WO2022172991A1 - 皮膚角層由来の核酸試料の調製方法 - Google Patents

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高良 井上
路子 矢野
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Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a nucleic acid sample derived from the stratum corneum of the skin.
  • the skin is a tissue that covers the outer surface of the body and is exposed to the outside world, so it is a tissue that allows easy and minimally invasive collection of biological samples.
  • Skin tissue can be collected from the body by biopsy, but as a less invasive method, a method of peeling off the skin tissue using an adhesive tape is also used.
  • an epidermis (stratum corneum) sample is isolated by applying an adhesive tape to a target area of the skin, and nucleic acid molecules contained in the obtained epidermis sample are detected to detect gene expression in the skin. A method is disclosed.
  • Non-Patent Document 1 RNA is extracted from two tapes collected using a less invasive acrylic adhesive tape, and comprehensive analysis of RNA expression is performed.
  • the number of gene reads per sample in this report does not generally meet the general conditions required for analysis, and there is a possibility that accurate analysis is not necessarily performed.
  • Patent Document 2 discloses dissolving a biological material and eluting the nucleic acid contained therein, and adding a water-soluble organic solvent to a solution containing the eluted nucleic acid to a final concentration of 10 to 60% by volume to obtain a lysate solution. and contacting the lysate solution with a solid material to adsorb and recover the nucleic acid on the solid material.
  • Multiplex PCR is a method of simultaneously amplifying multiple regions from a single DNA sample through PCR reactions that use multiple primer pairs simultaneously.
  • Multiplex RT-PCR which combines a reverse transcription (RT) reaction from RNA to cDNA with multiplex PCR, is used for gene expression analysis, genotyping, and the like.
  • Non-Patent Document 2 describes that BSA and T4 gene 32 protein (T4GP32) improve PCR reactions in the presence of inhibitors.
  • T4GP32 BSA and T4 gene 32 protein
  • the yield of RT-PCR products was significantly increased by adding T4GP32 to the RT system during RT-PCR, but T4GP32 was added to the PCR system after RT. It is described that no clear increase in yield was observed even with the In Patent Document 3, in an amplification reverse transcription method (RT-RamDA method) in which cDNA is amplified using RNA as a template, single-stranded cDNA stripped from the template RNA is bound with T4GP32 to protect the cDNA from nuclease degradation. have been described to increase the yield of cDNA.
  • Non-Patent Document 5 describes that DMSO and betaine improved the specificity and yield of PCR.
  • Patent Document 1 JP-A-2007-531529 (Patent Document 2) JP-A-2007-117084 (Patent Document 3) International Publication No. 2016/052619 (Non-Patent Document 1) J Dermatol Sci, 2021, 101 (1): 14-21 (Non-Patent Document 2) Appl Environ Microbiol, 1996, 62(3):1102-1106 (Non-Patent Document 3) Appl Environ Microbiol, 1998, 64(2):669-677 (Non-Patent Document 4) BioTechniques, 2001, 31(1):81-86 (Non-Patent Document 5) PLOS ONE, 2010, 5(6): e11024
  • the present invention provides a method for preparing a nucleic acid sample derived from the stratum corneum of the skin, comprising: extracting nucleic acid from the stratum corneum collected from the surface of the skin and preparing a water-soluble alcohol aqueous solution containing the nucleic acid, the stratum corneum having a depth of 5 ⁇ m or less from the surface of the skin; Contacting the nucleic acid in the water-soluble alcohol aqueous solution with a solid phase material to separate the nucleic acid, wherein the concentration of the water-soluble alcohol in the water-soluble alcohol aqueous solution before contacting with the solid phase material is 39 to 50% by volume.
  • a method comprising:
  • the present invention also provides a method for detecting gene expression in skin, which comprises detecting gene expression in a stratum corneum-derived nucleic acid sample prepared by the above method.
  • amino acid sequence or nucleotide sequence means 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, further preferably 99% or more. Percent or more identity.
  • nucleotide sequences and amino acid sequences are calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-41). Specifically, using the homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win (Ver.5.1.1; software development), Unit size to compare (ktup) is set to 2 and analysis is performed. Calculated by
  • the present invention provides a method for preparing a nucleic acid sample derived from the stratum corneum of the skin.
  • the present inventor extracts nucleic acid from the superficial layer of the stratum corneum of the skin, prepares a solution containing the nucleic acid and a predetermined concentration of water-soluble alcohol, isolates the nucleic acid from the solution, and then separates the isolated nucleic acid into a single It was found that by reverse transcription and/or amplification in the presence of a stranded nucleic acid binding protein T4GP32, it is possible to prepare a high-yield nucleic acid derived from the stratum corneum from the less invasive superficial stratum corneum.
  • a nucleic acid sample can be prepared in high yield from a small amount of biological sample collected from a site suitable for minimally invasive collection, such as the superficial layer of the stratum corneum.
  • a site suitable for minimally invasive collection such as the superficial layer of the stratum corneum.
  • the present invention contributes to improving the sensitivity, accuracy, or efficiency of various analyzes (eg, genetic analysis, diagnosis, etc.) using nucleic acid samples derived from living organisms.
  • the nucleic acid prepared by the method of the present invention may be any type of nucleic acid, as long as it can be contained in the stratum corneum, and includes, for example, RNA, DNA, PNA, and oligonucleotides.
  • said nucleic acid is RNA or DNA. Any of these nucleic acids may be single-stranded or double-stranded.
