベルについての1.0から、高く有意である示差的な遺伝子発現レベルについての非常に小さいp値までの範囲である。しかしながら、単純t検定は、少数の反復試験では十分に果たせないことを留意しなければならない。限られた数の反復測定で、しばしば、DNAマイクロアレイ実験について2〜5回の範囲において、得られる平均、標準偏差およびp値の推定値は不良である。
全RNA収量
RNAは、上記のように4つのテープを用いた30個の皮膚部位のうちの27個から回収された。回収された全RNAの量は、部位部位間で、および被験体被験体間で、変動した(データ示されず)。非病変皮膚部位から回収されたRNAの平均質量は、0(2個の試料)〜3.2 ngの範囲をもつ0.92ナノグラム(±0.35)であった。水で閉塞された皮膚から回収されたRNAは、0(1個の試料)〜2.7 ngの範囲をもつ0.69ナノグラム(±0.27)であった。SLSの炎症を起こした皮膚は、185 ng(±76)の平均および0.067〜747 ngの範囲をもつRNAの最大の平均収量を生じた。
炎症過程のマーカー、IL-1βおよびIL-8のmRNAが選択された。試料における全RNA質量の示差的回収は、内部対照、β-アクチン転写産物、に対してこれらのmRNAを標準化することにより説明された。本発明者らは、その後、SLSおよび水試料におけるmRNAx/アクチン比率を未処理の皮膚試料におけるその比率に対して較正した。この研究において、IL-1βおよびIL-8のmRNAは、SLS処理に対する応答においてβ-アクチンと比較して増加することが予測され、一方、β-アクチンおよびGAPDHのようなハウスキーピングmRNAのレベルは、一定のままであることが予測される。本発明者らは、それらの比率が本当に、異なる皮膚試料において一定であるかどうかを決定するために、2つのハウスキーピングmRNA、GAPDHおよびβ-アクチンの相対的比率を測定することによりこの仮定を試験した。
表IIIより、テープおよび生検で採取されたRNA試料において、非病変皮膚に対する(に対して較正された)水で閉塞された、およびSLSで閉塞された皮膚におけるIL-1β/β-アクチンのmRNAの倍変化が明らかにされている。SLSで閉塞された皮膚の10個の生検試料のうち9個において、IL-1β/β-アクチンのmRNA比率が有意に上昇した。10個の非病変皮膚生検試料のうち7個において、IL-1β mRNAは検出できなかったが、残りの3個の試料において、非常に低いレベルで存在していた(本発明者らの検出限界の3Ctユニット内;データ示されず)。水で閉塞された皮膚の生検試料において、IL-1β mRNAは、2個の試料において検出できず、3個の試料において有意に上昇した(表III)。従って、SLS閉塞は、IL-1β/アクチンのmRNA比率の最も一貫した上昇を生じたが、水閉塞は、より小さいといえども類似した応答をもたらすことができた。水閉塞の効果が水処理された部位に対するSLS試料の較正による効果の中へ取り入れられる場合、本発明者らは、7個のSLS処理された試料が、IL-1β/アクチンのmRNA比率における有意な増加をもつことを見出す(表IIIからのデータ;計算示されず)。
表IIIより、非病変皮膚と比較した水で閉塞されたおよびSLSで閉塞された皮膚におけるIL-8/β-アクチンのmRNA比率の倍増加が明らかにされている。データは、SLSで閉塞された皮膚の10個の生検試料のうちの8個が、IL-8/アクチンのmRNA比率における有意な増加を示したことを実証している。10個の未処理の皮膚部位のうちの9個からの生検試料が、検出不可能なIL-8 mRNAレベルをもった。検出可能なIL-8 mRNAをもつ1個の非病変皮膚生検試料は、検出のレベルに近かった。従って、IL-8 mRNAは、一般的に、非病変皮膚の生検において検出できなかった。同様に、水で閉塞された部位の生検からの10個の試料のうちの5個もまた、検出不可能なIL-8 mRNAをもった。残りの5個の水処理された試料において、2個は、有意に増加したIL-8/アクチンのmRNA比率をもったが、これらの増加は、それぞれのSLSで閉塞された部位と比較して小さかった。従って、水閉塞は、たいていの被験体の表皮において、認めうるほどにはIL-8 mRNA出現を刺激しなかった。
異なる皮膚部位からテープ採取されたRNAの上記分析における成功は、このRNAが増幅およびDNAマイクロアレイへのハイブリダイゼーションを受け入れられうることを示唆した。遺伝子発現プロファイリング実験のためのテープ採取されたRNA試料の再現性および一貫性を評価するために、2人の健康な個体、1人の男性(試料C1、C2およびC3)および1人の女性(試料A5、A6およびA9)、のそれぞれの上背から3つの試料が収集された。全RNAの約1ナノグラムが単離され、材料および方法に記載されているように、mRNAは、増幅され、MessageAmp(商標)aRNAキットを用いてビオチン標識された。各試料から結果として生じたビオチン標識aRNAは、Affmetrix HG-U133A GeneChipへのハイブリダイゼーションに用いられた。
別個の実験において、1〜10ナノグラムの範囲である合計9個のRNA試料は、3つの個体のそれぞれの3個の未処理の部位、3個の水で閉塞された部位、および3個のSLSで閉塞された部位からのテープ採取により単離された。9個の試料のそれぞれからのmRNAは、増幅され、ビオチン標識され、図1に示されているような、9個のAffymetrix HG-U133A GeneChipのそれぞれへのハイブリダイゼーションに用いられた。
分子医学における最近の進歩は、分子診断の可能性を現実のものにさせた(Aitman 2001; Bertucci, Houlgatte et al. 2001; Galiegue and Casellas 2002; Lacroix, Zammatteo et al. 2002; Whipple and Kuo 2002; Satagopan and Panageas 2003)。マイクロアレイおよびRNAプロファイリングの使用を通して、単純および複雑な細胞集団が、それらの細胞または組織の生理学的状態を理解する目的で、モニターまたは「プロファイリング」されうることが、ますます明確になってきている。この情報は、より正確な、および場合により予測的な診断へ導くことが期待される。この実施例は、4つの小さなテープの使用が、皮膚の表面からメッセンジャーRNAを捕獲することへの効果的かつ非侵襲的なアプローチであること、およびこの技術が、正常な生理の機能としての病理学的および生理学的バイオマーカーの直接の定量的および定性的評価を可能にすることを例証している。
ΔCt,GAPDHは、[Ct,GAPDH−Ct,アクチン]として定義される;材料および方法を参照;平均±SD;被験体4および5の非病変皮膚ならびに水で閉塞された皮膚(被験体4)からのテープ採取された試料は、正確なβ-アクチンアッセイのために十分なRNAを有しなかった。
生検およびテープ採取された試料についての、水対正常およびSLS対正常に関するp値(両側、対応のあるt検定)。
生検およびテープ採取された試料についての、水対正常および水対SLSに関するp値。
正常、水閉塞およびSLS閉塞の皮膚についての、テープ採取対生検の試料に関するp値。
