JP2007531529A - 皮膚疾患および病的皮膚状態を分析するためのテープ剥ぎ取り法 - Google Patents

皮膚疾患および病的皮膚状態を分析するためのテープ剥ぎ取り法 Download PDF

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Abstract

本発明は、刺激された皮膚および乾癬のような皮膚疾患ならびに病的皮膚状態を検出、モニターおよび診断するための非侵襲的方法を提供する。方法は、1つまたは複数の皮膚マーカーの表皮試料における発現を分析するためにテープ剥ぎ取りを用いることを含む。例証的な例において、テープ剥ぎ取りは、ゴム系接着剤を有する柔軟なテープを用いて行われる。さらに、本発明は、乾癬または皮膚炎のような皮膚疾患についての治療に対する応答を予測またはモニターするための方法を提供する。最後に、方法は、マイクロアレイの使用を含むことが出来る。

Description

発明の分野
本発明は、一般的には、非侵襲的診断方法に、ならびにより具体的には、皮膚試料由来の拡散を単離および分析するための方法に関する。
発明の背景
皮膚疾患は、今日、大きな保健医療課題を示している。例えば、5百万人を超える米国人および世界中で1億人を超える人々が、乾癬を患っている。皮膚疾患の検出、診断およびステージングは、それの管理の重要な局面である。現在の診断方法は、主に、可視的観察および生検に頼っている。しかしながら、可視的観察に頼る皮膚疾患についての検出方法は、多くの皮膚疾患を診断することに効果的ではなく、臨床症状後までには疾患を検出しない。生検のような侵襲的方法は、検査されることになっている被験体にとって外傷性であるだけでなく、それらはまた、感染のリスクを増加させる。さらに、侵襲的方法は、表面反応に関与する細胞である皮膚の表面上の細胞の濃縮試料を供給しない。
皮膚疾患の検出および診断は、患者管理のためだけでなく、新しい皮膚疾患治療剤および新しいスキンケア製品の安全性ならびに効力を評価するために重要である。新しい治療剤は、現治療剤が十分には効果的ではない多くの皮膚疾患に必要とされている。さらに、診断方法は、被験体の皮膚疾患の根底にある特定の遺伝的変化に関する重要な情報を提供する。これらの遺伝的変化を同定することは、可能性のある薬物標的を同定し、人が特定の治療剤に応答するかどうかを決定するにおいて重大な意味をもちうる。
新しい治療剤を評価することに加えて、検出および診断方法はまた、新しいスキンケア製品の安全性を評価するために重要である。化粧品を含むスキンケア製品は、たいていの人々の毎日の身繕い習慣の重要な部分である。平均的成人は、毎日少なくとも7つの異なるスキンケア製品を使用する。現在、すべての市販のスキンケア製品は、安全性試験を受けることが要求されている。これらの試験は、臨床急性一次刺激(Clinical Acute Primary Irritation)および14日累積刺激プロトコール(14-day Cumulative Irritation Protocols)、続いて感作(接触アレルギー)を検出するためのヒト反復傷害パッチ試験(Human Repeat Insult Patch Testing)(HRIPT)の方式をとる。可視的分析は、Richard Berger and James Bowman, A reappraisal of the 21-day cumulative irritancy test in man, J. Toxicol-Cut and Ocular Toxicol 1(2), 101-107 (1982)（非特許文献1）に記載されているように試験結果を決定するために用いられる。それゆえに、アレルギー反応は、それらが可視反応に現れるまで検出されない。
検出の相対的に遅い段階に関する問題に加えて、可視的分析は、刺激反応またはアレルギー反応として分類するのが困難であるかすかな皮膚反応を区別できない。この分類区別は、新しいスキンケア製品を開発し続けるかどうかを決定するための根拠として用いられうるため、非常に重要である。刺激の問題は、改質により対応されうるが、感作(すなわち、アレルギー反応)の問題は、安全性および賠償懸念のためにより思い切った製品改造行動を必要としうる。それゆえに、刺激性皮膚炎のアレルギー性皮膚炎としての誤診は、安全かつ効力のあるスキンケア製品を、それから恩恵を受けうる人々が利用できるのを妨げうる。
Richard Berger and James Bowman, A reappraisal of the 21-day cumulative irritancy test in man, J. Toxicol-Cut and Ocular Toxicol 1(2), 101-107 (1982)
発明の概要
本発明は、バイオマーカーの直接的な定量的および定性的評価を可能にする簡単なテープ剥ぎ取り手順により皮膚表面からDNAまたはメッセンジャーRNAのような核酸を回収するための非侵襲的アプローチに基づいている。方法は、可視的検出方法を用いて得ることができない、価値のある遺伝的情報を提供する。さらに、テープ採取されたRNAは、生検により回収されたRNAに質および有用性において匹敵することが示されているが、方法は、生検試料を用いて得られない皮膚の最外層の細胞に関する情報を提供する。最後に、方法は、生検よりはるかに外傷性が少ない。
方法は、刺激性接触皮膚炎中の遺伝子発現の分析に適用された。モデル系としてSLS刺激を用いて、IL-19およびIL-8のmRNAにおける変化をアッセイすることの有用性が、刺激性皮膚反応の表示として試験された。両方の試料採取方法はRNAの回収を可能にし、その分析が皮膚の刺激を明らかにすることが示されている。生検およびテープ採取されたRNAが、異なる細胞集団由来である可能性が高いこと、ならびにテープ採取が、表皮を試料採取することおよび選り抜きの示差的に制御された表皮バイオマーカーを同定することのための効率的方法であることを、データは示している。さらに、本明細書に提供された実施例は、DNAマイクロアレイへのハイブリダイゼーションのためのテープ採取されたRNAの増幅の成功を例証している。これらの実験は、被験体における反復試験部位間の有意な遺伝子発現レベル差を示さず、男性と女性の被験体の間で極微の差を示している。正常と24時間1%SLSで閉塞された皮膚の間のアレイ作成RNAプロファイルが比較され、SLS処理は、結果として、1,700個より多い遺伝子の発現レベルにおいて統計学的に有意な変化を生じたことが観察された。これらのデータは、テープ採取が、マイクロアレイ分析のためにヒト皮膚からRNAを捕獲するための非侵襲的方法として有用であることを例証している。
従って、接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で接着テープを皮膚の標的領域に当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階を含む被験体の皮膚を特徴付けるための方法が本明細書に提供されている。発現が皮膚疾患または病的皮膚状態の情報を与える少なくとも1つの核酸分子が、表皮試料において検出される。テープ剥ぎ取りを用いて皮膚を特徴付ける方法は、以下のようないくつかの適用がある：(i)疾患分類/下位分類；(ii)疾患重症度および進行をモニターすること；(iii)処置効力をモニターすること；ならびに(iv)最も有益な処置計画の予測。これらの適用のすべては、それら自身、本明細書に開示された態様を表しているのだが、別な方法で回収する(すなわち、生検の使用を通して)のが困難または実際的ではない情報を回収するための非侵襲的試料採取の概念に依存する。この情報は、皮膚表面に近い皮膚細胞のRNAに含まれる。一つの例において、表VIIに列挙された遺伝子の1つもしくは複数の発現またはそれらの組み合わせは、皮膚を特徴付けるために表皮試料において検出される。この例示的方法は、特に、皮膚の刺激された状態に関する情報を得るために有用である。
本発明の特定の態様は、乾癬に苦しむ対象において、乾癬病変を含む皮膚領域の表皮から容易に得られる核酸、例えば、RNA、はその疾患に関する情報を提供する。従って、本発明は、ヒト被験体の乾癬病変の表皮試料から核酸分子を単離または検出するための非侵襲的方法を提供する。方法は、接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で、接着テープを被験体の乾癬病変に当てる段階を含む。表皮試料は、その後単離されるおよび/または直接的に検出される核酸分子を含む。乾癬病変を剥ぎ取る方法は、例えば、乾癬患者の処置に対する応答性をモニターするために、用いられうる。さらに、方法は、治療に対する応答を予測する遺伝子を同定するために用いられうる。
他の態様は、非極性の柔軟な接着テープ、特に、ゴム系接着剤を含む柔軟なテープ、は接着テープの他の型より効果的である。ゴム系接着剤を含む柔軟なテープを用いる、わずか10個ほどまたはそれ未満のテープ剥ぎ取り、および特定の例において、わずか4個ほどまたは1個までものテープ剥ぎ取り、は皮膚の表皮層から核酸分子を単離および/または検出するために用いられうる。
従って、接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で接着テープを皮膚の標的領域に当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含み、かつテープがゴム系接着剤を含み、柔軟である、段階を含む、皮膚由来の表皮試料から核酸分子を単離および/または検出するための方法が本明細書に提供されている。
もう一つの態様において、本発明は、皮膚試料における増幅された核酸の遺伝子発現を定量的に評価するための方法であって、そのような方法における前の問題点を克服する方法を提供する。従って、接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で、接着テープを皮膚の標的領域に、および皮膚の非罹患領域に、当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階；ならびに標的領域試料および正常領域試料のそれぞれについて、類似した試料容量および類似したプローブを用いる同じ実験において、標的核酸分子および対照核酸分子を増幅する段階であって、標的領域対正常領域での対照核酸分子に対する標的核酸分子の相対的増幅レベルにおける変化が、標的領域での標的核酸分子の遺伝子発現における変化を示している、段階を含む、遺伝子発現における変化を検出するための方法が本明細書に提供されている。
さらに、表皮試料を単離するのに十分な様式で、乾癬について処置されることになっている被験体の皮膚に接着テープを当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階；および核酸分子を含む試料において標的核酸分子を検出する段階を含む、乾癬についての処置に対する被験体の応答を検出するための方法が、本明細書に提供されている。標的核酸分子の発現は、乾癬に関する情報を与える。
もう一つの態様において、本発明は、乾癬病変、または炎症を起こしているのではないかと疑われる皮膚の標的領域由来の表皮試料のような、表皮試料からの核酸の単離および検出のためのキットを提供する。キットは、本明細書に提供された方法を行うための接着テープを含む。従って、一つの態様において、少なくとも一部、非極性ポリマーでできている柔軟な接着テープを含むキットが本明細書に提供される。特定の局面において、テープはゴム系テープである。
発明の詳細な説明
本発明は、病理学的および生理学的バイオマーカーの直接的な定量的ならびに定性的評価を可能にする簡単なテープ剥ぎ取りによる皮膚表面からDNAまたはRNAのような核酸を回収または分析するための非侵襲的アプローチに基づいている。テープ採取されたRNAは、生検により回収されたRNAに、質および有用性において匹敵することが示されている。本方法は、患者へ、ほとんどまたは全く、不快を引き起こさない。それゆえに、それは、医師の診療所において日常的に、例えば、ケア試験の点について、行われうる。従って、テープ剥ぎ取りを用いる表皮試料からの核酸の非侵襲的単離および/または検出のための方法ならびにマーカーが本明細書に提供されている。
方法は、乾癬皮膚または刺激された皮膚のような、罹患しているまたは病的状態にある皮膚の分析に効果的である。方法は、肉眼では同じ様に見える罹患皮膚における分子の違いを特徴付けるために用いられうることが、本明細書に示されている。さらに、方法は、処置に対する皮膚の応答をモニターするために用いられうることが本明細書に示されている。
方法は、特に、テープ剥ぎ取り方法においてのような、「正常な」核酸試料を得ることが困難である状況において、遺伝子発現に関する有用な情報を提供する、ΔCt値を利用することができる。本開示の前には、ΔCt値は、遺伝子発現分析に適切ではないということが教えられていた。
本発明の方法は、DNAおよびRNAを含むポリヌクレオチドを得るための迅速、非侵襲的な皮膚試料採取方法を含む。例えば、mRNAは、典型的には、遺伝子発現が分析される方法において単離される。核酸分子の改善された単離は、ゴム系接着剤を含む柔軟なテープを用いて得られる。
従って、本明細書に提供された方法において、表皮試料は、皮膚をテープ剥ぎ取りすることにより得られ、核酸分子を含むテープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で、接着テープを皮膚に当てる段階を含む。本明細書に提供されたテープ剥ぎ取り方法、例えば、4つの個々のテープの単回適用、は結果として、非病変皮膚のてかりを生じず、それに従って、生存可能な表皮をむき出しにしない。対照的に、薄片生検は、表皮の細胞(主として、ケラチン生成細胞およびメラニン形成細胞および免疫細胞)だけでなく、その上、真皮上層由来の線維芽細胞も含むことが予想される。
「生体分子」は、天然で見出される特異的結合ペア、または天然で見出される分子由来である。本明細書に用いられる場合、用語「特異的結合ペアメンバー」とは、特異的結合ペアのもう一つのメンバー、を特異的に結合する、または、へ選択的にハイブリダイズする、または、と相互作用する分子を指す。特異的結合ペアメンバーは、例えば、分析物および生体分子を含む。
「核酸」は、DNA、RNA、一本鎖、二本鎖、または三本鎖、およびそれらの任意の化学修飾体を意味する。実質的にいかなる核酸の修飾も企図される。「核酸」は、10、20、30、40、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、150,000、200,000、500,000、1,000,000、1,500,000、2,000,000、5,000,000塩基長またはさらにそれ以上の、完全長染色体DNA分子までの、ほとんど任意の長さでありうる。遺伝子の発現を分析する方法について、試料から単離された核酸は、典型的には、RNAである。
用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合により連結された2個以上のアミノ酸を意味するために本明細書に広く用いられる。用語「断片」または「タンパク分解性断片」もまた、ポリペプチドにおけるタンパク分解性反応により生成されうる生成物、すなわち、ポリペプチドにおけるペプチド結合の切断により生成されたペプチド、を指すために本明細書に用いられる。本発明のポリペプチドは、少なくとも約6個のアミノ酸を含み、通常には約10個のアミノ酸を含み、15個以上のアミノ酸、特に20個以上のアミノ酸、を含むことができる。用語「ポリペプチド」は、分子を含むアミノ酸の特定のサイズまたは数を示唆するために本明細書では用いられないこと、および本発明のペプチドが、数個のアミノ酸残基またはそれ以上まで含むことができることは、認識されるべきである。タンパク質は、リン酸基または糖部分のような、アミノ酸以外の他の化学的部分を含むポリペプチドである。
「皮膚病変」は、皮膚上の創傷または皮膚への傷害である。「斑」は、皮膚上のやや平らな隆起した斑である。「鱗屑」は、皮膚表面上の薄片である。
本出願を通して、用語「増殖性皮膚疾患」とは、皮膚組織の望ましくないまたは異常な増殖により特徴付けられる皮膚の疾患/障害を指す。これらの状態は、典型的には、表皮細胞増殖または不完全な細胞分化により特徴付けられ、例えば、X染色体性魚鱗癬、乾癬、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、表皮剥離性角質増殖症、および脂漏性皮膚炎を含む。例えば、表皮発育異常症は、表皮の不完全な発育の一形態である。もう一つの例は、自然発生的にまたは外傷の部位において、ブレブおよびブラの形成をもつ表皮の緩んだ状態を指す「表皮剥離」である。
本明細書に用いられる場合、用語「乾癬」とは、皮膚の制御機構を変える過剰増殖性皮膚疾患を指す。特に、表皮増殖、皮膚の炎症性応答、ならびにリンフォカインおよび炎症性因子のような制御分子の発現における一次的および二次的変化を含む病変が形成される。乾癬の皮膚は、表皮細胞のターンオーバーの増加、肥厚した表皮、異常な角質化、皮膚層への炎症性細胞浸潤物、結果として、基底細胞周期における増加を生じる表皮層への多形核白血球浸潤により形態的に特徴付けられる。さらに、角化性およびパラ角化性細胞が存在する。
用語「試料」とは、被験体の皮膚由来の任意の調製物を指す。例えば、上記の非侵襲的方法を用いて得られた細胞の試料は、本発明の方法のための、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または脂質、好ましくはポリヌクレオチドおよびポリペプチド、最も好ましくはポリヌクレオチドのような核酸分子、を単離するために用いられうる。本発明のための試料は、典型的には、乾癬もしくは皮膚炎のような疾患または病的状態の結果であるのではないかと疑われる、皮膚病変から採取される。試料は、本明細書に考察された非侵襲的皮膚試料採取方法を用いて疑わしい病変の皮膚表面から採取される。
用語「皮膚」とは、真皮および表皮からなる、身体の外側の保護被覆を指し、汗腺および脂腺、加えて毛包構造を含むと理解される。本出願を通して、形容詞の「皮膚の」が用いられうり、一般的に、それらが用いられる文脈に応じて適切に、皮膚の限定語を指すことを理解されるべきである。好ましい態様において、皮膚は、哺乳動物の皮膚である。例証的態様において、皮膚はヒト皮膚である。
本明細書に提供されたテープ剥ぎ取り方法は、典型的には、1回または複数回、接着テープを被験体の皮膚に当て、かつ接着テープを被験体の皮膚から取り外す段階を含む。特定の例において、約1〜10回、接着テープは、皮膚に当てられ、皮膚から取り外される。または、約10個の接着テープが、皮膚に当てられ、皮膚から取り外されうる。これらの接着テープは、その後、さらなる分析のために混合される。従って、接着テープが、10回、9回、8回、7回、6回、5回、4回、3回、2回もしくはは1回、標的部位に当てられ、かつ取り外されうる、および/または10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個、もしくは1個の接着テープが、標的部位に当てられかつ取り外されうる。一つの例証的な例において、接着テープは、約1回と8回の間、もう一つの例において、1回と5回の間、皮膚に当てられ、もう一つの例証的な例において、テープは、4回、皮膚に当てられ、かつ取り外される。
テープ剥ぎ取りについて、テープの同じ条片は、乾癬病変のような標的部位に、繰り返し、当てられ、かつ取り外されうる。しかしながら、例証的な態様において、接着テープの新しい一片が、逐次的に、皮膚の標的部位に当てられる。部位を試料採取するために用いられる個々のテープ条片は、その後、核酸抽出のようなさらなる処理のために1つの抽出容器へ混合されうる。一つの例証的な例において、接着テープは、約1回と8回の間、もう一つの例において、1回と5回の間、皮膚に当てられ、もう一つの例証的な例において、テープは、4回、皮膚に当てられ、かつ取り外される。
用いられる接着テープの屈曲性、柔軟性および組成、テープを取り外す前の皮膚に接着するようにさせておく時間、皮膚に当てられている場合にテープへ加えられる力、分析されることになっている遺伝子産物の普及率、皮膚の疾患状態、患者/患者の変動性のような因子が、典型的には、十分な核酸が表皮試料に存在することを保証するために、特定のテープ剥ぎ取り方法に有用なプロトコールを決定するにおいて、考慮される。テープに剥ぎ取られる試料は、限定されるわけではないが、皮膚の表面に限定される組織を含み、優先的には、軟毛包、ならびに脂腺、エクリンおよび汗管を裏打ちする細胞(すなわち、角質層および表皮に関連した付属器構造体)、加えて、角質細胞を回収する。テープ剥ぎ取りは、組織がピカピカ光る前にテープ剥ぎ取りを終わることにより、生存可能な表皮が露出される前に停止される。それゆえに、テープ剥ぎ取り方法は、「非侵襲的」方法とみなされる。表皮試料を単離するのに十分なテープ剥ぎ取りは、テープ剥ぎ取りが、組織がピカピカ光る(すなわち、光沢があるようになる、「濡れている」または反照しているように見える)前に停止される、RNA試料を得るのに十分な回数、皮膚に行われるテープ剥ぎ取りである。
本発明の特定の局面は、それ自身、本発明の態様であるのだが、非極性の柔軟な接着テープ、特に、プラスチック系接着テープ、は接着テープの他の型より皮膚から核酸試料を得るのに効果的である。非極性の柔軟な接着テープを用いる、わずか10回ほどまたはそれ未満のテープ剥ぎ取り、および特定の例においてわずか4回ほどまたは1回までものテープ剥ぎ取り、が分析されうる核酸を得るために用いられうる。方法は、遺伝子発現分析のために、皮膚の表皮からRNA試料を単離するために、本明細書に提供された様々な態様の一部として用いられうる。
従って、接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で、接着テープを皮膚の標的領域に当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含み、テープがゴム系接着剤を含み、かつテープが柔軟である、段階を含む、皮膚において遺伝子の発現を検出する方法が本明細書に提供されている。表皮試料における核酸分子は、その後、検出される。核酸分子は、特定の例において、核酸分子を検出するためにマイクロアレイに適用される。
もう一つの態様において、接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で、接着テープを皮膚の標的領域に当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含み、テープが非極性ポリマー接着剤を含み、かつテープが柔軟である、段階を含む、皮膚由来の表皮試料から核酸分子を単離するための方法が本明細書に提供されている。核酸分子は、その後、表皮試料から単離される。例証的な例において、非極性ポリマー接着剤は、ゴム系接着剤である。
ゴム系接着剤は、例えば、合成ゴム系接着剤でありうる。例証的な例におけるゴム系接着剤は、高い引き剥がし、高い剪断、および高い粘着性を有する。例えば、ゴム系接着剤は、D-squame(商標)のようなアクリル系テープのピーク力粘着性より少なくとも25%、50%、または100%大きいピーク力粘着性を有しうる。D-squame(商標)は、2ニュートンのピーク力を有することが見出されており、本明細書に提供された方法に用いられるゴム系接着剤のピーク力は、4ニュートン以上でありうる。さらに、ゴム系接着剤は、アクリル系テープの2倍、5倍、または10倍大きい接着力を有しうる。本明細書に提供されたゴム系テープは、テクスチャ分析器を用いて、約0.01ニュートンメートルの接着力を有しうるに対して、例えば、D-squame(商標)は、0.0006ニュートンメートルの接着力を有することが見出されている。さらに、特定の例証的な例において、本明細書に提供された方法に用いられる接着剤は、他のゴム系接着剤、特に医療用に用いられるものおよびダクトテープより高い引き剥がし、剪断および粘着性を有する。
より高い引き剥がし、剪断および粘着性を有することに加えて、ゴム系接着剤は、アクリル系接着剤より疎水性である。さらに、例証的な例におけるゴム系接着剤は、生体分子に対して、ならびに生体分子、特にDNAおよびRNAのような核酸、を単離するために用いられる化学物質に対して、不活性である。最後に、接着剤は、D-squame(商標)のような他のテープと比較して相対的に軟らかくありうる。
ゴム系接着剤は、テープを柔軟かつ屈曲にさせる支持体、典型的にはフィルム、上にある。特定の局面において、テープは柔らかくかつ柔軟でありうる。「柔軟な」テープは、容易に曲げられるまたは形づくられるテープである。「柔らかくかつ柔軟な」テープは、容易に曲げられるまたは形づくられる、かつ圧力または重さに対してたやすく屈するテープである。フィルムは、テープが柔軟であり、かつゴム系接着剤と共に用いられうるという条件で、多くの可能なポリマーのいずれからでも作製されうる。厚さは、テープが柔軟なままであるという条件で、変わりうる。例えば、テープは、厚さが0.5ミル〜10ミル、厚さが1.0〜5.0ミルでありうる。一つの例において、テープは、3.0ミルのポリウレタンフィルム上にゴム系接着剤を含む。例えば、フィルムは、Adhesives Research, Inc(Glen Rock, PA)から入手できる皮膚採取テープ(製品No. 90068)のようなポリウレタンフィルムでありうる。
実施例は、本明細書に提供されたテープ剥ぎ取り方法を例証している。一般的に、皮膚部位を接着テープに接触させる前に、剥ぎ取られるべき皮膚部位は、例えば、アルコールのような殺菌性洗剤を用いて、清潔にされる。次に、テープは、圧力で皮膚部位に当てられる。圧力は、ほんの一瞬、加えられうるが、1秒間と5分間の間、典型的には10秒間と45秒間の間、加えられうる。特定の例証的な例において、テープは、各テープ剥ぎ取りに対して30秒間、加えられる。皮膚部位に加えられる圧力の量および剥ぎ取りのための時間の長さは、特定の適用について理想的な圧力および時間を同定するために変動されうることは理解されているものと思われる。一般的に、圧力は、接着テープを皮膚へ手で押しつけることにより加えられるが、尖っていない平らな物体のような物体が、皮膚、特に、乾癬に苦しんでいる被験体の非病変皮膚のような、皮膚から核酸試料を得ることがより困難である皮膚の領域についての、にテープを当てるにおいて援助するように用いられうる。
実質的にいかなる接着テープのサイズおよび/または形ならびに標的皮膚部位のサイズおよび形も、それぞれ、本発明の方法により、用いられかつ分析されうる。例えば、接着テープは、10ミリメートルと100ミリメートルの間の直径、例えば、直径が15ミリメートルと25ミリメートルの間、の円板へと製作されうる。接着テープは、約50 mm2と1000 mm2の間、約100 mm2〜500 mm2または約250 mm2、の表面積をもちうる。
本明細書に提供された実施例に例証されているように、生検およびテープ剥ぎ取りは、等価の試料採取方法でありうり、それゆえに、同一の結果を生じることが予想されるはずである。理論に限定されることを意図されないが、テープ剥ぎ取りは、「テープ採取」とも呼ばれているが、皮膚表面に限定され、それゆえに、優先的に、軟毛包、ならびに脂腺、エクリンおよび汗管を裏打ちする細胞、加えて、角質細胞(RNAを含まないことが予想される)を回収しうる。本明細書に提供されるテープ剥ぎ取り方法は、典型的には、10回未満のテープ剥ぎ取り、例えば、4個の個々のテープの単回適用、を利用するが、結果として、非病変皮膚のてかりを生じず、それに従って、生存可能な表皮をむき出しにしない。従って、本明細書に提供されるテープ剥ぎ取り方法は、表皮試料を供給する。対照的に、薄片生検は、外科用メスの刃が表面から皮膚の薄片をスライスするために用いられる(かつ、典型的には、結果として、出血を生じるが、縫合する必要はない)のだが、表皮の細胞(主として、ケラチン生成細胞およびメラニン形成細胞および免疫細胞)だけでなく、真皮上層由来の線維芽細胞を含むことが予想される。薄片生検と比較した、テープ剥ぎ取りにより運ばれる表面表皮の可能性のある濃縮は、テープの表面積が284 mm2であり、一方、2x2 mm 薄片生検の表面積が4 mm2であることを考慮することにより認識されうる。従って、テープ採取された細胞は、薄片生検に見出される細胞の分集団の濃縮を表す。表IおよびIVに示されたデータは、テープおよび生検に採取されたRNAが異なる細胞集団由来であるという仮説を裏付けている。
ヒト皮膚の表皮は、皮膚組織のいくつかの別個の層を含む。最も深い層は、円柱細胞からなる基底層である。覆っている層は、多面細胞から構成される有棘層である。有棘層から押し上げられた細胞は、平板化され、ケラトヒアリン顆粒を合成して、顆粒層を形成する。これらの細胞が外へ移動する時、それらは、それらの核を失い、ケラトヒアリン顆粒は、張原線維と融合かつ混和する。これは、透明層と呼ばれる透明な層を形成する。透明層の細胞は、密接に詰められている。細胞が透明層から上へ移動する時、それらは、多層の不透明な鱗屑へ圧縮される。これらの細胞はすべて、完全にケラチンで満たされて、核を含むすべての他の内部構造を喪失している細胞の平板化されたレムナントである。これらの鱗屑は、表皮の外層、角質層、を構成する。角質層の下部において、細胞は密接に詰められて、お互いに強く接着するが、層のより高い所では、それらは、ゆるく詰められ、最終的には、表面で剥がれ落ちる。
テープ剥ぎ取り方法を用いて得られる皮膚試料は、付属器構造体を含む細胞を含む表皮細胞を含む。特定の例証的な例において、試料は、大部分は表皮細胞を、または全く表皮細胞だけまでも、含む。表皮は、大部分は、ケラチン生成細胞(>90%)からなり、それらは、基底層から分化し、細胞組織のレベルを減少させている様々な層を通して外へ移動し、角質層の角化細胞になる。表皮の再生は、非病変皮膚において20〜30日間ごとに起こる。表皮に存在する他の細胞型は、メラニン形成細胞、ランゲルハンス細胞、およびメルケル細胞を含む。本明細書での実施例に例証されているように、本発明のテープ剥ぎ取り方法は、特に、表皮試料を単離するにおいて効果的である。
核酸は、当業者に周知の任意の数の手段により、溶解された細胞および細胞物質から単離されうる。例えば、限定されるわけではないが、RNeasy(商標)(Qiagen, Valencia, CA)およびTriReagent(商標)(Molecular Research Center, Inc, Cincinnati, OH)を含む、ポリヌクレオチドを単離するためのいくつかの市販されている製品が用いられうる。単離されたポリヌクレオチドは、その後、サイトカインをコードするポリヌクレオチドを含む特定の核酸配列について試験またはアッセイされうる。核酸試料内の標的核酸を検出する方法は、当技術分野において周知であり、本明細書でより詳細に考察されているように、マイクロアレイ分析を含みうる。
もう一つの態様において、以下の段階を含む、疾患または病的状態への処置に対する応答についての予測的皮膚マーカーを同定するための非侵襲的方法が本明細書に提供されている：核酸分子を含む表皮試料を単離するのに十分な様式で、第一時点で、疾患または病的状態に冒された被験体の皮膚に接着テープを当てる段階、および疾患または病的状態について被験体を処置する段階。その後、疾患または病的状態が処置に対して応答したかどうか、およびそうである場合には、表皮試料における核酸分子の発現が処置に対する応答を予測するかどうかが測定される。
表皮試料における核酸分子の発現は、第一の時点での核酸分子の発現が、処置に応答しない被験体と比較して処置に応答する被験体において異なる場合には、処置に対する応答を予測する。核酸の発現と処置に対する被験体の応答との間に統計学的に有意な関連を同定するために、様々な統計学的解析が行われうることは、理解されているものと思われる。例えば、特定の例における核酸の発現は、処置に応答しないであろう被験体において上昇している。さらに、核酸の発現は、処置に対する応答のレベル、例えば、処置に対する部分的または一時的応答対完全な応答、を予測することができる。
もう一つの態様において、核酸分子を含む表皮試料を単離するのに十分な様式で、疾患または病的状態に冒された被験体の皮膚に接着テープを当てる段階を含む、疾患または病的状態への処置に対する応答を予測するための非侵襲的方法が本明細書に提供されている。発現が処置に対する応答を示しており、それにより、疾患または病的状態への処置に対する応答を予測する、標的核酸分子が、表皮試料において検出される。
予測的皮膚マーカー、これらの態様において標的核酸分子とも呼ばれているが、を同定すること、または予測的皮膚マーカーを検出することにより処置に対する応答を予測することに向けられた態様についての疾患は、実質的にいかなる皮膚疾患でもありうる。例えば、皮膚疾患は、乾癬、または刺激性接触皮膚炎もしくはアレルギー性接触皮膚炎のような皮膚炎でありうる。疾患が乾癬である局面において、処置は、例えば、局所的処置、光線療法、全身性薬物療法、または生物学的製剤でありうる。特定の処置は、表VIIIに提供されている。
組織由来の試料は、当技術分野において周知の任意の数の手段により単離されうる。試料を単離するための侵襲的方法は、例えば血液試料採取中における、針の使用、および様々な組織の生検を含む。これらの技術の侵襲的性質のために、死亡および罹病のリスクの増加がある。本発明の方法およびキットは、皮膚試料を得るために非侵襲的試料採取方法を用いる。特定の例において、これらの方法は、追加の情報を提供するために、皮膚生検のような従来の方法と共に用いられる。
上で述べられているように、テープ採取された細胞は、薄片生検に見出される細胞の分集団の濃縮を表しているように思われる。従って、特定の局面において、本明細書に提供されているテープ剥ぎ取り方法に加えて、生検は、乾癬病変部位のようなテープ剥ぎ取りの部位において、またはもう一つの皮膚部位において、採取されうる。生検由来の核酸分子は、単離されかつ分析されうる。生検データの解析は、乾癬病変に関する追加の情報を提供するためにテープ剥ぎ取り方法からのデータの解析と組み合わせられうる。
特定の局面において、非病変表皮組織由来の核酸分子は、接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で、接着テープを被験体の皮膚に当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含み、かつ皮膚が検査されるべき疾患に影響をうけていない、段階により、得られる。その後、核酸分子は、罹患していない皮膚の表皮試料から単離かつ検出される。
特定の局面において、非病変皮膚は、上腕または上背由来でありうる。これらの部位は、テープ剥ぎ取りを用いて核酸分子の相対的に豊富な量を供給するように思われる。例えば、テープ剥ぎ取りは、三角筋より上、または肩甲棘より上の上背および耳周囲領域の非病変皮膚上で行われうる。テープ剥ぎ取りは、一般的に、皮膚表面を含み、それゆえに、優先的には、軟毛包、ならびに脂腺、エクリンおよび汗管を裏打ちする細胞(すなわち、付属器構造体)、加えて、角質細胞(RNAを含まないことが予想される)を回収しうる。
本明細書に提供された特定の態様は、特定の遺伝子の発現が治療に対する応答をモニターするために用いられうるという発見に一部、基づいている。従って、もう一つの態様において、第一の時点および第二の時点において接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で、第一の時点および少なくとも第二の時点において、疾患または病的状態について処置されることになっている被験体の皮膚へ接着テープを当てる段階を含む、疾患または病的状態への処置に対するヒト被験体の応答をモニターするための方法が本明細書に提供されている。表皮試料は、核酸分子を含み、第一の時点と第二の時点の間での核酸分子の発現における変化が、疾患または病的状態における変化を示している。