  • RNA include mRNA, tRNA, rRNA, small RNA (e.g., microRNA (miRNA), small interfering RNA (siRNA), Piwi-interacting RNA (piRNA), etc.), long intergenic non-coding (linc) RNA, etc. and combinations of any two or more thereof.
  • DNA include genomic DNA, mitochondrial DNA, and combinations thereof.
  • the subject from which the stratum corneum is collected should be an organism that has skin (epidermis).
  • subjects include mammals, including humans and non-human mammals, preferably humans.
  • the subject can be a human or non-human mammal that requires or desires analysis of its own nucleic acids.
  • the subject may be a human or non-human mammal that requires or desires gene expression analysis in the stratum corneum, or various other analyzes using stratum corneum-derived nucleic acids.
  • the part of the skin from which the stratum corneum of the subject is collected includes the skin of any part of the body such as the head, face, neck, trunk, limbs, healthy skin, atopy, acne, dryness, inflammation (redness), Examples include, but are not limited to, skin with diseases such as tumors, skin with wounds, and the like.
  • the stratum corneum used for nucleic acid extraction in the present invention is derived from the superficial layer of the stratum corneum, specifically the stratum corneum at a depth of 5 ⁇ m or less from the surface of the skin.
  • the stratum corneum is collected at a depth of 5 ⁇ m or less from the surface of the skin, and the nucleic acid contained therein is extracted.
  • the stratum corneum at a depth of 2.6 ⁇ m or less from the surface of the skin is collected, and the nucleic acid contained therein is extracted.
  • the stratum corneum of such a region contains a large amount of RNA related to keratinization and lipid synthesis or metabolism (Examples described later, Table 4).
  • RNA related to keratinization and lipid synthesis or metabolism (Examples described later, Table 4).
  • no stratum corneum lying deeper than 5 ⁇ m, more preferably 2.6 ⁇ m from the surface of the skin is harvested.
  • the depth of 5 ⁇ m or less from the surface of the skin corresponds to the thickness of 3 to 4 stratum corneum, and the depth of 2.6 ⁇ m from the surface corresponds to the thickness of 1 to 2 stratum corneum.
  • any means that can mainly collect the superficial layer of the stratum corneum can be adopted.
  • a method of applying a glass plate, an adhesive tape, or the like to the skin surface to adhere the superficial stratum corneum a method of scraping off the stratum corneum from the skin surface with a spatula, a scraper, or the like and recovering the stratum corneum.
  • the method using an adhesive tape is preferred.
  • An adhesive tape is composed of an adhesive layer having adhesive strength and a holder for holding it.
  • the holder is not particularly limited in shape or material as long as it can hold the adhesive layer and does not affect the adhesive of the adhesive layer.
  • the carrier preferably has a flexibility suitable for being brought into close contact with the skin surface, and is inert to extraction of nucleic acid from the stratum corneum, which will be described later.
  • the adhesive constituting the adhesive layer is not particularly limited as long as it has adhesive strength to adhere and peel the stratum corneum, and acrylic adhesives, rubber adhesives, silicone adhesives, urethane adhesives, etc. mentioned.
  • a pressure-sensitive adhesive having adhesive strength capable of peeling off the stratum corneum to a depth of 5 ⁇ m from the skin surface by tape stripping once or several times is preferably used.
  • an acrylic pressure-sensitive adhesive is preferred.
  • the size of the adhesive tape is not particularly limited, but may be, for example, a range of 0.5 to 25 cm 2 , preferably 1 to 17.5 cm 2 , more preferably 2 to 10 cm 2 .
  • Examples of such an adhesive tape include D-Squame (2.2 cm in diameter, manufactured by Clinical & Derm), which is a disc-shaped acrylic adhesive tape.
  • the stratum corneum can be collected repeatedly from the same target area of the skin.
  • the method of the present invention involves applying an adhesive tape to the same target area of the subject's skin one or more times to adhere the stratum corneum to the tape and harvest. .
  • a deeper stratum corneum can be collected depending on the number of times the tape is applied to the skin.
  • the number of times the tape is applied can be appropriately changed according to the adhesive strength of the tape so that the stratum corneum at the desired depth can be collected.
  • the method of the present invention does not necessarily preclude multiple applications of the same tape to the skin, preferably multiple sheets of tape are applied to the skin, one each.
  • one or two adhesive tapes are applied to the same target area of skin, preferably each tape is applied to the skin once.
  • the stratum corneum at a depth of 5 ⁇ m or less, preferably 2.6 ⁇ m or less from the surface of the skin is adhered to the tape and collected.
  • the nucleic acid contained in the collected stratum corneum can be extracted according to a standard method.
  • phenol/chloroform method phenol/chloroform/isoamyl alcohol (PCI) method
  • AGPC acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction
  • a modified method a method using special magnetic particles coated with silica, a method using Solid Phase Reversible Immobilization magnetic particles, or a commercially available nucleic acid purification reagent (e.g., TRIzol (registered trademark) Reagent, RNeasy (registered trademark), QIAzol (registered trademark), ISOGEN, DNeasy, DNAzol, ISOGENOME, etc.
  • nucleic acids e.g., TRIzol (registered trademark) Reagent, RNeasy (registered trademark), QIAzol (registered trademark), ISOGEN, DNeasy, DNAzol, ISOGENOME, etc.
  • TRIzol registered trademark
  • RNeasy registered trademark
  • the extracted nucleic acid is prepared as an aqueous solution containing the nucleic acid.