a. 非病変皮膚に対する示された試料におけるGAPDH/β-アクチンのmRNAの倍増加;材料および方法に記載されているように、表Iにおけるデータから計算された個々の倍変化および表Iにおける平均値から計算された平均変化。
b. 後に角型括弧での臨床評点が続いている被験体識別、評点定義は材料および方法に考察されている。
c. 倍変化は、材料および方法に記載されているように、平均Ct値(IL-1βデータは示されていない、および表IVにおけるIL-8データ)から計算される。以下の略語が用いられている;「-」は、β-アクチmRNAを正確にアッセイするには不十分な回収されたRNAを示す;「ND」は、IL-1βまたはIL-8のmRNAが示された試料(水またはSLS)において検出されなかったことを示す;NCは、mRNAが示された試料において検出されることができたが、倍変化の計算が、非病変皮膚試料における低いRNA回収のためになされえなかったことを示す;「**」は、倍変化が95%より大きい信頼度で有意であることを表す;†は、倍変化がまた、水試料(データ示されず)に対して計算される場合も有意であることを示す;>符号は、IL-1βまたはIL-8のmRNAが対照試料において検出されることができず、それに従って、倍変化の最小推定値が材料および方法に記載されているように計算されたことを示す。
d. 被験体IDおよび角型括弧におけるSLS部位の臨床評点;採点法は、材料および方法に記載されている。
e. ΔCtおよび最小ΔCt計算は、材料および方法に記載されている;「-」の入力は、示されたΔCtの意味のある推定値を提供するには回収されたRNAが不十分であったことを示した。「>」が前に付く価は、IL-1βまたはIL-8についてのmRNAが試料において検出されず、それゆえに、それぞれのCtが、37の値を割り当てられ、最小ΔCtが与えられている(すなわち、ΔCt=37−Ct,アクチン)。
f. 与えられた皮膚処理についてのテープ対生検に関するΔCtを比較する二元の対応のあるt検定。
本明細書に提供されたテープ剥ぎ取り方法を用いる乾癬患者からの表皮RNAの非侵襲的単離
この実施例は、乾癬病変からの核酸の単離および検出、ならびに発現が乾癬病変に関連している遺伝子の同定を例証する。この実施例は、様々な処理段階での24人の乾癬患者におけるテープ採取する病変および非病変皮膚の結果を要約する。この治験中の研究の目標は、ポリウレタンフィルム(製品番号90068)上の合成ゴム系接着剤(Adhesive Research, Glen Rock, PA)と用いられたテープ円盤である、DermTechの表皮遺伝情報検索テクノロジー(Epidermal Genetic Information Retrieval Technology)(EGIR)が、乾癬患者由来の病変および非病変皮膚の表面からRNAをうまく回収しうるかどうかを決定すること;ならびに、乾癬病変において上昇していることが知られている特定のmRNA分子について回収されたRNAを半定量化することであった。これらの患者から生じたデータは、RNAが回収されうること、ならびにTNFα、IFNγ、CD2、GAPDHおよびβ-アクチンについてのmRNAが、テープ採取された表皮試料において検出され、かつ半定量化されうることを実証している。RNAのナノグラム量は、テープ採取された乾癬斑の92%から回収された。非病変対照皮膚からのRNAの回収は、31%成功率で、それほど成功しなかった。非病変皮膚からのRNAの回収は、繰り返して首尾よくテープ採取されることができた被験体もあるし、そうでなかった被験体もあるため、ランダムではなかった。非病変乾癬皮膚からのRNAの回収は、85%成功率をもつ健康な個体の正常な皮膚をテープ採取することの成功と対照をなす。半定量的RT-PCR分析は、β-アクチンに対して、少なくとも6人の患者が乾癬斑においてTNFα mRNAレベルを有意に上昇させ、4人の患者がIFNγ mRNAを上昇させ、3人がCD2メッセージを増加させたことを実証した。18人の患者は、対照皮膚からの不十分なRNA収集のため、乾癬病変においてアッセイされたいずれのマーカーの相対変化も示すことができなかった。しかしながら、21人の患者の病変におけるΔCt値の解析は、乾癬対対照の皮膚においてβ-アクチンに対するTNFαとCD2のmRNAレベル間に高い有意差を実証した。これらのデータは、TNFαおよびCD2のmRNAが、実際、ほとんどの患者において上昇していたこと、および患者が2つの群、上昇したTNFαおよびCD2のmRNAをもつ者ならびに上昇したTNFα、CD2およびIFNγのmRNAをもつ者、へ分類されることができたことを示唆する。データは、乾癬対非病変皮膚においてβ-アクチンに対して3つのmRNAの別個の相対存在量があり、それらの差が全被験体に渡って共通であることを実証している。これらの予備的結果は、非常に勇気づけられるものであり、追加の患者での確認を必要とする。
臨床:試料収集は、Gerald Krueger博士と共同してUniversity of Utahで行われた。各身体部位について、合計4つの新しいテープが、逐次的に、単一部位へ1回、当てられ、外された。テープは、個々のエッペンドルフチューブへ置かれ、-80で凍結され、すべてのその後の分析が行われるDermTech Internationalへドライアイスにおいて速達で郵送された。テープ剥ぎ取りに用いられたテープは、ポリウレタンフィルム上の合成ゴム系接着剤MA70(Adhesive Research)であった。
XTは、サイクルCにおける全PCR産物の量であり、X0は、mRNAxの最初の量である。PCR反応中、ΔRnは、指数関数的に上昇する(反応の初期段階において非競合性条件下で);ΔRnが有意にバックグラウンドより上へ上昇する場合、それは閾値に達したと言われ、方程式1]は以下になる:
Kxは、蛍光プローブに特異的な分光定数であり、反応条件およびCt,x(閾値)は、閾値蛍光ΔRnに達するのに必要とされるPCRサイクルの数である。同様の方程式は、この場合β-アクチンである、標準化mRNAについて作成されうる:
KAは、アクチン特異的定数であり、A0は、アクチンmRNA分子の最初の数である。方程式2を方程式3で割り、整理し直すことにより、本発明者らは、mRNAxの率を本発明者らの未知または「実験の(experimental)」試料におけるβ-アクチンmRNAと関連づける方程式を得る:
KAX=KA/KXおよびΔCt,Exp=Ct,X−Ct,Aである。この方程式は、mRNA分子の最初の(未知の)数を実験的に決定された閾値サイクル数と関連づける。方程式から、2つのmRNAの比率が、実験的に導かれたCt値の関数だけでなく、定数KAX(未知)、および計器により測定かつ報告されている2つのΔRn値の関数でもあることがわかる。従って、KAXの知識なしには、比較法により、単一の試料における2つのmRNAの絶対的比率が明らかにされない。しかしながら、第二の「較正物質(calibrator)」試料についての以下の同様の方程式を作成する:
および方程式4を方程式5で割ることにより、以下を得る:
実験および較正物質の試料が同じ実験中に分析される場合には、閾値は等しい、
KAXは両方の試料について同一であるため、方程式6は以下へ簡約する:
ΔΔCt=ΔCt,exp−ΔCt,calであり、ΔCt,expは実験試料についてのCt,x−Ct,アクチンであり、ΔCt,calは較正物質試料についての同じような差であることを思い起こす。従って、方程式7は、対象となる試料(乾癬組織)と較正物質試料(非病変皮膚)の間のmRNAx/mRNAaの変化をCt測定値から直接、推論することを可能にする。「ハウスキーピング」遺伝子が全RNAに対するそれの発現を変化させないという仮定をさらに加える場合には、方程式7は以下へ簡約することに留意されたい:
この最終の簡約は、診断目的のためにCt値から有意性を引き出す必要がないことは注目されるべきである。
方程式9をΔCtについて解くことは以下を生じる
ΔCt,Expは、3つの因子;X0/A0;ΔRn,X/ΔRn,A;およびKAXに依存することがわかる。同じ実験中で分析された2つの試料を比較する場合には、ΔRn値は同一であり、ΔCtにおける変化に寄与することができない。同様に、KAX値は同一であるため、ΔCt値は、X0/A0が変化する場合に変化するのみであることがわかる。それゆえに、同じプレート測定下において、較正段階なしにΔCt値を比較することは妥当である。論理的延長は、別々の実験からのΔCt測定値が比較されうるかどうかを問うことである。そのような事象において、ΔRnが異なる可能性が高いが、方程式10は、異なるΔRn値の効果を反映する調整されたΔCtを計算することを可能にする。方程式10の再整理は以下を与える:
方程式11における同等の左側の表現は、異なるΔRnを説明する「調整された」ΔCtである。調整されたΔCtは、A0/X0およびKAXに依存するのみであることがわかる。この場合、KAXは、両方の試料について一定である − 同一の反応条件およびプローブを仮定すれば − 調整されたΔCt間の任意の差はX0/A0における差の結果である。
RNA収量
表1は、24人の患者における非病変および病変の皮膚からの全RNAの収量を示す。200ピコグラム未満の収量はβ-アクチンの8分の1の存在量のmRNAレベルを定量化するためには役に立たないことが、テープ採取での本発明者らの経験である。少なくとも200ピコグラムのこの標準を適用することにより、本発明者らは、RNA回収を成功したまたは成功していないとして分類できる。表2は、200ピコグラム基準により質量データを分類した結果を要約する。病変皮膚のテープ採取は、試料の91%が分析のための十分なRNAを有して、非常に成功であった。しかしながら、非病変皮膚のテープ採取は、それほど成功しなかった(31%成功)。
表3は、非病変皮膚と比較した、病変皮膚におけるTNFα、IFNγおよびCD2についてのmRNAにおける相対的増加を明らかにしている。表3は、6人の患者が、非病変皮膚と比較して有意に上昇したTNFα/β-アクチンのmRNA比率をもったことを示している。15人の患者において、対照部位からの不十分なRNA回収のために、TNF/アクチンのmRNA比率を上昇しているまたはしていないとして分類できなかった。
この研究において、本発明者らは、24人の患者において乾癬および非病変皮膚をテープ採取した結果を分析した。本発明者らは、回収されたRNAを定量化し、十分なRNAが回収された場合、それが生産的に分析されうることを示した。本発明者らは、RNAが乾癬斑から高頻度で回収されうるが、非病変皮膚からは平均頻度より下(健康な被験体と比較して)で回収されることを見出した。非病変皮膚からのRNAの回収は患者特異的であることは明らかなように思われるが、本発明者らは、身体部位がRNA回収において主要な役割を果たすという可能性を排除しなかった。乾癬患者から非病変皮膚データを効率的に収集することができないことは、病変の分析の障害であるように思われる(表3)。しかしながら、この研究の最終的な目標は、病変試料のみで対照皮膚を必要としないアッセイ法を考案することである(下で考察されている)。そのような目標は、非病変皮膚からの、またはせめて少なくとも正常な皮膚における、ΔCt値の基礎的なデータベースを必要とするため、本発明者らは、非病変皮膚からのRNAの単離を増加させるためのアイディアを追求し続けるつもりである。
1. テープ用法の最適化:テープを皮膚に当てる異なる技術がRNAの回収に影響を及ぼしうることはありそうである。特に、皮膚への押しの強い貼り付けは必要である。2人の医師がその方法において訓練された。意見の一致は、訓練が非常に有益であって、どれくらい効率的に非病変皮膚が試料採取されるかにおいて違いを生じるであろうことであった。
2. 原則として、そのデータが後の時点で採取された病変試料を較正するために用いられうるため、たった1つの非病変(すなわち、影響をうけていない)対照が必要とされる。従って、非病変試料は、試料を得ることを保証するために単一の部位へテープの10回までの貼り付けの1回限りの使用を含みうる。
3. 身体位置がRNA回収について重要な因子であるという不確かな証拠がある。この仮説は、健康な個体において試験されることになっている。予備的データは、三角筋より上の上腕、肩甲棘より上の上背、および耳周囲(乳様突起)領域が優れたRNA産出部位でありうることを示唆している。
4. 単一の薄片生検は、すべてのその後の分析についての対照としての役割を果たす。
5. 市販されているRNAを「ユニバーサル」較正物質として用いることは可能であり、おそらく望ましい。
*収量は、ナノグラムで全RNAを報告した;ND=少しも検出されず
1. University of Utahラウンド1
2. University of Utahラウンド2
3. 被験体は1回のテープ適用に同意した
4. University of Utahラウンド3;1人の患者は単一の対照(試料ID 70)および病変(ID 60)を試料採取された、残りの4人の患者は2つの対照および1つの病変を試料採取された;対照IDは括弧内である
5. University of Utahラウンド4;2つの対照および1つの病変が試料採取された;対照IDは括弧内である
6. これらの試料は試料/病変名称を割り当てられておらず、凍結までの不明確な時間、氷上で輸送された可能性がある
1. ≧200ピコグラムRNAをもつ試料の率;合計23人の患者から、ラウンド2からの被験体6はこれらのデータに含まれていない(しかし、患者合計に含まれている)
1] 非病変皮膚に対する倍誘発が示されている;括弧内の数は、対象となるmRNA(TNFα、IFNγまたはCD2)にCt=37を割り当てることにより計算された下限推定値である、この推定値は、対象となるmRNAが対照部位において検出できなかったため、用いられる;**をもつ値は、材料および方法に記載されているように、95%信頼区間において対照部位と統計学的に異なるとみなされる;「-」は、対照(典型的な)または病変部位から回収されたRNAが不十分であったことを示す;NDは、病変または対照のいずれかの試料において検出された、対象となる遺伝子のmRNAがないことを示す(RNAは存在する);試料130および150は、2つの異なる非病変皮膚部位に対する較正に対応する2つの異なる倍増加をもつ。
2] University of Utahラウンド1
3] University of Utahラウンド2