関連した態様において、以下の段階を含む、疾患または病的状態への処置に対する被験体の応答を検出するための方法が本明細書に提供されている。皮膚疾患または病的皮膚状態について被験体を処置する段階、表皮試料を単離するのに十分な様式で、接着テープを被験体の皮膚に当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階、および核酸分子を含む試料において標的核酸分子を検出する段階。標的核酸分子の発現は、疾患または病的状態に関する情報を与える。それゆえに、方法は、疾患または病的状態への処置に対する被験体の応答を同定する。
検出は、標的遺伝子が発現されているかどうかの定性的検出でありうるが、典型的には、定量的発現レベル測定である。方法は、処置の前および処置後の両方に行われうる。一つの局面において、方法は処置後に行われるが、前に、疾患または病的状態における変化は視覚的に観察される。
本明細書に提供されたモニタリングおよび処置に対する応答の方法についての時点は、任意の時間間隔を含みうるが、典型的には、少なくとも2週間、およびより典型的には、少なくとも1ヶ月間、離れている。特定の態様について、時点は、2ヶ月間、3ヶ月間、6ヶ月間、1年間、または2年間、離れている。試料は、2つ、3つ、4つ、5つなどの時点を含む、任意の数の時点において採取されうる。異なる時点からの発現分析データの比較は、管理図法のような時間に基づいた統計学的方法を含む、データにおける差を評価しうるデータ点を比較するための公知の統計学的方法のいずれかを用いて行われうる。疾患または病的状態は、例えば、発現レベルをカットオフ値と比較することにより、または発現レベルにおける変化を、それらが、パーセント変化カットオフ値のようなカットオフ変化値を超えるかどうかを決定するように比較することにより、時系列において同定されうる。特定の局面において、第一時点は、処置前、例えば、治療剤の投与前、であり、第二時点は、処置後である。
疾患または病的状態は、実質的にいかなる皮膚疾患でもありうる。例えば、皮膚疾患は、乾癬、皮膚炎または皮膚感染症、アレルギー性反応、蕁麻疹性丘疹、脂漏症、刺激性接触皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、汗腺炎、化膿性、アレルギー性紫斑病、バラ色粃糠疹、疱疹状皮膚炎、結節性紅斑、多形性紅斑、エリテマトーデス、挫傷、光線性角化症、ケロイド、脂肪腫、皮脂嚢腫、皮膚ポリープ、黄色板症、基底細胞癌、扁平上皮癌、またはカポジ肉腫でありうる。特定の局面において、疾患または病的状態は、黒色腫以外である。
少なくとも1つの核酸分子の発現レベルにおける変化は、発現における増加または減少でありうる。さらに、特定の核酸および特定の疾患または病的状態に依存して、増加または減少が、処置に対する応答、または応答の欠如を示しうる。例えば、核酸は、CD2、TNFI、またはIFNγのようなタンパク質をコードすることができ、第一時点と比較した第二時点における発現の減少は、乾癬への処置に対する陽性応答を示している。もう一つの例として、方法は、TNFI、IFNγ、IL-12B、NPFまたはIL-23Bの発現における減少を検出することができ、発現における減少が、乾癬への処置に対する応答を示している。もう一つの例として、方法は、ケラチン10、ケラチン16、またはケラチン17遺伝子産物の発現を検出し、発現における増加が、刺激性皮膚炎のような皮膚炎への処置に対する応答を示している。
この方法の他の局面において、遺伝子の集団が検出される。これらの局面について、方法は、マイクロアレイを用いて行われうる。
もう一つの態様において、接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で、接着テープを皮膚の標的領域に当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階を含む、動物被験体の皮膚を特徴付けるための方法が本明細書に提供されている。発現が皮膚疾患または病的皮膚状態の情報を与える核酸分子は、その後、表皮試料において検出される。例えば、表VIIに列挙された遺伝子の発現は、刺激された状態について皮膚を特徴付けるために表皮試料において検出されうる。
皮膚を特徴付ける方法は、以下のようないくつかの適用を有する：(i)疾患分類/下位分類；(ii)疾患重症度および進行のモニタリング；(iii)処置効力のモニタリング；ならびに(iv)最も有益な処置計画の予測。これらの適用のすべては、それら自身、本明細書に開示された態様を表しているのだが、別な方法で回収する(すなわち、生検の使用を通して)のが困難または実際的ではない情報を回収するための非侵襲的試料採取の概念に依存する。この情報は、皮膚表面に近い皮膚細胞のRNAに含まれる。
皮膚を特徴付けるための方法の一つの局面において、試験作用物質は、接着テープが当てられる前に標的領域に適用される。従って、一つの態様において、以下の段階を含む、試験作用物質のような作用物質の皮膚への効果を測定するための方法が本明細書に提供されている：皮膚の標的領域を作用物質と接触させ、接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で、接着テープを皮膚の標的領域に当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階。核酸分子は、任意で、皮膚の標的領域についての発現プロファイルを測定するために表皮試料から単離される。発現プロファイルは、皮膚の状態を示し、それにより、作用物質の皮膚への効果の測定を与える。発現プロファイルは、本明細書により詳細に考察されているように、マイクロアレイを用いて得られうる。
本明細書に提供されたいくつかの態様および局面は、試験作用物質のような作用物質の皮膚への効果を試験することに向けられる。これらの態様および局面において、作用物質は、任意の視覚症状が明らかになるまでに、または前に、適用されうる。例えば、作用物質は、皮膚部位に、1秒間〜12時間、適用されうる、より具体的には、試験作用物質は、それが除去される前の約0.5時間と2時間の間、適用されうり、テープ剥ぎ取りは、作用物質と接触した皮膚部位において行われる。
特定の局面において、試験作用物質への曝露後、試験部位は、テープ剥ぎ取りにより問いただされ、分子プロファイルが作用物質を分類するために作成される。例えば、作用物質は、皮膚への損傷なしに、高い刺激性または腐蝕性として分類されうる。さらに、作用物質は、刺激物の特定の型、例えば、界面活性剤または色素、として分類されうる。
本発明のこれらの局面によるテープ剥ぎ取りは、本明細書により詳細に開示されているように、表皮を得るために行われる。例えば、表皮試料を得るために、接着テープは、本明細書により詳細に考察されているように、約1回〜10回、皮膚に当てられて、取り外されうる。
試験作用物質の皮膚への効果を測定するための本明細書で行われる方法は、試験作用物質の安全性および/または効力を試験する過程の一部として行われうる。例えば、試験は、試験作用物質を市販するための承認審査方式の一部として行われる試験の一部でありうる。作用物質の効果を分析する方法の一部として、作用物質は、典型的には、皮膚に適用される(すなわち、局所的に)。作用物質は、例えば、ペースト、軟膏、ローション、またはシェイクローションとして製剤化されうる。特定の局面において、作用物質はプラシーボである。
もう一つの局面において、本発明は、皮膚疾患もしくは病的皮膚状態を引き起こしうる、または皮膚疾患もしくは病的皮膚状態を処置するために用いられうる、作用物質についてスクリーニングする、または作用物質を同定する方法を提供する。この局面において、例えば、ケラチン生成細胞およびメラニン生成細胞を含む表皮細胞、または線維芽細胞のような真皮細胞のような皮膚の細胞が、試験作用物質と接触させられる。皮膚疾患または病的皮膚状態のマーカーの発現は、その後、検出される。
接触がなされる条件は、可変性であり、作用物質の型、試験されるべき皮膚における細胞の型および量、試験されるべき試料における作用物質の濃度、加えて作用物質への曝露の時間に依存する。日常的実験が、皮膚を作用物質と接触させることについての条件を最適化するために用いられうることは、理解されているものと思われる。
本明細書に用いられる場合の「作用物質」とは、皮膚が曝される任意の分子を意味するために本明細書に広く用いられる。用語「試験作用物質」または「試験分子」は、本発明の方法において、皮膚への効果について試験されることになっている任意の作用物質を意味するために本明細書に広く用いられる。例えば、作用物質は、生体分子または有機低分子でありうる。例証的な例において、作用物質は、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質、ペプチド模倣体、オリゴ糖、リポタンパク質、糖タンパク質、もしくは糖脂質、例えば、薬物もしくは他の薬学的作用物質として製剤化されうる有機低分子を含む化学物質、またはポリヌクレオチドのような核酸である。
特定の局面において、作用物質はスキンケア製品である。スキンケア製品は、健康な皮膚を維持するために設計された製品である。それらは、収斂剤、保湿剤、および日焼け止め剤を含む。本明細書に用いられる場合のスキンケア製品は、皮膚洗浄料、シャンプー、コンディショナー、および脱臭剤/発汗抑制剤を含む、皮膚および毛髪をきれいにかつさわやかなにおいに保つのを助ける製品である、パーソナルケア製品を含む。さらに、スキンケア製品は、皮膚のような身体の表面を彩色して飾るために設計された皮膚ケア製品である化粧品を含む。それゆえに、本明細書に用いられる場合の皮膚ケア製品は、例えば、芳香剤、収斂剤、保湿剤、日焼け止め剤、皮膚洗浄料、ヘアケア品目、脱臭剤/発汗抑制剤、着色化粧品、頭髪用化粧品、および爪用化粧品を含む。薬用化粧品は、厳密に皮膚を彩色して飾ることの範囲を越えるように設計されたスキンケア製品である。これらの製品は、実際には、皮膚の機能を改善し、早期老化を防ぐにおいて有用でありうる。これらの物質の例は、グリコール酸のようなαヒドロキシ酸、βヒドロキシ酸およびサリチル酸である。これらのヒドロキシ酸は、老化した皮膚をよりなめらかに見せ、かつより柔らかに感じさせる皮膚剥離作用を増加させる。ビタミンA(レチナール)のようないくつかのビタミンは、皮膚機能をより良くさせることにより老化した皮膚の外観を改善する。
スキンケア製品は、一部の個体において皮膚炎を引き起こしうる。アレルギー接触皮膚炎はより重症の状態であるため、刺激された皮膚の結果である皮膚炎と、アレルギーにより引き起こされる皮膚炎を区別することは重要である。現在、アレルギー性接触皮膚炎を刺激性接触皮膚炎から区別するために有効な方法はない。
本明細書に提供された実施例は、モデル系としてSLS刺激を用いて実証し、IL-1+およびIL-8のmRNAにおける変化をアッセイすることの有用性が、刺激性皮膚反応の指標として試験された。正常と24時間1%SLSで閉塞された皮膚の間のアレイ作成RNAプロファイルが比較され、SLS処置は、結果として、1,700個より多い遺伝子の発現レベルにおいて統計学的に有意な変化を生じたことが観察された。これらのデータは、刺激された皮膚のマーカーを同定するだけでなく、テープ採取が、マイクロアレイ分析のためのヒト皮膚からRNAを捕獲するための非侵襲的方法として有用であることを実証している。
従って、以下の段階を含む、動物被験体の皮膚を特徴付けるための方法が本明細書に提供されている：接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で、刺激された皮膚を含むのではないかと疑われる皮膚の標的領域に接着テープを当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階。表VIIに列挙された遺伝子から発現される核酸分子またはそれらの組み合わせは、その後、表皮試料において検出され、核酸分子の発現は、刺激された皮膚において変化しており、それにより被験体の皮膚を特徴付ける。
もう一つの態様において、本明細書に開示された方法を用いる発疹のテープ剥ぎ取りにより、感染と診断するための方法が本明細書に提供されている。発疹の部位から単離された核酸は、微生物の核酸の存在について分析されうり、微生物の核酸の存在が、微生物による感染を示している。微生物は、例えば、真菌、ブドウ球菌または連鎖球菌でありうる。
もう一つの態様において、以下の段階を含む、被験体において、刺激性接触皮膚炎(ICD)とアレルギー性接触皮膚炎(ACD)を区別するための方法が本明細書に提供されている：接着テープに付着した表皮試料を単離のに十分な様式で、接着テープを皮膚炎に冒された皮膚の領域に当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む。その後、ICDまたはACDに関連した遺伝子の発現レベルを測定し、それによりICDとACDを区別する段階。発現レベルが測定される前に、リボ核酸RNA分子は、任意で、表皮試料から単離されうる。
特定の局面において、1つより多い核酸分子の発現は、皮膚を特徴付けるため、例えば、ICDとACDを区別するために、検出されうる。実施例に例証されているように、約1700個の遺伝子の発現は、非病変皮膚に対する刺激された皮膚において変化している。それゆえに、正常から刺激された状態への皮膚状態の変化は、少なくとも1700個の遺伝子における変化を伴う。それゆえに、特定の例において、本明細書に提供された方法は、表VIIに列挙された遺伝子のうちの2個以上、5個以上、10個以上、25個以上、50個以上、100個以上、500個以上、1000個以上、1500個以上、または全部の発現を分析することにより皮膚を特徴付ける。特定の例において、発現は、刺激された皮膚において最も劇的な発現変化をもつ、本明細書に開示された研究において同定された100個の遺伝子を列挙する表VIに列挙された遺伝子について、検出される。例えば、検出された核酸は、IL-8遺伝子の発現産物でありうる。もう一つの例において、検出される核酸は、ケラチン10、16および/または17遺伝子、例証的な例においてはケラチン16および/または17遺伝子、であり、テープ剥ぎ取りされた皮膚における核酸の下方制御が、刺激された皮膚を示している。
本明細書に提供された実施例は、核酸マイクロアレイへのハイブリダイゼーションのためのテープ採取された核酸の増幅の成功を例証している。これらの実験は、被験体における反復試験部位間の有意な遺伝子発現レベル差を示さず、かつ男性と女性被験体の間に極微の差を示す。
従って、もう一つの態様において、本発明は、接着テープに付着した上皮試料を単離するのに十分な様式で、疾患または病的状態に冒された皮膚の領域に接着テープを当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階、および核酸分子をマイクロアレイに適用する段階を含む、ヒト被験体の疾患または病的状態を示す発現プロファイルを同定するための方法を提供する。核酸分子は、任意で、マイクロアレイに適用される前に表皮試料から単離されうる。少なくとも10個の遺伝子の発現レベルは、その後、マイクロアレイを用いて測定される；正常な試料由来の表皮試料における発現と比較して、少なくとも10個の遺伝子のうちの少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個またはそれぞれについての変化した発現レベルが、疾患または病的状態に冒された皮膚を同定し、それにより、疾患または病的状態を示す発現プロファイルを同定する。
もう一つの態様において、ヒト被験体の疾患または病的状態を示す発現プロファイルを同定するための方法が本明細書に提供されている。方法は、接着テープに付着した上皮試料を単離するのに十分な様式で、疾患または病的状態に冒された皮膚の領域に接着テープを当てる段階；ならびに、疾患または病的皮膚状態試料および影響をうけていない試料について発現パターンを測定するために試料由来のRNA分子をマイクロアレイに適用する段階を含む。発現プロファイルにおける差は、疾患または病的状態皮膚の発現プロファイルを示している。RNA分子は、任意で、マイクロアレイに適用される前に、表皮試料から単離されうる。
特定の局面において、疾患または病的状態は、皮膚炎である。他の局面において、疾患または病的状態は、乾癬である。
1個より多い遺伝子の発現が分析される態様において、検出はマイクロアレイを用いて行われうる。例えば、マイクロアレイは、表VIIに列挙された遺伝子の2個以上、10個以上、25個以上、50個以上、100個以上、500個以上、1000個以上、1500個以上、1700個以上、もしくは全部、または表VIに列挙された遺伝子のサブセットに向けられる、プローブのアレイを含みうる。マイクロアレイは、本発明のもう一つの態様を形成する。従って、もう一つの態様において、表VIIに列挙された遺伝子の2個以上、10個以上、25個以上、50個以上、100個以上、500個以上、1000個以上、1500個以上、1700個以上、もしくは全部、または表VIに列挙された遺伝子のサブセットに向けられる、プローブのアレイを含むマイクロアレイが本明細書に提供されている。
マイクロアレイ発現分析について、RNAの約0.1〜1ミリグラム、典型的には、1〜10ナノグラムが、例えば、本明細書に開示されたテープ剥ぎ取り方法を用いて得られる、表皮試料から単離される。単離されたRNAは、その後、増幅され、バイオチップ上のプローブへのハイブリダイゼーションに用いられる。増幅は、典型的には、結果として、合計、少なくとも1マイクログラム、およびより典型的には、少なくとも20マイクログラムの増幅された核酸を生じる。例えば、増幅は、MessageAmp(商標)aRNAキット(Ambion Inc.)を用いて行われうる。単離されたRNAは、標的アレイへの結合が、ストレプトアビジンを用いて検出されうるように、バイオチップに接触させる前にビオチン標識されうる。プローブは、表VIIおよびVIIIに列挙された遺伝子、またはそれらの相補体、の1個または複数へ特異的に結合する。
増幅された核酸のマイクロアレイ上のプローブへのハイブリダイゼーションは、典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行われる。ハイブリダイゼーション反応についての条件は、当技術分野において周知であり、マイクロアレイ供給業者から入手できる。例えば、核酸分子のマイクロアレイ上に見出されるプローブとのハイブリダイゼーションは、当技術分野において知られているような、中位にストリンジェントまたは高くストリンジェントな生理的条件下で行われうる。例えば、本明細書の実施例の項に例証されているように、マイクロアレイ上のハイブリダイゼーションは、製造会社(Affymetrix)の使用説明書に従って実行されうる。例えば、ハイブリダイゼーションは、100 mM MES、1 M [Na+]、20 mM EDTA、0.01% Tween 20から構成されるハイブリダイゼーション緩衝液において45℃で16時間、実行されうる。洗浄は、25℃で低ストリンジェント性緩衝液(6X SSPE、0.01% Tween 20)、続いて、50℃で高ストリンジェント性緩衝液(100 mM MES、0.1 M [Na+]、0.01% Tween 20)において実行されうる。本明細書に開示された方法に用いられうるだんだん高くなるストリンジェント性条件のもう一つの例は、以下の通りである：およそ室温で2X SSC/0.1% SDS(ハイブリダイゼーション条件)；およそ室温で0.2X SSC/0.1% SDS(低ストリンジェント性条件)；約42℃で0.2X SSC/0.1% SDS(中位のストリンジェント性条件)；および約68℃で0.1X SSC(高ストリンジェント性条件)。洗浄は、これらの条件の1つのみ、例えば、高ストリンジェント性条件、を用いて実行されうる、または各条件が、上で列挙された順に、例えばそれぞれ10〜15分間、用いられうり、列挙された段階のいずれかまたは全部を繰り返す。
本明細書に提供された実施例に例証されているように、バイオアレイとしても知られているマイクロアレイを含むもののようなバイオチップの製造および使用は、当技術分野において公知である(バイオチップおよびマイクロアレイの概説として、例えば、Kallioniemi O.P., 「Biochip technologies in cancer research」 Ann Med, Mar;33(2):142-7 (2001);およびRudert F., 「Genomics and proteomics tools for the clinic」 Curr Opin. Mol. Ther., Dec;2(6):633-42 (2000)を参照)。さらに、いくつかの発現分析のためのバイオチップが市販されている(例えば、Sigma-Genosys(The Woodlands, TX); Affymetrix(Santa Clara, CA)およびFull Moon Biosystems(Sunnyvale, CA)から入手できるマイクロアレイを参照)。
そのようなマイクロアレイは、本明細書に提供された実施例に例証されているように、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを検出する通常の技術について下で考察されたものと同様のブロッティング技術を用いて分析されうる。ハイブリダイゼーション条件についての詳細なプロトコールは、マイクロアレイの製造会社を通して入手できる。遺伝子発現を分析するための他のマイクロ流体装置および方法、特に、1個より多い遺伝子が同時に分析されうるもの、および高処理量技術を含むもの、が本発明の方法に用いられうる。マイクロアレイは、少なくとも10個、20個、25個、50個、100個、200個、250個、500個、750個、1000個、2500個、5000個、7500個、10,000個、12,500個、25,000個、50,000個、または100,000個の遺伝子の検出および分析を提供することができる。
バイオアレイを用いる発現レベルの定量的測定もまた当技術分野において公知であり、典型的には、本明細書に記載されているような発現を測定するための伝統的な方法の改変バージョンを含む。例えば、そのような定量は、リン光体画像装置および画像化ソフトウェアを用いてマイクロアレイのスポットに結合する放射性標識プローブのリン光体画像を測定することにより行われうる。
現在、一次刺激プロトコールは、限定的パッチ試験を通して高い刺激性および腐蝕性材料を検出するために設計される。しかしながら、これらのプロトコールに関連した臨床的続発症のいくつかは、現れるのに何日間または何週間もかかりうる。試験プロトコールは、物質がより短い時間、例えば0.5〜2時間、適用されて、任意の視覚的症状が明らかになる前に除去されうるならば、はるかに優れているものと思われる。試験部位がテープ剥ぎ取りにより問いただされ、皮膚への損傷なしに、作用物質を高い刺激性または腐蝕性と分類しうる分子プロファイルを作成されうるならば、これは、極めて有用かつ価値のある試験であると思われる。従って、無症状性刺激性皮膚反応を予測する、および臨床症状の顕現前に刺激性皮膚反応の迅速な予測のための方法が本明細書に提示されている。これらの方法は、試験作用物質のような作用物質の皮膚への効果を試験するために有用である。
本明細書に提供された方法は、実質的にいかなる動物もの外面を特徴付けるために用いられうる。特定の局面において、方法は、哺乳動物被験体の身体の外面を特徴付けるおよび/または別なふうに分析するために用いられうる。例えば、方法は、マウスのような齧歯類、およびウサギまたはブタをテープ剥ぎ取りするために用いられうる。例証的な例において、方法はヒト皮膚を分析するために用いられる。
本発明の特定の態様は、具体的には、乾癬に関し、皮膚の表皮由来の核酸試料、例えばRNA試料、が乾癬患者においてテープ剥ぎ取りを用いて乾癬病変から得られうるという発見に一部、基づいている。乾癬は、多くの異なる形で現れる慢性、遺伝性、非感染性皮膚疾患であり、爪および頭皮を含む身体のいかなる部分をも冒しうる。乾癬は、関係している身体表面のパーセンテージおよび患者の生活の質(QoL)への影響に依存して、軽度、中等度、または重度として分類される。乾癬は、いくつかの型：斑状乾癬、膿疱性乾癬、紅皮性乾癬、滴状乾癬、または逆位乾癬の一つでありうる。本明細書に示されているように、本明細書に提供されたステージングのための方法は、乾癬の重症度および型を決定するのを援助する。
乾癬は身体のいかなる領域をも冒しうるが、頭皮、肘、膝、手、足、生殖器に最も一般的に見出される。斑状乾癬、その疾患の最も一般的な型、は銀白色の鱗屑で覆われた赤色皮膚の隆起した、肥厚性斑に特徴付けられる。乾癬の他の型は、異なる徴候および症状に特徴付けられる。例えば、膿疱性乾癬は膿様疱疹に特徴付けられ、紅皮性乾癬は、皮膚表面の大部分の激しい赤みおよび腫れに特徴付けられ、滴状乾癬は、小さな滴状様病変に特徴付けられ、逆位乾癬は、皮膚のひだにおけるなめらかな赤色病変に特徴付けられる。本明細書に提供された方法は、乾癬の様々な型間を区別するのを助ける。
乾癬は、それの初期段階においてほとんど知覚できない場合があるが、被験体は、しばしば、疾患が進行するにつれて、そう痒および/または灼熱感を報告する。特に、斑状乾癬は、通常、痒くかつ不快になりうる、より大きな鱗屑性斑へ進行する、皮膚上の小さな赤色隆起から始まる。鱗屑が集積するにつれて、銀色鱗屑の白色痂皮をもつピンク色から深紅色の斑が皮膚表面上に現れる。
乾癬病変ではないかと疑われる病変は、ケブナー現象の結果でありうる。この現象において乾癬病変は、傷害、感染または他の皮膚の問題の部位に現れる。病変は、乾癬の最初の発症を特徴付けうる、または乾癬の既存の症例における新しい病変でありうる。特定の例において、テープ剥ぎ取りの部位は、乾癬性関節炎に関与しうる乾癬の既知の部位である指の爪または足指の爪上でありうる。
「乾癬皮膚マーカー」は、発現レベルが、乾癬病変の部位における皮膚試料と非病変皮膚の皮膚試料の間で異なる遺伝子である。それゆえに、乾癬皮膚マーカーの発現は、乾癬に関連している、または、を示している。本明細書に考察されているように、本明細書に例証された乾癬皮膚マーカーのすべては、非乾癬皮膚細胞に対して乾癬病変において発現の増加を示す。本明細書に提供された方法、例えば、テープ剥ぎ取りされた皮膚から得られた試料を用いて遺伝子発現分析を行うためにマイクロアレイを用いる方法、は追加の乾癬マーカーを同定するために用いられうる。これらの乾癬マーカーの発現は、乾癬病変において増加または減少しうる。
発現における統計学的有意差が90%、または好ましくは95%信頼水準において観察されるかどうかを決定するために用いられうる多くの統計学的技術は、当技術分野において公知である。特定の例において、4倍より大きい増加または減少が、乾癬皮膚マーカーを同定するためのカットオフ値として用いられうる。本明細書に提供された実施例は、乾癬皮膚マーカーの同定を例証している。特定の例において、乾癬病変由来の皮膚試料と非病変皮膚由来の皮膚試料の間にレベルにおける少なくとも4倍の差がある。本明細書に同定された乾癬皮膚マーカーは、CD2、インターフェロンK(IFNK)、および腫瘍壊死因子I(TNFI)を含む。
従って、本発明は、接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で、接着テープを被験体の乾癬病変に当てる段階を含む、ヒト被験体の乾癬病変の表皮試料から核酸分子を単離または検出するための非侵襲的方法を提供する。表皮試料は、その後単離および/または検出される核酸分子を含む。
核酸は、例えば、CD2、TNFIまたはIFNγのようなタンパク質をコードしうる。これらの遺伝子の発現は、乾癬病変において分析されうる。これらの態様は、乾癬への処置に対する応答をモニターするために；乾癬を遺伝的に特徴付けるのに最も効果的である可能性が高い処置を決定するために；乾癬を診断するために；ならびに、乾癬への処置に対する応答について予測する核酸を同定および分析するために、有用である。これらの遺伝子の発現における変化は、本明細書に提供された実施例において、乾癬と関連していることが示されている。例えば、TNFIおよびCD2の発現は、乾癬をもつたいていの患者において上昇している。さらに、特定の患者において、TNFI、CD2およびIFNγが上昇している。従って、特定の局面において、TNFIおよびCD2の発現が分析される。他の局面において、TNFI、CD2およびIFNγが分析される。
乾癬病変の表皮試料から核酸試料を単離および検出する本発明の方法は、乾癬病変を検出およびステージングするにおいてだけでなく、乾癬を診断および予知する、加えて乾癬病変の処置に対する応答をモニターすることにおいても、有用性をもつ。これらの方法はまた、乾癬への処置に応答するであろう病変および/または患者を同定しうる予測的皮膚マーカーを同定するために用いられうる。
生物学的製剤は、生きている生物体由来の分子である。乾癬を処置するために用いられる生物学的製剤は、典型的には、乾癬に関係している正確な免疫応答を標的にする。研究からの発表されたデータは、特定の免疫応答をピンポイントすることは、免疫系全体が影響されず、かつ肝臓および腎臓のような器官もまた影響されないため、より毒性の低い副作用を生じることを示唆している。いくつかの生物学的製剤は、異常なT細胞に干渉するかまたはTNF-αを遮断するかのいずれかにより働く。典型的には、生物学的製剤は、働くために注射または注入されなければならない。
生物学的製剤は、例えば、典型的には、中等度から重度の慢性斑状乾癬をもつ成人の処置に用いられる、アレファセプト(alefacept)またはエファリツマブ(efalizumab)でありうる。アレファセプトは、典型的には、12週間、週に1回、筋肉内注射により与えられるのだが、乾癬を促進するT細胞の選択群を標的にして殺す。
エファリツマブは、アレファセプトのように、T細胞が活性化するのを防ぐ；およびT細胞輸送を阻害する。これは、T細胞が皮膚へ浸入し、炎症を引き起こすのを防ぐ。エファリツマブは、典型的には、毎週の注射を含むが、乾癬を処置するために用いられる他の全身性薬物とは違って、継続的治療を条件とし、長期間使用に向いている。
etanercept(商標)、infliximab(商標)、およびadalimumab(商標)は、TNF-αを遮断する生物学的作用物質である。乾癬において、TNF-αは、急速すぎる再生および成熟を行うように皮膚へシグナル伝達する免疫系により用いられると考えられる化学物質である(Gribetz, C. et al. 「Clearing Psoriasis: A New Era of Optimism」 Contemporary Dermatology 2003: Vol. 1,No. 1:1-8)。特定の例証的な例において、乾癬に関与すると考えられる標的遺伝子の発現が、本明細書に提供されたテープ剥ぎ取り方法を用いて乾癬病変において検出される。発現または上昇した発現が検出される場合には、標的遺伝子の機能を遮断する処置が、被験体に施されうる。例えば、TNFIの発現は、本明細書に提供された方法を用いて検出され、etanercept(商標)、infliximab(商標)、およびadalimumab(商標)のようなTNFIを標的にする生物学的製剤に対する応答を予測するために用いられうる。例えば、皮膚での表皮試料におけるTNFIのレベルの上昇は、TNFIを標的にする生物学的製剤が、被験体の乾癬を処置するにおいて少なくとも一時的に有効であろうことを予測できる。
本明細書に例証されているように、少なくともいくつかの乾癬病変は、増加したレベルのTNFαを発現させる。それゆえに、乾癬病変を特徴付けるための本明細書での方法は、TNFαを遮断するEtanercept(商標)、infliximab(商標)、およびadalimumab(商標)のような生物学的製剤で被験体が処置される前に、乾癬病変がTNFαを発現させていることを確認するために用いられうる。さらに、本明細書に例証されているように、IFNKは、いくらかの患者の乾癬病変において過剰発現されない。従って、特定の態様において、本明細書に提供された方法は、被験体が異常なT細胞を標的にする生物学的製剤での処置に対して応答する可能性が高いかどうかを決定するために、IFNKの発現について乾癬病変を特徴付けるために用いられる。IFNKはT細胞において発現されることは公知である。
（表ＶＩＩＩ）乾癬治療におけるAAD合意の記載(Callen, JP et al. AAD Consensus statement on psoriasis therapies. J Amer Acad Cermatol 2003: 49:897-899)
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*乾癬についてU.S. Food and Drug Administration (FDA)にまだ認可されていない。
本発明の特定の態様は、乾癬病変をテープ剥ぎ取りすることが、皮膚疾患への処置に対する被験体の応答をモニターするために用いられうるという発見に一部、基づいている。例えば、テープ剥ぎ取りは、1つまたは複数の乾癬病変の、処置に対する応答をモニターするために用いられうる。テープ剥ぎ取り方法は、乾癬病変における臨床的変化が観察される前、または乾癬の重症度における変化が観察できる前である時点において、皮膚試料を得るために用いられうる。それゆえに、テープ剥ぎ取り方法は、乾癬患者が、現行の方法が処置に対する応答またはその欠如を検出できる前に、処置に対応しているかどうかに関する情報を得るために用いられうる。
乾癬の型および重症度は、通常、視覚的に測定される。例えば、乾癬の重症度は、赤み、病変の型、および赤みに冒されている皮膚の量を含む様々な観察可能な因子を用いる、National Psoriasis Grading Score(NPGS)を使って測定されうる。本明細書に提供された方法は、乾癬に関連した遺伝子の発現レベルに基づいた乾癬の重症度の指標および型を提供する。これらの方法は、NPGSを用いるようなこれらの変化が視覚的に観察される前に、乾癬重症度における変化を検出するために用いられうる。特定の局面において、本発明の方法は、処置に対する応答を測定するために、視覚的方法と組み合わせて用いられる。
もう一つの態様において、以下の段階を含む被験体における乾癬を特徴付けるための方法が本明細書に提供される：被験体の乾癬病変の表皮試料由来の1つまたは複数の核酸分子の発現を分析する段階。この態様について、典型的には、被験体は、ヒト被験体である。特定の局面において、分析される核酸分子の少なくとも1つが、TNFI、CD2および/またはIFNKのような、発現のレベルが処置の選択をもたらしうる核酸である。さらに、テープ剥ぎ取り方法はマイクロアレイを用いる発現分析に首尾よく用いられうることが、本明細書に例証されている。従って、マイクロアレイ分析は、発現レベルが異なる患者の乾癬病変において異なる、および発現レベルが乾癬病変の型、処置選択、疾患における変化の臨床的徴候の前の疾患進行、または治療に対して応答しうる可能性に関する有用な情報を提供する、追加の遺伝子を同定するために用いられうる。