  • the aqueous layer (upper layer) containing the nucleic acid and the phenol-chloroform layer (lower layer) are separated, so that by recovering the aqueous layer, an aqueous solution containing the nucleic acid can be prepared. .
  • RNA extraction procedure by the phenol/chloroform method is described below: Acidic phenol is added to a sample containing nucleic acid (for example, a solution obtained by dissolving the stratum corneum adhered to the adhesive tape described above) and mixed. RNA is then extracted from the sample by adding chloroform and mixing. The resulting mixture is then centrifuged to separate an aqueous layer (upper layer) containing RNA and a phenol-chloroform layer (lower layer) (an intermediate layer may be separated). By collecting the aqueous layer, an aqueous solution containing RNA is prepared.
  • nucleic acid for example, a solution obtained by dissolving the stratum corneum adhered to the adhesive tape described above
  • water-saturated phenol may be used alone, or a reagent mixture containing phenol may be used.
  • a reagent solution for extracting RNA from a biological sample containing a commercially available reagent for RNA extraction containing guanidine thiocyanate e.g., TRIzol (registered trademark) Reagent, QIAzol Lysis Reagent, ISOGEN, etc.
  • a commercially available reagent solution for RNA extraction as described above.
  • RNA extraction by the modified AGPC method it is preferable to perform RNA extraction by the modified AGPC method.
  • chloroform used for the RNA extraction it is preferable to use chloroform alone, but a reagent mixture solution containing chloroform may be used as long as the necessary amount of RNA is distributed in the aqueous layer.
  • the prepared aqueous solution containing the RNA may be mixed again with phenol and chloroform and centrifuged to recover the aqueous layer. This procedure may be repeated two or more times.
  • the prepared aqueous solution containing the RNA may be mixed with chloroform again and centrifuged to recover the aqueous layer. This procedure may be repeated two or more times.
  • a water-soluble alcohol aqueous solution containing the extracted nucleic acid (hereinafter also referred to as a nucleic acid-containing water-soluble alcohol aqueous solution) is prepared.
  • the extracted nucleic acid or an aqueous solution containing it may be mixed with a water-soluble alcohol or an aqueous alcohol solution.
  • water-soluble alcohols include primary alcohols, secondary alcohols and tertiary alcohols, among which methanol, ethanol, isopropanol, n-propanol and butanol are preferably used.
  • Butanol may be linear or branched. These water-soluble alcohols can be used alone or in combination of two or more.
  • the final concentration of the water-soluble alcohol in the nucleic acid-containing water-soluble alcohol aqueous solution is 39 to 50% by volume before contact with the solid-phase material, from the viewpoint of improving the nucleic acid yield in the nucleic acid separation using the solid-phase material, which will be described later. It is preferably 40 to 46% by volume, more preferably 41 to 45.5% by volume, still more preferably 42 to 45% by volume.
  • the final concentration of the aqueous alcohol is 39 to 50% by volume, preferably 40 to 46% by volume, more preferably 41 to 45.5% by volume, and still more preferably 42 to 45% by volume. is prepared and contacted with the solid phase material.
  • volume % means volume % at 25° C. and 1 atm.
  • nucleic acid is separated from the nucleic acid-containing aqueous alcohol solution.
  • Separation of nucleic acids from the nucleic acid-containing water-soluble alcohol aqueous solution can be carried out according to a nucleic acid separation method using a solid phase material.
  • a nucleic acid-containing water-soluble alcohol aqueous solution containing a water-soluble alcohol at the above final concentration is brought into contact with the solid phase material to allow the nucleic acid in the solution to be adsorbed to the solid phase material.
  • the nucleic acid is detached and recovered from the solid phase material.
  • the solid phase material may be any nucleic acid-adsorbing solid phase material, such as a silica-based solid phase material.
  • the solid phase material is preferably a solid phase material having a porous silica membrane.
  • the solid phase material is preferably in the form of a spin column, a pipette tube with a column, or a column cartridge that can be attached to a centrifugation tube or a pipette tube. More preferably, it is in the form of a column cartridge that can be attached to a spin column or a centrifugal tube from the viewpoint of contamination prevention and operational efficiency.
  • the solid phase material is preferably in a form such as a miniprep column that can purify a small amount of nucleic acid.
  • a miniprep column that can purify a small amount of nucleic acid.
  • Commercially available columns for DNA or RNA purification can be used as the solid phase material, examples of which include RNeasy (registered trademark) Spin Column (QIAGEN), QIAamp Mini Spin Column (QIAGEN), and NucleoSpin (registered trademark).
  • RNA Column Tekara Bio
  • a solution for example, an aqueous solution containing at least one of a water-soluble organic solvent and a water-soluble salt can be used as the cleaning solution used for cleaning contaminants from the solid phase material.
  • a water-soluble alcohol can be used as the water-soluble organic solvent contained in the cleaning liquid.
  • Water-soluble alcohols include methanol, ethanol, propanol, butanol, and the like. Propanol may be either isopropanol or n-propanol, and butanol may be linear or branched. These water-soluble alcohols can also use multiple types together. Among them, it is preferable to use ethanol.
  • the amount of the water-soluble organic solvent contained in the washing solution may be any amount that can retain the nucleic acid on the solid phase material and wash out contaminants, and can be determined as appropriate by those skilled in the art. % by volume is preferable, and 35 to 50% by volume is more preferable.