4] University of Utahラウンド3;1人の患者は単一の対照および病変を試料採取された、残りの4人は2つの対照および1つの病変を試料採取された;対照IDは括弧内である
5] University of Utahラウンド4;2つの対照および1つの病変が試料採取された;対照IDは括弧内である
6] これらの試料は試料/病変IDを割り当てられておらず、凍結までの不明確な時間、氷上で輸送された
1. ΔCt値は、対象となるmRNAについてのCt値マイナスβ-アクチンについてのCt値(Ct,mRNA−Ct,アクチン)として定義される。いくつかの試料において、対象となるmRNAは検出されることができず、その場合、Ctは、37サイクル、本発明者らの検出限界、と定義される;そのような場合、推定されたΔCtは、式37−Ct,アクチンから計算され、括弧に入れて報告されている。↑により見出しを付けられた列は、統計学的に上昇した(95%信頼区間)サイトカインレベルをもつ病変からのデータを含む;⇔で見出しを付けられた列は、有意な変化を示していない病変からのデータを含む;UKにより見出しを付けられた列は、分類されていないデータ(較正物質が利用できない)を含む;NRNAは回収された不十分なRNAを示す。
2. University of Utahラウンド1
3. University of Utahラウンド2
4. University of Utahラウンド3;1人の患者は単一の対照および病変を試料採取された、残りの4人は2つの対照および1つの病変を試料採取された;対照IDは括弧内である。
5. University of Utahラウンド4;2つの対照および1つの病変が試料採取された;対照IDは括弧内である
6. これらの試料は試料/病変IDを割り当てられておらず、凍結までの不明確な時間、氷上で輸送された可能性がある。
* 平均および標準偏差は推定されたデータ(括弧内の数)を含まない。
† 非病変皮膚と比較した両側t検定;括弧内のΔCt値は計算に含まれない。
乾癬患者の病変および非病変皮膚におけるΔCt値により示されているようなmRNAの相対的レベル
この実施例は、乾癬病変および非病変皮膚の角質層においてゲノム発現を特徴付けるために、本明細書に開示されたテープ剥ぎ取り方法およびΔCt値の使用を例証する。より具体的には、この研究は、乾癬病変において上方制御されることが知られている様々なmRNAについてのΔCt値が、テープ剥ぎ取りにより回収されたRNAを用いて特徴付けられうるかどうかを決定する。
テープ剥ぎ取り手順およびテープは実施例3に開示されたものと同一である。1つの病変が試料採取され、3つの独立した非病変皮膚(UIS)部位が患者につき試料採取された。3つの非病変皮膚部位試料は、1つの「大域」対照試料を作製するように組み合わせられた。各部位は、それぞれが逐次的に、1回、当てられて外される4つの個々のテープで試料採取された。mRNAは、標準化メッセージとしてβ-アクチンを用いる比較またはΔCt方法を用いて半定量化された。
このテープ剥ぎ取り研究において、合計72個の被験体病変および163個の正常皮膚部位が試料採取された。それほど重症ではない疾患をもついくらかの患者は非病変皮膚部位においてのみ試料採取された。各試料は、β-アクチンmRNAに対して標準化されるGAPDH、TNFα、IFNγ、CD2、Krt-16、IL-12B、およびIL-23A mRNAについて半定量化された。これらのアッセイの結果は表9に示されている。
a. テープ剥ぎ取りされた部位、病変または非病変皮膚(UIS);観察の数は括弧に入れて下に挙げられている。
b. ΔCtはCt,mRNAx−Ct,アクチンmRNAとして定義され、Ctは閾値蛍光に達するのに必要とされるPCRサイクルのそれぞれの数である。いくつかの試料において、閾値が測定されることができなかった(すまわちmRNAは検出できなかった)、またはアッセイされなかった、従って、観察の数は、各mRNAについて異なる。SEMは、N1/2により割られた標準偏差として計算された平均値の標準誤差である。
時間および処置を通しての臨床評価(NPF評点)との乾癬病変におけるΔCt値の比較
この実施例は、テープ採取されたRNAおよび-Ct値が乾癬における変化をモニターするために用いられうることを例証している。
患者は、何ヶ月間にも渡ってEnbrel(商標)(Etanercept)で処置された。処置が開始される前(0週間目)および処置中の様々な時点においての両方で、病変は、ポリウレタンフィルム上の合成ゴム系接着剤MA70(Adhesives Research)を用いてテープ剥ぎ取りされた。接着条片は、17 mmの直径の円として製造された。皮膚部位は、4つの個々のテープで逐次的に剥ぎ取られ、各テープは1回、当てられて、外される。すべての4つのテープ上の接着細胞から単離されたRNAは1つの試料へプールされた。テープから回収された全RNAは、表1に列挙されたmRNAについて半定量化された。定量化は、内部標準化mRNA標準としてβ-アクチンmRNAでの比較法を用いる定量的RT-PCRにより、較正は、乾癬被験体の非病変皮膚におけるΔCtについての集団平均値を用いることにより達成された(表1)。
表10は、処置前および処置の8週間後の両方で、β-アクチンmRNAに対してGAPDH、TNFα、IFNγ、IL-12BおよびIL-23AのmRNAをアッセイした結果、加えてNPF評点により特徴付けられるような疾患の臨床評価を示す。各患者の非病変皮膚に対して病変試料を較正するよりむしろ、本発明者らは、非乾癬皮膚に対する倍変化を得るように集団平均値に対して較正することを選択した。各患者の非病変皮膚値に対して較正した結果は、事実上、同一であった(データ示されず)。表10はまた、病変試料におけるほとんどすべてのΔCt値についてベースラインから8週間目までの変化は正であり、一方、NPF評点における変化は、この同じ期間に渡って負であった(疾患における改善を示す)ことを示す。従って、これらの特定のmRNAのΔCt値における正の変化は、NPF評点における8週間目でのベースラインからの変化と負の相関関係がある。この負の相関関係は、TNFα、IFNγ、IL-12BおよびIL-23AのmRNAのレベルにおける増加が、臨床症状における改善と相関していることを示唆する。これは、表10における倍変化データを調べることにより最も明らかに実証される。この観察の有意性を評価するために、表10におけるΔCtおよびNPFデータが解析された。この解析の結果は表11に示されている。
a. 試料についてのΔCtは、Ct,mRNAx−Ct,mRNAアクチンとして計算され、Ct,mRNAxは、遺伝子「X」について閾値蛍光に達するのに必要とされるPCRサイクルの数であり、Ct,mRNAアクチンはβ-アクチンについての同じような値である。与えられた試料について対象およびβ-アクチンのmRNAに関する閾値は、同時にアッセイされた(すなわち、同じ実験中に)。
b. 非病変皮膚についての集団平均値ΔCtに対するmRNA/β-アクチンmRNAの比率の倍変化。倍変化は、2-(ΔΔCt)として計算され、ΔΔCt(比較法)はΔCt,病変−ΔCt,集団平均と等しい。
c. 0週間目および8週間目におけるNational Psoriasis Foundation(NPF)評点。