もう一つの態様において、本発明は、以下の段階を含む、ヒト被験体において乾癬を診断するための方法を提供する：接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で、被験体の皮膚における乾癬病変ではないかと疑われる病変に接着テープを当てる段階であって、表皮試料が標的核酸分子を含む、段階。乾癬をもたない試料由来の表皮試料における発現と比較しての標的核酸分子の発現の変化が、乾癬を示している、標的核酸分子が検出される。特定の局面において、2つまたはそれ以上の標的核酸分子が検出される。
特定の局面において、CD2、TNFI、IFNγ；GAPDH、
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IL-12B、IL-23A、Krt-16、Krt-17から選択される2つまたはそれ以上のタンパク質をコードする2つまたはそれ以上の標的核酸分子が検出される。特定の局面において、GAPDHおよび
Figure 2007531529
は、例えば-Ct計算における、対照として用いられる。特定の局面において、生検材料は、皮膚の部位において採取され、核酸試料は、生検材料から得られる。例えば、生検を行われた試料において、TNFI、CD2、IFNγ、IL-12B、IL-23A、Krt-16またはKrt-17から選択されるタンパク質をコードする標的核酸分子の発現が検出される。これらの遺伝子のすべての発現は、生検が行われた試料において上昇していることが知られている。
本明細書に提供された方法において、テープ剥ぎ取りは、核酸検出のために第二者へテープ条片を送ることができる第一者により臨床的設定において行われうる。核酸単離は、第一者かまたは第二者かのいずれかにより行われうる。例えば、テープ剥ぎ取りは、核酸単離および検出を行う外部会社のような第二者へテープ条片を送る看護士により医師の診療所において行われうる。または、核酸単離は、核酸検出および発現分析を行うために、提供される外部サービスのような第二者へ単離された核酸試料を送ることができる医師の診療所において行われうる。
本明細書に考察された方法を行うにおいて二者が関与する場合、または本明細書に開示された方法が同じ団体内で行われる場合、収益は、本明細書に開示された方法を行うことに対して発生しうる。例えば、収益は、テープ条片からの核酸検出および発現分析と引き換えに収益を受け取ることにより、方法の一部を実施するサービスに対して発生しうる。さらに、サービスは、RNAプロファイルおよび/またはACD対ICDもしくは可能性のある腐蝕性のような試料の分類を作成することができる。腐蝕性物質は、皮膚にひどい損傷を引き起こしうる(例えば、水酸化ナトリウム、10%酢酸)。それゆえに、テープ剥ぎ取りを用いて得られた表皮試料において核酸を単離および検出することに対する収益を得ることにより収益を発生させる方法が、本明細書に提供される。さらに、収益は、ゴム系の柔軟な接着テープのような皮膚をテープ剥ぎ取りするための接着テープを含む、本明細書に開示されたキットを売ることにより発生しうる。キットは、RNA単離試薬、ならびに任意で、発現が皮膚疾患または病的皮膚状態と相関している遺伝子についてのプライマーおよびプローブを含みうる。さらに、キットは、ハウスキーピング遺伝子のような対照遺伝子についてのプライマーおよびプローブを含みうる。対照遺伝子についてのプライマーおよびプローブは、例えば、-Ct計算において、用いられうる。キットはまた、テープ剥ぎ取りを行うことについて、および-Ct計算を用いて遺伝子発現を分析することについての使用説明書を含みうる。
もう一つの態様において、テープ剥ぎ取りが分類を必要としている皮膚部位をテープ採取するために用いられる方法が、本明細書に提供される。試料は、95%より大きい信頼度を以て分類(すなわち、ACD対ICDまたは腐蝕性の可能性)を示すRNAプロファイルの展開についてのサービス会社の研究所へ郵送されうる。RNAプロファイルは、サービス会社の顧客により見るためにイントラネットまたはインターネットを通じて入手できうる。特定の態様において、表皮試料から作成されたRNAプロファイルのデータベースが提供される。
接着フィルム上に得られた皮膚試料は、本発明の方法を用いて分析される前に凍結されうる。典型的には、これは、液体窒素またはドライアイスを用いて、本明細書での実施例に例証されているように、試料を急速凍結することにより行われる。
表皮試料のような本明細書に提供される試料における核酸分子の1つまたは複数は、それらが単離および/もしくは検出される前または後に増幅されうる。用語「増幅される」とは、単一の核酸分子から核酸の複数コピーを作製する過程を指す。核酸分子の増幅は、当業者に公知の生化学的過程によりインビトロで実行されうる。増幅剤は、酵素を含むプライマー伸長産物の合成を達成するように機能する任意の化合物または系でありうる。検出の前および後に、本明細書に提供された方法を用いて得られた核酸試料において標的核酸のコピー数を増加させるために、様々な増幅方法が利用されうることは認識されているものと思われる。この目的に適切な酵素は、例えば、熱安定性酵素(すなわち、変性を引き起こすのに十分に上昇した温度にかけられた後、プライマー伸長を行う酵素、またはDNA鋳型からaRNA、すなわち、線形的に増幅されたaRNA、を作製するためにRNAポリメラーゼプロモーターを用いるもの)を含む、大腸菌(E. coli)DNAポリメラーゼI、Taqポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウ断片、T4 DNAポリメラーゼ、他の利用可能なDNAポリメラーゼ、T4またはT7RNAポリメラーゼ、ポリメラーゼムテイン、逆転写酵素、リガーゼ、および他の酵素を含む。
適した酵素は、各ヌクレオチド鎖に相補的であるプライマー伸長産物を形成しうる適切な様式でヌクレオチドの取り込みを促進する。一般的に、合成は、各プライマーの3'末端で開始され、合成が終結するまで鋳型鎖に沿って5'方向に進行し、異なる長さの分子を産生する。しかしながら、上記と同じ過程を用いて、5'末端で合成を開始し、他方の方向に進行する増幅剤がありうる。いずれにしても、本発明の方法は、実質的にいかなる増幅方法も用いられうることが理解されているので、本明細書に記載された増幅方法に限定されるべきではない。
本発明により用いられうるインビトロの増幅の1つの方法は、米国特許第4,683,202号および第4,683,195号に記載されたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である。PCR反応についての最適な条件は、公知の技術を用いて同定されうることは理解されているものと思われる。一つの例証的な例において、RNAは、MessageAmp(商標)aRNAキットを用いて増幅される(本明細書での実施例に開示されているように)。
本発明のポリヌクレオチドを増幅するにおいて用いるプライマーは、プライマーが対象となるポリヌクレオチドにハイブリダイズする能力がある限り、通常のホスホトリエステルおよびホスホジエステルまたはそれらの自動化された態様のような任意の適した方法を用いて調製されうる。修飾された固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成するための1つの方法は、米国特許第4,458,066号に記載されている。プライマーの正確な長さは、温度、緩衝液およびヌクレオチド組成物を含む多くの因子に依存する。プライマーは、増幅の誘発剤の存在下で伸長産物の合成を開始しなければならない。
本発明の方法により用いられるプライマーは、増幅されるべきヌクレオチド配列の各鎖に相補的である。用語「相補的な」とは、プライマーが、重合のための作用物質が機能するのを可能にする条件下でそれらのそれぞれの鎖とハイブリダイズしなければならない。換言すれば、フランキング配列に相補的であるプライマーが、フランキング配列にハイブリダイズし、かつヌクレオチド配列の増幅を可能にする。伸長されるプライマーの3'末端は、相補的なフランキング鎖と完全な塩基対形成される相補性を有しうる、または高ストリンジェント性条件下でフランキング配列にハイブリダイズできる。
単離および任意の増幅により、1つまたは複数の遺伝子の発現が分析される。発現を分析することは、遺伝子の発現を検出するための任意の定性的または定量的方法を含むが、多くは当技術分野において公知である。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを分析するための非限定的方法は、下に考察されている。本発明の発現を分析する方法は、2つまたはそれ以上の遺伝子の発現を検出するための、バイオチップまたは他の小規模の高処理量テクノロジーを利用できる。
本発明の方法は、典型的には、皮膚試料からの、メッセンジャーRNA(mRNA)を含むRNAの単離を含む。RNAは、一本鎖または二本鎖でありうる。当技術分野において周知の鋳型をDNAへ逆転写するための酵素および最適な条件が用いられうる。または、RNAは、増幅RNAを形成するように増幅されうる。RNAは、RNAseプロテクションアッセイにかけられうる。それぞれの1つの鎖を含むDNA-RNAハイブリッドもまた用いられうる。ポリヌクレオチドの混合物もまた用いられうる、または同じもしくは異なるプライマーを用いる前の増幅反応で産生されたポリヌクレオチドがそのように用いられうる。特定の例において、分析されるべき核酸は、それが単離された後に増幅される。増幅されるべき配列が最初に、純粋な形で存在する必要はない；それは複雑な混合物の微量の画分である可能性がある。
さらに、RNAseプロテクションアッセイは、RNAが方法において検出されるべきポリヌクレオチドである場合に用いられうる。この手順において、標識アンチセンスRNAプローブが、試料において相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズする。残りのハイブリダイズしていない一本鎖プローブは、リボヌクレアーゼ処置により分解される。ハイブリダイズした二本鎖プローブは、RNAse消化から保護される。適切な時間後、消化反応の生成物は収集され、ゲル上で分析される(例えば、Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, section 4.7.1 (1987)参照)。本明細書に用いられる場合、「RNAプローブ」は、対象となる試料におけるRNAにハイブリダイズする能力があるリボヌクレオチドを指す。当業者は、測定されるべきポリヌクレオチドに特異的なRNAseプロテクションアッセイを同定および改変することができる、例えば、プローブ特異性が変えられうる、ハイブリダイゼーション温度、核酸の量など。さらに、いくつかの市販のキットが利用できる、例えば、RiboQuantTM Multi-Probe RNAseプロテクションアッセイ系(Pharmingen, Inc., San Diego, CA)。
もう一つの態様において、試料における核酸は、ブロッティング手順、典型的にはノーザンブロット手順、により分析されうる。ブロッティング手順について、ポリヌクレオチドは、ゲル上で分離され、その後、対象となる配列へ相補的なポリヌクレオチドで探索される。例えば、RNAは、ニトロセルロースへ転写されるゲル上で分離され、本明細書に開示された遺伝子の1つへ相補的なDNAで探索される。相補的なプローブは、放射活性物質で、化学的になど標識されうる。
核酸の検出は、核酸をサイズ分画することを含みうる。核酸をサイズ分画する方法は、当業者に周知であり、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を含むゲル電気泳動による。例えば、ゲルは、変性の7 Mまたは8 M 尿素-ポリアクリルアミド-ホルムアミドゲルでありうる。核酸をサイズ分画することはまた、当業者に公知のクロマトグラフ方法により達成されうる。
核酸の検出は、任意で、放射活性物質で標識されたプローブを用いることにより行われうる。適切なシグナルを提供する任意の放射性標識が用いられうる。他の標識は、リガンド、着色色素、および蛍光分子、標識リガンドに特異的な結合ペアメンバーとしての役割を果たすことができるもの、などを含む。標識調製物は、例えば、サザンまたはノーザンハイブリダイゼーション技術により核酸を探索するために用いられる。試料から得られたヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを結合するフィルターへ転写される。標的核酸配列を含むヌクレオチド断片にハイブリダイズする標識ポリヌクレオチドプローブへの曝露後、放射性プローブの標的核酸断片への結合は、オートラジオグラフィーにより同定される(Genetic Engineering, 1 ed. Robert Williamson, Academic Press (1981), pp. 72-81参照)。特定のハイブリダイゼーション技術は、本発明に必須ではない。ハイブリダイゼーション技術は、周知である、または当業者により容易に確かめられる。ハイブリダイゼーション技術において改良がなされた場合、それらは、容易に、本発明の方法において適用されうる。
本発明による、および本発明の方法に用いられるプローブは、選択的に標的遺伝子へハイブリダイズする。好ましい態様において、プローブは、当技術分野において公知の方法を用いてバイオアレイ上にスポットされる。本明細書に用いられる場合、用語「選択的ハイブリダイゼーション」または「選択的にハイブリダイズする」とは、ヌクレオチド配列が、皮膚マーカーの発現を検出するにおいて有用であるのに十分高い程度で、関連していないヌクレオチド配列に対して選択されたヌクレオチド配列と優先的に会合するような、中位にストリンジェントなまたは高くストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションを指す。若干の非特異的ハイブリダイゼーションは避けられないが、標的ヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーションが、例えば、標的分子以外の核酸分子、特に標的核酸分子以外の実質的に類似した(すなわち、相同性の)核酸分子、と比較した、標的核酸分子に結合する標識オリゴヌクレオチドの量により測定される場合、それが非特異的クロスハイブリダイゼーションに対して、例えば、少なくとも約2倍高く選択的、一般的に少なくとも約3倍高く選択的、通常には少なくとも約5倍高く選択的、および特に少なくとも約10倍高く選択的に区別されうるように、十分に選択的であるとの条件で受け入れられることは、認識されているものと思われる。
選択的ハイブリダイゼーションを可能にする条件は、経験的に決定されうる、または、例えば、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドおよびそれがハイブリダイズすることになっている配列の相対的なGC:AT含有量、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの長さ、ならびに、もしあれば、オリゴヌクレオチドとそれがハイブリダイズすることになっている配列との間のミスマッチの数に基づいて推定されうる(例えば、Sambrook et al., "Molecular Clonig: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)参照)。だんだん高くなるストリンジェント性条件の例は、以下の通りである：およそ室温で2X SSC/0.1% SDS(ハイブリダイゼーション条件)；およそ室温で0.2X SSC/0.1% SDS(低ストリンジェント性条件)；約42ECで0.2X SSC/0.1% SDS(中位のストリンジェント性条件)；および約68ECで0.1X SSC(高ストリンジェント性条件)。洗浄は、これらの条件の1つのみ、例えば、高ストリンジェント性条件、を用いて実行されうる、または各条件が、上で列挙された順に、例えばそれぞれ10〜15分間、用いられうり、列挙された段階のいずれかまたは全部を繰り返す。しかしながら、上で述べられているように、最適な条件は、含まれる特定のハイブリダイゼーション反応に依存して変わり、経験的に決定されうる。
1つまたは複数の遺伝子を検出するための方法は、代替として、これらの遺伝子の1つのポリペプチド産物の検出を用いることができる。例えば、乾癬または刺激された皮膚に関連しているような本明細書に開示された遺伝子の1つのポリペプチド産物が分析されうる。そのような遺伝子産物のレベルは、類似した組織における正常または標準のポリペプチドプロファイルと比較した場合、乾癬または皮膚刺激を示している。従って、乾癬または刺激性皮膚炎に関連しているような本明細書に開示された遺伝子の発現パターンは、乾癬または刺激性皮膚炎の存在および時期、それぞれに依存して変わる。
この事において、本明細書に記載されているような試料は、ポリペプチドを単離するための供給源として用いられうる。例えば、上記の方法を用いる皮膚剥ぎ取り後、角質層から単離された細胞は、かなり多数の手段により溶解されうり、ポリペプチドが細胞から得られうる。これらのポリペプチドは、その後、当業者に公知の方法を用いて、例えば、タンパク質マイクロアレイ、またはELISA分析により、定量化されうる。
もう一つの態様において、本発明は、増幅反応における可変性を代償する増幅された核酸からの遺伝子発現データを得るための方法を提供する。この方法において、標的核酸分子および対照核酸分子の相対的発現が、関連性のある発現データを得るために比較される。従って、本明細書に提供された特定の態様において、ΔCt値は、遺伝子発現変化を同定するために測定される。この値および方法は、テープ剥ぎ取りされた皮膚試料に関して本明細書に例証されているが、任意の組織において識別的遺伝子発現を同定するために用いられうる。対照試料から十分なRNAを得ることが比較的困難である場合、それは特に有用である。
Ct値は、mRNAxおよび対照mRNAについての閾値シグナルレベル(バックグラウンドに対してシグナルレベル(例えば、蛍光)における統計学的に有意な増加)に達するのに必要とされる増幅(例えば、PCR)サイクルの実験的に決定された数である(Gibson, Heid et al. 1996; Heid, Stevens et al. 1996)。Ct値は、典型的には、標的核酸(例えば、mRNAx)プライマーおよびプローブセット、ならびに対照mRNAプライマーおよびプローブセットを用いて測定される。-Ct値は、標的核酸分子と対照核酸分子の間での閾値シグナルレベルに達するのに必要とされる増幅サイクルの数における差を計算することにより計算される。被験体の皮膚の標的領域対、正常領域または影響をうけていない領域のような別の領域におけるΔCt値における差は、標的領域における標的核酸分子の遺伝子発現における変化を示している。
この値を用いて、変化した発現は、標的核酸分子の発現を対照核酸分子の発現と比較することにより検出される。本明細書に提供された実施例は、ΔCt値は、通常には、ΔΔCt値(およびそれに従って、較正された倍変化)を計算するために用いられるのだが、それ自身、較正部位への参照なしに、表皮の生理学的状態を特徴付けるために有用であることを例証している。実施例2は、ΔCt値を計算するための式および関連した開示を提供している。当技術分野では、発現データを解析するためにΔΔCt値を用いて、ΔCt値を用いないことを教示しているが、ΔCt値は、この目的のために有用であり、かつ十分な核酸分子を得ることが困難でありうる場合に対照部位から核酸試料を得る必要がないという利点を提供することが、本明細書に例証されている。
ΔCt値の可能性のある有用性は、実施例2において、被験体4のSLS処置された皮膚(テープ採取された試料；表IV)についてのΔCt,IL-8により例証されている。ΔCtは、-1.28であるが、影響をうけていない対照部位および水で閉塞された対照部位から回収されたRNAが不十分であったため、それは、ΔΔCt値(およびそれゆえに、倍変化)を計算するために用いられることができない。しかしながら、-0.89という残りの被験体の平均SLS ΔCt,IL-8値およびテープ採取された水閉塞および非病変皮膚部位からの平均値(正常について>2.49またはテープについて1.54)とのこのΔCt値の比較は、-1.28のΔCt値が実際、刺激された皮膚を示していることを大いに示唆している。例えば、-1.28の値は、10人の被験体についての平均値と比較して、被験体4のSLS部位IL-8/β-アクチンmRNA比は、非病変皮膚についての平均値より少なくとも2-(-1.28-2.49)または13.6倍高い。較正物質として水で閉塞された試料についての平均ΔCt,IL-8を用いる同様の計算は、IL-8/アクチンmRNA比が2-(-1.28-1.54)または7.1倍上昇していることを示唆している。これらのデータは、異なるmRNAバイオマーカーについてのΔCt値のデータベースの確立が、被験体内の対照部位への参照なしに生理学的皮膚状態を同定するために有用であるという仮説へと導く。ΔCt値のこの有用性は、PCR反応条件の一貫性および試料間の同一プローブの使用を前提とする。これらの必要条件を仮定すれば、本明細書での実施例におけるデータは、ΔCt値が診断指標であるという可能性を裏付けている。
従って、以下の段階を含む、遺伝子発現における変化を検出するための方法が本明細書に提供されている：第一接着テープおよび第二接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で、第一テープを皮膚の標的領域に、および第二接着テープを皮膚の影響をうけていない領域に、当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む段階；ならびに、標的領域試料および正常領域試料のそれぞれについて、標的核酸分子および対照核酸分子を増幅する段階。標的領域試料および正常領域試料のそれぞれについて、標的核酸分子および対照核酸分子は、増幅かつ同定され、ΔCt値は、標的核酸分子と対照核酸分子の間の閾値シグナルレベルに達するのに必要とされる増幅サイクルの数における差を計算することにより計算され、標的領域対正常領域におけるΔCt値の差が、標的領域における標的核酸分子の遺伝子発現の変化を示している。Ct値は、典型的には、他の反応と類似した反応条件を用いて同じ増幅実験(例えば、同じ複数ウェル反応プレート上の別々の反応ウェルを用いる)において測定される。
遺伝子発現における変化を検出するための方法は、遺伝子発現における変化を同定するための本明細書に提供された他の態様と共に用いられうる。例えば、方法は、皮膚疾患または病的皮膚状態を診断するために用いられうる。特定の局面において、方法は、刺激性接触皮膚炎を含むような皮膚領域の特徴付けを助けるために、表VIIに列挙された遺伝子のいずれかについての発現における変化を検出するのに用いられうる。
本明細書に提供されたテープ剥ぎ取りに従って、接着テープの第一集団は、標的領域に当てられうり、接着テープの第二集団は、皮膚の正常領域または皮膚の影響をうけていない領域に当てられうる。例えば、4つの別々のテープ条片は、皮膚の標的領域に当てられうり、テープ条片における核酸は、第一反応容器においていっしょに増幅されうる。異なる4つの別々のテープ条片は、皮膚の正常領域に当てられうり、これらのテープ条片における核酸は、第二反応容器においていっしょに増幅されうる。第一容器および第二容器において、対照核酸および標的核酸の両方が増幅されうる。
この態様についての標的領域は、典型的には、罹患皮膚または病的状態の皮膚を含むのではないかと疑われる皮膚の領域である。例えば、標的領域は、乾癬病変、または皮膚炎の特徴をもつ皮膚の領域を含みうる。
特定の例において、対照核酸分子は、ハウスキーピング遺伝子から発現される。例えば、対照核酸分子は、β-アクチン、GAPDH、18S rRNA、28S rRNAまたはチューブリンをコードすることができる。接着テープは、本明細書に提供されたテープ剥ぎ取り方法に関連して本明細書に考察されているように、典型的には、1回〜10回、当てられる、または1回と10回の間で、同一接着テープが当てられる。さらに、この態様による方法は、標的核酸分子の集団を検出するためにマイクロアレイを利用することができる。
もう一つの態様において、本発明は、本明細書に提供されたテープ剥ぎ取り方法を用いて、皮膚以外の表皮層を試料採取するための方法を提供する。例えば、テープ剥ぎ取り方法は、口、喉、もしくは鼻の、または肝臓、膵臓、腎臓、腸、胃、膀胱、脳、心臓、もしくは肺などのような臓器の、表皮層から、被験体へテープ条片を導入し、臓器の表面へそれを当てることにより、核酸試料を得るために用いられうる。臓器は、被験体の身体内で、または臓器が被験体から取り出された後に、試料採取されうる。さらに、テープ剥ぎ取り方法は、インビトロで増殖した細胞、または、例えば臓器移植のために、インビトロで復元された臓器を試料採取するために用いられうる。
もう一つの態様において、本発明は、乾癬病変または炎症を起こしているのではないかと疑われる皮膚の標的領域由来の表皮試料のような表皮試料からの核酸の単離および検出のためのキットを提供する。キットは、本明細書に提供された方法を行うための接着テープを含みうる。従って、一つの態様において、少なくとも一部、非極性ポリマーからできている柔軟な接着テープを含むキットが本明細書に提供されている。特定の局面において、テープは、ゴム系接着剤を含む。例証的な例において、テープは、Adhesives Research, Inc(Glen Rock, PA)から入手できる皮膚採取テープ（製品 No. 90068）でありうる。
接着テープに加えて、キットは、典型的には、1つまたは複数の検出試薬、例えば、発現が皮膚疾患もしくは病的状態に関連している標的核酸配列、の増幅、もしくは、へのハイブリダイゼーションのためのプローブおよび/またはプライマー、を含む。プローブまたはプライマーは、酵素、蛍光または放射性核種の標識で標識されうる。例えば、プローブは、CD2、TNFI、IFNγ；GAPDHまたはKrt-16から選択されるタンパク質をコードする標的核酸分子に結合することができる。または、プローブは、例えば、コードされたタンパク質を結合する抗体でありうる。プローブは、キットに供給されているマイクロアレイ上でスポットされうる。
用語「検出可能に標識されたデオキシリボヌクレオチド」とは、デオキシリボヌクレオチドを検出するために検出可能な標識と会合しているデオキシリボヌクレオチドを指す。例えば、検出可能な標識は、放射性標識されたヌクレオチド、または低分子がよく特徴付けられた巨大分子により認識される、ヌクレオチドに共有結合性に結合した低分子でありうる。これらの低分子の例は、アビジンにより結合されるビオチン、および抗チロキシン抗体により結合されるチロキシンである。他の標識は、当業者に公知であり、酵素、蛍光化合物、化学ルミネセンス化合物、リン光性化合物、および生物ルミネセンス化合物を含む。
キットは、一つの鎖において、発現が、例えば、乾癬または刺激性皮膚炎に関連している遺伝子の上流を選択的に結合するフォワードプライマー、および相補鎖において、乾癬または刺激性皮膚炎に関与する遺伝子の上流を選択的に結合するリバースプライマーを含む、1つまたは複数のプライマー対を含みうる。本発明のこの局面によるプライマー対は、典型的には、本明細書に記載された増幅方法を用いて、乾癬または接触皮膚炎に関連した皮膚マーカー遺伝子に対応するポリヌクレオチドを増幅するために有用である。
本明細書に提供されたキットはまた、バイアル、チューブなどのような1つまたは複数の容器を厳重な監禁下で受けるように区画に分けられている運搬手段を含みうり、容器のそれぞれが、本明細書に提供された方法に用いられうる別々の要素の1つを含む。存在する場合には、第二容器は、例えば、溶解緩衝液を含みうる。または、キットは、細胞の溶解が電流を用いて達成されるコンピュータ型チップを含みうる。
従って、本明細書に提供されたキットは、ゴム系の柔軟な接着テープのような皮膚をテープ剥ぎ取りするための接着テープを含みうる。キットは、RNA単離試薬、ならびに、任意で、発現が皮膚疾患または病的皮膚状態と相関している遺伝子についてのプライマーおよびプローブを含みうる。さらに、キットは、ハウスキーピング遺伝子のような対照遺伝子についてのプライマーおよびプローブを含みうる。対照遺伝子についてのプライマーおよびプローブは、例えば、-Ct計算において用いられうる。キットはまた、テープ剥ぎ取りを行うことについて、および-Ct計算を用いて遺伝子発現を解析することについての使用説明書を含みうる。
本発明は、本発明の個々の局面の単一の例証として意図される、下に提供された特定の実施例により範囲において限定されるべきではなく、機能的に等価の方法および構成要素は、本発明の範囲内である。
実施例1
皮膚試料から核酸を単離するための優れたテープ特性の同定
この実験の目的は、皮膚の表面から表皮および付随した全RNAを取り出す能力について異なる剛性の接着フィルムを比較することであった。
本明細書に記載された実験プロトコールは、硬いテープが、より硬くない支持体上の等価の接着剤より多くの表皮を取り出す（従ってより多くのRNAを回収する）という仮説を試験するために設計されている。
（表５）接着テープ試験試料についての製品コード
Figure 2007531529
手順：最少の毛をもつ上背上の2つの主要部位が、テープ剥ぎ取りに選択された。各部位は、テープ剥ぎ取りされるべき主要部位内に3つの重複していない領域または「小部位」を可能にするようにサイズが約40 mm x 40 mmであった。主要部位は、すべての被験体について類似した解剖学的位置にあった。主要部位を、アルコールパッドで清潔にし、5分間、空気乾燥するようにさせておいた。試験テープ(Adhesive Research, Glen Rock, PAから入手された)を1つの小部位へ圧力で当て、外した。この手順は、さらに3回(合計4つのテープ条片)、繰り返され、各回は新しいテープで同じ小部位に行われた。合計3つの小部位がテープ剥ぎ取りされた。各被験体において、1つの主要部位が、3つの小部位において、テープ413-201-1でテープ剥ぎ取りされた；他の主要部位は、3つの小部位において、テープ413-92-1でテープ剥ぎ取りされた。RNAは、Qiagen RNeasy(商標)キットを用いて実施例2に記載されているようにテープから抽出され、標準としてヒト脾臓全RNAでの標準曲線方法を用いる定量的RT-PCRにより定量化された。
結果および考察：表6は、各被験体についての部位あたり回収されたRNAの平均質量を示す。表6におけるデータは、明らかに、屈曲性(すなわち、柔軟な)裏板(92-1)が、部位あたり回収されたRNAの平均量において優れていることを示している。テープ92-1は、テープ201-1より平均して6.1倍多いRNAを収集した。
（表６）2つの異なる裏板において1つの接着製剤を用いて被験体につき部位あたり回収された全RNAの平均質量
Figure 2007531529
1]6人の被験体における、各テープについて小部位あたり回収されたナノグラムでの全RNAの平均質量。RNAは、標準曲線方法による定量的RT-PCRを用いて定量化された。
表6におけるデータから、柔軟なポリウレタンフィルム上の合成ゴム系接着剤が、硬いポリエチレンフィルム裏板上の同じ接着剤よりRNA回収の目的として優れていることが、結論づけられる。
次に、合成ゴム系接着製剤が、アクリル系接着製剤と、テープ剥ぎ取りにより非病変皮膚および水で閉塞された皮膚の表面から回収された表皮細胞からRNAを取り出す能力について比較された。
（表７）このプロトコールに用いられた接着テープフィルムの説明
Figure 2007531529
部位選択および採取手順：背中が、このプロトコールについての部位として選択された。部位をアルコールで清潔にし、水浸パッチを当てる前に空気乾燥するようにさせた。水パッチは、0.25 mlの滅菌蒸留水を含んだ。パッチは、24時間、付着したままであった。
被検者は、パッチ除去のために24時間後、診療所へ戻った。いったん、パッチを除去したならば、パッチを当てられた部位を、洗い清めないで、単に、15分間、空気乾燥するようにさせた；非病変皮膚部位を、アルコールパッチで清潔にし、5分間、空気乾燥するようにさせた。空気乾燥および視覚的等級付け後、3つの水浸皮膚部位および3つの近接した非病変皮膚部位を、テープ413-92-1でそれぞれ4回(部位あたり4つの新しいテープ)、テープ剥ぎ取りした。残りの3つの水浸皮膚部位および3つの非病変皮膚部位を、テープ413-92-3で同様に採取した。
結果および考察：この実験において、2つの異なる接着製剤が、皮膚の表面をテープ採取することによりRNAを回収する能力について試験された。
（表８）7被験体における正常皮膚および水処理された皮膚からの部位あたり回収された全RNAの平均質量
Figure 2007531529
1]部位あたり回収された全RNAの平均質量は、ナノグラムで示されている；特に断りのない限り、各値は、3つの小部位の平均である；NDはRNAが検出されなかったことを示す；*は、RNAがすべての部位で検出されるとは限らないため、値が3つ未満の部位の平均であることを示す。
表8より、はっきりと、テープ92-1が、正常皮膚および水で閉塞された皮膚からRNAを回収するにおいて優れていることが明らかにされた。要するに、原型ゴム系接着フィルム(製品90068)(Adhesive Research, Inc., Glen Rock, PA)が、アクリル系接着剤に対して、皮膚の表面からRNAを回収する能力について試験された。結果は、決定的に、原型ゴム系フィルムが、アクリル系フィルムより、正常皮膚部位および水で閉塞された皮膚部位からRNAを回収するにおいて良いことを実証している。
実施例2
正常および炎症性皮膚の非侵襲的テープ採取により回収されたRNAを特徴付けるためのRT-PCRおよびDNAマイクロアレイの使用
この実施例は、病理学的および生理学的バイオマーカーの直接的な定量的ならびに定性的評価を可能にする簡単なテープ剥ぎ取り手順による皮膚の表面からメッセンジャーRNAを回収するための非侵襲的アプローチを例証する。テープ採取されたRNAは、生検により回収されたRNAと質および有用性において匹敵していることが示されている。モデル系としてSLS刺激を用いて、IL-1βおよびIL-8のmRNAにおける変化を評価することの有用性は、刺激性皮膚反応の表示として試験されており、両方の試料採取方法が、RNAの回収を可能にし、その分析が皮膚の刺激を明らかにすることを示している。生検およびテープ採取されたRNAが異なる細胞集団由来である可能性が高いこと、ならびにテープ採取が、表皮を試料採取することおよび選り抜きの示差的に制御された表皮バイオマーカーを同定することのための効率的な方法であることをデータは示している。DNAマイクロアレイへのハイブリダイゼーションのための、テープ採取されたRNAの増幅の成功が報告されている。これらの実験は、被験体における反復試験部位間の有意な遺伝子発現レベル差を示さず、男性と女性の被験体の間で極微の差を示している。アレイ作成RNAプロファイルはまた、正常と24時間1%SLSで閉塞された皮膚の間で比較され、SLS処理が、結果として、1,700個より多い遺伝子の発現レベルにおいて統計学的に有意な変化を生じたことが観察された。これらのデータは、ヒト皮膚からRNAを捕獲するための非侵襲的方法としてのテープ採取の有用性を確立している。