  • the water-soluble salt contained in the cleaning liquid is preferably a halide salt, and among these, a chloride salt is preferable.
  • the water-soluble salt is preferably a monovalent or divalent cation salt, more preferably an alkali metal salt or an alkaline earth metal salt, still more preferably a sodium salt or a potassium salt, still more preferably. is the sodium salt.
  • the water-soluble salt When the water-soluble salt is contained in the washing solution, its concentration is preferably 10 mmol/L or more, more preferably 20 mmol/L or more.
  • the upper limit of the concentration is not particularly limited as long as it does not impair the solubility of impurities, but is preferably 1 mol/L or less, more preferably 0.1 mol/L or less. More preferably, the water-soluble salt is sodium chloride, and its concentration in the washing liquid is preferably 20 mmol/L or more and 0.1 mol/L or less.
  • Desorption of nucleic acids from the solid phase material can preferably be carried out by flowing an elution solution through the solid phase material to elute the nucleic acids.
  • Water, Tris-EDTA (TE) buffer, or the like can be used as an elution solution for elution of nucleic acids.
  • TE Tris-EDTA
  • the washing solution and elution solution the washing solution and elution solution attached to the commercially available nucleic acid purification column may be used. Washing and elution of the solid phase material can be carried out by ordinary procedures.
  • the solid-phase material when attached to a spin column, an alcoholic aqueous solution containing nucleic acids is passed through the column, a washing solution is added to the column to which the nucleic acids are adsorbed, and the contaminants are washed away together with the washing solution by centrifugation. Subsequently, the eluate is added to the column and centrifuged to elute the nucleic acids from the column.
  • the solid phase material to which RNA is adsorbed may be treated with DNase, such as RNase-Free DNase set (QIAGEN), if necessary.
  • DNase treatment can remove contaminating DNA and improve the purity of the recovered RNA.
  • the DNase treatment is preferably performed between washing of the solid phase material and RNA elution.
  • the isolated nucleic acid is reverse transcribed and/or amplified in the presence of a single-stranded nucleic acid binding protein to prepare a nucleic acid sample.
  • Nucleic acids are amplified by multiplex PCR (MPCR).
  • MPCR multiplex PCR
  • cDNA is preferably synthesized from the RNA by reverse transcription (RT) and then amplified.
  • the DNA is amplified by multiplex PCR in the presence of a single-stranded nucleic acid binding protein to prepare a nucleic acid sample.
  • the nucleic acid is RNA
  • the RNA is reverse transcribed and amplified by multiplex RT-PCR (RT-MPCR) in the presence of a single-stranded nucleic acid binding protein to prepare a nucleic acid sample.
  • RT-MPCR multiplex RT-PCR
  • Reverse transcription (RT) of RNA can be performed according to normal procedures, except for adding a single-stranded nucleic acid binding protein to the reaction system.
  • a reaction solution containing a target RNA to be reverse transcribed, a primer, a reverse transcriptase, and a substrate is incubated to allow the reverse transcriptase to act on the target RNA to synthesize cDNA.
  • a primer targeting a specific RNA to be analyzed may be used, but for more comprehensive storage and analysis of nucleic acids, an oligo-dT primer, a random primer, or a mixture thereof may be used. preferable.
  • the reverse transcriptase a general reverse transcriptase can be used, but a reverse transcriptase with high RT accuracy and efficiency (for example, M-MLV Reverse Transcriptase and its variants, or commercially available It is preferable to use a reverse transcription enzyme).
  • the substrate is that of the reverse transcriptase, preferably deoxyribonucleotides such as dATP, dCTP, dGTP and dTTP, and mixtures thereof can be used.
  • the deoxyribonucleotide may be modified.
  • enzymes and other reagents for RT include commercially available reverse transcription reaction enzymes and reverse transcription reagent kits, such as PrimeScript (registered trademark) Reverse Transcriptase series (Takara Bio Inc.), SuperScript (registered trademark) Reverse Transcriptase series (Life Technologies Japan Co., Ltd.), etc., and SuperScript (registered trademark) III Reverse Transcriptase and SuperScript (registered trademark) VILO cDNA Synthesis kit (both Life Technologies Japan Co., Ltd.) can be preferably used.
  • the temperature and time for the RT reaction can be appropriately set according to the type of enzyme or reagent used, target RNA, cDNA to be synthesized, and the like.
  • a commercially available reverse transcription reaction reagent may be used to prepare a reaction solution according to its manual, and the single-stranded nucleic acid binding protein may be added to the reaction solution.
  • RT conditions may also be set according to the manual for the reagent.
  • Amplification of nucleic acids by MPCR can be carried out according to normal procedures, except for adding a single-stranded nucleic acid binding protein to the reaction system.
  • a reaction solution containing the DNA or cDNA of interest, a plurality of primer pairs, a DNA synthetase, and a substrate may be subjected to MPCR in the presence of a single-stranded nucleic acid binding protein.
  • the primer pair can be appropriately designed according to the target DNA sequence.
  • the DNA synthetase a general DNA synthetase can be used, but it is preferable to use a DNA synthetase with high amplification accuracy and efficiency.
  • the substrate is that of the DNA synthetase, preferably deoxyribonucleotides such as dATP, dCTP, dGTP and dTTP, and mixtures thereof can be used.
  • the deoxyribonucleotide may be modified.
  • Commercially available enzymes and reagents can be used as enzymes and other reagents for MPCR.