a. 自由度4をもつt統計値は、式;T(N-2)=R*(N-2)0.5/(1-R2)0.5を用いて観察された相関係数の有意性を検定するために計算された。
b. 相関係数の計算に用いられた観察の数はたった6であるため、漸近的正規性に基づいたT統計値の計算は適切ではない可能性がある。それゆえに、本発明者らは、並べかえ検定を用い、相関係数を観察すること<=観察された値の正確な確率は、ブートストラップサンプリングを用いて計算された。これらのp値を計算するために用いられたソフトウェアは、EXCELにおける「RESAMPLING STATS」であった。
a. 正常の分類は、「+」により示され、異常は「-」により示されている。正常の指定は、病変ΔCt値(表10)が、非病変皮膚についての集団平均値(表1)の3標準誤差(SEM)内に近い場合に与えられる。この基準は、正常として分類されるために、病変におけるΔCt値が、1.89(GAPDH);7.84(TNFα);8.34(IFNγ);6.1(IL-12B);7.14(IL-23A);-1.69(Krt-16);7.53(CD2)以上でなければならないことを意味する。ΔCtデータは、示されていないKrt-16およびCD2患者データを除いて、表1および3から取られる。
SLS刺激および対照の皮膚におけるケラチン遺伝子発現の分析
この実施例は、テープ採取および生検により回収された場合のSLS刺激および対照の皮膚の試料におけるケラチン10、16および17の発現データを提供する。ケラチンは、ケラチン生成細胞において顕著に見出される細胞骨格タンパク質のファミリーである。表皮の基底層はKrt-5およびKrt-14を発現させ、一方、分化している基底上層はKrt-1およびKrt-10を発現させる。ケラチン生成細胞が炎症を起こした場合、それらは活性化されて、Krt-6、Krt-16およびKrt-17を発現させるが、Krt-10の転写を下方制御する(Komine, Freedberg et al. 1996; Freedberg, Tomic-Canic et al. 2001)。従って、SLSにより炎症を起こした皮膚は、K16およびK17を発現させ、K10の転写を抑制すると予測されるものと思われる。遺伝子発現における定量的変化を確実に明らかにする、テープ条片回収されたRNAの能力を明確にするための継続的な努力において、炎症を起こしたおよび対照の皮膚のテープ剥ぎ取りおよび生検試料において炎症により誘発されることが知られている遺伝子の発現が比較された。
Freedberg, I.M., M. Tomic-Canic, et al. (2001). "Keratins and the keratinocyte activation cycle." J Invest Dermatol 116(5):633-40.
Komine, M., I.M. Freedberg, et al. (1996). "Regulation of epidermal expression of keratin K17 in inflammatory skin diseases." J Invest Dermatol 107(4): 569-75.
Wong, R., V. Tran, et al. (2004). "The use of RT-PCR and DNA microarrays to characterize RNA recovered by non-invasive tape-harvesting of normal inflamed skin." Journal of Investigative Dermatology 印刷中。
a. ΔCt,Krt-10は、Ct,Krt-10−Ct,アクチンとして定義され、Ct,Krt-10はKrt-10検出についての閾値蛍光に達するのに必要とされるPCRサイクルの数であり、Ct,アクチンは、同じ試料におけるβ-アクチン検出についての同じような数である。
b. 倍増加は、2-(ΔΔCt)として計算され、ΔΔCtはΔCt,状態−ΔCt,正常と等しい;ΔCt,状態は上で定義されており、「状態」は水処理かSLS処理のいずれかを指す;ΔCt,正常は、正常な(未処理の皮膚)試料におけるΔCt値である。倍増加は、左側の列におけるデータを用いて計算された。方法は、Wong et al.(Wong, Tran et al. 2004)に詳細に記載されている。
a. 計算の説明について表13の脚注を参照。
d. 計算の説明について表13の脚注を参照。
a. 単一方法が示されている場合、比較は、正常な皮膚におけるその試料採取方法対水またはSLS処理された皮膚における同じ試料採取方法の間である。
b. 二元完全測定ANOVAのペアワイズ比較からの結果として生じるp値。ΔCt値は、正常対SLSまたは水処理された皮膚について試料採取方法内で(すなわち、SLS処理された皮膚の生検対正常な皮膚の生検)、および与えられた処理について方法間で(すなわち、SLS処理された皮膚について生検対テープ)、比較される。
mRNAプロファイリングによる刺激性およびアレルギー反応の区別
この実施例は、刺激性接触皮膚炎(ICD)とアレルギー性接触皮膚炎(ACD)を区別することができるRNAプロファイルを同定するための実験を提供する。刺激性とアレルギー性の皮膚反応を区別することへの現在の障害は、これらの異なる皮膚炎の臨床的類似性である。分子および組織学的分析は、これらの反応が多くの類似した特徴を共有するが、明確な識別する組織学的特徴をもつとわかっていることを示した。今日まで、幅広いクラスの物質について皮膚炎のこれらの2つのクラス間を確実に区別できるRNAアッセイの実証がなかった。
臨床症状前の、またはかすかな臨床提示をもつ、刺激性皮膚反応の予測
この実施例は、臨床刺激または毒性もしくは腐蝕性皮膚反応の発生を予測するRNA発現プロファイルを同定するための実験を提供する。刺激性または毒性/腐蝕性皮膚反応を実証するために、化合物を皮膚に塗り、反応が臨床的に明らかになるまで、またはいずれの反応もなく適切な時間量が経過する(典型的には、2〜3週間)まで、それを放置することが必要である。物質が皮膚への1〜3時間の塗布後、刺激性または毒性/腐蝕性皮膚反応を生じるという確率を容易に予測しうるアッセイの導入が重要な進歩を表す。
特定の処置結果に相関したRNAプロファイルを同定するための処置前の乾癬病変および非病変皮膚の分析
この実施例は、特定の処置を用いての成功を予測する、− テープ剥ぎ取りにより捕獲されたRNAを用いて − 乾癬病変のマイクロアレイ分析、特異的RNAプロファイルにより同定しうる実験を提供する。上の実施例で例証されているように、テープ採取されたRNA試料は、病的および/または正常な皮膚生理を反映している。さらに、本明細書に例証されているように、乾癬病変は、テープ条片試料において示されたRNAプロファイルに依存して異なる群へ分類されうる。従って、種々の処置、より多数の患者、および多数の遺伝子をより分けうる(ヒトゲノムスキャン)核酸アレイの使用で、特定の治療の効果を予測する固有のプロファイルが同定されることが期待される。
処置過程の初期におけるRNA分析による臨床的徴候前の処置効力の予測