接触皮膚炎、一般的な皮膚反応、はいくつかのシグナル伝達経路を含む。刺激性接触皮膚炎(ICD)は、大部分は、ケラチン生成細胞活性化を含むが(Freedberg, Tomic-Canic et al. 2001)、流入領域リンパ節におけるランゲルハンス細胞のT細胞への抗原の提示、およびメモリーT細胞による皮膚における原因アレルゲンの認識が、アレルギー性接触皮膚炎の惹起および発現を制御している(ACD; (Feghali and Wright 1997)。臨床的には、両方の接触皮膚炎とも、かゆみ、紅斑および水腫に特徴付けられる。この臨床的徴候および症状の共通性が、臨床レベルにおいて、特に、症状がかすかである場合、ICDとACDを区別することを困難にさせている。それに反して、既刊文献は矛盾しているのだが(Hoefakker, Caubo et al. 1995; Flier, Boorsma et al. 1999; Morhenn, Chang et al. 1999; Ryan and Gerberick 1999; Ulfgren, Klareskog et al. 2000; Cumberbatch, Dearman et al. 2002)、分子レベルにおいて、ICDおよびACDは、固有のmRNAパターンにより特徴付けられると考えられる。単純および複雑なmRNAプロファイルの文書化は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)およびDNAマイクロアレイテクノロジーを用いて可能である。テープ剥ぎ取りの技術を用いて、RNAは、正常および炎症を起こした皮膚の両方から採取されうり、テープ剥ぎ取りおよびRNAプロファイリングを組み合わせることにより、ICDまたはACDの診断を非侵襲的に確立することが可能でありうる。
この実施例に開示された研究は、十分なRNAが、わずか4つの小さなテープの皮膚部位への逐次的な貼り付けを用いて回収されうることを実証している。正確かつ信頼性のある試料採取方法としてのテープ採取の使用を立証するために、本発明者らは、1%SLS(刺激性)かまたは水(媒体対照)のいずれかを含む閉塞パッチが、10人の被験体の背中中央へ24時間、当てられる臨床試験を行った。部位は、その後、臨床的に評価され、正常な対照皮膚と共に、表面細胞が、個々のテープの4つの貼り付けで、および薄片生検により、採取された。RNAは、テープおよび生検から抽出され、蛍光の定量的RT-PCRを用いて、IL-1β、IL-8、GAPDHおよびβ-アクチンのmRNAについて半定量的に評価された。結果は、未処理の皮膚に対して、炎症を起こした皮膚においてIL-1βおよびIL-8のmRNAの一貫した増加を示した。さらに、この実施例に開示された実験は、DNAマイクロアレイを用いて正常および実験的に炎症を起こした皮膚をプロファイリングするためのテープ採取されたRNAの使用の成功を実証している。SLS刺激された皮膚のこのプロファイルは、刺激性皮膚反応とアレルギー性皮膚反応を区別するために設計されるRNAプロファイルの定義において重要な段階である。
材料および方法
臨床プロトコール：研究プロトコールは、独立したIRB(BioMed IRB, San Diego)により審査されて承認され、すべての被検者は、インフォームドコンセントにサインした。年齢21〜55歳の10人の健康な女性が研究に登録された。背中中央における傷のない正常な外見の皮膚の領域が、約4 cm x 6.5 cmの包帯の形をとった2つの閉塞パッチの貼り付けのために選択された。包帯は、透明な通気性のないプラスチックの低アレルギー誘発性接着テープを用いて作製された。このテープの中央に、約2 cm x 4.5 cmの大きさであるWebril(不織布綿)パッチがあった。1つのWebrilパッチは、1% 水性ラウリル硫酸ナトリウムの0.6 mlを含み、他方は、媒体対照として滅菌水の0.6 mlを含んだ。パッチは、SLSパッチが水パッチより上で、直接隣接している；正常な対照皮膚の領域が、水パッチより下で、隣接している、ように配置された。貼り付け後24時間目において、SLSおよび水パッチを除去し、皮膚をスコアリングの前に15分間、空気乾燥するようにさせておいた。部位は、下に提供された尺度を用いて訓練された技術者によりスコアリングされた。パッチを当てられる部位は、2つの領域が重複なしにテープ採取され、かつ薄片生検(〜2 x 2 mm)のために余地が残りうるのに十分に大きい。皮膚部位は、4つのテープそれぞれでテープ剥ぎ取りされ、その後、局所麻酔薬(リドカインHCl 1%およびエピネフィリン1:100,000; Abbott Laboratories)下で薄片生検材料が採取された。テープは、円運動しながらの20秒間の強固な圧力を用いて皮膚に当てられた。テープ剥ぎ取りに用いられるテープは、ポリウレタンフィルム上の合成ゴム系接着剤であった(製品No. 90068, Adhesive Research, Glen Rock, PA)。非病変皮膚の領域は、同一の様式で、テープ採取され、かつ薄片生検を行われた。テープは、抽出まで-80で個々のエッペンドルフチューブに保存された；生検試料は、緩衝液RLTに置かれ、抽出まで-80で保存された。各パッチ貼り付けに対する皮膚応答が、調べられ、100ワットの白熱青色電球により供給される光の下で採点された。以下の評点尺度が用いられた：0、可視的反応なし；1、かすかなピンク色の斑状紅斑；2、軽い融合性のピンク色紅斑；3、水腫をもつ中等度の紅斑(明確な赤み)；4、水腫をもつ強い紅斑(非常に激しい赤み)。第二研究において、3人の被験体が、1% SLSを含む3つのパッチおよび3つの水パッチを24時間、背中中央に当てられた。上のように、パッチを除去し、スコアリングし、テープ剥ぎ取りした。第三研究において、2人の個体が、上のような3つの隣接部位で、上背の非病変皮膚においてテープ剥ぎ取りされた。これらの最後の2つの研究で採取されたRNAは、下記のDNAマイクロアレイ実験において用いられた。
材料および試薬：接着テープは、バルクロールでAdhesives Research, Inc. (製品No. 90068)(Glen Rock, PA)から購入された。これらのロールは、Diagnostic Laminations Engineering(Oceanside, CA)により直径が17ミリメートルの小さな円板へ注文加工された。脾臓全RNAは、Ambionから購入された。「RNeasy」RNA抽出キットおよびSensiscript Reverse Transcriptaseキットは、Qiagen(Valencia, CA)から購入された。PCRプライマーおよびプローブ(TaqMan(商標)Pre-Developed Assay Reagents)および特定のcDNAの増幅および蛍光検出に必要なすべての緩衝液ならびに酵素を含むTaqMan Universal Master Mixは、Applied Biosystems(Foster City, CA)から購入された。全mRNAは、Ambion Inc. (Austin, TX)から購入されたMessageAmp aRNAキットを用いて増幅された。ヒトゲノムU133A DNAチップは、Affymetrix Inc. (Santa Clara, CA)から購入された。
RNAの単離：部位を採取するために用いられた4つのテープに付着した皮膚細胞内のRNAは、多量の緩衝液RLT(RNeasyキットに同梱された)においてテープを同時に抽出することにより、プールされた。抽出は、製造会社の使用法を用いて行われ、プロテイナーゼK消化、テープの超音波処理および「カラム上で」のDNase I消化を含んだ。RNAは、RNAseを含まない滅菌水の100マイクロリットルに溶出された。生検材料の抽出は、同じキットで製造会社の使用説明書に従って行われた。
定量的RT-PCR：10 μlのRNAは、Sensiscript Reverse Transcriptaseキットおよびランダムヘキサマーで、20 μlの最終容量に、製造会社の使用法に従って、cDNAへ逆転写(RT)された。反応物は、その後の増幅/検出反応に用いるためにヌクレアーゼを含まない滅菌水(Ambion)で5倍に希釈された。それぞれの特定のmRNA検出について、3つの反復RT+反応および1つのRT-(逆転写酵素なし；陰性対照)反応が行われた。2つの増幅/検出反応が、各RT+反応において行われ、合計6つの独立した閾値(Ct；下に考察されている)の測定を生じた。すべてのRT-反応は、2つの反復試験試料を用いて増幅され、陰性であった(データ示されず)。
接着テープおよび生検で回収されたRNA質量の定量：テープにより回収されたRNAの量は、UVにより検出するには少なすぎる(たいていの試料において)。本発明者らはまた、接着剤における夾雑物がRNAと同時精製され、UVおよび蛍光検出に干渉することを見出した。本発明者らは、それゆえに、商業的に購入されたヒト脾臓全RNAから作成された標準曲線(Ct,actin対log[RNA]; (AppliedBiosystems 2001))を参照して定量的RT-PCRを用いることにより、テープから回収されたRNA質量を推定した。脾臓RNAは、DNase Iで処理され、製造会社の使用説明書に従ってQiagen RNeasyキットで精製された。精製された標準RNAは、O.D. 260を用いて分光的に定量化された。標準曲線は、0.01 μgm/mlから1 μgm/mlまでのRNAの4つの濃度を用いて作図された。各RNA標準は、3連で、逆転写され、各RT反応は、1回増幅されて、標準濃度あたり3つの反復試験試料を生じた。未知物質の増幅および検出は、定量マーカーとしてβ-アクチンmRNAを用いて下記のように達成された。実験試料を3連で逆転写し、各RT反応物を2連で増幅して、合計6つの反復試験試料を生じた。これらの6つの反復試験試料の平均は、標準曲線を参照して未知物質におけるRNAの濃度を計算するために用いられた。すべての試料についての全RNA収量は、表Iに報告されている。この方法の正確さは、ヒト脾臓における全RNAに類似している表皮における全RNAに対するβ-アクチmRNAの相対量に頼っている。全RNAに対するβ-アクチmRNAの相対量が2つの組織間で異なる場合には、本発明者らの質量データは同様に影響を及ぼされるであろう。それゆえに、本発明者らは、すべてのテープ採取されたRNA質量計算を、この不確定性を反映しうる推定値として記載する。生検から回収されたRNAは、RiboGreen RNA Quantitation Reagent (Molecular Probes, Eugene, OR)で蛍光測定的に定量化された。
特定のmRNAの増幅および検出：特定のmRNAは、上記のようにcDNAへ変換された。特定のcDNAは、遺伝子特異的プライマー/プローブ(5'-ヌクレアーゼアッセイ)および蛍光検出を用いて半定量化された。増幅および検出アッセイは、Applied Biosystems 7000 Sequence Detection SystemにおいてTaqMan Pre-Developed Assay Reagents(PDAR; AppliedBiosystems)用いて行われた。β-アクチン、IL-1β、およびIL-8のmRNAアッセイが、同じチューブ内で行われた(多重アッセイ)；これらの多重結果は、6つの反復試験試料を用いる単一チューブ形式(β-アクチンおよび対象となるmRNAの別々のチューブ測定；データ示されず)での反復アッセイにおいて確認された；GAPDH mRNAアッセイは、一重形式で行われた。温度サイクリング条件は以下である：サイクリング前、50℃で2分間、その後95℃で10分間；その後、95℃で15秒間および60℃で60秒間を40サイクル。閾値検出は、すべてのアッセイについて0.2に設定された。
ΔΔCt方法を用いるmRNAの半定量：この実施例において、2つの試料間の相対的遺伝子発現レベルを計算する比較法またはΔΔCt方法が用いられた。ΔΔCt方法において、IL-1β、IL-8およびGAPDHのmRNAのレベルは、各RNA試料について(mRNAx)/(β-アクチン)mRNAの比率を生じるようにβ-アクチmRNAに対する標準化により半定量的にアッセイされる。この比率は、その後、さらに、対照試料に対して標準化される(「較正」と呼ばれる過程；(AppliedBiosystems 2001))。2つの異なる試料間でmRNAxのβ-アクチmRNAに対する比率を比較する場合、全RNAに対するβ-アクチmRNAのレベルが2つの試料間で一定である(すなわち、それは、不変のハウスキーピング遺伝子である)ことを暗に仮定されている。比較法において、2つの試料間の対象となるmRNA(「mRNAx」)の相対的倍増加が以下の方程式により与えられる：
Figure 2007531529
「Exp」は、実験的試料(この場合、SLSまたは水試料)を示す；「Cal」は較正物質試料(非病変皮膚)を示す；およびΔΔCt,x＝[ΔCt,Exp−ΔCt,Cal]x；ΔCt,ExpおよびΔCt,Calは、それぞれの試料について(平均Ct,RNAx)−(平均Ct,アクチン)として計算される。Ct値は、mRNAxおよびβ-アクチンmRNAについて閾値蛍光(バックグラウンドに対する蛍光における統計学的に有意な増加)に達するのに必要とされるPCRサイクルの実験的に決定された数である(Gibson, Heid et al. 1996; Heid, Stevens et al. 1996)。
倍増加の計算およびデータ解析：mRNAを測定するために用いられる方法にとっての鍵は、特定のmRNAの量が閾値蛍光に達するのに必要とされるサイクル数と直接的に相関し、それに従って、サイクル数が少なければ少ないほど(Ctが低ければ低いほど)、最初に存在するmRNAは多いという事実である。上記のように、実験データは、閾値蛍光に達するのに必要とされるサイクル数(Ct)として報告されている。それぞれの報告されたCtは、6つの反復測定の平均である。較正された倍変化計算は、上の方程式を用いて作成される。mRNAx/β-アクチンmRNA比率は、2-(ΔΔCt±2 SEM)により与えられる倍変化の範囲が1の値、較正物質についてのΔΔCtは0に等しいため、較正物質の定義された値、を含まない場合には、それの較正物質に対する有意な(>95%信頼区間を以て)倍増加をもつとみなされた。ΔCt値(表IおよびIV)の有意性は、両側の、対応のあるt検定を適用することにより決定された。
リアルタイムPCRについての検出の実際的限界は37サイクルであるというのが本発明者らの経験である。PCRサイクルの閾値数(Ct)が37を超えて拡大する場合、これらの値は、非常に変わりやすくなる、または蛍光が閾値に達しない。検出不可能および>37の反復測定の組み合わせを解釈するために、本発明者らは、6つの反復試験試料のうちの3つ以上が37(検出の境界)以上のCt値の任意の組み合わせを有する、または検出できない(記録されるCt値なし)場合には、そのmRNAは検出不可能として定義され、Ct＝37を割り当てるというルールを適用した。この37に等しい閾値の割当は、典型的には、全RNAが低い場合、またはメッセージが存在しない(例えば、非病変皮膚におけるIL-1βおよびIL-8のmRNA)場合、生じる。検出できないmRNAへのCt＝37の割当は、それが2つの試料間でのmRNAx/アクチンmRNA比率の最小限の倍変化の計算を可能にするため、有用である。
T7線形RNA増幅：mRNAは増幅され、Ambion Inc.から購入されたMessageAmp(商標)aRNAキットを用い、製造会社の使用説明書に従ってビオチン標識された。増幅の2ラウンドから得られるaRNAの典型的収量は、30〜80 μgの範囲であった。
ビオチン化mRNA標的のAffymetrix GeneChipへのハイブリダイゼーション、染色、データ獲得およびデータ解析：ハイブリダイゼーションおよび染色は、製造会社の使用説明書に従って行われた。データ獲得：Affymetrix GeneChipからの遺伝子発現値は、Affymetrixからの発現解析技術マニュアルに記載されているように、各遺伝子について、完全マッチ(PM)とミスマッチ(MM)オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションシグナル間の平均差(AD)に基づいている。各プローブセットのAD値は、
Figure 2007531529
として計算される。初期の反復において、Affymetrixソフトウェアは、各プローブセットについてAD値を計算する時、所定の範囲外であるプローブペアを除去した。この過程において、平均および標準偏差は、プローブセット全体(最高値および最低値を除く)に渡る強度差(PM−MM)について計算され、標準偏差の設定数(デフォルトとして3)内の値は、計算に含まれなかった。利点は、この過程が、各プローブセットに存在するアウトライアーを除去することにより実験的または生物学的エラーにより導入される分散を最小限にすることであった。欠点は、この過程が、GeneChip間のAD値の計算について必ずしも同じプローブペアを除去するとは限らないことであった。これは、GeneChip実験から得られた遺伝子発現プロファイルの誤った解釈へと導いた。この問題を解決するために、dChipと呼ばれるプログラムへ組み入れられたモデルに基づいた方法が、Li & Wong(Li and Wong 2001)により開発された。この方法は、クロスハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション中の汚染、またはプローブセット測定に影響を及ぼす製造欠陥によるアウトライアーを除外すると同時に、すべてのGeneChipに渡って一定のプローブペアセットアイデンティティを維持する。本明細書に報告されたGeneChip実験のすべてについて、*.celファイルからの各プローブペアセットは、統計学的解析の前にdChipソフトウェアによりモデル化された。各遺伝子のdChipモデル化発現測定は、各チップの総シグナルに対して標準化された。任意の与えられた測定について、ゼロより大きい値(発現レベルを示す)またはゼロ(バックグラウンドより低い発現レベルを示す)が得られた。すべての実験においてゼロより大きい発現レベルを示すそれらの遺伝子のみが、統計学的解析に用いられた。データ解析：遺伝子発現プロファイリング実験の多くの実験設計および適用が可能である。しかしながら、実験の目的が何であろうと、各実験は、データの統計学的解析にとって十分な回数を反復されなければならない。これは、基本的に、各遺伝子発現プロファイリング実験が、結果として、何千という遺伝子の発現レベルの測定を生じるからである。そのような高い次元の実験において、任意の個々の遺伝子発現レベルについての誤った測定の確率は高い。従って、高い反復を欠く場合、多くの遺伝子は、実験条件が同じである時でさえも、全く偶然だけで、2つの実験条件間で発現レベルにおける大きな変化を示すだろう。単純t検定は、群内標準偏差に関して標準化された2つの群の平均間の距離を評価する。結果は、任意の与えられた遺伝子についての遺伝子型間の大きな差が、その遺伝子の発現レベルが実験処理内で反復不可能であるならば、有意ではないと宣言されるだろう。逆に、発現における小さな差は、その遺伝子についての発現レベルが処理内で反復可能であるならば、統計学的に有意であると決定されるであろう。要するに、t検定統計値は、遺伝子型内の観察される分散に対して遺伝子型間の遺伝子発現レベルにおける差を計ることにより構築される。t検定統計値に基づくp値は、帰無仮説に関連した同一値をもつ遺伝子発現レベルについての1.0から、高く有意である示差的な遺伝子発現レベルについての非常に小さいp値までの範囲である。しかしながら、単純t検定は、少数の反復試験では十分に果たせないことを留意しなければならない。限られた数の反復測定で、しばしば、DNAマイクロアレイ実験について2〜5回の範囲において、得られる平均、標準偏差およびp値の推定値は不良である。
本発明者らは、少数の反復試験でのDNAマイクロアレイデータの解釈における信頼度が、処理測定内の情報を組み入れるベイズの統計学的アプローチを用いることにより改善されうる(Baldi and Long 2001; Long, Mangalam et al. 2001)。これは、結果として、より少ない反復試験で同定される示差的に発現される遺伝子のより一貫したセットを生じる。ベイズのアプローチは、類似した発現レベルの遺伝子は類似した分散を示すという観察に基づいている(Hatfield, Hung et al. 2003)。従って、遺伝子の分散のより頑健な推定値は、匹敵する発現レベルをもつ隣接する遺伝子をプールすることにより導かれうる。本明細書に報告されたデータの解析について、本発明者らは、各反復試験の平均遺伝子発現レベルを昇順に並べ、101個の遺伝子のスライドウィンドウを用いて、各遺伝子より下および上に並べられた50個の遺伝子の平均標準偏差をその遺伝子についてのバックグラウンド標準偏差として割り当てた。任意の与えられた処理内の任意の遺伝子の分散は、処理特異的バックグラウンド分散および実験的反復に渡る処理特異的経験的分散の加重平均により推定された。この研究に用いられたベイズのアプローチにおいて、実験内遺伝子分散推定値に与えられた加重値は、実験的反復の数の関数である。これは、そのような組織化されたt検定を用いるベイズのアプローチが、より少ない反復試験だけで、単純t検定と同じ示差的に発現される遺伝子のセットに収束するという望ましい性質へと導く(Long, Mangalam et al. 2001)。
ベイズの方法はより頑健なp値を提供するが、これらのp値が、個々の遺伝子測定に置かれうる局所的信頼度を表すことを留意しなければならない。それらは、個々の遺伝子が示差的に発現されるという大域の確率については言及していない。これは、各実験の大域の偽陽性レベルが決定されることができるならば、評価されうるのみである。換言すれば、高次元のDNAアレイ実験の結果を解釈するために、解析されることになっているデータセットに内在する大域の偽陽性および陰性レベルを決定することが必要である。この目的のために、本発明者らは、DNAマイクロアレイ実験に内在する大域の偽陽性および陰性レベルの計算についてAllison et al.(Allison, Gadbury et al. 2002)により記載された混合モデルに基づいた方法を実行した。基本的考えは、上記の組織化されたt検定に基づくp値を新しいデータセットとみなすこと、およびこれらの新しいデータについて確率的モデルを構築することである。対照データセットがお互いに比較される(すなわち、示差的な遺伝子発現がない)場合、p値がゼロと1の間に一様分布を示すだろうと見るのは容易である。対照的に、異なる遺伝子型または処理条件からのデータセットがお互いに比較される(示差的な遺伝子発現)場合、p値が1よりゼロにより近く、群がる傾向にある、一様でない分布が観察されるだろう；すなわち、「有意な」p値を以て示差的に発現される遺伝子のサブセットがあるだろう。Allison(Allison, Gadbury et al. 2002)の計算的方法は、任意の与えられたp値における任意の遺伝子が示差的に発現される確率、0から1までの範囲であるPPDE(p)、を決定するために一様および一様でない分布のこの混合をモデル化すること；すなわち、それは、一様(示差的に発現されていない)または一様でない(示差的に発現されている)分布のメンバーであること、のために用いられる。この方法を用いて、本発明者らは、任意の与えられたp値閾値における偽陽性および偽陰性、加えて真の陽性および真の陰性の比率、PPDE(<p)、を推定できる。換言すれば、本発明者らは、各遺伝子測定についての示差的発現の事後確率PPDE(p)値、ならびに実験全体の大域の偽陽性レベルに基づく任意の与えられたp値閾値およびその遺伝子により示されたp値におけるPPDE(<p)値を得ることができる。この情報が示差的に発現されるゲノムワイドな数の遺伝子を推測すること；すなわち、一様でない分布(示差的に発現されている)における遺伝子の率および一様分布(示差的に発現されていない)における遺伝子の率、を可能にすることもまた、強調されるに値する。
マイクロアレイデータ解析のための一般的に用いられるソフトウェアパッケージは、ベイズの統計学的方法を実行するためのアルゴリズムを有しない。しかしながら、本発明者らの統計学的プログラム、Cyber-T(www.igb.uci.edu)は、このアプローチおよび上記のPPDE解析を対応している。本明細書に報告された実験について、本発明者らは、Cyber-Tへ組み入れられたこれらの統計学的ツールを用いた。
結果
全RNA収量
RNAは、上記のように4つのテープを用いた30個の皮膚部位のうちの27個から回収された。回収された全RNAの量は、部位部位間で、および被験体被験体間で、変動した(データ示されず)。非病変皮膚部位から回収されたRNAの平均質量は、0(2個の試料)〜3.2 ngの範囲をもつ0.92ナノグラム(±0.35)であった。水で閉塞された皮膚から回収されたRNAは、0(1個の試料)〜2.7 ngの範囲をもつ0.69ナノグラム(±0.27)であった。SLSの炎症を起こした皮膚は、185 ng(±76)の平均および0.067〜747 ngの範囲をもつRNAの最大の平均収量を生じた。
テープ条片試料および生検材料におけるハウスキーピング遺伝子の相対的レベル
炎症過程のマーカー、IL-1βおよびIL-8のmRNAが選択された。試料における全RNA質量の示差的回収は、内部対照、β-アクチン転写産物、に対してこれらのmRNAを標準化することにより説明された。本発明者らは、その後、SLSおよび水試料におけるmRNAx/アクチン比率を未処理の皮膚試料におけるその比率に対して較正した。この研究において、IL-1βおよびIL-8のmRNAは、SLS処理に対する応答においてβ-アクチンと比較して増加することが予測され、一方、β-アクチンおよびGAPDHのようなハウスキーピングmRNAのレベルは、一定のままであることが予測される。本発明者らは、それらの比率が本当に、異なる皮膚試料において一定であるかどうかを決定するために、2つのハウスキーピングmRNA、GAPDHおよびβ-アクチンの相対的比率を測定することによりこの仮定を試験した。
試料における2つのmRNAの相対的存在量の測定は、実験的に決定された閾値間の差であるΔCt値により与えられる。ΔCt,GAPDH(Ct,GAPDH−Ct,アクチン)が異なって処理された皮膚試料についての固有の値でありうるという可能性を調べるために、本発明者らは、すべての試料についてこれらの値を測定した。表Iにおけるデータは、水およびSLS処理された部位からの生検採取されたRNA試料が、生検採取された非病変皮膚とは有意に異なるΔCt,GAPDH値(両側、対応のあるt検定；p<0.005)をもつことを示している。
表Iにおけるデータはまた、SLS処理された部位からのテープ採取されたRNA試料が、水処理された部位からのテープ採取された試料とは有意に異なるΔCt,GAPDH値をもつことを実証している(p<0.005)。SLS処理された皮膚部位および非病変皮膚部位からのテープ採取された試料の比較は、有意性に近づいている(p=0.087)。水で閉塞された部位からのテープ採取されたRNA試料は、非病変皮膚と有意に異なる差ΔCt,GAPDH値をもたない(p=0.61)。
表Iはさらに、同一に処理された皮膚部位のテープおよび生検で採取された試料間でΔCt,GAPDH値を比較している。データは、各試料採取方法が、異なるΔCt,GAPDHをもつRNA試料を生じていること、ならびにこの差がSLS処理された皮膚試料および非病変皮膚試料(p=0.014)について高く有意である(p<0.005)ことを示している。生検およびテープ採取されたRNA試料は、異なるΔCt,GAPDH値(およびそれゆえに、異なるGAPDH/β-アクチンのmRNAの比率)をもつため、本発明者らは、試料採取方法が異なる細胞集団を回収しているという仮説を立てている。
表Iにおけるデータは、非病変皮膚に対するGAPDH/アクチンのmRNA比率における倍変化を計算するために用いられうる(材料および方法を参照)。表IIに示されたそのような計算の結果より、異なる試料についてのGAPDH/アクチンのmRNA比率においていくらかの変動があるが、特定の処理についての被験体間の平均変動は、2倍未満であることが明らかにされている。いくつかの個々の変化は2倍より大きいが、これらの差は、IL-1β/アクチンおよびIL-8/アクチンのmRNAの比率について本発明者らが観察するずっと大きい倍変化を説明するには不十分である。従って、皮膚の水およびSLS処理によるGAPDH/アクチンのmRNA比率における統計学的に有意な変化があるが、これらの差は、後で考察されるIL-1β/アクチンおよびIL-8/アクチンの比率における変化を説明しない。
SLS刺激された皮膚および対照皮膚におけるIL-1β/β-アクチンのmRNAの比率
表IIIより、テープおよび生検で採取されたRNA試料において、非病変皮膚に対する(に対して較正された)水で閉塞された、およびSLSで閉塞された皮膚におけるIL-1β/β-アクチンのmRNAの倍変化が明らかにされている。SLSで閉塞された皮膚の10個の生検試料のうち9個において、IL-1β/β-アクチンのmRNA比率が有意に上昇した。10個の非病変皮膚生検試料のうち7個において、IL-1β mRNAは検出できなかったが、残りの3個の試料において、非常に低いレベルで存在していた(本発明者らの検出限界の3Ctユニット内；データ示されず)。水で閉塞された皮膚の生検試料において、IL-1β mRNAは、2個の試料において検出できず、3個の試料において有意に上昇した(表III)。従って、SLS閉塞は、IL-1β/アクチンのmRNA比率の最も一貫した上昇を生じたが、水閉塞は、より小さいといえども類似した応答をもたらすことができた。水閉塞の効果が水処理された部位に対するSLS試料の較正による効果の中へ取り入れられる場合、本発明者らは、7個のSLS処理された試料が、IL-1β/アクチンのmRNA比率における有意な増加をもつことを見出す(表IIIからのデータ；計算示されず)。
表IIIにおけるデータより、非病変皮膚に対する、水で閉塞されたおよびSLSで閉塞された皮膚のテープ採取された試料におけるIL-1β/β-アクチンのmRNAの倍変化が明らかにされている。SLSで閉塞された部位のテープ採取された試料は、10個の試料のうち5個において有意な増加を示した。IL-1β増加をもつこれらの5個の試料は、生検データと定性的に一致している。残りの5個の試料の分析は、低いRNA回収のため不確定であった。生検試料と同様に、非病変皮膚のテープ試料は、1つの例外をもって、IL-1βの検出可能な量を有しなかった。水で閉塞された皮膚のテープ採取された試料もまた、10個の試料のうち9個においてIL-1β mRNAの検出不可能な量を示したが、検出可能なIL-1βをもつ1個の試料は、非病変皮膚に対してIL-1β/アクチンのmRNAにおける有意な増加を示した。
SLS刺激された皮膚および対照皮膚におけるIL-8/β-アクチンのmRNA比率
表IIIより、非病変皮膚と比較した水で閉塞されたおよびSLSで閉塞された皮膚におけるIL-8/β-アクチンのmRNA比率の倍増加が明らかにされている。データは、SLSで閉塞された皮膚の10個の生検試料のうちの8個が、IL-8/アクチンのmRNA比率における有意な増加を示したことを実証している。10個の未処理の皮膚部位のうちの9個からの生検試料が、検出不可能なIL-8 mRNAレベルをもった。検出可能なIL-8 mRNAをもつ1個の非病変皮膚生検試料は、検出のレベルに近かった。従って、IL-8 mRNAは、一般的に、非病変皮膚の生検において検出できなかった。同様に、水で閉塞された部位の生検からの10個の試料のうちの5個もまた、検出不可能なIL-8 mRNAをもった。残りの5個の水処理された試料において、2個は、有意に増加したIL-8/アクチンのmRNA比率をもったが、これらの増加は、それぞれのSLSで閉塞された部位と比較して小さかった。従って、水閉塞は、たいていの被験体の表皮において、認めうるほどにはIL-8 mRNA出現を刺激しなかった。
表IIIはさらに、SLSで閉塞された部位からの10個のテープ採取された試料のうちの8個が、有意に増加したIL-8/β-アクチンのmRNA比率を示したことを明らかにしている。有意な増加をもたない2個の試料のうち、一つは検出可能なIL-8 mRNAをもたず(試料はRNAにおいて低くく、結果は確定的ではない)、一方、第二試料(被験体4)は、IL-8メッセージの増加をもった可能性が高いが(考察参照)、対照テープ試料がRNAを回収できなかったため、これは確認されることができなかった。表IIIにおけるデータは、水処理された部位のテープ採取された試料が、3人の被検者においてIL-8/アクチンのmRNA比率の有意な増加を現していることを示す。残りの被検者において、IL-8は、有意に上昇したレベルにおいて検出されることはできなかった。従って、テープのデータは、炎症を起こした部位の大部分がIL-8 mRNAにおける増加を示している生検データと良く定性的に一致している。
表IVは、すべての試料についてのΔCt,IL-8値を示している。このデータは、等価に処理された部位の生検およびテープ採取された試料が有意に異なるΔCt値を生じうるという前の観察を支持かつ拡大している。表IVは、テープ採取されたSLS処理の部位からの平均ΔCt,IL-8値が-0.89であり、一方、生検採取されたSLS部位からの平均値は4.13であったことを示している。個々のΔCt値間の対応のあるt検定はP<0.005をもった。水で閉塞された部位からの生検とテープの採取されたRNA試料間のΔCt,IL-8値の同様の比較もまた、高い有意差を示した(p<0.005)。これらの観察は、その上、非病変皮膚まで及ぶ。表IVは、テープ採取された非病変皮膚の4個の試料が、1.51〜4.15の範囲をもつΔCt,IL-8値をもち、一方、類似の生検試料が8.22〜>9.7の範囲をもったこと、明らかな差を示している。テープにより回収された正常、水処理、およびSLS処理の皮膚試料においてより高い量のIL-8 mRNAを一貫して検出する能力は、テープ採取が、生検において不十分に表されていた細胞のサブセット(おそらく、表面に近い)を優先的に回収するという仮説を強化する。
テープを用いて非病変皮膚から抽出されたRNAのDNAマイクロアレイ分析
異なる皮膚部位からテープ採取されたRNAの上記分析における成功は、このRNAが増幅およびDNAマイクロアレイへのハイブリダイゼーションを受け入れられうることを示唆した。遺伝子発現プロファイリング実験のためのテープ採取されたRNA試料の再現性および一貫性を評価するために、2人の健康な個体、1人の男性(試料C1、C2およびC3)および1人の女性(試料A5、A6およびA9)、のそれぞれの上背から3つの試料が収集された。全RNAの約1ナノグラムが単離され、材料および方法に記載されているように、mRNAは、増幅され、MessageAmp(商標)aRNAキットを用いてビオチン標識された。各試料から結果として生じたビオチン標識aRNAは、Affmetrix HG-U133A GeneChipへのハイブリダイゼーションに用いられた。
表Vにおける結果は、2つのGeneChip間でのペアワイズ遺伝子発現比較のマトリックスがAffymetrix Microarray Suiteソフトウェアを用いて実行された場合に観察された差を示している。これらのデータは、同じ個体における異なる部位からのデータが比較されるか、または異なる個体からの部位からのデータが比較されるかに関わらず、遺伝子測定間のたった12%分散の平均を示している。さらに、表Vの象限3におけるデータ(A対C)を象限1におけるデータ(A対A)および象限4(C対C)と比較することにより、約15%のこの分散が、性別差(A対C)かまたは被験体内変動(A対AまたはC対C)のいずれかによることが示される。従って、驚くべきことに、異なる部位から、または異なる個体から、得られた試料が寄与する分散はほとんどない。