  • Commercially available enzymes and other reagents for MPCR include, for example, Ion AmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression Kit (Life Technologies Japan).
  • the temperature and time of the amplification reaction can be appropriately set according to the method of amplification, the type of enzyme or reagent used, the template DNA, and the like.
  • a commercially available MPCR reagent may be used to prepare a reaction solution according to its manual, and the single-stranded nucleic acid binding protein may be added to the reaction solution.
  • PCR conditions may also be set according to the manual for the reagent.
  • T4GP32 Single-stranded nucleic acid binding proteins used for RT and MPCR of nucleic acids
  • T4GP32 T4 gene 32 protein
  • variants thereof are typically a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and binds to single-stranded DNA.
  • Variants of T4GP32 include proteins obtained by modifying or mutating arbitrary amino acids in the amino acid sequence of T4GP32.
  • variants of T4GP32 include proteins that consist of an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and that bind to single-stranded nucleic acids, preferably single-stranded DNA.
  • T4GP32 can be purchased (eg, from NEW ENGLAND BioLabs Inc., Sigma-Aldrich, etc.).
  • the initial concentration of the single-stranded nucleic acid binding protein in the RT and MPCR reaction solution is preferably 3 ⁇ g/mL or more, more preferably 9 ⁇ g/mL or more, and still more preferably 20 ⁇ g/mL.
  • mL or more preferably 300 ⁇ g/mL or less, more preferably 200 ⁇ g/mL or less, still more preferably 150 ⁇ g/mL or less, or preferably 3 to 300 ⁇ g/mL, It is more preferably 9 to 200 ⁇ g/mL, and still more preferably 20 to 150 ⁇ g/mL.
  • RNA RT and MPCR are preferably performed in separate reaction systems (2 steps), but may be performed in one reaction system (1 step) for convenience.
  • the single-stranded nucleic acid binding protein used for RT can be used for MPCR as it is.
  • the initial concentration of the single-stranded nucleic acid binding protein in the reaction solution for RT-MPCR is preferably adjusted to 3 ⁇ g/mL or higher, more preferably 9 ⁇ g/mL or higher, and still more preferably 20 ⁇ g/mL or higher.
  • it is preferably adjusted to 300 ⁇ g/mL or less, more preferably 200 ⁇ g/mL or less, still more preferably 150 ⁇ g/mL or less, or preferably 3 to 300 ⁇ g/mL, more preferably 9 to 200 ⁇ g/mL, and further Preferably, it should be adjusted to 20 to 150 ⁇ g/mL.
  • the reaction product obtained by the above reverse transcription and/or MPCR can be used as a nucleic acid sample derived from the stratum corneum of the skin.
  • the reaction product may be used as a nucleic acid sample as it is, or purified as necessary and used as a nucleic acid sample.
  • Size separation allows the amplification product (the nucleic acid of interest) to be separated from the primers and other impurities contained in the reaction. Size separation of nucleic acids can be performed by, for example, a size separation column, a size separation chip, magnetic beads that can be used for size separation, or the like. Preferred examples of magnetic beads that can be used for size separation include Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) magnetic beads such as Ampure XP.
  • SPRI Solid Phase Reversible Immobilization
  • the DNA is adsorbed to the carboxyl groups coated on the surface of the magnetic beads, and only the magnetic beads are collected using a magnet to purify the DNA.
  • the mixing ratio of the Ampure XP solution and the DNA solution is changed, the molecular size of the DNA adsorbed to the magnetic beads changes.
  • the purified nucleic acid may be subjected to further processing necessary for subsequent analysis.
  • the purified nucleic acid is cDNA obtained by reverse transcription, it can be amplified by the procedure described above.
  • purified DNA is prepared in an appropriate buffer solution, the primer region contained in the DNA is cleaved, and an adapter sequence is further added to the DNA.
  • purified DNA is prepared in a buffer solution, the DNA is subjected to primer sequence removal and adapter ligation, the resulting reaction product is amplified as necessary, and a library for various analyses. can be prepared.
  • Nucleic acid samples prepared in the present invention can be used for various analyzes or diagnoses using nucleic acids, such as gene expression analysis, transcriptome analysis, functional analysis of subjects, diagnosis of diseases, efficacy evaluation of drugs administered to subjects, and the like. can be used for comprehensive gene analysis or expression analysis targeting a specific gene. Therefore, the present invention also relates to the use of the stratum corneum-derived nucleic acid sample prepared by the above-described method for preparing a nucleic acid sample according to the present invention for various analyses. In one embodiment, the present invention provides a method for detecting gene expression in skin, comprising detecting gene expression in a skin stratum corneum-derived nucleic acid sample prepared by the method for preparing a nucleic acid sample according to the present invention. do.
  • the procedure and technique for detecting gene expression are not particularly limited.
  • a library can be prepared by adapter ligation to amplified and purified nucleic acids, and the library can be subjected to sequencing. Gene expression can be detected or quantified based on the number of reads for each gene-derived sequence obtained by sequencing.
  • a method for preparing a nucleic acid sample derived from the stratum corneum of the skin comprising: extracting nucleic acid from the stratum corneum collected from the surface of the skin and preparing a water-soluble alcohol aqueous solution containing the nucleic acid, the stratum corneum having a depth of 5 ⁇ m or less from the surface of the skin; Contacting the nucleic acid in the water-soluble alcohol aqueous solution with a solid phase material to separate the nucleic acid, wherein the concentration of the water-soluble alcohol in the water-soluble alcohol aqueous solution before contacting with the solid phase material is 39 to 50% by volume.