この実施例は、処置プログラムの初期に、最終的な処置効力を予測するRNAプロファイルを同定することを目的とする実験を提供する。乾癬病変のテープ試料採取は、RNAプロファイリングにより処置の経過をモニターするために用いられうることが本明細書に例証されている。予備的データはまた、いくつかのmRNAレベルが正常レベルに戻らないこと、およびこのプロファイルをもついくらかの患者は最終的には処置に応答できないことを示している。追加のRNAが同定されること、および多変量解析により、処置過程の初期における処置への応答と高く相関するRNA発現プロファイルが同定されることが仮説として取り上げられる。
Claims (119)
- 以下の段階を含む、皮膚における遺伝子の発現を検出する方法:
a)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で接着テープを皮膚の標的領域に当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含み、テープがゴム系接着剤を含み、かつテープが柔軟である、段階;および
b)表皮試料において核酸分子を検出し、それにより、皮膚における遺伝子の発現を検出する段階。 - テープがポリウレタンフィルム上にゴム系接着剤を含む、請求項1記載の方法。
- 約1〜10個の接着テープが皮膚に当てられ、外される、請求項1記載の方法。
- 約1〜8個の接着テープが皮膚に当てられ、外される、請求項1記載の方法。
- 約1〜5個の接着テープが皮膚に当てられ、外される、請求項1記載の方法。
- 核酸分子が、核酸分子を検出するためにマイクロアレイに適用される、請求項1記載の方法。
- 変化した発現が、ΔCt値における差を検出することにより検出され、ΔCt値が、標的核酸分子と対照核酸分子の間での閾値シグナルレベルに達するのに必要とされる増幅サイクルの数における差である、請求項1記載の方法。
- 以下の段階を含む、皮膚疾患または病的皮膚状態についての処置に対する被験体の応答を検出するための方法:
a)皮膚疾患または病的皮膚状態について被験体を処置する段階;
b)表皮試料を単離するのに十分な様式で接着テープを被験体の皮膚に当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階;および
c)核酸分子を含む試料において標的核酸分子を検出する段階であって、標的核酸分子の発現が皮膚疾患および病的皮膚状態に関する情報を与え、それにより、皮膚疾患または病的皮膚状態についての処置に対する被験体の応答を検出する、段階。 - 方法が処置前および処置後に行われる、請求項8記載の方法。
- 皮膚疾患または病的皮膚状態が乾癬である、請求項9記載の方法。
- 標的核酸分子が、TNFI、IFNγ、IL-12B、NPFまたはIL-23Bから選択されるタンパク質をコードする、請求項10記載の方法。
- 標的核酸分子が、CD2、TNFIまたはIFNγから選択されるタンパク質をコードする、請求項10記載の方法。
- 処置前と比較した処置後の標的核酸分子の発現における減少が処置に対する正の応答を示している、請求項12記載の方法。
- 遺伝子の集団が検出される、請求項9記載の方法。
- 検出がマイクロアレイを用いて行われる、請求項14記載の方法。
- 皮膚疾患または病的皮膚状態が皮膚炎である、請求項9記載の方法。
- 皮膚の標的領域が刺激された皮膚である、請求項16記載の方法。
- 方法がケラチン10、ケラチン16、またはケラチン17の遺伝子産物の発現を検出し、かつ発現における増加が処置に対する応答を示している、請求項17記載の方法。
- 方法がケラチン16またはケラチン17の遺伝子産物の発現を検出し、かつ発現における増加が処置に対する応答を示している、請求項17記載の方法。
- 以下の段階を含む、ヒト被験体の乾癬病変の表皮試料から核酸分子を単離または検出するための非侵襲的方法:
a)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で接着テープを被験体の乾癬病変に当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階;および
b)表皮試料において核酸分子を単離または検出する段階。 - 核酸がTNFα、IFNγ、CD2、IL-12B、Krt-16およびIL-23Aをコードする、請求項20記載の方法。
- 核酸がCD2、TNFIおよびIFNγから選択されるタンパク質をコードする、請求項21記載の方法。
- 1個と10個の間の接着テープが皮膚に当てられ、皮膚から外される、請求項20記載の方法。
- 1個と8個の間の接着テープが皮膚に当てられ、皮膚から外される、請求項20記載の方法。
- 約1個と4個の間の接着テープが皮膚に当てられ、皮膚から外される、請求項20記載の方法。
- 方法が、乾癬病変の生検材料を採取する段階をさらに含む、請求項20記載の方法。
- 核酸試料が生検材料から得られ、テープ試料由来の核酸および生検材料由来の核酸が分析される、請求項26記載の方法。
- 接着テープがゴム系接着剤を含む、請求項20記載の方法。
- ヒト被験体の非病変表皮組織から核酸試料を得る段階をさらに含む、請求項20記載の方法。
- 核酸試料が非病変皮膚の生検材料を採取することにより得られる、請求項29記載の方法。
- 正常な表皮組織からの核酸が以下の段階により得られる、請求項29記載の方法:
a)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で接着テープを被験体の皮膚に当てる段階であって、表皮試料が核酸を含み、かつ皮膚が検査されるべき疾患により影響をうけていない、段階;および
b)影響をうけていない皮膚の表皮試料から核酸を単離または検出する段階。 - 非病変皮膚が上腕または上背に由来する、請求項30記載の方法。
- 核酸がデオキシリボ核酸(DNA)である、請求項20記載の方法。
- 核酸がリボ核酸(RNA)である、請求項20記載の方法。
- 皮膚が刺激された皮膚である、請求項20記載の方法。
- 標的核酸の変化した発現が、処置前および後にΔCt値における差を検出することにより検出され、ΔCt値が、標的核酸分子と対照核酸分子の間での閾値シグナルレベルに達するのに必要とされる増幅サイクルの数における差である、請求項20記載の方法。
- 以下の段階を含む、被験体において乾癬を特徴付けるための方法:
a)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で被験体の皮膚上の乾癬病変ではないかと疑われる病変に接着テープを当てる段階であって、表皮試料が標的核酸分子を含む、段階;および
b)標的核酸分子を検出する段階であって、標的核酸が、乾癬をもつ少なくともいくつかの被験体において異なっている、段階。 - 標的核酸分子がCD2、TNFI、またはIFNγから選択されるタンパク質をコードする、請求項37記載の方法。
- 処置の選択または処置を続けるかどうかを決定するために特徴付けを用いる段階をさらに含む、請求項37記載の方法。
- 発現プロファイルがマイクロアレイを用いて検出される、請求項37記載の方法。