これらのデータをより定量的様式で比較するために、個体Aから得られたRNA試料由来の標的とそれぞれハイブリダイズした3つのAffymetrix GeneChipが、個体Cから得られた3つのRNA試料由来の標的とハイブリダイズした3つのGeneChipと比較された。これらのデータは、Cyber-T統計学的プログラムにおいて実行される組織化されたt検定で解析された。この3X3比較により、各被験体からのすべての3つの部位についてバックグラウンドを超える遺伝子発現レベルを示す21,790個のプローブセットが明らかにされた。これらの遺伝子のうち、1,117個(5%)は、このデータセットの大域の偽陽性および陰性レベルに基づいて0.95の示差的発現の事後確率(PPDE)値に対応する、0.0035未満のp値で示差的に発現された。従って、このp値閾値を超える1,117個の示差的に発現された遺伝子のうちの56個は、偽陽性であることが予想される。これらの被験体内遺伝子発現差の源はまだ決定されていないが、これらの差の少なくとも1つは、性別に基づいている。例えば、最小のp値および最高のPPDE値をもつ遺伝子は、Y連鎖リボソームタンパク質S4(PRS4Y)である。性別に基づいていない差は、個体間の遺伝子発現の正常変動の反映である可能性が高い。これらのデータは、www.igb.uci.eduで入手できる。
正常皮膚対水で閉塞されたおよびSLSで閉塞された皮膚のDNAマイクロアレイ分析
別個の実験において、1〜10ナノグラムの範囲である合計9個のRNA試料は、3つの個体のそれぞれの3個の未処理の部位、3個の水で閉塞された部位、および3個のSLSで閉塞された部位からのテープ採取により単離された。9個の試料のそれぞれからのmRNAは、増幅され、ビオチン標識され、図1に示されているような、9個のAffymetrix HG-U133A GeneChipのそれぞれへのハイブリダイゼーションに用いられた。
未処理対SLS処理試料。3個の未処理(A1、B1、C1)試料と3個のSLS処理(A2、B2、C2)試料間の遺伝子発現レベルの比較により、すべての試料についてバックグラウンドより上の発現レベルを示した21,031個の遺伝子が明らかにされた。遺伝子発現の大域の変化における信頼度を評価するために、すべての遺伝子測定についてのp値は、0から1.0までの範囲である100個のビンへ分配され、各ビンにおける遺伝子の数に対してプロットされた(図2A)。Cyber-Tにおいて実行されるβ-混合モデリング方法が、Hung et al.(Hung, Baldi et al. 2002)およびBaldi and Hatfield(Baldi and Hatfield 2002)により記載されているように、大域の偽陽性および陰性の遺伝子測定レベルに基づいた各遺伝子の示差的発現の事後確率、PPDE、を決定するために一様(示差的に発現されていない)および一様でない(示差的に発現された)データセットのこれらのp値分布をモデル化するのに用いられた。未処理対SLS閉塞(図2A)のデータが比較される場合、示差的に発現された遺伝子についてのp値は低く、0の方へ群がる。これは、いくつかの遺伝子の測定レベル間での高く統計学的に有意な差と一致している。実際、1,771個の遺伝子が、0.99以上のPPDE(p)値に対応するp=0.003の閾値で示差的に発現されている。これらのデータは表VIIで入手できる。
SLS対水処理の試料。3個のSLS処理された(A2、B2、C2)試料と3個の水処理された(A3、B3、C3)試料間の遺伝子発現レベルの比較により、すべての試料についてバックグラウンドより上の発現レベルを示した21,307個の遺伝子が明らかにされた。これらの遺伝子測定のすべてについてのp値もまた、0から1.0までの範囲である100個のビンへ分配され、各ビンにおける遺伝子の数に対してプロットされた(図2B)。未処理の細胞との比較と同様に、遺伝子の約20パーセントが示差的に発現されていることが、p値分布の調査から明らかである。p=0.003の閾値に基づいて、1,364個の遺伝子が、0.99のPPDE(p)値で示差的に発現されている。これらのうち、1,063個の遺伝子はまた、SLSおよび未処理の試料が比較された場合、0.003のp値および0.99のPPDE値で示差的に発現されている。これらのデータは、www.igb.uci.eduで入手できる。
未処理対水処理の試料。3個の未処理(A1、B1、C1)試料と3個の水処理された(A3、B3、C3)試料間の遺伝子発現レベルの比較により、すべての試料についてバックグラウンドより上の発現レベルを示した21,164個の遺伝子が明らかにされた。すべてのこれらの遺伝子測定についてのp値は再び、0から1.0までの範囲である100個のビンへ分配され、各ビンにおける遺伝子の数に対してプロットされた(図2C)。これらのp値が一様に分布されているという事実は、これらの実験に内在する分散のレベルにおいて、これらの2つのデータセットの遺伝子発現レベル間に統計学的な有意差がないことを実証している。それにもかかわらず、多くが炎症と関連している、最低p値に割り当てられた遺伝子の再検討に基づいて、本発明者らは、水処理が、未処理の対照皮膚と比較して遺伝子発現におけるいくらかの変化へと導くと考えている。これらのデータは、表VIIおよびVIIIに見出される。
考察を目的として、1.4X10-10未満のp値および0.99より大きいPPDE(p)値で示差的に発現された100個の遺伝子のみが、ここ、および表VIで考察されている。SLS処理された皮膚試料が未処理の皮膚試料と比較された場合、最も有意に変化したこれらの上位100個の遺伝子の調査により、予想通り、これらの遺伝子の大部分が、組織炎症および傷害に関連した機能を果たしていることが明らかにされた(表VI)。これらの示差的に発現された遺伝子は、プロテイナーゼ、プロテアーゼ、インヒビター、サイトカイン、ケモカイン、補体成分、HLA因子、または免疫制御に関与する受容体である。これらの主として上方制御された遺伝子の多くについての炎症および傷害応答とのこれらの関連は、文献に記述されている(表VI)。これらの結果は、本明細書に記載されたテープ剥ぎ取り方法が、それの病的状態を正確に反映する皮膚の完全な遺伝子発現プロファイルに適したRNAを採取することを実証している。
考察
分子医学における最近の進歩は、分子診断の可能性を現実のものにさせた(Aitman 2001; Bertucci, Houlgatte et al. 2001; Galiegue and Casellas 2002; Lacroix, Zammatteo et al. 2002; Whipple and Kuo 2002; Satagopan and Panageas 2003)。マイクロアレイおよびRNAプロファイリングの使用を通して、単純および複雑な細胞集団が、それらの細胞または組織の生理学的状態を理解する目的で、モニターまたは「プロファイリング」されうることが、ますます明確になってきている。この情報は、より正確な、および場合により予測的な診断へ導くことが期待される。この実施例は、4つの小さなテープの使用が、皮膚の表面からメッセンジャーRNAを捕獲することへの効果的かつ非侵襲的なアプローチであること、およびこの技術が、正常な生理の機能としての病理学的および生理学的バイオマーカーの直接の定量的および定性的評価を可能にすることを例証している。
IL-1βおよびIL-8のmRNAのレベルは、正常、水で閉塞された、およびSLSで閉塞された皮膚部位において、β-アクチンに対して半定量的にアッセイされ、テープおよび生検試料からのRNAが、定性的に類似した結果を生じることを示した。β-アクチンmRNAにおける変化が、インターロイキン/β-アクチンのmRNA比率における観察された変化の原因であるという可能性を明らかにするために(Suzuki, Higgins et al. 2000; Bustin 2002; Tricarico, Pinzani et al. 2002)、お互いに比較した2つのハウスキーピング遺伝子のレベルが定量化された。結果として生じたデータ(表IおよびII)は、GAPDH/β-アクチンのmRNA比率が異なって処理された皮膚試料において異なっているが、この差の大きさは、Il-1βおよびIL-8のmRNAレベルにおいて観察された変化を説明することができないことを示した。この事実は、IL-1βおよびIL-8のmRNAが対照試料において事実上検出できないが、SLS処理された試料において容易に検出される、β-アクチンmRNAレベルにおける微量な変化により説明されえない観察の、テープ採取および生検データにより最も明らかに実証されている。さらに、IL-1βおよびIL-8のmRNAならびにタンパク質は、炎症においてよく特徴付けられており、SLSおよび他の処理に応答して上昇することが知られている(Paludan and Thestrup-Pedersen 1992; Grangsjo, Leijon-Kuligowski et al. 1996; Corsini and Galli 1998; Tomic-Canic, Komine et al. 1998; Freedberg, Tomic-Canic et al. 2001; Perkins, Osterhues et al. 2001; Cumberbatch, Dearman et al. 2002; Coquette, Berna et al. 2003)。従って、テープおよび生検の両方からの本明細書に提供されたデータは、発表された観察と一致している。
生検およびテープ採取は、等価の試料採取方法ではなく、それゆえに、同一の結果を生じることを期待されるべきではない。テープ採取は、皮膚表面に限定され、それゆえに、優先的に、軟毛包、ならびに脂腺、エクリンおよび汗管を裏打ちする細胞、加えて、角質細胞(RNAを含まないことが予想される)を回収しうる。4つの個々のテープの単回適用を用いる本発明者らの方法は、結果として、非病変皮膚のてかりを生じず、それに従って、生存可能な表皮をむき出しにしない。対照的に、薄片生検は、表皮の細胞(主として、ケラチン生成細胞およびメラニン形成細胞および免疫細胞)だけでなく、その上、真皮上層由来の線維芽細胞も含むことが予想される。薄片生検と比較した本発明者らの円形テープにより運ばれた表面表皮の可能性のある濃縮は、テープの表面積が284 mm2であり、一方、2x2 mm 薄片生検の表面積が4 mm2であることを考慮することにより認識されうる。従って、本発明者らは、テープ採取された細胞が、薄片生検に見出される細胞の分集団の濃縮を表していることを提案する。
表IおよびIVに示されたデータは、テープおよび生検採取されたRNAが異なる細胞集団に由来しているという仮説を裏付けている。表Iは、SLSおよび非病変の皮膚試料のテープと生検の試料間のΔCt,GAPDH値を比較した場合の高く有意なp値を示している。表IVは、ΔCt,IL-8が、正常、水処理またはSLS処理の皮膚試料由来のテープと生検の試料間で高く有意に異なる(p<0.005)ことを実証している。SLS処理された皮膚試料において、平均ΔCt,IL-8値における差は、生検に対するテープ採取されたRNA試料において、IL-8/β-アクチンのmRNA比率が、2-(-0.89-4.13)または32倍大きいことを意味する。水処理された試料において、IL-8/β-アクチンのmRNA比率が、テープ採取されたRNA試料において平均して2-(1.54-9.22)または少なくとも200倍大きい(表IVからのデータ)。同様に、裏付けとなるデータはまた、ΔCt,IL-1βについて観察された。このデータは、いくつかの示差的に発現されたバイオマーカーが、生検よりむしろテープ採取された表皮試料において最良に検出されうることを意味している。
臨床的刺激を診断するバイオマーカーの同定は、念願の目標であった(Muller-Decker, Furstenberger et al. 1994; Boelsma, Gibbs et al. 1998; Muller-Decker, Heinzelmann et al. 1998; van Ruissen, Le et al. 1998; Komine, Rao et al. 2001; Perkins, Osterhues et al. 2001; Boxman, Hensbergen et al. 2002; Perkins, Cardin et al. 2002; Coquette, Berna et al. 2003)。IL-1βおよびIL-8のmRNAにおける変化が、刺激の指標として本明細書で用いられ、全部ではないが大部分の刺激された部位は、これらの標準化されたmRNAマーカーのレベルの増加を示すことが示されている(表III)。データはまた、テープ採取された、および生検回収された、RNAが刺激性皮膚反応を明らかにする能力において質的に等しいことを示している。生検試料に関して、どちらのマーカーも刺激を診断するにおいて100%の効率であることはないこと、紅斑および炎症の診断となることを提案されているあらゆるバイオマーカーについて観察される結果、は明らかである(Grangsjo, Leijon-Kuligowski et al. 1996; Muller-Decker, Heinzelmann et al. 1998; Chung, Marshall et al. 2001; Perkins, Osterhues et al. 2001; Boxman, Hensbergen et al. 2002)。テープ採取アッセイの現行の限界は、RNAの制限的な量で試料において特定のマーカーを検出することにおける非効率性、下で考察されている問題、である。しかしながら、約30%の感度(Hoffrage, Lindsey et al. 2000)をもつ刺激についてのSebutapeアッセイ(IL-8タンパク質のイムノアッセイ；(Perkins, Osterhues et al. 2001))と比較して、mRNAバイオマーカーは、優れた可能性を有するように思われる。水閉塞がいくらかの被験体においてバイオマーカー比率の増加を生じたという観察は、他の者により報告されている(Grangsjo, Leijon-Kuligowski et al. 1996; Howie, Aldridge et al. 1996; Perkins, Osterhues et al. 2001)。
本明細書に示された結果は、テープ剥ぎ取り方法が、DNAマイクロアレイ実験に適したRNAを採取すること、およびこれらの遺伝子発現プロファイルがヒト皮膚の病的状態を反映していること、高度の統計学的正確度を以て、示差的発現パターンが異なる病的状態と相関しうる遺伝子のサブセットを同定することは可能であるはずである、を示している。1,700個の示差的に発現された遺伝子が高い統計学的信頼度を以て同定されたという事実は、刺激性皮膚反応の診断となる、場合によっては異なる刺激の診断となるおよび刺激反応の予測となる、遺伝子発現のパターンを同定するために設計される小さなカスタムDNAアレイの作成のステージを設定する。この進路に沿った次の段階は、アレルギー性皮膚反応中に発現される遺伝子の類似したセットを同定する、刺激性またはアレルギー性応答に固有の遺伝子を同定する、およびそれらを1つのDNAアレイへ組み合わせることであり、それは、物質に対する軽度の反応が本来、刺激性かまたはアレルギー性かを決定するために用いられうる。そのようなアレイはまた、様々な刺激原およびアレルゲンを固有のプロファイルについて試験するために用いられうる。
本発明者らのSLS処理された試料において示差的に発現された上位100個の遺伝子の分析は、これらの遺伝子の大部分が上方制御されていて、これらの遺伝子の優に半分を超すものが傷害および炎症に結びつけられていること(表VI)を示す。興味深いことに、下方制御された遺伝子の多くは、毛周期の成長期中に毛において選択的に発現される毛ケラチンおよびケラチン関連タンパク質である。閉塞SLS処理がテープ剥ぎ取りの前に毛を取り除くか、または処理が毛包における発育相を妨害するかのいずれかである。
RNAが、4つの小さなテープ条片を用いて皮膚の表面から非侵襲的にかつ生産的に回収されうることをこの実施例において示されている。テープ条片の数は、24時間のSLS閉塞のように皮膚の表面が崩壊している状態において、または乾癬のような過剰増殖性皮膚状態において、例えば、2つのテープ剥ぎ取りまで低減されうる(実施例2参照)。さらに、いくつかの皮膚部位から少量のRNAを捕獲することの制限は、反復試験対照試料を得ることにより、およびmRNAバイオマーカーの適切な選択により、効果的に克服されうる(下に考察されている)。ΔΔCt値(およびそれに従って、較正された倍変化)を計算するために通常用いられるΔCt値が、それ自身、較正部位への参照なしに表皮の生理学的状態を特徴付けるために有用である可能性があるというデータもまた本明細書に示されている。
ΔCt値の可能性のある有用性は、被験体4のSLS処理された皮膚(テープ採取された試料；表IV)についてのΔCt,IL-8により例証されている。そのΔCtは-1.28であるが、正常および水閉塞された対照部位から回収されたRNAは不十分であったため、ΔΔCt値(およびそれゆえに、倍変化)を計算するために用いられることができない。しかしながら、-0.89という残りの被験体の平均SLS ΔCt,IL-8値およびテープ採取された水閉塞および非病変皮膚部位からの平均値(正常について>2.49またはテープについて1.54)とのこのΔCt値の比較は、-1.28のΔCt値が実際、刺激された皮膚を示していることを大いに示唆している。例えば、-1.28の値は、10人の被験体についての平均値と比較して、被験体4のSLS部位IL-8/β-アクチンmRNA比は、非病変皮膚についての平均値より少なくとも2-(-1.28-2.49)または13.6倍高い。較正物質として水で閉塞された試料についての平均ΔCt,IL-8を用いる同様の計算は、IL-8/アクチンmRNA比が2-(-1.28-1.54)または7.1倍上昇していることを示唆している。これらのデータは、異なるmRNAバイオマーカーについてのΔCt値のデータベースの確立が、被験体内の対照部位への参照なしに生理学的皮膚状態を同定するために有用であるという仮説へと導く。ΔCt値のこの有用性は、PCR反応条件の一貫性および試料間の同一プローブの使用を前提とする。これらの必要条件を仮定すれば、本発明者らのデータは、ΔCt値が診断指標であるという可能性を裏付けている。
この研究において、異なる個体および皮膚部位から回収されたRNAの量は変わりやすく、SLS処理された部位から非病変皮膚部位より有意に多いRNAが回収された。SLS刺激された部位から回収された多量のRNAは、炎症性細胞の浸潤をもたらし、炎症を起こした表皮の除去を促進する弱まったバリアを形成する、SLSの公知の効果と一致している。RNA回収はまた、解剖学的位置の関数であり、類似した部位は、RNA収量に関して個体間で異なることが見出された。
回収された全RNAの変動性は、相対的遺伝子定量化の結果に影響を及ぼさないが、非常に少量のRNAの回収は、いくつかの試料を完全に分析する本発明者らの能力に影響を及ぼした。この点において、バイオマーカーの選択は、部位から回収されたRNAの量と同じくらい重要でありうる。例えば、表Iは、たいていのテープ採取された試料が、β-アクチンおよびGAPDHのmRNAについてアッセイされうり、それに従って、較正されたGAPDH/アクチン比率が計算されうることを示している。しかしながら、表IIIは、これらの同じ試料の一部が、較正されたIL-1β/アクチンまたはIL-8/アクチンのmRNA比率をもたず、IL-1βアッセイが最も影響を及ぼされていることを示している。バイオマーカーアッセイ間のこの違いについての理由は、特定のmRNAの相対存在量にある。GAPDH mRNAはβ-アクチmRNAと存在量においておよそ等しいため、検出可能なアクチンmRNAをもつすべての試料は、成功裡にGAPDHについてアッセイされた。同様に、IL-8メッセージがこれらの試料において比較的豊富であるため、水およびSLS処理のテープ採取された皮膚試料でIL-8/アクチンのmRNA比率を較正するにおいて高い成功率が達成された。従って、最も豊富であるバイオマーカーmRNAは、RNA質量を最も効率的に用いるものと思われる。それゆえに、RT-PCRが検出のために用いられ、かつテープ採取が試料採取方法であることになっている場合、候補バイオマーカーmRNAは、最良の感度、積極的予測値および高い相対存在量について選択されるべきである。
本実施例は、いくつかの理由で、半定量的RT-PCRおよびマイクロアレイ適用のためにテープ採取されたRNAの有用性を実証している。両方の方法とも特定の利点をもち、異なる状況において適切である。マイクロアレイの使用は、診断および予後のバイオマーカー候補の発見のための非常に有益なツールであり、何百というバイオマーカーの同時的アッセイを要求しうる疾患状態を下位区分するために必須でありうる。しかしながら、マイクロアレイの使用は、高価で、かつ技術的に面倒である。定量的RT-PCRは、安上がりであり、それほど技術的に大変な労力を要さず、限られた数の公知のマーカーが研究されることになっている研究にふさわしい。
要約すれば、この実施例のデータは、テープ剥ぎ取り方法が、RNA単離および遺伝子発現プロファイリング実験に適している、正常および炎症を起こした皮膚から皮膚試料を収集することを示している。この方法は、皮膚疾患の分子診断を可能にするカスタムアレイを設計するために異なる皮膚状態において多数の遺伝子の発現をプロファイリングするために用いられうる。
（表Ｉ）処理および未処理の皮膚からのテープならびに生検採取されたRNA試料におけるΔCt,GAPDH値
Figure 2007531529
ΔCt,GAPDHは、[Ct,GAPDH−Ct,アクチン]として定義される；材料および方法を参照；平均±SD；被験体4および5の非病変皮膚ならびに水で閉塞された皮膚(被験体4)からのテープ採取された試料は、正確なβ-アクチンアッセイのために十分なRNAを有しなかった。
生検およびテープ採取された試料についての、水対正常およびSLS対正常に関するp値(両側、対応のあるt検定)。
生検およびテープ採取された試料についての、水対正常および水対SLSに関するp値。
正常、水閉塞およびSLS閉塞の皮膚についての、テープ採取対生検の試料に関するp値。
（表ＩＩ）正常、水閉塞およびSLS閉塞の皮膚のEGIRならびに生検の試料におけるGAPDH/アクチンのmRNA比率
Figure 2007531529
a. 非病変皮膚に対する示された試料におけるGAPDH/β-アクチンのmRNAの倍増加；材料および方法に記載されているように、表Iにおけるデータから計算された個々の倍変化および表Iにおける平均値から計算された平均変化。
（表ＩＩＩ）非病変皮膚に対するIL-1β/β-アクチンおよびIL-8/β-アクチンのmRNA比率における倍変化の概要
Figure 2007531529
b. 後に角型括弧での臨床評点が続いている被験体識別、評点定義は材料および方法に考察されている。
c. 倍変化は、材料および方法に記載されているように、平均Ct値(IL-1βデータは示されていない、および表IVにおけるIL-8データ)から計算される。以下の略語が用いられている；「-」は、β-アクチmRNAを正確にアッセイするには不十分な回収されたRNAを示す；「ND」は、IL-1βまたはIL-8のmRNAが示された試料(水またはSLS)において検出されなかったことを示す；NCは、mRNAが示された試料において検出されることができたが、倍変化の計算が、非病変皮膚試料における低いRNA回収のためになされえなかったことを示す；「**」は、倍変化が95%より大きい信頼度で有意であることを表す；†は、倍変化がまた、水試料(データ示されず)に対して計算される場合も有意であることを示す；>符号は、IL-1βまたはIL-8のmRNAが対照試料において検出されることができず、それに従って、倍変化の最小推定値が材料および方法に記載されているように計算されたことを示す。
（表ＩＶ）正常、水閉塞およびSLS閉塞の皮膚におけるIL-8 mRNAについてのΔCt値
Figure 2007531529
d. 被験体IDおよび角型括弧におけるSLS部位の臨床評点；採点法は、材料および方法に記載されている。
e. ΔCtおよび最小ΔCt計算は、材料および方法に記載されている；「-」の入力は、示されたΔCtの意味のある推定値を提供するには回収されたRNAが不十分であったことを示した。「>」が前に付く価は、IL-1βまたはIL-8についてのmRNAが試料において検出されず、それゆえに、それぞれのCtが、37の値を割り当てられ、最小ΔCtが与えられている(すなわち、ΔCt＝37−Ct,アクチン)。
f. 与えられた皮膚処理についてのテープ対生検に関するΔCtを比較する二元の対応のあるt検定。
（表Ｖ）2人(AおよびC)の被験体の上背における3つの異なる位置から得られたaRNAとハイブリダイズしたGeneChip(A5、A6、A9、C1、C2およびC3)間のすべての可能なペアワイズ比較のそれぞれについて変化していない遺伝子発現レベルの測定のパーセンテージ
Figure 2007531529
（表ＶＩ）1.4x10-10未満のp値および0.99より大きいPPDE(p)値を以て未処理とSLS処理の状態間で示差的に発現された上位100個の遺伝子の機能的分類
Figure 2007531529
Figure 2007531529
Figure 2007531529
Figure 2007531529
Figure 2007531529
Figure 2007531529
Figure 2007531529
Figure 2007531529
Figure 2007531529
実施例3
本明細書に提供されたテープ剥ぎ取り方法を用いる乾癬患者からの表皮RNAの非侵襲的単離
この実施例は、乾癬病変からの核酸の単離および検出、ならびに発現が乾癬病変に関連している遺伝子の同定を例証する。この実施例は、様々な処理段階での24人の乾癬患者におけるテープ採取する病変および非病変皮膚の結果を要約する。この治験中の研究の目標は、ポリウレタンフィルム(製品番号90068)上の合成ゴム系接着剤(Adhesive Research, Glen Rock, PA)と用いられたテープ円盤である、DermTechの表皮遺伝情報検索テクノロジー(Epidermal Genetic Information Retrieval Technology)(EGIR)が、乾癬患者由来の病変および非病変皮膚の表面からRNAをうまく回収しうるかどうかを決定すること；ならびに、乾癬病変において上昇していることが知られている特定のmRNA分子について回収されたRNAを半定量化することであった。これらの患者から生じたデータは、RNAが回収されうること、ならびにTNFα、IFNγ、CD2、GAPDHおよびβ-アクチンについてのmRNAが、テープ採取された表皮試料において検出され、かつ半定量化されうることを実証している。RNAのナノグラム量は、テープ採取された乾癬斑の92%から回収された。非病変対照皮膚からのRNAの回収は、31%成功率で、それほど成功しなかった。非病変皮膚からのRNAの回収は、繰り返して首尾よくテープ採取されることができた被験体もあるし、そうでなかった被験体もあるため、ランダムではなかった。非病変乾癬皮膚からのRNAの回収は、85%成功率をもつ健康な個体の正常な皮膚をテープ採取することの成功と対照をなす。半定量的RT-PCR分析は、β-アクチンに対して、少なくとも6人の患者が乾癬斑においてTNFα mRNAレベルを有意に上昇させ、4人の患者がIFNγ mRNAを上昇させ、3人がCD2メッセージを増加させたことを実証した。18人の患者は、対照皮膚からの不十分なRNA収集のため、乾癬病変においてアッセイされたいずれのマーカーの相対変化も示すことができなかった。しかしながら、21人の患者の病変におけるΔCt値の解析は、乾癬対対照の皮膚においてβ-アクチンに対するTNFαとCD2のmRNAレベル間に高い有意差を実証した。これらのデータは、TNFαおよびCD2のmRNAが、実際、ほとんどの患者において上昇していたこと、および患者が2つの群、上昇したTNFαおよびCD2のmRNAをもつ者ならびに上昇したTNFα、CD2およびIFNγのmRNAをもつ者、へ分類されることができたことを示唆する。データは、乾癬対非病変皮膚においてβ-アクチンに対して3つのmRNAの別個の相対存在量があり、それらの差が全被験体に渡って共通であることを実証している。これらの予備的結果は、非常に勇気づけられるものであり、追加の患者での確認を必要とする。
材料および方法
臨床：試料収集は、Gerald Krueger博士と共同してUniversity of Utahで行われた。各身体部位について、合計4つの新しいテープが、逐次的に、単一部位へ1回、当てられ、外された。テープは、個々のエッペンドルフチューブへ置かれ、-80で凍結され、すべてのその後の分析が行われるDermTech Internationalへドライアイスにおいて速達で郵送された。テープ剥ぎ取りに用いられたテープは、ポリウレタンフィルム上の合成ゴム系接着剤MA70(Adhesive Research)であった。
RNAの単離：全RNAが、本発明者らの標準方法およびRNeasy線維性組織キット(Qiagen)を用いて単離された。各部位を採取するために用いられた4つのテープは、緩衝液RLTにおいて混合され、本発明者らの標準適応を用いる製造会社のガイドラインに従っていっしょに抽出された。
RNA質量の定量化：試料は、ABI 7000または7900上で蛍光に基づいた5'-ヌクレアーゼアッセイ(「リアルタイム」PCR)を用いる非競合性半定量的RT-PCRにより定量化された。各試料は3連で逆転写され、各cDNAは2連で増幅および定量化された；結果として生じた6個のCt値は、RNA質量へ変換され、平均されて、表1におけるデータを生じた。Ct値は、標準曲線方法を用いてRNA質量へ変換された。標準曲線は、ヒト脾臓由来の全RNAで作成された。この方法の正確さは、ヒト脾臓RNAにおけるβ-アクチンの相対量が、テープ剥ぎ取りにより回収された皮膚試料におけるそれと同一であることを仮定する。すべてのアッセイは、Applied Biosystemsから購入されたPredeveloped Assay Reagentsを用いて行われた。最初の11人の被験体(試料セット1および2)からのデータは、多重アッセイ法(アクチンおよび対象となるmRNAの同じチューブアッセイ)を用いて集められた。その後、すべての分析は、単一チューブ単一分析形式で行われた。すべてのΔCtおよびΔΔCt計算は、同じ実験中に測定されたCt値で行われた(すなわち、同時増幅/検出)。
mRNAレベルの半定量化：メッセンジャーRNA(mRNA)レベルは、非競合性RT-PCRおよび比較法(ΔΔCt方法；5'-ヌクレアーゼアッセイ)を用いてGAPDH、TNFα、IFNγおよびCD2について半定量化された。ΔΔCt方法において、個々のmRNA(「mRNAx」、すなわち、対象となるRNA)が、β-アクチンmRNA(mRNAa)への標準化により半定量化され、この比率は、非病変皮膚部位からの同様の比率で割られる、「較正」と呼ばれる段階。結果として生じた数は、病変対非病変の皮膚における(mRNAx/mRNAa)の変化の示度である。
ΔΔCt方法のバックグラウンド(以下の考察および本明細書に考察されていない追加の情報の一部は、http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdfにおいて見出されうる、ABI User Bulletin #2に見出されうる)：蛍光検出および5'-ヌクレアーゼアッセイを用いる試料の増幅中、試料の正味の(バックグラウンド補正された)蛍光は、試料における特定のmRNAの最初の量に関連している、合成されたPCR産物の量に直接関連している。この蛍光は、ΔRnと呼ばれるが、以下の方程式によりPCR産物の量と関連している：
Figure 2007531529
XTは、サイクルCにおける全PCR産物の量であり、X0は、mRNAxの最初の量である。PCR反応中、ΔRnは、指数関数的に上昇する(反応の初期段階において非競合性条件下で)；ΔRnが有意にバックグラウンドより上へ上昇する場合、それは閾値に達したと言われ、方程式1]は以下になる：
Figure 2007531529
Kxは、蛍光プローブに特異的な分光定数であり、反応条件およびCt,x(閾値)は、閾値蛍光ΔRnに達するのに必要とされるPCRサイクルの数である。同様の方程式は、この場合β-アクチンである、標準化mRNAについて作成されうる：
Figure 2007531529
KAは、アクチン特異的定数であり、A0は、アクチンmRNA分子の最初の数である。方程式2を方程式3で割り、整理し直すことにより、本発明者らは、mRNAxの率を本発明者らの未知または「実験の(experimental)」試料におけるβ-アクチンmRNAと関連づける方程式を得る：
Figure 2007531529
KAX＝KA/KXおよびΔCt,Exp＝Ct,X−Ct,Aである。この方程式は、mRNA分子の最初の(未知の)数を実験的に決定された閾値サイクル数と関連づける。方程式から、2つのmRNAの比率が、実験的に導かれたCt値の関数だけでなく、定数KAX(未知)、および計器により測定かつ報告されている2つのΔRn値の関数でもあることがわかる。従って、KAXの知識なしには、比較法により、単一の試料における2つのmRNAの絶対的比率が明らかにされない。しかしながら、第二の「較正物質(calibrator)」試料についての以下の同様の方程式を作成する：
Figure 2007531529
および方程式4を方程式5で割ることにより、以下を得る：
Figure 2007531529
実験および較正物質の試料が同じ実験中に分析される場合には、閾値は等しい、
Figure 2007531529
KAXは両方の試料について同一であるため、方程式6は以下へ簡約する：
Figure 2007531529
ΔΔCt＝ΔCt,exp−ΔCt,calであり、ΔCt,expは実験試料についてのCt,x−Ct,アクチンであり、ΔCt,calは較正物質試料についての同じような差であることを思い起こす。従って、方程式7は、対象となる試料(乾癬組織)と較正物質試料(非病変皮膚)の間のmRNAx/mRNAaの変化をCt測定値から直接、推論することを可能にする。「ハウスキーピング」遺伝子が全RNAに対するそれの発現を変化させないという仮定をさらに加える場合には、方程式7は以下へ簡約することに留意されたい：
Figure 2007531529
この最終の簡約は、診断目的のためにCt値から有意性を引き出す必要がないことは注目されるべきである。
較正なしのΔCt値の分析：ΔΔCt方法は、方程式4における未知定数を消去する、および2つの試料においてΔCt値をmRNAレベルと直接的に関連づけるために、較正物質試料の使用を必要とする。較正物質試料の必要性なしにΔCt値を分析することができることは有利であろうと思われる。方程式4は、これを行ういくつかの手段を提供するように思われる。方程式4は、X0/A0をΔCtと関連づける；この比率を実験的に変化させることができたならば(例えば、インビトロで転写されたRNAを用いることにより)、ΔCt対log[X0/A0]のグラフは、既知のΔRnおよび未知のKAxに関連した傾きをもつはずであり、KAxについて解かれうり、次には、較正なしに試料において、ΔCtをmRNAx/mRNAaと直接関連づけるために用いられうる。
代替ストラテジーは、方程式4を観察されたΔCtに寄与する変数について調べ、それへのそれらの寄与を評価することである。方程式4のlogをとることにより、以下を得る：
Figure 2007531529