  • a method including [2] Preferably, the method according to [1], further comprising collecting stratum corneum from the surface of the skin.
  • the stratum corneum collected from the surface of the skin Preferably, the stratum corneum is within 4 stratum corneum from the surface of the skin, and more preferably the stratum corneum is within 2 stratum corneum from the surface of the skin, or Preferably, the stratum corneum is at a depth of 2.6 ⁇ m or less from the surface of the skin, and does not include the stratum corneum at a depth of more than 5 ⁇ m from the surface of the skin.
  • the method according to any one of [1] to [3], wherein the harvesting of the stratum corneum from the skin surface is performed by tape stripping.
  • the method according to [4], wherein the adhesive tape used for the tape stripping is an acrylic adhesive tape.
  • the stratum corneum is collected by tape stripping by applying one or two acrylic adhesive tapes to the target area of the skin, and the stratum corneum is adhered to the tape and peeled off.
  • the method according to any one of [1] to [6], wherein the nucleic acid extracted from the stratum corneum is RNA or DNA.
  • the nucleic acid extracted from the stratum corneum and the isolated nucleic acid are RNA, and the isolated RNA is reverse transcribed and amplified in the presence of the single-stranded nucleic acid binding protein to obtain a nucleic acid sample.
  • the initial concentration of the single-stranded nucleic acid binding protein in the reaction solution for reverse transcription and amplification is preferably 3 ⁇ g/mL or more, more preferably 9 ⁇ g/mL or more, still more preferably 20 ⁇ g/mL or more, and preferably 300 ⁇ g/mL or less, more preferably 200 ⁇ g/mL or less, further preferably 150 ⁇ g/mL or less ,or,
  • the method of [9], wherein the reverse transcription and amplification are multiplex RT-PCR.
  • the nucleic acid extracted from the stratum corneum and the isolated nucleic acid are DNA, and the isolated DNA is amplified in the presence of the single-stranded nucleic acid binding protein to prepare a nucleic acid sample. , the method described in [7].
  • the initial concentration of the single-stranded nucleic acid binding protein in the amplification reaction solution is preferably 3 ⁇ g/mL or more, more preferably 9 ⁇ g/mL or more, still more preferably 20 ⁇ g/mL or more, and preferably 300 ⁇ g/mL or less, more preferably 200 ⁇ g/mL or less, further preferably 150 ⁇ g/mL or less ,or,
  • the method according to [11] which is preferably 3 to 300 ⁇ g/mL, more preferably 9 to 200 ⁇ g/mL, still more preferably 20 to 150 ⁇ g/mL.
  • the water-soluble alcohol is preferably at least one selected from the group consisting of methanol, ethanol, isopropanol, n-propanol and butanol, more preferably ethanol, The method according to any one of [1] to [12].
  • the T4GP32 or a variant thereof consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence that is at least 90% identical to the sequence, and is a protein that binds to a single-stranded nucleic acid [1] The method according to any one of [13].
  • the concentration of the water-soluble alcohol in the water-soluble alcohol aqueous solution is preferably 40 to 46% by volume, more preferably 41 to 45.5% by volume, still more preferably 42 to 45% by volume, [1] The method according to any one of to [15].
  • the solid phase material is preferably a silica-based solid phase material, More preferably, it is a solid phase material having a porous silica membrane, The method according to any one of [1] to [16].
  • the washing liquid for washing the solid phase material is a solution containing at least one selected from the group consisting of water-soluble organic solvents and water-soluble salts, here,
  • the water-soluble organic solvent is preferably a water-soluble alcohol, more preferably at least one selected from the group consisting of methanol, ethanol, isopropanol, n-propanol and butanol, still more preferably ethanol
  • the water-soluble salts are preferably monovalent or divalent cation salts, more preferably alkali metal salts or alkaline earth metal salts, more preferably sodium and potassium salts, and preferably chlorides.
  • a salt more preferably sodium chloride, [21] The method described. [23] The method according to [22], wherein the concentration of the water-soluble organic solvent in the cleaning liquid is preferably 30 to 100% by volume, more preferably 35 to 50% by volume. [24] the concentration of the water-soluble salt in the washing solution is preferably 10 mmol/L or more and 1 mol/L or less, more preferably 10 mmol/L or more and 0.1 mol/L or less, and still more preferably 20 mmol/L or more and 1 mol/L or less; The method according to [22], which is more preferably 20 mmol/L or more and 0.1 mol/L or less.
  • the method of any one of [21] to [24], wherein the eluent for elution of nucleic acids from the solid phase material is water or a buffer.
  • the reverse transcription is preferably carried out in a reaction solution containing an oligo-dT primer, a random primer, or a mixture thereof, More preferably, it is carried out in a reaction solution containing random primers, The method according to any one of [1] to [25].
  • a method for detecting gene expression in skin preferably comprising detecting gene expression in a nucleic acid sample derived from the stratum corneum of the skin prepared by the method according to any one of [1] to [26]. .
  • the method of [27] wherein the detection of gene expression is performed by sequencing.