- ΔCt値が、標的核酸分子と対照核酸分子の間での閾値シグナルレベルに達するのに必要とされる増幅サイクルの数における差である、ΔCt値を測定する段階をさらに含む、請求項37記載の方法。
- 以下の段階を含む、ヒト被験体において乾癬を診断するための方法:
a)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で被験体の皮膚における乾癬病変ではないかと疑われる病変に接着テープを当てる段階であって、表皮試料が標的核酸分子を含む、段階;および
b)標的核酸分子を検出する段階であって、乾癬を有さない試料由来の表皮試料における発現と比較して標的核酸分子の変化した発現が、乾癬を示しており、それにより、被験体の乾癬を診断する、段階。 - 標的核酸分子が、TNFα、IFNγ、CD2、IL-12B、Krt-16、およびIL-23Aから選択されるタンパク質をコードする、請求項42記載の方法。
- 2つまたは以上の標的核酸分子が検出される、請求項43記載の方法。
- CD2、TNFIまたはIFNγから選択される2つまたはそれ以上のタンパク質をコードする2つまたはそれ以上の標的核酸分子が検出される、請求項44記載の方法。
- 生検材料が皮膚の部位において採取される、請求項42記載の方法。
- 核酸試料が生検材料から得られる、請求項46記載の方法。
- CD2、TNFI、またはIFNγから選択されたタンパク質をコードする標的核酸分子の発現が検出される、請求項46記載の方法。
- 変化した発現が、標的核酸分子の発現を対照核酸分子の発現と比較することにより検出される、請求項42記載の方法。
- 標的核酸分子および対照核酸分子の発現が、同じ試料容量およびプローブを用いる同じ実験において検出される、請求項49記載の方法。
- 変化した発現がΔCt値における差を検出することにより検出され、ΔCt値が、標的核酸分子と対照核酸分子の間での閾値シグナルレベルに達するのに必要とされる増幅サイクルの数における差である、請求項50記載の方法。
- 以下の段階を含む、動物被験体の皮膚を特徴付けるための方法:
a)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で刺激された皮膚を含むのではないかと疑われる皮膚の標的領域に接着テープを当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階;および
b)表VIIに列挙された遺伝子から発現される核酸分子、またはそれらの任意の組み合わせを表皮試料において検出する段階であって、核酸分子の発現が刺激された皮膚において変化しており、それにより被験体の皮膚を特徴付ける、段階。 - 表VIIに列挙された遺伝子より発現される2つまたはそれ以上の核酸分子の発現が検出される、請求項52記載の方法。
- 表VIIに列挙された遺伝子より発現される10個またはそれ以上の核酸分子の発現が検出される、請求項53記載の方法。
- 表VIIに列挙された遺伝子より発現される100個の核酸分子の発現が検出される、請求項53記載の方法。
- 検出がマイクロアレイにおいて行われる、請求項55記載の方法。
- 核酸分子が表VIに列挙された遺伝子より発現される、請求項52記載の方法。
- 遺伝子がIL-8である、請求項52記載の方法。
- 試験物質が、接着テープが当てられる前に標的領域に塗布される、請求項52記載の方法。
- 特徴付けが試験物質の臨床試験の一部として行われる、請求項59記載の方法。
- 動物被験体が哺乳動物である、請求項52記載の方法。
- 哺乳動物がマウス、ウサギまたはブタである、請求項61記載の方法。
- 哺乳動物被験体がヒトである、請求項61記載の方法。
- 以下の段階を含む、遺伝子発現における変化を検出するための方法:
a)接着テープに付着した表皮試料を皮膚の標的領域および皮膚の正常領域から単離するのに十分な様式で、第一接着テープを皮膚の標的領域に、および第二接着テープを皮膚の影響をうけていない領域に、当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階;ならびに
b)標的領域試料および正常領域試料のそれぞれについて、標的核酸分子および対照核酸分子を増幅し、かつ標的核酸分子と対照核酸分子の間での閾値シグナルレベルに達するのに必要とされる増幅サイクルの数における差を計算することによりΔCt値を同定する段階であって、標的領域対正常領域におけるΔCt値における差が、標的領域における標的核酸分子の遺伝子発現における変化を示している、段階。 - 対照核酸分子がハウスキーピング遺伝子より発現される、請求項64記載の方法。
- 約1個〜10個の接着テープが皮膚の対照領域に、および皮膚の標的領域に、当てられる、請求項64記載の方法。
- 約1個〜5個の接着テープが皮膚の対照領域に、および皮膚の標的領域に、当てられる、請求項64記載の方法。
- 標的核酸分子の集団が検出される、請求項64記載の方法。
- 検出がマイクロアレイを用いて行われる、請求項68記載の方法。
- 皮膚の標的領域が乾癬病変である、請求項64記載の方法。
- 皮膚の標的領域が皮膚炎に冒された皮膚を含む、請求項64記載の方法。
- 皮膚の標的領域が刺激された皮膚である、請求項64記載の方法。
- 方法がケラチン10、ケラチン16、またはケラチン17の遺伝子産物の発現における減少を検出する、請求項72記載の方法。
- 方法がケラチン16またはケラチン17の遺伝子産物の発現における減少を検出する、請求項72記載の方法。
- 以下の段階を含む、ヒト被験体の疾患または病的状態を示す核酸分子発現のパターンを同定するための方法:
a)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で、疾患または病的状態に冒された皮膚の領域に、および影響をうけていない領域に、接着テープを当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階;
b)試料から得られたRNA分子をマイクロアレイに適用する段階;ならびに
c)マイクロアレイを用いて少なくとも10個の遺伝子の発現レベルを測定する段階であって、影響をうけていない皮膚試料における発現と比較して少なくとも10個の遺伝子のそれぞれについての疾患または病的皮膚状態試料における変化した発現レベルが、疾患または病的状態に冒された皮膚を同定し、それにより、疾患または病的状態を示す核酸分子発現のパターンを同定する、段階。 - 少なくとも100個の遺伝子の発現レベルがマイクロアレイにおいて測定される、請求項75記載の方法。
- 少なくとも1000個の遺伝子の発現レベルがマイクロアレイにおいて測定される、請求項75記載の方法。
- 少なくとも10000個の遺伝子の発現レベルがマイクロアレイにおいて測定される、請求項75記載の方法。
- 約1個〜10個の接着テープが皮膚に当てられ、外される、請求項75記載の方法。
- 約1個〜8個の接着テープが皮膚に当てられ、外される、請求項75記載の方法。
- 1個〜5個の接着テープが皮膚に当てられる、請求項75記載の方法。
- 以下の段階を含む、ヒト被験体の疾患または病的状態を示す発現プロファイルを同定するための方法:
a)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で、疾患または病的状態に冒された皮膚の領域に接着テープを当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階;ならびに
b)疾患または病的皮膚状態試料および影響をうけていない試料について発現パターンを測定するために、試料由来のRNA分子、またはそれらの増幅産物をマイクロアレイに適用する段階であって、発現プロファイルにおける差が疾患または病的状態皮膚の発現プロファイルを示している、段階。 - 疾患または病的状態が皮膚炎である、請求項82記載の方法。
- 疾患または病的状態が乾癬である、請求項82記載の方法。
- 皮膚から表皮試料を単離するための方法であって、表皮試料を単離するのに十分な様式で接着テープを皮膚の標的領域に当てる段階を含み、テープがゴム系接着剤を含み、かつテープが柔軟であり、それにより接着テープに付着した表皮試料を単離する段階を含む、方法。
- テープがゴム系テープである、請求項85記載の方法。
- テープがポリウレタンフィルム上にゴム系接着剤を含む、請求項86記載の方法。
- テープが、約1回〜10回、皮膚に当てられ、外される、請求項85記載の方法。
- テープが、約1回〜8回、皮膚に当てられ、外される、請求項85記載の方法。
- テープが、約1回〜5回、皮膚に当てられ、外される、請求項85記載の方法。
- 以下の段階を含む、皮膚由来の表皮試料から核酸分子を単離するための方法:
a)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で接着テープを皮膚の標的領域に当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含み、テープが非極性ポリマーを含み、かつテープが柔軟である、段階;および
b)表皮試料から核酸分子を単離する段階。 - テープがゴム系テープである、請求項91記載の方法。
- テープがポリウレタンフィルム上のゴム系接着剤を含む、請求項92記載の方法。
- 以下の段階を含む、疾患または病的状態についての処置に対する応答について予測皮膚マーカーを同定するための非侵襲的方法:
a)核酸分子を含む表皮試料を単離するのに十分な様式で、第一時点において、疾患または病的状態に冒された被験体の皮膚に接着テープを当てる段階;
b)疾患または病的状態について被験体を処置する段階;
d)疾患または病的状態が処置に応答したかどうかを測定する段階;および
e)表皮試料における核酸分子の発現が処置に対する応答を予測しているかどうかを決定し、それにより処置に対する応答についての皮膚マーカーを同定する段階。 - 疾患または病的状態が乾癬である、請求項94記載の方法。
- 処置がエタネルセプト(Etanercept)、クロベタゾール(Clobetasol)、アレファセプト(Alefacept)、または狭帯域紫外線B光である、請求項95記載の方法。
- 以下の段階を含む、疾患または病的状態についての処置に対する応答を予測するための非侵襲的方法:
a)核酸分子を含む表皮試料を単離するのに十分な様式で、疾患または病的状態に冒された被験体の皮膚に接着テープを当てる段階;
b)表皮試料において標的核酸分子を検出する段階であって、標的核酸分子の発現が処置に対する応答を示しており、それにより、疾患または病的状態についての処置に対する応答を予測する、段階。 - 疾患または病的状態が乾癬である、請求項97記載の方法。
- 処置がエタネルセプトまたは狭帯域紫外線光である、請求項98記載の方法。
- 以下の段階を含む、作用物質の皮膚への効果を測定するための方法:
a)皮膚の標的領域を作用物質と接触させる段階;
b)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で接着テープを皮膚の標的領域に当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階;および
c)皮膚の標的部位についての発現プロファイルを測定する段階であって、発現プロファイルが皮膚の状態を示しており、それにより作用物質の皮膚への効果を測定する、段階。 - 作用物質が生体分子である、請求項100記載の方法。
- 作用物質が組み合わせライブラリーから同定される、請求項100記載の方法。
- 作用物質が有機低分子である、請求項100記載の方法。
- 作用物質がスキンケア製品である、請求項100記載の方法。
- 段階d)の前に、試料由来の核酸分子またはそれらの増幅産物をマイクロアレイに適用する段階をさらに含む、請求項100記載の方法。
- 方法が臨床試験の一部として行われる、請求項100記載の方法。
- 発現プロファイルが少なくとも100個の遺伝子の発現レベルを含む、請求項100記載の方法。
- 接着テープが約1回〜10回、皮膚に当てられ、外される、請求項100記載の方法。
- 以下の段階を含む、ヒト被験体において刺激性接触皮膚炎(ICD)とアレルギー性接触皮膚炎(ACD)を区別する方法:
a)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で皮膚炎に冒された皮膚の領域に接着テープを当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階;および
b)ICDまたはACDと関連した遺伝子の発現レベルを測定し、それによりICDとACDを区別する段階。 - 単離されたRNAまたはその増幅産物が、発現レベルを測定するためにマイクロアレイに適用される、請求項109記載の方法。
- 少なくとも10個の遺伝子の発現レベルがマイクロアレイを用いて測定され、少なくとも10個の遺伝子のそれぞれについてのICD対ACDについて異なる発現レベルが、ICDまたはACDに冒された皮膚を同定する、請求項110記載の方法。
- 少なくとも100個の遺伝子の発現レベルがマイクロアレイを用いて測定され、少なくとも100個の遺伝子のそれぞれについてのICD対ACDについて異なる発現レベルが、ICDまたはACDに冒された皮膚を同定する、請求項111記載の方法。
- 少なくとも1000個の遺伝子の発現レベルがマイクロアレイを用いて測定され、少なくとも1000個の遺伝子のそれぞれについてのICD対ACDについて異なる発現レベルが、ICDまたはACDに冒された皮膚を同定する、請求項112記載の方法。
- 約1個〜10個の接着テープが皮膚に当てられ、外される、請求項109記載の方法。
- 以下を含む、キット:
a)ゴム系接着剤を含む柔軟な接着テープ;および
b)生体分子についてのプローブ。 - テープがポリウレタンフィルム上のゴム系接着剤を含む、請求項115記載のキット。
- ポリウレタンフィルムが3.0ミルのフィルムである、請求項116記載のキット。
- プローブがバイオアレイの一部である、請求項115記載のキット。
- プローブが、TNFα、IFNγ、CD2、IL-12B、Krt-10、Krt-16、Krt-17およびIL-23Aから選択されるタンパク質をコードする標的核酸分子を結合する、またはコードされたタンパク質を結合する、請求項115記載のキット。
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