方程式9をΔCtについて解くことは以下を生じる
Figure 2007531529
ΔCt,Expは、3つの因子；X0/A0；ΔRn,X/ΔRn,A；およびKAXに依存することがわかる。同じ実験中で分析された2つの試料を比較する場合には、ΔRn値は同一であり、ΔCtにおける変化に寄与することができない。同様に、KAX値は同一であるため、ΔCt値は、X0/A0が変化する場合に変化するのみであることがわかる。それゆえに、同じプレート測定下において、較正段階なしにΔCt値を比較することは妥当である。論理的延長は、別々の実験からのΔCt測定値が比較されうるかどうかを問うことである。そのような事象において、ΔRnが異なる可能性が高いが、方程式10は、異なるΔRn値の効果を反映する調整されたΔCtを計算することを可能にする。方程式10の再整理は以下を与える：
Figure 2007531529
方程式11における同等の左側の表現は、異なるΔRnを説明する「調整された」ΔCtである。調整されたΔCtは、A0/X0およびKAXに依存するのみであることがわかる。この場合、KAXは、両方の試料について一定である − 同一の反応条件およびプローブを仮定すれば − 調整されたΔCt間の任意の差はX0/A0における差の結果である。
データ操作および統計学的解析：各mRNAアッセイについて、Ctの6個の反復試験測定値をもつ。これらのCt値の平均は、試料および較正物質についてのΔCt,xを計算するために用いられる。Ct値は37サイクルに近づく時、個々のアッセイは、検出不可能な読み取りまたは高変動性をもつCt値>37を生じうることが本発明者らの経験である。検出不可能および高い標準偏差をもつ37より大きい読み取りの組み合わせを処理するために、本発明者らは、以下のデータ管理ルールを採用した。ルール1]検出不可能の4個以上の読み取り(6個の反復試験のうち)がある場合には、37(本発明者らの検出の限界)のCt値が試料に割り当てられる；ルール2]平均Ctが37以上であり、かつ標準偏差が1以上である場合には、Ct＝37の値が測定されることになっているmRNAに割り当てられる。この最後のルールは、mRNAが検出または信頼性のある定量化の本発明者らの限界にある場合には、本発明者らは、それの最大値を推定するためにはそれを検出不可能として、単に定義するだけである。その値が上のルールにより割り当てられている、Ct≡37で行われた計算は、結果として生じたデータを括弧でくくることにより示されている。アウトライアー測定値は、残りの測定値の平均±3標準偏差の外側として定義される。単一の測定値がこの境界の外側に位置する場合には、それは計算から排除される。mRNAx/mRNAa比率は、2-ΔΔCt±2標準偏差により与えられた倍変化が2±2標準偏差により与えられた対照範囲に重複しない場合には対照値より統計学的に異なるとみなされる(95%信頼度において)。
結果
RNA収量
表1は、24人の患者における非病変および病変の皮膚からの全RNAの収量を示す。200ピコグラム未満の収量はβ-アクチンの8分の1の存在量のmRNAレベルを定量化するためには役に立たないことが、テープ採取での本発明者らの経験である。少なくとも200ピコグラムのこの標準を適用することにより、本発明者らは、RNA回収を成功したまたは成功していないとして分類できる。表2は、200ピコグラム基準により質量データを分類した結果を要約する。病変皮膚のテープ採取は、試料の91%が分析のための十分なRNAを有して、非常に成功であった。しかしながら、非病変皮膚のテープ採取は、それほど成功しなかった(31%成功)。
第二試料セットの分析は、非病変皮膚が回収問題を提示する可能性があることを示唆したため、その後の試料セットは、対照として2つの非病変皮膚部位を含んだ。合計12人の患者はそれぞれ、テープ採取される2つの対照部位をもった。これらの12ペアの部位のうち、9ペアは不十分なRNAを生じ、3ペアはナノグラム量のRNAを生じた(表1)。混合した部位のペアはなかった。このデータは、非病変皮膚からのRNAの回収がランダムな発生ではないが、一部の患者は実際、ほとんどRNAを生じない可能性があることを強く示唆している。同様の観察は、乾癬をもたない被験体の皮膚に当てはまる。しかしながら、健康な被験体の正常な皮膚からの成功した回収の頻度は84%である。これは、非病変乾癬皮膚からの31%回収とかなり強く対照をなす。本発明者らは、1]乾癬患者の非病変皮膚は、皮膚の表面からRNAを回収する能力のレベルにおいて異なること；および2]これらの12人の乾癬患者は、非病変皮膚からRNAを回収する能力に基づいて2つのカテゴリーへ分類されうることを結論する。この第二の結論への補足説明は、身体位置が重要な因子である可能性があること、および採取された特定の部位がまだ報告されていないことである。EGIR接着フィルムを用いて非病変皮膚からRNAを生じるかまたは生じないかのいずれかである乾癬患者間の差を理解することは興味深いものと思われる。
相対的サイトカインレベル
表3は、非病変皮膚と比較した、病変皮膚におけるTNFα、IFNγおよびCD2についてのmRNAにおける相対的増加を明らかにしている。表3は、6人の患者が、非病変皮膚と比較して有意に上昇したTNFα/β-アクチンのmRNA比率をもったことを示している。15人の患者において、対照部位からの不十分なRNA回収のために、TNF/アクチンのmRNA比率を上昇しているまたはしていないとして分類できなかった。
IFNγについてのデータは、上昇したIFNγ/アクチンmRNA比率をもつ3人の患者、および不十分な対照データのために決定をもたない18人の患者を示している。CD2についてのデータは、3人の患者が上昇したCD2/アクチンのmRNAレベルをもち、2人が正常または境界線上の上昇したレベル(可能な2.4倍増加)をもち、16個の試料は未決定であったことを明らかにしている。
考察
この研究において、本発明者らは、24人の患者において乾癬および非病変皮膚をテープ採取した結果を分析した。本発明者らは、回収されたRNAを定量化し、十分なRNAが回収された場合、それが生産的に分析されうることを示した。本発明者らは、RNAが乾癬斑から高頻度で回収されうるが、非病変皮膚からは平均頻度より下(健康な被験体と比較して)で回収されることを見出した。非病変皮膚からのRNAの回収は患者特異的であることは明らかなように思われるが、本発明者らは、身体部位がRNA回収において主要な役割を果たすという可能性を排除しなかった。乾癬患者から非病変皮膚データを効率的に収集することができないことは、病変の分析の障害であるように思われる(表3)。しかしながら、この研究の最終的な目標は、病変試料のみで対照皮膚を必要としないアッセイ法を考案することである(下で考察されている)。そのような目標は、非病変皮膚からの、またはせめて少なくとも正常な皮膚における、ΔCt値の基礎的なデータベースを必要とするため、本発明者らは、非病変皮膚からのRNAの単離を増加させるためのアイディアを追求し続けるつもりである。
いくつかのストラテジーは、乾癬患者における非病変皮膚部位からのRNAの収量を増加させる、または非病変対照を用いることなしに病変からΔCtを較正する方法を考案するために用いられることが可能でありうる。これらのストラテジーは以下である：
1. テープ用法の最適化：テープを皮膚に当てる異なる技術がRNAの回収に影響を及ぼしうることはありそうである。特に、皮膚への押しの強い貼り付けは必要である。2人の医師がその方法において訓練された。意見の一致は、訓練が非常に有益であって、どれくらい効率的に非病変皮膚が試料採取されるかにおいて違いを生じるであろうことであった。
2. 原則として、そのデータが後の時点で採取された病変試料を較正するために用いられうるため、たった1つの非病変(すなわち、影響をうけていない)対照が必要とされる。従って、非病変試料は、試料を得ることを保証するために単一の部位へテープの10回までの貼り付けの1回限りの使用を含みうる。
3. 身体位置がRNA回収について重要な因子であるという不確かな証拠がある。この仮説は、健康な個体において試験されることになっている。予備的データは、三角筋より上の上腕、肩甲棘より上の上背、および耳周囲(乳様突起)領域が優れたRNA産出部位でありうることを示唆している。
4. 単一の薄片生検は、すべてのその後の分析についての対照としての役割を果たす。
5. 市販されているRNAを「ユニバーサル」較正物質として用いることは可能であり、おそらく望ましい。
集団データに基づいて − 対照試料への参照なしに − 組織試料を分析しかつ結論を引き出すことは、医学診断学において比較的よくある。例えば、血液は、日常的に分析され、判定は、与えられたパラメーターの値が正常または異常範囲内にあるかどうかに基づいている。この例において、「対照」試料がない、患者だけが1つの血液供給源をもつ；対照は、正常な試料に見出された値の範囲に基づいている。同様に、その個体からの対照試料への参照なしに、乾癬斑を評価することができるはずである。診断パラメーターとして最も明らかな候補は、mRNAx/参照mRNAの比率であるが、本発明者らは、mRNAの絶対的定量化なしに、2つのmRNAの絶対的比率を計算するためにCt値を用いることができないことがわかった。これは、病変を比較かつ分類するために較正されていないΔCtを用いることができないことを意味しない。
ΔΔCt方法がmRNAを半定量化するために用いられる場合、未知定数の消約、ならびに結果として生じる、未知および較正物質試料における、ΔΔCtの相対的mRNAx/mRNAaレベルとの直接的関連を可能にする較正物質試料が必要とされる(式6；材料および方法の部)。たとえ試料間でΔCt値を比較するとしても(すなわち、較正されていない試料比較)、観察されたΔCtに寄与するX0/A0以外の変数を明らかにする必要があるだろう。
方程式4は、試料において、ΔCt値をmRNAx/mRNAa比率と関連づける。方程式4の再整理(材料および方法)は、ΔCtは、1]試料におけるmRNAx/mRNAa比率；2]対象となるメッセージおよび標準化mRNAについてのΔRn値；ならびに3]分光定数KAXの関数であることを示している。比較されるべき試料が同じ実験中でアッセイされる場合には、ΔRn値は、同一であり、ΔCtにおけるいずれの差にも寄与しないであろう。同じ試料容量およびプローブの使用は、同様に、KAXがすべての試料について同じであることを保証するだろう。それゆえに、較正されていないΔCt値を比較する − それらがただ、X0/A0の関数であるのみであることを知っている − ならびに、mRNAx/mRNAa比率が乾癬対非乾癬の皮膚において異なること、およびこの差が集団における全個体に渡ることの仮説を評価することは可能であるはずである。
表4におけるデータは、この仮説を試験するために用いられうる。表4は、すべての試料についてのΔCtを含む。それぞれの対象となるmRNAの下において、病変についてのΔCt値は、3つの列のうちの1つへ保存される。左側の第一列(↑により表されている)は、対照皮膚と比較してmRNAx/mRNAa比率における有意な増加をもつ病変試料からのΔCt値を含む(表3)。第二列は、対照皮膚から有意な変化がない病変からのΔCt値を含む。第三列は、分類されていない病変からのΔCt値を含む。病変が分類されていないことについての典型的な理由は、対照皮膚(非病変皮膚)からの不十分なRNA収集のせいである。第四列は、非病変皮膚からのΔCt値を含む。
ΔCt値を既知および未知のカテゴリーへ分類することにより、カテゴリーが固有の範囲を定義しているかどうかを決定するために統計学的検定を用いることができる。表4において、増加したTNFα mRNAレベルをもつ試料における平均ΔCt,TNFは5.18である。対照的に、対照皮膚試料についての平均ΔCt,TNFは9.53である。t検定は、病変対非病変の皮膚についてのΔCt値間の差が高く有意であることを示している(p=0.0007)。分類されていないΔCt,TNFデータにおける同様の解析は、分類されていない病変試料が対照値と有意に異なるΔCt,TNF値をもつことを示している(表4；p<0.0005)。従って、分類されていない病変試料は、大部分が、上昇したTNFα/β-アクチンのmRNA比率をもつ試料からなるように思われる。
同じ解析は、ΔCt,CD2データへ適用されうる。表4は、上昇したCD2 mRNAをもつ試料についてのΔCt,CD2値は、対照試料と有意に異なること(p=0.001)、および分類されていない病変試料についてのΔCt,CD2値もまた対照値と異なることを示している(p<0.005)。それゆえに、本発明者らの分類されていない病変試料は、ほとんど、増加したCD2 mRNAレベルをもつ試料を表しているように思われる。
IFNγ mRNAの同様の解析により、上昇したIFNγ/アクチンのmRNA比率をもつ病変におけるΔCt,IFNは、対照皮膚と有意に異なるΔCt,IFN値をもつことが明らかにされている(表4；p=0.02)。分類されていない病変試料についてのΔCt,IFN値が対照皮膚と比較される場合、それらが非病変皮膚と異なるという信頼度はそれほど高くない(p=0.12)。このデータの本発明者らの解釈は、分類されていないカテゴリーが、ある一部は上昇したIFNγレベルをもち、ある一部はそうではない、試料の混合を含むことである。実際に、分類されていないΔCt,IFN値の検閲により、2.01の低(ほとんど間違いなく異常に高い)から11.14の高(おそらく正常)までの値の範囲が示されている。このデータから、試料の大部分が、上昇したTNFαおよびCD2のmRNAレベルをもつこと、ならびに患者のいくらかの割合は、上昇したIFNγ mRNAレベルをもつことを結論づけることができる。これは、患者の2つのクラス、すべての3つのマーカーの高レベルをもつもの、および、TNFおよびCD2の高レベルならびにIFNγの正常レベルをもつもの、を有することを示唆している。これらのカテゴリーを生じる臨床的違いを定義することは非常に興味深い。
ΔCt値の上の解析は、皮膚型に固有の病変乾癬皮膚および非病変皮膚についての値の範囲があるという尤度を確立している(表4)。分類されていないΔCt,IFNγデータにおける不均一性は、対照試料をもたない病変ΔCtデータを分類する方法のより大きな問題を浮き彫りにする。ΔCtを分類するために、病変および非病変(または健康な個体由来の正常な皮膚)の皮膚からの較正されたΔCt値のデータベースを必要とする。非病変皮膚からRNAを得る本発明者らの現行の成功率において、正常および異常範囲を定義することができる25〜30個の較正されたΔCtを得るためにおよそ100人の患者を必要とするものと思われる。患者の一部は良いRNA産出者であると思われるという事実は、興味深い質問を起こさせる。実際、これらの個体が「異なる」正常な皮膚をもつならば、彼らは適切な対照ではない可能性がある(いくつかのマーカーについて、定義からして興味深いことではあるが)。実際、正常な健康な人々が最良の対照群でありうる。
（表１）全RNA収量要約
Figure 2007531529
*収量は、ナノグラムで全RNAを報告した；ND＝少しも検出されず
1. University of Utahラウンド1
2. University of Utahラウンド2
3. 被験体は1回のテープ適用に同意した
4. University of Utahラウンド3；1人の患者は単一の対照(試料ID 70)および病変(ID 60)を試料採取された、残りの4人の患者は2つの対照および1つの病変を試料採取された；対照IDは括弧内である
5. University of Utahラウンド4；2つの対照および1つの病変が試料採取された；対照IDは括弧内である
6. これらの試料は試料/病変名称を割り当てられておらず、凍結までの不明確な時間、氷上で輸送された可能性がある
（表２）試料セット1〜4における質量回収の要約
Figure 2007531529
1. ≧200ピコグラムRNAをもつ試料の率；合計23人の患者から、ラウンド2からの被験体6はこれらのデータに含まれていない(しかし、患者合計に含まれている)
（表３）乾癬病変におけるTNFα、IFNγおよびCD2の相対的レベル
Figure 2007531529
1] 非病変皮膚に対する倍誘発が示されている；括弧内の数は、対象となるmRNA(TNFα、IFNγまたはCD2)にCt=37を割り当てることにより計算された下限推定値である、この推定値は、対象となるmRNAが対照部位において検出できなかったため、用いられる；**をもつ値は、材料および方法に記載されているように、95%信頼区間において対照部位と統計学的に異なるとみなされる；「-」は、対照(典型的な)または病変部位から回収されたRNAが不十分であったことを示す；NDは、病変または対照のいずれかの試料において検出された、対象となる遺伝子のmRNAがないことを示す(RNAは存在する)；試料130および150は、2つの異なる非病変皮膚部位に対する較正に対応する2つの異なる倍増加をもつ。
2] University of Utahラウンド1
3] University of Utahラウンド2
4] University of Utahラウンド3；1人の患者は単一の対照および病変を試料採取された、残りの4人は2つの対照および1つの病変を試料採取された；対照IDは括弧内である
5] University of Utahラウンド4；2つの対照および1つの病変が試料採取された；対照IDは括弧内である
6] これらの試料は試料/病変IDを割り当てられておらず、凍結までの不明確な時間、氷上で輸送された
（表４）ΔCt値の分類および比較
Figure 2007531529
Figure 2007531529
1. ΔCt値は、対象となるmRNAについてのCt値マイナスβ-アクチンについてのCt値(Ct,mRNA−Ct,アクチン)として定義される。いくつかの試料において、対象となるmRNAは検出されることができず、その場合、Ctは、37サイクル、本発明者らの検出限界、と定義される；そのような場合、推定されたΔCtは、式37−Ct,アクチンから計算され、括弧に入れて報告されている。↑により見出しを付けられた列は、統計学的に上昇した(95%信頼区間)サイトカインレベルをもつ病変からのデータを含む；⇔で見出しを付けられた列は、有意な変化を示していない病変からのデータを含む；UKにより見出しを付けられた列は、分類されていないデータ(較正物質が利用できない)を含む；NRNAは回収された不十分なRNAを示す。
2. University of Utahラウンド1
3. University of Utahラウンド2
4. University of Utahラウンド3；1人の患者は単一の対照および病変を試料採取された、残りの4人は2つの対照および1つの病変を試料採取された；対照IDは括弧内である。
5. University of Utahラウンド4；2つの対照および1つの病変が試料採取された；対照IDは括弧内である
6. これらの試料は試料/病変IDを割り当てられておらず、凍結までの不明確な時間、氷上で輸送された可能性がある。
* 平均および標準偏差は推定されたデータ(括弧内の数)を含まない。
† 非病変皮膚と比較した両側t検定；括弧内のΔCt値は計算に含まれない。
実施例4
乾癬患者の病変および非病変皮膚におけるΔCt値により示されているようなmRNAの相対的レベル
この実施例は、乾癬病変および非病変皮膚の角質層においてゲノム発現を特徴付けるために、本明細書に開示されたテープ剥ぎ取り方法およびΔCt値の使用を例証する。より具体的には、この研究は、乾癬病変において上方制御されることが知られている様々なmRNAについてのΔCt値が、テープ剥ぎ取りにより回収されたRNAを用いて特徴付けられうるかどうかを決定する。
方法
テープ剥ぎ取り手順およびテープは実施例3に開示されたものと同一である。1つの病変が試料採取され、3つの独立した非病変皮膚(UIS)部位が患者につき試料採取された。3つの非病変皮膚部位試料は、1つの「大域」対照試料を作製するように組み合わせられた。各部位は、それぞれが逐次的に、1回、当てられて外される4つの個々のテープで試料採取された。mRNAは、標準化メッセージとしてβ-アクチンを用いる比較またはΔCt方法を用いて半定量化された。
結果および考察
このテープ剥ぎ取り研究において、合計72個の被験体病変および163個の正常皮膚部位が試料採取された。それほど重症ではない疾患をもついくらかの患者は非病変皮膚部位においてのみ試料採取された。各試料は、β-アクチンmRNAに対して標準化されるGAPDH、TNFα、IFNγ、CD2、Krt-16、IL-12B、およびIL-23A mRNAについて半定量化された。これらのアッセイの結果は表9に示されている。
（表９）乾癬患者の病変および非病変皮膚における精選されたバイオマーカーmRNAの集団平均ΔCt値
Figure 2007531529
a. テープ剥ぎ取りされた部位、病変または非病変皮膚(UIS)；観察の数は括弧に入れて下に挙げられている。
b. ΔCtはCt,mRNAx−Ct,アクチンmRNAとして定義され、Ctは閾値蛍光に達するのに必要とされるPCRサイクルのそれぞれの数である。いくつかの試料において、閾値が測定されることができなかった（すまわちmRNAは検出できなかった）、またはアッセイされなかった、従って、観察の数は、各mRNAについて異なる。SEMは、N1/2により割られた標準偏差として計算された平均値の標準誤差である。
表9におけるデータは明らかに、病変および対照皮膚において列挙されたすべてのmRNAの異なる相対的レベルがあることを実証している。TNFα、IFNγ、CD2、IL-12B、Krt-16およびIL-23Aについて、ΔCt値はすべて、既報のデータと一致して、病変皮膚においてmRNA発現の相対的増加を示している。従って、本発明者らは、テープ剥ぎ取りされた皮膚から回収されたRNAが、非病変皮膚と比較して病変の乾癬皮膚において活性があることが知られている分子事象を正確に反映することができると結論づける。
実施例5
時間および処置を通しての臨床評価(NPF評点)との乾癬病変におけるΔCt値の比較
この実施例は、テープ採取されたRNAおよび-Ct値が乾癬における変化をモニターするために用いられうることを例証している。
方法
患者は、何ヶ月間にも渡ってEnbrel(商標)(Etanercept)で処置された。処置が開始される前(0週間目)および処置中の様々な時点においての両方で、病変は、ポリウレタンフィルム上の合成ゴム系接着剤MA70(Adhesives Research)を用いてテープ剥ぎ取りされた。接着条片は、17 mmの直径の円として製造された。皮膚部位は、4つの個々のテープで逐次的に剥ぎ取られ、各テープは1回、当てられて、外される。すべての4つのテープ上の接着細胞から単離されたRNAは1つの試料へプールされた。テープから回収された全RNAは、表1に列挙されたmRNAについて半定量化された。定量化は、内部標準化mRNA標準としてβ-アクチンmRNAでの比較法を用いる定量的RT-PCRにより、較正は、乾癬被験体の非病変皮膚におけるΔCtについての集団平均値を用いることにより達成された(表1)。
結果および考察
表10は、処置前および処置の8週間後の両方で、β-アクチンmRNAに対してGAPDH、TNFα、IFNγ、IL-12BおよびIL-23AのmRNAをアッセイした結果、加えてNPF評点により特徴付けられるような疾患の臨床評価を示す。各患者の非病変皮膚に対して病変試料を較正するよりむしろ、本発明者らは、非乾癬皮膚に対する倍変化を得るように集団平均値に対して較正することを選択した。各患者の非病変皮膚値に対して較正した結果は、事実上、同一であった(データ示されず)。表10はまた、病変試料におけるほとんどすべてのΔCt値についてベースラインから8週間目までの変化は正であり、一方、NPF評点における変化は、この同じ期間に渡って負であった(疾患における改善を示す)ことを示す。従って、これらの特定のmRNAのΔCt値における正の変化は、NPF評点における8週間目でのベースラインからの変化と負の相関関係がある。この負の相関関係は、TNFα、IFNγ、IL-12BおよびIL-23AのmRNAのレベルにおける増加が、臨床症状における改善と相関していることを示唆する。これは、表10における倍変化データを調べることにより最も明らかに実証される。この観察の有意性を評価するために、表10におけるΔCtおよびNPFデータが解析された。この解析の結果は表11に示されている。
（表１０）6人の患者の乾癬病変における、処置前および処置の8週間目でのΔCt値、倍変化およびNPF評点
Figure 2007531529
Figure 2007531529
a. 試料についてのΔCtは、Ct,mRNAx−Ct,mRNAアクチンとして計算され、Ct,mRNAxは、遺伝子「X」について閾値蛍光に達するのに必要とされるPCRサイクルの数であり、Ct,mRNAアクチンはβ-アクチンについての同じような値である。与えられた試料について対象およびβ-アクチンのmRNAに関する閾値は、同時にアッセイされた(すなわち、同じ実験中に)。
b. 非病変皮膚についての集団平均値ΔCtに対するmRNA/β-アクチンmRNAの比率の倍変化。倍変化は、2-(ΔΔCt)として計算され、ΔΔCt(比較法)はΔCt,病変−ΔCt,集団平均と等しい。
c. 0週間目および8週間目におけるNational Psoriasis Foundation(NPF)評点。
表11におけるデータは、処置の0週間目と8週間目の間でのNPF評点およびΔCt値における変化の比較に関する、相関係数および片側t検定についてのp値、加えて並べかえ検定についての正確なp値を示す。データは、TNFα、IFNγ、IL-12BについてのΔCt値とNPF評点の間で有意な相関を示し、負の相関が、NPF評点における改善(減少)がmRNAレベルにおける減少(ΔCtにおける減少)と対応することを確認している。表はまた、ハウスキーピング遺伝子GAPDHの相関は有意ではないが、IL-23Bについての相関は有意性に近づいていることを示す。本発明者らは、研究において患者のより多い数では、データはよりいっそう有意であろうと推測する。CD2およびKrt-16についての類似したデータは、有意ではなかったが、有意性へ傾いていた(データ示されず)。本発明者らは、乾癬病変の非侵襲的テープ剥ぎ取りにより回収されたRNAは、臨床的改善を正確に描くことができると結論づける。このデータは、臨床的改善に先んずる(すなわち、結果を予測する)分子プロファイルが存在するならば、テープ剥ぎ取りにより回収されたそのRNAはこれらのプロファイルを明らかにすることができることを示唆している。
（表１１）乾癬病変において、NPF評点および様々なmRNAについてのΔCt値における0週間目から8週間目までの変化の間の相関係数の要約
Figure 2007531529
a. 自由度4をもつt統計値は、式；T(N-2)＝R*(N-2)0.5/(1-R2)0.5を用いて観察された相関係数の有意性を検定するために計算された。
b. 相関係数の計算に用いられた観察の数はたった6であるため、漸近的正規性に基づいたT統計値の計算は適切ではない可能性がある。それゆえに、本発明者らは、並べかえ検定を用い、相関係数を観察すること＜＝観察された値の正確な確率は、ブートストラップサンプリングを用いて計算された。これらのp値を計算するために用いられたソフトウェアは、EXCELにおける「RESAMPLING STATS」であった。
表9における非病変皮膚データは、表2における患者の病変皮膚をΔCt値により分類するために用いられうる。すなわち、0時間目での病変における異なるmRNAについてのΔCt値が、非病変皮膚についての集団平均ΔCtとの比較により「正常」または「異常」として分類されうる。本発明者らは、表9におけるデータを用いて非病変皮膚についての平均ΔCtの3 SEM内にある任意の値を正常として選択した。処置前の病変を分類した結果は表12に示されている。
（表１２）非病変皮膚についての集団平均値との比較による乾癬病変の特徴付け
Figure 2007531529
a. 正常の分類は、「+」により示され、異常は「-」により示されている。正常の指定は、病変ΔCt値(表10)が、非病変皮膚についての集団平均値(表1)の3標準誤差(SEM)内に近い場合に与えられる。この基準は、正常として分類されるために、病変におけるΔCt値が、1.89(GAPDH)；7.84(TNFα)；8.34(IFNγ)；6.1(IL-12B)；7.14(IL-23A)；-1.69(Krt-16)；7.53(CD2)以上でなければならないことを意味する。ΔCtデータは、示されていないKrt-16およびCD2患者データを除いて、表1および3から取られる。
表12は、類似した臨床的疾患をもつ患者のこの限定されたセットでさえも、病変におけるmRNAの正常/異常のプロファイルに依存していくつかのサブグループへ分類されうることを示す。最も目立つカテゴリーは、病変皮膚においてすべてのmRNAの高レベルをもつ患者3および7、ならびに病変においてIFNおよびIL-12Bの正常レベルをもつ患者4および6である。非常に低いIFNγ mRNAの観察は、IFNγタンパク質がすべての病変において上昇しているという現行の定説を考慮すれば、驚くべきことである。IFNγの低いmRNAレベルは高いタンパク質レベルを排除しないとはいえ、IFNγが低い病変もあるし、高い病変もあるという事実は驚くべきことである。これらの異なる病変プロファイルの有意性はまだ決定されていないが、本発明者らは、そのようなプロファイリングがテープ剥ぎ取りされたmRNAを用いて行われうることを確認した。そのような研究におけるより多い患者の追加およびRNAを分析しうるDNAアレイの使用で、臨床的に有用であろう有意な多遺伝子プロファイルが出現する可能性は高い。
実施例6
SLS刺激および対照の皮膚におけるケラチン遺伝子発現の分析
この実施例は、テープ採取および生検により回収された場合のSLS刺激および対照の皮膚の試料におけるケラチン10、16および17の発現データを提供する。ケラチンは、ケラチン生成細胞において顕著に見出される細胞骨格タンパク質のファミリーである。表皮の基底層はKrt-5およびKrt-14を発現させ、一方、分化している基底上層はKrt-1およびKrt-10を発現させる。ケラチン生成細胞が炎症を起こした場合、それらは活性化されて、Krt-6、Krt-16およびKrt-17を発現させるが、Krt-10の転写を下方制御する(Komine, Freedberg et al. 1996; Freedberg, Tomic-Canic et al. 2001)。従って、SLSにより炎症を起こした皮膚は、K16およびK17を発現させ、K10の転写を抑制すると予測されるものと思われる。遺伝子発現における定量的変化を確実に明らかにする、テープ条片回収されたRNAの能力を明確にするための継続的な努力において、炎症を起こしたおよび対照の皮膚のテープ剥ぎ取りおよび生検試料において炎症により誘発されることが知られている遺伝子の発現が比較された。
この研究において分析された試料は、Wong et al(Wong, Tran et al. 2004)により行われたプロトコールに記載されているものである。簡単には、10人の被験体が、24時間、背中中央に1%SLS(水性)および水で閉塞的にパッチを当てられた(2つの二重反復試験パッチ)。パッチは取り外され、等価の皮膚部位が、上の実施例に記載されているように生検およびテープ剥ぎ取りを実施された。追加の対照として、正常な皮膚もまた生検およびテープ剥ぎ取りを実施された。試料は全RNAについて処理され、ケラチン-10、ケラチン-16、ケラチン-17およびβ-アクチンのmRNAについてアッセイされた。ケラチンmRNAは、各試料においてβ-アクチンmRNAに対して標準化された。半定量的RT-PCRアッセイは、以前に記載されている(Wong, Tran et al. 2004)。
表13、表14および表15は、β-アクチンmRNAに対するKrt-10、Krt-16およびKrt-17のmRNAについてのΔCtを示す。さらに、表はまた、未処理の皮膚に対するSLSおよび水処理された皮膚におけるmRNA/アクチン比率の計算された倍変化を示す。平均K10発現についてのテープおよび生検データは、事実上同一であり、SLS処理で発現における約20倍平均減少を示し、一方、水処理はほとんど効果がない(表13)。従って、K10発現について、テープおよび生検データは一致する。
表14は、SLSおよび水処理された皮膚におけるK16発現についての生検データならびにテープデータを示す。予想通り、K16 mRNA発現は、SLS処理された皮膚の生検試料において増加している。表は、SLS処理での平均39倍増加を示す。驚くべきことに、テープ試料は、SLS処理された試料においてK16発現での平均9分の1の減少を示している。生検とテープデータ間のこの違いを確認するために、本発明者らは、炎症中、K16と共に誘発されることが知られているK17の発現をアッセイした。
表15は、SLSおよび水処理された試料のテープおよび生検試料についてのK17データを示す。SLS処理された皮膚の生検試料におけるK17の平均倍増加は42倍で、K16データと事実上同一である。再び、生検試料と対照的に、テープ試料は、SLS処理された皮膚のテープ採取された試料において8分の1に減少しているK17/アクチンのmRNA比率を示した。従って、K16およびK17/アクチンのmRNA比率は、一貫して、予測通り生検試料において上昇し、テープ採取された試料において減少している。これは、刺激された皮膚がテープで試料採取される場合、K16またはK17の発現における減少が炎症の診断となるという驚くべき結論へと導く。
表13、表14および表15におけるΔCtデータの有意性は、二元完全反復測定ANOVAにより検定された。結果は、すべてのケラチンについての有意な全体的効果を示した(p<0.0001)。表16は、有意なペアワイズ比較の一部を示す。表16は、テープと生検の方法間において、予想通り、SLS処理による倍変化が高く有意に異なるだけでなく、ΔCt値もまた、高く有意に異なることを示す。処理内でのΔCt値におけるこの差、ならびにテープがKrt-16およびKrt-17発現において減少を示すが、生検は増加を示すという事実は、テープ採取および生検が明確に異なる細胞集団を回収していることを示唆する前のデータを確信させる。
この実施例に引用された文献
Freedberg, I.M., M. Tomic-Canic, et al. (2001). "Keratins and the keratinocyte activation cycle." J Invest Dermatol 116(5):633-40.
Komine, M., I.M. Freedberg, et al. (1996). "Regulation of epidermal expression of keratin K17 in inflammatory skin diseases." J Invest Dermatol 107(4): 569-75.
Wong, R., V. Tran, et al. (2004). "The use of RT-PCR and DNA microarrays to characterize RNA recovered by non-invasive tape-harvesting of normal inflamed skin." Journal of Investigative Dermatology 印刷中。
（表１３）テープ剥ぎ取りおよび生検により回収されたRNA試料における、SLS処理、水処理および未処理の皮膚におけるΔCt,Krt-10の変化、ならびに結果として生じた、未処理の皮膚に対するKrt-10/β-アクチンのmRNA比率の倍変化