  • Test 1 Detection of gene expression in stratum corneum of skin: comparison by library preparation method 1) Collection of stratum corneum and extraction of RNA Two healthy males and females in their 30s to 50s (4 in total) were used as subjects. The stratum corneum was collected from each of two locations on the left and right sides of the face and cheek of the subject using a piece of D-Squame tape (disc shape with a diameter of 2.2 cm; manufactured by Clinical & Derm). Specifically, after washing the face, the tape was applied to the sampled site on the cheek of the subject, and after applying a constant pressure of about 225 g/cm 2 , the tape was slowly peeled off at an even speed to sample the stratum corneum.
  • D-Squame tape disc shape with a diameter of 2.2 cm; manufactured by Clinical & Derm
  • RNeasy mini kit RNeasy mini kit; Qiagen
  • RNA was purified from the aqueous ethanol solution containing the obtained sample using a silica base column (RNeasy mini kit; Qiagen) according to the protocol attached to the kit.
  • RNA from the purified RNA, SuperScript (registered trademark) VILO cDNA Synthesis kit (Life Technologies Japan) was used to perform reverse transcription at 42°C for 90 minutes to synthesize cDNA.
  • a library containing DNA derived from the 20802 gene detectable by multiplex PCR was prepared from the resulting cDNA.
  • Method B • The other of the two samples prepared in 1) was mixed with an equal volume of 85% (v/v) ethanol.
  • RNA was purified from the aqueous ethanol solution containing the obtained sample using a silica-based column (RNeasy mini kit; Qiagen) according to the protocol attached to the kit.
  • SuperScript registered trademark
  • VILO cDNA Synthesis kit (Life Technologies Japan) was used to perform reverse transcription at 42°C for 90 minutes to synthesize cDNA.
  • T4GP32 NW ENGLAND BioLabs
  • a library containing DNA derived from the 20802 gene was prepared from the resulting cDNA by multiplex PCR. Multiplex PCR was performed using Ion AmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression Kit (Life Technologies Japan Co., Ltd.) [99°C, 2 minutes ⁇ (99°C, 15 seconds ⁇ 62°C, 16 minutes) ⁇ 20 cycles ⁇ 4°C, Hold]. During PCR, T4GP32 (NEW ENGLAND BioLabs) was added to the reaction solution at a final concentration of 35 ⁇ g/mL.
  • RNA, PCR product, and library prepared by this procedure was measured using Agilent 4200 TapeStation system (Agilent technologies).
  • the genes detected in 3) were compared. All subjects with the library prepared by Method A showed a corrected count value of 0, and at least 3 of the 4 subjects with the library prepared with Method B had a corrected count value greater than 0. After selecting genes that showed values, 139 genes were confirmed (Table 2). On the other hand, in the library prepared by Method B, the corrected count value was 0 in all subjects, and in the library prepared by Method A, at least 3 out of 4 subjects had the corrected count value. Only 22 genes were identified when genes with values greater than 0 were selected (data not shown). The results indicated that the library prepared by method B could detect a larger number of genes than method A.
  • TSLP Cell, 155: 285-295, 2013
  • MC1R Cancer Manag Res, 10: 1143- 1154, 2018
  • Example 2 Comparison of gene expression profiles for each stratum corneum depth 1) RNA extraction from the stratum corneum and RNA sequencing Ten D-Squame tapes (diameter 2 Using a 0.2 cm disk (manufactured by Clinical & Derm), stratum corneum was sequentially collected from the same site to a depth of 10 tapes. Specifically, after washing the face, the tape is applied to the sampling site of the subject's cheek, and after applying a constant pressure of about 225 g/cm 2 , the tape is slowly and evenly peeled off, and the stratum corneum is harvested. was repeated for 10 tapes.
  • the amount collected from the 1st to 2nd tapes (group A), the amount collected from the 3rd to 5th tapes (group B), the amount collected from the 6th to 8th tapes (group B) Group C) and the stratum corneum collected from the 9th to 10th tapes (group D) were pooled, and libraries were prepared and sequenced in the same manner as in Method B of Example 1, and gene expression was detected. did. According to a report by Caroline Meyer Olesen et al. (Scientific Reports, 9: 12217, 2019), the thickness of the stratum corneum tape is 1.3 ⁇ m/sheet up to the 5th tape, and 0.3 ⁇ m/sheet from the 6th to the 10th tape.
  • the stratum corneum can be collected with a thickness of 7 ⁇ m/sheet. According to this report, 0-2.6 ⁇ m for A group, 2.7-6.6 ⁇ m for B group, 6.7-8.8 ⁇ m for C group, and 8.9-10.3 ⁇ m for D group. It is thought that the deep stratum corneum was collected.