Figure 2007531529
a. ΔCt,Krt-10は、Ct,Krt-10−Ct,アクチンとして定義され、Ct,Krt-10はKrt-10検出についての閾値蛍光に達するのに必要とされるPCRサイクルの数であり、Ct,アクチンは、同じ試料におけるβ-アクチン検出についての同じような数である。
b. 倍増加は、2-(ΔΔCt)として計算され、ΔΔCtはΔCt,状態−ΔCt,正常と等しい；ΔCt,状態は上で定義されており、「状態」は水処理かSLS処理のいずれかを指す；ΔCt,正常は、正常な(未処理の皮膚)試料におけるΔCt値である。倍増加は、左側の列におけるデータを用いて計算された。方法は、Wong et al.(Wong, Tran et al. 2004)に詳細に記載されている。
（表１４）テープ剥ぎ取りおよび生検により回収されたRNA試料における、SLS処理、水処理および未処理の皮膚におけるΔCt,Krt-16の変化、ならびに結果として生じた、未処理の皮膚に対するKrt-16/β-アクチンのmRNA比率の倍変化
Figure 2007531529
a. 計算の説明について表13の脚注を参照。
（表１５）テープ剥ぎ取りおよび生検により回収されたRNA試料における、SLS処理、水処理および未処理の皮膚におけるΔCt,Krt-17の変化、ならびに結果として生じた、未処理の皮膚に対するKrt-17/β-アクチンのmRNA比率の倍変化
Figure 2007531529
d. 計算の説明について表13の脚注を参照。
（表１６）試料採取方法と処理の間でのΔCt値の有意なペアワイズ比較
Figure 2007531529
a. 単一方法が示されている場合、比較は、正常な皮膚におけるその試料採取方法対水またはSLS処理された皮膚における同じ試料採取方法の間である。
b. 二元完全測定ANOVAのペアワイズ比較からの結果として生じるp値。ΔCt値は、正常対SLSまたは水処理された皮膚について試料採取方法内で(すなわち、SLS処理された皮膚の生検対正常な皮膚の生検)、および与えられた処理について方法間で(すなわち、SLS処理された皮膚について生検対テープ)、比較される。
実施例7
mRNAプロファイリングによる刺激性およびアレルギー反応の区別
この実施例は、刺激性接触皮膚炎(ICD)とアレルギー性接触皮膚炎(ACD)を区別することができるRNAプロファイルを同定するための実験を提供する。刺激性とアレルギー性の皮膚反応を区別することへの現在の障害は、これらの異なる皮膚炎の臨床的類似性である。分子および組織学的分析は、これらの反応が多くの類似した特徴を共有するが、明確な識別する組織学的特徴をもつとわかっていることを示した。今日まで、幅広いクラスの物質について皮膚炎のこれらの2つのクラス間を確実に区別できるRNAアッセイの実証がなかった。
方法：臨床試験は20人までの被験体で行われた。各被験体は、異なる刺激物およびアレルゲンを含むFinnチャンバーで閉塞的にパッチを当てられる。Triton X100、ラウリル硫酸ナトリウム、8%ホルムアルデヒド、Tween 80、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、CTAB、レゾルシノール、またはフェノールのような刺激物は、適切な媒体と共に、媒体対照と共に、24時間までの間、刺激性皮膚反応を起こすことが知られている濃度で適用される。ツタウルシ(ウルシ属)、1%ホルムアルデヒド、硫酸ニッケル、クマリン、ネオマイシン、ペルーバルサム、Kathon CG、エポキシ樹脂、カルバミックス(Carbamix)、メチルジブロモグルタロニトリル、イミダゾリジニルウレア、またはセクイテルペンラクトン混合のようなアレルゲンは、標準的な媒体において適切な濃度で用いられる。24時間までの曝露後、チャンバーは取り外され、皮膚反応が評点をつけられる。その後、部位は、皮膚採取テープ(製品番号90068)(Adhesives Research, Glen Rock, PA)を用いて、4つまでのテープが逐次的に当てられ、そして外されて、テープ採取される。RNAは、テープから抽出され、標準T7線形方法により増幅され、増幅されたRNAはDNAアレイにハイブリダイズされる。このデータから、別個のRNA示差的発現プロファイルが同定される；これらのプロファイルは第二実験において確認される。
第二プロトコールは、上で同定されたプロファイルがACDとICDを再現可能的に区別するために用いられうる。この第二研究は、少なくとも半分の被験体が第一研究とは異なることを除いて、第一と設計において類似している。
示差的に制御されたRNAのコア群は、アレルギー性皮膚反応と比較した刺激性皮膚反応において、固有である、または異なるレベルで発現されることを同定されることが予想される。これらのRNAは、アレルギー性皮膚反応と刺激性皮膚反応を区別するために用いられうるプロファイルを構成する。
実施例8
臨床症状前の、またはかすかな臨床提示をもつ、刺激性皮膚反応の予測
この実施例は、臨床刺激または毒性もしくは腐蝕性皮膚反応の発生を予測するRNA発現プロファイルを同定するための実験を提供する。刺激性または毒性/腐蝕性皮膚反応を実証するために、化合物を皮膚に塗り、反応が臨床的に明らかになるまで、またはいずれの反応もなく適切な時間量が経過する(典型的には、2〜3週間)まで、それを放置することが必要である。物質が皮膚への1〜3時間の塗布後、刺激性または毒性/腐蝕性皮膚反応を生じるという確率を容易に予測しうるアッセイの導入が重要な進歩を表す。
方法：20人までの被験体をもつ臨床プロトコールが行われる。閉塞性パッチが皮膚へ1〜3時間、当てられる。パッチは、治験の条件下で、わずかよりも多い刺激性皮膚反応(斑点状の薄いピンク色の紅斑として定義される)を引き起こさないことが事前にわかっている濃度で強い刺激剤、または公知の腐蝕性/毒性物質を含む。試験材料の希釈溶液または水のような媒体対照が加えられる。そのような強い刺激物の例は以下である：20%ラウリル硫酸ナトリウム；100%オクタノール；10%酢酸；100%デカノール。曝露の1〜3時間後、パッチ(またはフィルムチャンバー)が外され、皮膚が臨床的に評点をつけられる。部位は、その後、4つまでのテープが逐次的に当てられ、そして外されて、テープ採取される。RNAはテープから抽出され、標準T7線形方法により増幅され、増幅されたRNAはDNAアレイにハイブリダイズされる。このデータから、別個のRNA示差的発現プロファイルが同定される；これらのプロファイルは、同じ化学物質および異なる被験体での第二実験において確認される。
希釈された刺激性または毒性/腐蝕性化学物質への閉塞的曝露の1〜3時間は、実際に重度の臨床刺激状態または毒性を引き起こすことなく、強い刺激性または毒性の可能性を予測する転写性変化を誘発するのに十分である。従って、RNAプロファイルを用いて、実際にその反応をもたらすことなく、強い刺激性または毒性/腐蝕性皮膚反応を生じうる物質の可能性を推論することは可能である。
実施例8
特定の処置結果に相関したRNAプロファイルを同定するための処置前の乾癬病変および非病変皮膚の分析
この実施例は、特定の処置を用いての成功を予測する、− テープ剥ぎ取りにより捕獲されたRNAを用いて − 乾癬病変のマイクロアレイ分析、特異的RNAプロファイルにより同定しうる実験を提供する。上の実施例で例証されているように、テープ採取されたRNA試料は、病的および/または正常な皮膚生理を反映している。さらに、本明細書に例証されているように、乾癬病変は、テープ条片試料において示されたRNAプロファイルに依存して異なる群へ分類されうる。従って、種々の処置、より多数の患者、および多数の遺伝子をより分けうる(ヒトゲノムスキャン)核酸アレイの使用で、特定の治療の効果を予測する固有のプロファイルが同定されることが期待される。
方法：この研究において、乾癬患者は、処置を受ける前に病変および非病変皮膚においてAdhesive Research (Glen Rock, PA)からの接着テープ製品番号90068を用いて1回と10回の間で、テープ剥ぎ取りされる。以前に処置を受けた患者は、テープ剥ぎ取りされかつ処置を開始する前に標準の「洗い流し」期間を受ける。処置中、患者は、1週間目、2週間目、4週間目、8週間目、12週間目および24週間目にテープ剥ぎ取りされる；NPF評点はかれらの来診時に作成される。RNAは、前に記載されているように、単離、増幅され、そして、核酸アレイにハイブリダイズされる。統計は、異なる週においてRNAプロファイルをNPF評点と相関させるために行われる。
特定の治療での処置後のNPF評点の低下(すなわち、成功した臨床的結果)と相関する、病変および/または非病変皮膚のいずれかのRNAプロファイル − 処置より前の − が存在することが予想される。これは、特定の患者について最も効果的な治療をあらかじめ決めることを可能にする。
実施例9
処置過程の初期におけるRNA分析による臨床的徴候前の処置効力の予測
この実施例は、処置プログラムの初期に、最終的な処置効力を予測するRNAプロファイルを同定することを目的とする実験を提供する。乾癬病変のテープ試料採取は、RNAプロファイリングにより処置の経過をモニターするために用いられうることが本明細書に例証されている。予備的データはまた、いくつかのmRNAレベルが正常レベルに戻らないこと、およびこのプロファイルをもついくらかの患者は最終的には処置に応答できないことを示している。追加のRNAが同定されること、および多変量解析により、処置過程の初期における処置への応答と高く相関するRNA発現プロファイルが同定されることが仮説として取り上げられる。
方法：患者は、治療前および中に、病変および非病変皮膚においてテープ剥ぎ取りされる。テープ条片試料およびNPF評点は、0時間目、1週間目、2週間目、3週間目、4週間目および6週間目において作製される。RNAは、前に本明細書で開示されているように、単離、増幅され、そしてDNAアレイにハイブリダイズされる。データは解析され、RNAプロファイルはNPF評点と相関している。
最終的なNPF評点の低下(16週間目またはそれ以降における)と高く相関している処置計画の初期に(1〜6週間目)作成されたRNAプロファイルが、作成されることが予想される。そのようなプロファイルの同定は、最終的に処置に応答しないことが運命づけられている患者の同定を可能にし、それに従って、過程の初期に処置における変化を可能にする。そのようなスクリーニングは、より高い、費用効率および時間効率、ならびにおそらく、回復する速度を可能にする。
方法は、以下のように、刺激性接触皮膚炎を含むような皮膚領域の特徴付けを助けるために、表VIIに列挙された遺伝子のいずれかについての発現における変化を検出するのに用いられうる：
（表ＶＩＩ）0.99以上のPPDEにおいて発現された1771個の遺伝子についてのAffymetrix遺伝子発現データ
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本発明は、上の実施例に関して記載されているが、改変および変化が本発明の真意および範囲内に含まれることは理解されるものと思われる。従って、本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
実施例2でさらに詳細に開示されたSLS刺激プロトコールの実験設計を図で示す。 図2A〜図2Cは、SLS曝露による刺激の誘導における遺伝子発現変化についてのp値分布を提供する。p値は、すべての反復試験においてバックグラウンドより上の値で発現されたすべての遺伝子の組織化されたt-検定分布に基づいて、100個のビンへ分類され、各ビンにおいて遺伝子の数に対してプロットされる。パネルA、未処理対SLS閉塞の試料間で比較された21,031個の遺伝子のp値。パネルB、SLS処理対水閉塞の試料間で比較された21,307個の遺伝子のp値。パネルC、未処理対水閉塞の試料間で比較された21,164個の遺伝子のp値。パネルAおよびBにおける破線は、示差的発現のない条件下でのp値の一様分布を示す。

Claims (119)

  1. 以下の段階を含む、皮膚における遺伝子の発現を検出する方法：
    a)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で接着テープを皮膚の標的領域に当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含み、テープがゴム系接着剤を含み、かつテープが柔軟である、段階；および
    b)表皮試料において核酸分子を検出し、それにより、皮膚における遺伝子の発現を検出する段階。
  2. テープがポリウレタンフィルム上にゴム系接着剤を含む、請求項1記載の方法。
  3. 約1〜10個の接着テープが皮膚に当てられ、外される、請求項1記載の方法。
  4. 約1〜8個の接着テープが皮膚に当てられ、外される、請求項1記載の方法。
  5. 約1〜5個の接着テープが皮膚に当てられ、外される、請求項1記載の方法。
  6. 核酸分子が、核酸分子を検出するためにマイクロアレイに適用される、請求項1記載の方法。
  7. 変化した発現が、ΔCt値における差を検出することにより検出され、ΔCt値が、標的核酸分子と対照核酸分子の間での閾値シグナルレベルに達するのに必要とされる増幅サイクルの数における差である、請求項1記載の方法。
  8. 以下の段階を含む、皮膚疾患または病的皮膚状態についての処置に対する被験体の応答を検出するための方法：
    a)皮膚疾患または病的皮膚状態について被験体を処置する段階；
    b)表皮試料を単離するのに十分な様式で接着テープを被験体の皮膚に当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階；および
    c)核酸分子を含む試料において標的核酸分子を検出する段階であって、標的核酸分子の発現が皮膚疾患および病的皮膚状態に関する情報を与え、それにより、皮膚疾患または病的皮膚状態についての処置に対する被験体の応答を検出する、段階。
  9. 方法が処置前および処置後に行われる、請求項8記載の方法。
  10. 皮膚疾患または病的皮膚状態が乾癬である、請求項9記載の方法。
  11. 標的核酸分子が、TNFI、IFNγ、IL-12B、NPFまたはIL-23Bから選択されるタンパク質をコードする、請求項10記載の方法。
  12. 標的核酸分子が、CD2、TNFIまたはIFNγから選択されるタンパク質をコードする、請求項10記載の方法。
  13. 処置前と比較した処置後の標的核酸分子の発現における減少が処置に対する正の応答を示している、請求項12記載の方法。
  14. 遺伝子の集団が検出される、請求項9記載の方法。
  15. 検出がマイクロアレイを用いて行われる、請求項14記載の方法。
  16. 皮膚疾患または病的皮膚状態が皮膚炎である、請求項9記載の方法。
  17. 皮膚の標的領域が刺激された皮膚である、請求項16記載の方法。
  18. 方法がケラチン10、ケラチン16、またはケラチン17の遺伝子産物の発現を検出し、かつ発現における増加が処置に対する応答を示している、請求項17記載の方法。
  19. 方法がケラチン16またはケラチン17の遺伝子産物の発現を検出し、かつ発現における増加が処置に対する応答を示している、請求項17記載の方法。
  20. 以下の段階を含む、ヒト被験体の乾癬病変の表皮試料から核酸分子を単離または検出するための非侵襲的方法：
    a)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で接着テープを被験体の乾癬病変に当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階；および
    b)表皮試料において核酸分子を単離または検出する段階。
  21. 核酸がTNFα、IFNγ、CD2、IL-12B、Krt-16およびIL-23Aをコードする、請求項20記載の方法。
  22. 核酸がCD2、TNFIおよびIFNγから選択されるタンパク質をコードする、請求項21記載の方法。
  23. 1個と10個の間の接着テープが皮膚に当てられ、皮膚から外される、請求項20記載の方法。
  24. 1個と8個の間の接着テープが皮膚に当てられ、皮膚から外される、請求項20記載の方法。
  25. 約1個と4個の間の接着テープが皮膚に当てられ、皮膚から外される、請求項20記載の方法。
  26. 方法が、乾癬病変の生検材料を採取する段階をさらに含む、請求項20記載の方法。
  27. 核酸試料が生検材料から得られ、テープ試料由来の核酸および生検材料由来の核酸が分析される、請求項26記載の方法。
  28. 接着テープがゴム系接着剤を含む、請求項20記載の方法。
  29. ヒト被験体の非病変表皮組織から核酸試料を得る段階をさらに含む、請求項20記載の方法。
  30. 核酸試料が非病変皮膚の生検材料を採取することにより得られる、請求項29記載の方法。
  31. 正常な表皮組織からの核酸が以下の段階により得られる、請求項29記載の方法：
    a)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で接着テープを被験体の皮膚に当てる段階であって、表皮試料が核酸を含み、かつ皮膚が検査されるべき疾患により影響をうけていない、段階；および
    b)影響をうけていない皮膚の表皮試料から核酸を単離または検出する段階。
  32. 非病変皮膚が上腕または上背に由来する、請求項30記載の方法。
  33. 核酸がデオキシリボ核酸(DNA)である、請求項20記載の方法。
  34. 核酸がリボ核酸(RNA)である、請求項20記載の方法。
  35. 皮膚が刺激された皮膚である、請求項20記載の方法。
  36. 標的核酸の変化した発現が、処置前および後にΔCt値における差を検出することにより検出され、ΔCt値が、標的核酸分子と対照核酸分子の間での閾値シグナルレベルに達するのに必要とされる増幅サイクルの数における差である、請求項20記載の方法。
  37. 以下の段階を含む、被験体において乾癬を特徴付けるための方法：
    a)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で被験体の皮膚上の乾癬病変ではないかと疑われる病変に接着テープを当てる段階であって、表皮試料が標的核酸分子を含む、段階；および
    b)標的核酸分子を検出する段階であって、標的核酸が、乾癬をもつ少なくともいくつかの被験体において異なっている、段階。
  38. 標的核酸分子がCD2、TNFI、またはIFNγから選択されるタンパク質をコードする、請求項37記載の方法。
  39. 処置の選択または処置を続けるかどうかを決定するために特徴付けを用いる段階をさらに含む、請求項37記載の方法。
  40. 発現プロファイルがマイクロアレイを用いて検出される、請求項37記載の方法。
  41. ΔCt値が、標的核酸分子と対照核酸分子の間での閾値シグナルレベルに達するのに必要とされる増幅サイクルの数における差である、ΔCt値を測定する段階をさらに含む、請求項37記載の方法。
  42. 以下の段階を含む、ヒト被験体において乾癬を診断するための方法：
    a)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で被験体の皮膚における乾癬病変ではないかと疑われる病変に接着テープを当てる段階であって、表皮試料が標的核酸分子を含む、段階；および
    b)標的核酸分子を検出する段階であって、乾癬を有さない試料由来の表皮試料における発現と比較して標的核酸分子の変化した発現が、乾癬を示しており、それにより、被験体の乾癬を診断する、段階。
  43. 標的核酸分子が、TNFα、IFNγ、CD2、IL-12B、Krt-16、およびIL-23Aから選択されるタンパク質をコードする、請求項42記載の方法。
  44. 2つまたは以上の標的核酸分子が検出される、請求項43記載の方法。
  45. CD2、TNFIまたはIFNγから選択される2つまたはそれ以上のタンパク質をコードする2つまたはそれ以上の標的核酸分子が検出される、請求項44記載の方法。
  46. 生検材料が皮膚の部位において採取される、請求項42記載の方法。
  47. 核酸試料が生検材料から得られる、請求項46記載の方法。
  48. CD2、TNFI、またはIFNγから選択されたタンパク質をコードする標的核酸分子の発現が検出される、請求項46記載の方法。
  49. 変化した発現が、標的核酸分子の発現を対照核酸分子の発現と比較することにより検出される、請求項42記載の方法。
  50. 標的核酸分子および対照核酸分子の発現が、同じ試料容量およびプローブを用いる同じ実験において検出される、請求項49記載の方法。
  51. 変化した発現がΔCt値における差を検出することにより検出され、ΔCt値が、標的核酸分子と対照核酸分子の間での閾値シグナルレベルに達するのに必要とされる増幅サイクルの数における差である、請求項50記載の方法。
  52. 以下の段階を含む、動物被験体の皮膚を特徴付けるための方法：
    a)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で刺激された皮膚を含むのではないかと疑われる皮膚の標的領域に接着テープを当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階；および
    b)表VIIに列挙された遺伝子から発現される核酸分子、またはそれらの任意の組み合わせを表皮試料において検出する段階であって、核酸分子の発現が刺激された皮膚において変化しており、それにより被験体の皮膚を特徴付ける、段階。
  53. 表VIIに列挙された遺伝子より発現される2つまたはそれ以上の核酸分子の発現が検出される、請求項52記載の方法。
  54. 表VIIに列挙された遺伝子より発現される10個またはそれ以上の核酸分子の発現が検出される、請求項53記載の方法。
  55. 表VIIに列挙された遺伝子より発現される100個の核酸分子の発現が検出される、請求項53記載の方法。
  56. 検出がマイクロアレイにおいて行われる、請求項55記載の方法。
  57. 核酸分子が表VIに列挙された遺伝子より発現される、請求項52記載の方法。
  58. 遺伝子がIL-8である、請求項52記載の方法。
  59. 試験物質が、接着テープが当てられる前に標的領域に塗布される、請求項52記載の方法。
  60. 特徴付けが試験物質の臨床試験の一部として行われる、請求項59記載の方法。
  61. 動物被験体が哺乳動物である、請求項52記載の方法。
  62. 哺乳動物がマウス、ウサギまたはブタである、請求項61記載の方法。
  63. 哺乳動物被験体がヒトである、請求項61記載の方法。
  64. 以下の段階を含む、遺伝子発現における変化を検出するための方法：
    a)接着テープに付着した表皮試料を皮膚の標的領域および皮膚の正常領域から単離するのに十分な様式で、第一接着テープを皮膚の標的領域に、および第二接着テープを皮膚の影響をうけていない領域に、当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階；ならびに
    b)標的領域試料および正常領域試料のそれぞれについて、標的核酸分子および対照核酸分子を増幅し、かつ標的核酸分子と対照核酸分子の間での閾値シグナルレベルに達するのに必要とされる増幅サイクルの数における差を計算することによりΔCt値を同定する段階であって、標的領域対正常領域におけるΔCt値における差が、標的領域における標的核酸分子の遺伝子発現における変化を示している、段階。
  65. 対照核酸分子がハウスキーピング遺伝子より発現される、請求項64記載の方法。
  66. 約1個〜10個の接着テープが皮膚の対照領域に、および皮膚の標的領域に、当てられる、請求項64記載の方法。
  67. 約1個〜5個の接着テープが皮膚の対照領域に、および皮膚の標的領域に、当てられる、請求項64記載の方法。
  68. 標的核酸分子の集団が検出される、請求項64記載の方法。
  69. 検出がマイクロアレイを用いて行われる、請求項68記載の方法。
  70. 皮膚の標的領域が乾癬病変である、請求項64記載の方法。
  71. 皮膚の標的領域が皮膚炎に冒された皮膚を含む、請求項64記載の方法。
  72. 皮膚の標的領域が刺激された皮膚である、請求項64記載の方法。
  73. 方法がケラチン10、ケラチン16、またはケラチン17の遺伝子産物の発現における減少を検出する、請求項72記載の方法。
  74. 方法がケラチン16またはケラチン17の遺伝子産物の発現における減少を検出する、請求項72記載の方法。
  75. 以下の段階を含む、ヒト被験体の疾患または病的状態を示す核酸分子発現のパターンを同定するための方法：
    a)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で、疾患または病的状態に冒された皮膚の領域に、および影響をうけていない領域に、接着テープを当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階；
    b)試料から得られたRNA分子をマイクロアレイに適用する段階；ならびに
    c)マイクロアレイを用いて少なくとも10個の遺伝子の発現レベルを測定する段階であって、影響をうけていない皮膚試料における発現と比較して少なくとも10個の遺伝子のそれぞれについての疾患または病的皮膚状態試料における変化した発現レベルが、疾患または病的状態に冒された皮膚を同定し、それにより、疾患または病的状態を示す核酸分子発現のパターンを同定する、段階。
  76. 少なくとも100個の遺伝子の発現レベルがマイクロアレイにおいて測定される、請求項75記載の方法。
  77. 少なくとも1000個の遺伝子の発現レベルがマイクロアレイにおいて測定される、請求項75記載の方法。
  78. 少なくとも10000個の遺伝子の発現レベルがマイクロアレイにおいて測定される、請求項75記載の方法。
  79. 約1個〜10個の接着テープが皮膚に当てられ、外される、請求項75記載の方法。
  80. 約1個〜8個の接着テープが皮膚に当てられ、外される、請求項75記載の方法。
  81. 1個〜5個の接着テープが皮膚に当てられる、請求項75記載の方法。
  82. 以下の段階を含む、ヒト被験体の疾患または病的状態を示す発現プロファイルを同定するための方法：
    a)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で、疾患または病的状態に冒された皮膚の領域に接着テープを当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階；ならびに
    b)疾患または病的皮膚状態試料および影響をうけていない試料について発現パターンを測定するために、試料由来のRNA分子、またはそれらの増幅産物をマイクロアレイに適用する段階であって、発現プロファイルにおける差が疾患または病的状態皮膚の発現プロファイルを示している、段階。
  83. 疾患または病的状態が皮膚炎である、請求項82記載の方法。
  84. 疾患または病的状態が乾癬である、請求項82記載の方法。
  85. 皮膚から表皮試料を単離するための方法であって、表皮試料を単離するのに十分な様式で接着テープを皮膚の標的領域に当てる段階を含み、テープがゴム系接着剤を含み、かつテープが柔軟であり、それにより接着テープに付着した表皮試料を単離する段階を含む、方法。
  86. テープがゴム系テープである、請求項85記載の方法。
  87. テープがポリウレタンフィルム上にゴム系接着剤を含む、請求項86記載の方法。
  88. テープが、約1回〜10回、皮膚に当てられ、外される、請求項85記載の方法。
  89. テープが、約1回〜8回、皮膚に当てられ、外される、請求項85記載の方法。
  90. テープが、約1回〜5回、皮膚に当てられ、外される、請求項85記載の方法。
  91. 以下の段階を含む、皮膚由来の表皮試料から核酸分子を単離するための方法：
    a)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で接着テープを皮膚の標的領域に当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含み、テープが非極性ポリマーを含み、かつテープが柔軟である、段階；および
    b)表皮試料から核酸分子を単離する段階。
  92. テープがゴム系テープである、請求項91記載の方法。
  93. テープがポリウレタンフィルム上のゴム系接着剤を含む、請求項92記載の方法。
  94. 以下の段階を含む、疾患または病的状態についての処置に対する応答について予測皮膚マーカーを同定するための非侵襲的方法：
    a)核酸分子を含む表皮試料を単離するのに十分な様式で、第一時点において、疾患または病的状態に冒された被験体の皮膚に接着テープを当てる段階；
    b)疾患または病的状態について被験体を処置する段階；
    d)疾患または病的状態が処置に応答したかどうかを測定する段階；および
    e)表皮試料における核酸分子の発現が処置に対する応答を予測しているかどうかを決定し、それにより処置に対する応答についての皮膚マーカーを同定する段階。
  95. 疾患または病的状態が乾癬である、請求項94記載の方法。
  96. 処置がエタネルセプト(Etanercept)、クロベタゾール(Clobetasol)、アレファセプト(Alefacept)、または狭帯域紫外線B光である、請求項95記載の方法。
  97. 以下の段階を含む、疾患または病的状態についての処置に対する応答を予測するための非侵襲的方法：
    a)核酸分子を含む表皮試料を単離するのに十分な様式で、疾患または病的状態に冒された被験体の皮膚に接着テープを当てる段階；
    b)表皮試料において標的核酸分子を検出する段階であって、標的核酸分子の発現が処置に対する応答を示しており、それにより、疾患または病的状態についての処置に対する応答を予測する、段階。
  98. 疾患または病的状態が乾癬である、請求項97記載の方法。
  99. 処置がエタネルセプトまたは狭帯域紫外線光である、請求項98記載の方法。
  100. 以下の段階を含む、作用物質の皮膚への効果を測定するための方法：
    a)皮膚の標的領域を作用物質と接触させる段階；
    b)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で接着テープを皮膚の標的領域に当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階；および
    c)皮膚の標的部位についての発現プロファイルを測定する段階であって、発現プロファイルが皮膚の状態を示しており、それにより作用物質の皮膚への効果を測定する、段階。
  101. 作用物質が生体分子である、請求項100記載の方法。
  102. 作用物質が組み合わせライブラリーから同定される、請求項100記載の方法。
  103. 作用物質が有機低分子である、請求項100記載の方法。
  104. 作用物質がスキンケア製品である、請求項100記載の方法。
  105. 段階d)の前に、試料由来の核酸分子またはそれらの増幅産物をマイクロアレイに適用する段階をさらに含む、請求項100記載の方法。
  106. 方法が臨床試験の一部として行われる、請求項100記載の方法。
  107. 発現プロファイルが少なくとも100個の遺伝子の発現レベルを含む、請求項100記載の方法。
  108. 接着テープが約1回〜10回、皮膚に当てられ、外される、請求項100記載の方法。
  109. 以下の段階を含む、ヒト被験体において刺激性接触皮膚炎(ICD)とアレルギー性接触皮膚炎(ACD)を区別する方法：
    a)接着テープに付着した表皮試料を単離するのに十分な様式で皮膚炎に冒された皮膚の領域に接着テープを当てる段階であって、表皮試料が核酸分子を含む、段階；および
    b)ICDまたはACDと関連した遺伝子の発現レベルを測定し、それによりICDとACDを区別する段階。
  110. 単離されたRNAまたはその増幅産物が、発現レベルを測定するためにマイクロアレイに適用される、請求項109記載の方法。
  111. 少なくとも10個の遺伝子の発現レベルがマイクロアレイを用いて測定され、少なくとも10個の遺伝子のそれぞれについてのICD対ACDについて異なる発現レベルが、ICDまたはACDに冒された皮膚を同定する、請求項110記載の方法。
  112. 少なくとも100個の遺伝子の発現レベルがマイクロアレイを用いて測定され、少なくとも100個の遺伝子のそれぞれについてのICD対ACDについて異なる発現レベルが、ICDまたはACDに冒された皮膚を同定する、請求項111記載の方法。
  113. 少なくとも1000個の遺伝子の発現レベルがマイクロアレイを用いて測定され、少なくとも1000個の遺伝子のそれぞれについてのICD対ACDについて異なる発現レベルが、ICDまたはACDに冒された皮膚を同定する、請求項112記載の方法。
  114. 約1個〜10個の接着テープが皮膚に当てられ、外される、請求項109記載の方法。
  115. 以下を含む、キット：
    a)ゴム系接着剤を含む柔軟な接着テープ；および
    b)生体分子についてのプローブ。
  116. テープがポリウレタンフィルム上のゴム系接着剤を含む、請求項115記載のキット。
  117. ポリウレタンフィルムが3.0ミルのフィルムである、請求項116記載のキット。
  118. プローブがバイオアレイの一部である、請求項115記載のキット。
  119. プローブが、TNFα、IFNγ、CD2、IL-12B、Krt-10、Krt-16、Krt-17およびIL-23Aから選択されるタンパク質をコードする標的核酸分子を結合する、またはコードされたタンパク質を結合する、請求項115記載のキット。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012501183A (ja) * 2008-08-28 2012-01-19 ダームテック インターナショナル 皮膚サンプルの年齢範囲の決定方法
JP2014504155A (ja) * 2010-11-30 2014-02-20 株式會社アモーレパシフィック 皮膚老化と関連した遺伝子及び皮膚老化を防止する物質をスクリーニングする方法
JP2015529817A (ja) * 2012-08-15 2015-10-08 ザ プロクター アンド ギャンブルカンパニー ヒトエックスビボ皮膚モデル及び皮膚炎症のモジュレータを特定する方法におけるその使用
JP2015197337A (ja) * 2014-03-31 2015-11-09 株式会社ナリス化粧品 角栓形成抑制効果を有する素材のスクリーニング方法
JP2021523735A (ja) * 2018-05-09 2021-09-09 ダームテック，インク． 自己免疫疾患における新規な遺伝子分類とその使用
US11332795B2 (en) 2008-05-14 2022-05-17 Dermtech, Inc. Diagnosis of melanoma and solar lentigo by nucleic acid analysis
WO2022172991A1 (ja) 2021-02-12 2022-08-18 花王株式会社 皮膚角層由来の核酸試料の調製方法
US11578373B2 (en) 2019-03-26 2023-02-14 Dermtech, Inc. Gene classifiers and uses thereof in skin cancers
US11976332B2 (en) 2018-02-14 2024-05-07 Dermtech, Inc. Gene classifiers and uses thereof in non-melanoma skin cancers

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7422743B2 (en) 2000-05-10 2008-09-09 Schering Corporation Mammalian receptor protein DCRS5;methods of treatment
AU2002346008A1 (en) * 2001-06-28 2003-03-03 Dermtech International Method for detection of melanoma
US7183057B2 (en) * 2004-03-31 2007-02-27 Dermtech International Tape stripping methods for analysis of skin disease and pathological skin state
US20050287593A1 (en) * 2004-05-03 2005-12-29 Schering Corporation Use of cytokine expression to predict skin inflammation; methods of treatment
BRPI0510617A (pt) * 2004-05-03 2007-10-30 Schering Corp uso de expressão de il-17 para prever inflamação de pele; processos de tratamento
DE102006012613B4 (de) * 2006-03-17 2010-01-14 Mpb Meltec Patent- Und Beteiligungsgesellschaft Mbh Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Substanzen
US20070281314A1 (en) * 2006-04-20 2007-12-06 Dermtech International Methods for capture and detection of micro-RNA molecules from the skin by non-invasive tape stripping
JP5311439B2 (ja) * 2006-12-27 2013-10-09 日本メナード化粧品株式会社 皮膚の状態を評価する方法及びその用途
US7642062B2 (en) * 2006-12-29 2010-01-05 Avon Products Inc. Compositions and methods of their use for improving the condition and appearance of skin
WO2008086596A1 (en) * 2007-01-16 2008-07-24 Premd, Inc. Apparatus for non-invasive skin sampling and testing
AU2008247502A1 (en) * 2007-05-04 2008-11-13 Dermtech International Diagnosis of melanoma by nucleic acid analysis
US8389215B2 (en) * 2007-07-26 2013-03-05 University Of Utah Research Foundation Non-invasive recovery of RNA and analysis of gene expression in skin
US7919250B2 (en) 2007-07-31 2011-04-05 New York University Diagnostic and treatment methods for characterizing bacterial microbiota in skin conditions
ES2523684T3 (es) * 2007-10-11 2014-11-28 Mitomics Inc. Procedimiento para someter a ensayo variantes del MC1R y marcadores mitocondriales en muestras de piel
CA2703333A1 (en) * 2007-10-26 2009-04-30 Galderma Research & Development Non-invasive method to perform skin inflammatory disease pharmaco-genomic studies and diagnosis method thereof
FR2923610B1 (fr) * 2007-11-14 2009-11-27 Galderma Res & Dev Methode non-invasive de recueil de donnees biologiques pour l'etablissement d'un diagnostic d'une pathologie cutanee.
US20090287120A1 (en) * 2007-12-18 2009-11-19 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Circulatory monitoring systems and methods
US9717896B2 (en) 2007-12-18 2017-08-01 Gearbox, Llc Treatment indications informed by a priori implant information
US8636670B2 (en) 2008-05-13 2014-01-28 The Invention Science Fund I, Llc Circulatory monitoring systems and methods
US20090286263A1 (en) * 2008-03-05 2009-11-19 United States Army As Represented By The Secretary Of The Army Skin tape stripping: a non-invasive diagnostic strategy for dermal exposure to cytotoxic compounds
US20090233954A1 (en) * 2008-03-12 2009-09-17 Goren Andy Ofer Methods and systems for prognosis of a patient's response to treatment of androgenetic skin disorders
FR2934278B1 (fr) * 2008-07-22 2013-12-06 Oreal Signature moleculaire representative de dysfonctionnements de l'homeostasie epidermique
US20110077512A1 (en) * 2009-06-16 2011-03-31 Dept. Of Veterans Affairs Biopsy marker composition and method of use
WO2011087524A1 (en) 2010-01-17 2011-07-21 The Procter & Gamble Company Biomarker-based methods for formulating compositions that improve skin quality and reduce the visible signs of aging in skin
FR2955593A1 (fr) * 2010-01-27 2011-07-29 Oreal Signature moleculaire peau agee
WO2012109319A1 (en) 2011-02-08 2012-08-16 Avery Dennison Corporation Comprehensive skin testing
CN102787094B (zh) * 2011-05-17 2015-09-23 李晖 培养基、细胞培养用试剂盒及细胞培养方法
US10531251B2 (en) 2012-10-22 2020-01-07 United States Cellular Corporation Detecting and processing anomalous parameter data points by a mobile wireless data network forecasting system
CA2969931C (en) 2012-12-14 2021-03-30 The Procter & Gamble Company Antiperspirant and deodorant compositions comprising a perfume raw material having a nitrile moiety
US9335229B2 (en) * 2013-03-15 2016-05-10 Frontier Wind, Llc Load distribution estimation
MX2015012298A (es) * 2013-03-15 2015-12-16 Procter & Gamble Un metodo no invasivo para medir peptidos antimicrobianos de la piel como una medicion objetica de proteccion natural de los microbios.
CN112858655B (zh) * 2013-03-15 2024-05-28 宝洁公司 用于测量皮肤健康代谢物的非侵入性方法
CN105593372A (zh) 2013-06-18 2016-05-18 普罗皮肤检测股份有限公司 基于皮肤菌群的分析的定制皮肤护理品和个人护理品
US9557331B2 (en) 2013-08-23 2017-01-31 Elwha Llc Systems, methods, and devices for assessing microbiota of skin
US9811641B2 (en) 2013-08-23 2017-11-07 Elwha Llc Modifying a cosmetic product based on a microbe profile
US9456777B2 (en) * 2013-08-23 2016-10-04 Elwha Llc Systems, methods, and devices for assessing microbiota of skin
US10010704B2 (en) 2013-08-23 2018-07-03 Elwha Llc Systems, methods, and devices for delivering treatment to a skin surface
US20150057574A1 (en) 2013-08-23 2015-02-26 Elwha Llc Selecting and Delivering Treatment Agents based on a Microbe Profile
US9526480B2 (en) 2013-11-27 2016-12-27 Elwha Llc Devices and methods for profiling microbiota of skin
WO2015026969A1 (en) * 2013-08-23 2015-02-26 Elwha Llc Systems, methods, and devices for assessing microbiota of skin
US9549703B2 (en) 2013-11-27 2017-01-24 Elwha Llc Devices and methods for sampling and profiling microbiota of skin
US9390312B2 (en) * 2013-08-23 2016-07-12 Elwha Llc Systems, methods, and devices for assessing microbiota of skin
US10152529B2 (en) 2013-08-23 2018-12-11 Elwha Llc Systems and methods for generating a treatment map
US9805171B2 (en) 2013-08-23 2017-10-31 Elwha Llc Modifying a cosmetic product based on a microbe profile
EP3035994B1 (en) * 2013-08-23 2019-04-17 Elwha LLC Systems, methods, and devices for delivering treatment to a skin surface
US9610037B2 (en) 2013-11-27 2017-04-04 Elwha Llc Systems and devices for profiling microbiota of skin
US9186278B2 (en) 2013-11-27 2015-11-17 Elwha Llc Systems and devices for sampling and profiling microbiota of skin
US9526450B2 (en) 2013-11-27 2016-12-27 Elwha Llc Devices and methods for profiling microbiota of skin
EP3113849B1 (en) 2014-02-26 2019-06-12 Luma Therapeutics, Inc. Ultraviolet phototherapy apparatus
US10966916B2 (en) 2014-11-10 2021-04-06 The Procter And Gamble Company Personal care compositions
WO2016077327A1 (en) 2014-11-10 2016-05-19 The Procter & Gamble Company Personal care compositions with two benefit phases
MX2017006148A (es) 2014-11-10 2017-07-27 Procter & Gamble Composiciones para el cuidado personal con dos fases beneficas.
WO2016179043A1 (en) * 2015-05-01 2016-11-10 Dermtech, Inc. Non-invasive skin collection system
WO2017139514A1 (en) 2016-02-09 2017-08-17 Luma Therapeutics, Inc. Methods, compositions and apparatuses for treating psoriasis by phototherapy
US11913061B2 (en) 2016-07-08 2024-02-27 Kao Corporation Method for preparing nucleic acid sample
JP6231252B1 (ja) * 2016-07-08 2017-11-15 花王株式会社 核酸試料の調製方法
WO2018027091A1 (en) 2016-08-05 2018-02-08 The Research Foundation For The State University Of New York Keratin 17 as a biomarker for bladder cancer
US10381105B1 (en) * 2017-01-24 2019-08-13 Bao Personalized beauty system
US11926876B2 (en) 2017-03-10 2024-03-12 Prodermiq, Inc. Customized skin care products and personal care products based on the analysis of skin flora
AU2018251770B2 (en) * 2017-04-10 2024-03-14 Dermtech, Inc. Non-invasive skin-based detection methods
CN110869736A (zh) * 2017-07-03 2020-03-06 宝洁公司 测量皮肤上的金属污染物的方法
CN107299099A (zh) * 2017-07-07 2017-10-27 中国人民解放军第四军医大学 可抑制角蛋白17表达的SiRNA序列及应用
CN109425521B (zh) * 2017-08-28 2021-11-30 中国石油化工股份有限公司 一种化石植物分散角质层的制备方法
CN111212625B (zh) 2017-10-20 2023-05-23 宝洁公司 气溶胶泡沫洁肤剂
WO2019079405A1 (en) 2017-10-20 2019-04-25 The Procter & Gamble Company AEROSOL FOAMING CLEANSER FOR THE SKIN
CN108359731B (zh) * 2018-03-09 2021-04-13 青岛泱深生物医药有限公司 AACS及其调控lncRNA在骨肉瘤转移诊疗中的应用
GB2576374A (en) * 2018-08-17 2020-02-19 Ecole Polytechnique Fed Lausanne Epfl Skin cell analysis
WO2020081664A1 (en) * 2018-10-16 2020-04-23 National Jewish Health Methods of identifying atopic dermatitis and food allergies
US20220002782A1 (en) * 2018-11-01 2022-01-06 Kao Corporation Method for preparing nucleic acid derived from skin cell of subject
EP3887824A1 (en) 2018-11-29 2021-10-06 The Procter & Gamble Company Methods for screening personal care products
US11642300B2 (en) * 2019-05-15 2023-05-09 Johnson & Johnson Consumer Inc. Method of selecting skin treatment regimens, ingredients and compositions
DE102019129444A1 (de) 2019-10-31 2021-05-06 Lts Lohmann Therapie-Systeme Ag Lagtime-Verkürzung/Eisspray
EP4182691A2 (en) * 2020-07-17 2023-05-24 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Biomarkers and classifier of psoriasis and methods of treatment
US20220142560A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Johnson & Johnson Consumer Inc. Microbiome and metobolome clusters to evaluate skin health
USD989861S1 (en) 2021-02-16 2023-06-20 Dermtech, Inc. Dermatology report document
USD988399S1 (en) 2021-02-16 2023-06-06 Dermtech, Inc. Dermatology report document
USD966300S1 (en) 2021-02-16 2022-10-11 Dermtech, Inc. Computer display panel with a graphical user interface for a dermatology report
USD966299S1 (en) 2021-02-16 2022-10-11 Dermtech, Inc. Computer display panel with a graphical user interface for a dermatology report
US20240167102A1 (en) * 2021-03-02 2024-05-23 Dermtech, Inc. Predicting therapeutic response
WO2024154131A1 (en) 2023-01-17 2024-07-25 Dermab.Io Biomarkers for assessing the effect of drugs in pathological disorders
GB202302959D0 (en) 2023-02-28 2023-04-12 Mitra Bio Ltd A method for determining a stage of an epigenetic property of an epidermis

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001161697A (ja) * 1999-12-03 2001-06-19 Sony Cp Laboratories Inc 皮膚表皮採取用粘着テープ
JP2002523145A (ja) * 1998-08-18 2002-07-30 ダームテック インターナショナル 表皮中の生物学的因子の検出法
WO2003001985A2 (en) * 2001-06-28 2003-01-09 Dermtech International Method for detection of melanoma

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4851510A (en) * 1984-11-30 1989-07-25 Wadley Technologies, Inc. Monoclonal antibodies to novel melanoma-associated antigens
US5493009A (en) * 1989-11-14 1996-02-20 New York Medical College Antiidiotypic monoclonal antibodies MK2-23 anti-melanomal antibody 763.74
US5654286A (en) * 1993-05-12 1997-08-05 Hostetler; Karl Y. Nucleotides for topical treatment of psoriasis, and methods for using same
US5962477A (en) * 1994-04-12 1999-10-05 Adolor Corporation Screening methods for cytokine inhibitors
US5807522A (en) * 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
IT1278052B1 (it) * 1995-03-14 1997-11-17 Mendes Srl Uso delle immunoglobuline della classe g, in particolare delle immunoglobuline per uso endovenoso o per uso intramuscolare, per
US6312909B1 (en) * 1996-03-29 2001-11-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the diagnosis prevention and treatment of tumor progression
US6054277A (en) * 1996-05-08 2000-04-25 Regents Of The University Of Minnesota Integrated microchip genetic testing system
US5858683A (en) * 1996-08-30 1999-01-12 Matritech, Inc. Methods and compositions for the detection of cervical cancer
US6056859A (en) * 1997-02-12 2000-05-02 Lockheed Martin Energy Research Corporation Method and apparatus for staining immobilized nucleic acids
US6551799B2 (en) * 1999-12-07 2003-04-22 Genentech, Inc. Interleukin-22 polypeptides, nucleic acids encoding the same and methods for the treatment of pancreatic disorders
US6891022B1 (en) * 1998-04-23 2005-05-10 Genentech, Inc. NSP molecules
KR100326937B1 (ko) * 1998-09-23 2002-03-13 정연보 접착성 쉬트로 사람의 표피 ｄｎａ 샘플을 획득하는 방법
US7094533B1 (en) * 1999-01-21 2006-08-22 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Therapeutic and diagnostic applications of prostatic acid phosphatase in prostate cancer
US6274362B1 (en) * 1999-02-04 2001-08-14 Millennium Pharmaceuticals, Inc. RGS-containing molecules and uses thereof
US6982089B2 (en) * 1999-02-24 2006-01-03 Tact Ip, Llc Cytokine antagonists for neurological and neuropsychiatric disorders
IL133976A (en) * 2000-01-11 2006-09-05 Dermipsor Ltd Agents for the treatment of skin disorders
EP1358348A2 (en) * 2000-05-09 2003-11-05 Genetics Institute, LLC Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of psoriasis
EP1176200A3 (de) * 2000-06-20 2005-01-12 Switch Biotech Aktiengesellschaft Verwendung von Polypeptiden oder diese kodierende Nukleinsäuren zur Diagnose oder Behandlung von Hauterkrankung oder Wundheilung sowie ihre Verwendung zur Indentifizierung von pharmakologisch aktiven Substanzen
US20020132274A1 (en) * 2001-01-17 2002-09-19 Nevalainen Marja T. Diagnostic and monitorings methods for cancer
US20030044406A1 (en) * 2001-03-02 2003-03-06 Christine Dingivan Methods of preventing or treating inflammatory or autoimmune disorders by administering CD2 antagonists in combination with other prophylactic or therapeutic agents
US7335467B2 (en) * 2001-05-15 2008-02-26 Ludwig Institute For Cancer Research Breast cancer antigens
WO2003006058A1 (en) * 2001-07-12 2003-01-23 Wyeth Cd25+ differential markers and uses thereof
US20030113906A1 (en) * 2001-12-14 2003-06-19 Sangha Jangbir S. Method and apparatus for DNA collection
US20030224422A1 (en) * 2002-04-08 2003-12-04 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Pre-and post therapy gene expression profiling to identify drug targets
JP2006518582A (ja) * 2002-09-11 2006-08-17 ジェネンテック・インコーポレーテッド 乾癬の治療のための新規組成物と方法
US20040191782A1 (en) * 2003-03-31 2004-09-30 Yixin Wang Colorectal cancer prognostics
JP4526839B2 (ja) * 2004-03-05 2010-08-18 株式会社資生堂 角層中の酸化タンパク質を指標とする角層の透明性・保水性を評価する方法
US7183057B2 (en) * 2004-03-31 2007-02-27 Dermtech International Tape stripping methods for analysis of skin disease and pathological skin state
WO2008031041A2 (en) * 2006-09-07 2008-03-13 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Melanoma gene signature

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002523145A (ja) * 1998-08-18 2002-07-30 ダームテック インターナショナル 表皮中の生物学的因子の検出法
JP2001161697A (ja) * 1999-12-03 2001-06-19 Sony Cp Laboratories Inc 皮膚表皮採取用粘着テープ
WO2003001985A2 (en) * 2001-06-28 2003-01-09 Dermtech International Method for detection of melanoma

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11753687B2 (en) 2008-05-14 2023-09-12 Dermtech, Inc. Diagnosis of melanoma and solar lentigo by nucleic acid analysis
US11332795B2 (en) 2008-05-14 2022-05-17 Dermtech, Inc. Diagnosis of melanoma and solar lentigo by nucleic acid analysis
JP2016019531A (ja) * 2008-08-28 2016-02-04 ダームテック インターナショナル 皮膚サンプルの年齢範囲の決定方法
JP2012501183A (ja) * 2008-08-28 2012-01-19 ダームテック インターナショナル 皮膚サンプルの年齢範囲の決定方法
JP2014504155A (ja) * 2010-11-30 2014-02-20 株式會社アモーレパシフィック 皮膚老化と関連した遺伝子及び皮膚老化を防止する物質をスクリーニングする方法
JP2015529817A (ja) * 2012-08-15 2015-10-08 ザ プロクター アンド ギャンブルカンパニー ヒトエックスビボ皮膚モデル及び皮膚炎症のモジュレータを特定する方法におけるその使用
JP2015197337A (ja) * 2014-03-31 2015-11-09 株式会社ナリス化粧品 角栓形成抑制効果を有する素材のスクリーニング方法
US11976332B2 (en) 2018-02-14 2024-05-07 Dermtech, Inc. Gene classifiers and uses thereof in non-melanoma skin cancers
JP2021523735A (ja) * 2018-05-09 2021-09-09 ダームテック，インク． 自己免疫疾患における新規な遺伝子分類とその使用
JP7431812B2 (ja) 2018-05-09 2024-02-15 ダームテック，インク． 自己免疫疾患における新規な遺伝子分類とその使用
US11578373B2 (en) 2019-03-26 2023-02-14 Dermtech, Inc. Gene classifiers and uses thereof in skin cancers
WO2022172991A1 (ja) 2021-02-12 2022-08-18 花王株式会社 皮膚角層由来の核酸試料の調製方法
KR20230145345A (ko) 2021-02-12 2023-10-17 카오카부시키가이샤 피부 각층 유래의 핵산 시료의 조제 방법

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