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Abstract

皮膚角層由来の核酸試料の調製方法であって、以下：皮膚の表面から採取した角層から核酸を抽出し、該核酸を含む水溶性アルコール水溶液を調製すること；該水溶性アルコール水溶液中の核酸を固相材料に接触させ、該核酸を分離すること；該分離した核酸を、一本鎖核酸結合タンパク質の存在下で増幅するか、又は逆転写及び増幅して核酸試料を調製すること、を含む方法。

Description

皮膚角層由来の核酸試料の調製方法
　本発明は、皮膚角層由来の核酸試料の調製方法に関する。
　皮膚は、身体の外表面を覆う外界に露出した組織であるため、容易かつ低侵襲性に生体試料を採取できる組織である。身体からの皮膚組織の採取は生検により行うことができるが、より侵襲性の低い方法として、接着性のテープを用いて皮膚組織を剥離する方法も用いられている。特許文献１には、接着テープを皮膚の標的領域に当てることで表皮（角層）試料を単離し、得られた表皮試料に含まれる核酸分子を検出することで、皮膚における遺伝子発現を検出する方法が開示されている。しかし、接着性のテープを用いて皮膚組織を採取する場合、１枚のテープにより回収できる角層試料の量は少なく、そこから抽出できる核酸の量はさらに微量であり、高精度な遺伝子解析のためには十分ではないことがある。そのため、前記の特許文献１では、一般的な接着テープによる角層剥離において用いられるアクリル系の粘着テープに代えて、より粘着力の強いゴム系粘着剤を付したテープを使用して角層剥離量を増やし、さらに皮膚の同じ場所から複数回テープを当てて採取することで角層のより深層までを採取することが記載されている。ただし、採取する角層の深さや面積を大きくするほど、侵襲性はより増加する。非特許文献１では、より侵襲性の低いアクリル系粘着テープを用いて採取した２枚のテープからＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ発現の網羅解析を行っている。しかし該報告におけるサンプル当たりの遺伝子リード数は一般的に解析に必要とされる一般的な条件を満たしておらず、必ずしも正確な解析が行われていないおそれがあった。
　生体試料からのＲＮＡ等の核酸の抽出には、一般に、フェノール／クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ　ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、それらの変法などが用いられている。これらの原理に基づく核酸抽出試薬が市販されている。特許文献２には、生体材料を溶解してそこに含まれる核酸を溶出させること、溶出した核酸を含む溶液に最終濃度で１０～６０体積％となるように水溶性有機溶媒を加えてライセート溶液を調製すること、及び、該ライセート溶液と固体材料とを接触させ、固体材料に核酸を吸着させて回収することを含む、核酸抽出法が記載されている。
　マルチプレックスＰＣＲは、複数のプライマー対を同時に使用したＰＣＲ反応により、１つのＤＮＡサンプルから複数の領域を同時に増幅する方法である。ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写（ＲＴ）反応をマルチプレックスＰＣＲと組み合わせたマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲは、遺伝子発現解析やジェノタイピングなどに利用されている。
　非特許文献２には、ＢＳＡ及びＴ４　ｇｅｎｅ　３２　ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｔ４ＧＰ３２）が阻害物質存在下でのＰＣＲの反応を改善することが記載されている。非特許文献３、４には、ＲＴ－ＰＣＲの際に、ＲＴ系にＴ４ＧＰ３２を添加しておくことでＲＴ－ＰＣＲ産物の収量が顕著に増加したが、ＲＴ後のＰＣＲ系にＴ４ＧＰ３２を添加しても明らかな収量の増加はみられなかったことが記載されている。特許文献３には、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを増幅させる増幅逆転写法（ＲＴ－ＲａｍＤＡ法）において、鋳型ＲＮＡから剥がされた１本鎖ｃＤＮＡにＴ４ＧＰ３２を結合させることで該ｃＤＮＡをヌクレアーゼ分解から保護して、ｃＤＮＡの収量を増加させることが記載されている。非特許文献５には、ＤＭＳＯとベタインがＰＣＲの特異性と収量を向上させたことが記載されている。
（特許文献１）特表２００７－５３１５２９号公報
（特許文献２）特開２００７－１１７０８４号公報
（特許文献３）国際公開公報第２０１６／０５２６１９号
（非特許文献１）J Dermatol Sci, 2021, 101(1):14-21
（非特許文献２）Appl Environ Microbiol, 1996, 62(3):1102-1106
（非特許文献３）Appl Environ Microbiol, 1998, 64(2):669-677
（非特許文献４）BioTechniques, 2001, 31(1):81-86
（非特許文献５）PLOS ONE, 2010, 5(6):e11024
　本発明は、皮膚角層由来の核酸試料の調製方法であって、以下：
　皮膚の表面から採取した角層から核酸を抽出し、該核酸を含む水溶性アルコール水溶液を調製すること、該角層は、該皮膚の表面から５μｍ以内の深さの角層である；
　該水溶性アルコール水溶液中の核酸を固相材料に接触させ、該核酸を分離すること、該固相材料に接触させる前の該水溶性アルコール水溶液における水溶性アルコールの濃度は３９～５０体積％である；
　該分離した核酸を、一本鎖核酸結合タンパク質の存在下で増幅するか、又は逆転写及び増幅して核酸試料を調製すること、該増幅は、マルチプレックスＰＣＲによる増幅であり、該一本鎖核酸結合タンパク質は、Ｔ４ＧＰ３２又はその改変体である、
を含む、方法を提供する。
　また本発明は、前記方法により調製された皮膚角層由来の核酸試料における遺伝子発現を検出することを含む、皮膚の遺伝子発現を検出する方法を提供する。
発明の詳細な説明
　本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
　本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性をいう。
　本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、リップマン－パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
　本発明は、皮膚角層由来の核酸試料の調製方法を提供する。
　本発明者は、皮膚角層の浅層から核酸を抽出し、該核酸と所定濃度の水溶性アルコールとを含む溶液を調製し、当該溶液から核酸を分離し、次いで分離した核酸を、一本鎖核酸結合タンパク質Ｔ４ＧＰ３２の存在下で逆転写及び／又は増幅することで、より侵襲性の低い浅層の角層から高収量に皮膚角層由来の核酸を調製できることを見出した。
　本発明によれば、角層の浅層などの低侵襲的な採取に適した部位から採取した微量の生体試料から、高収量で核酸試料を調製することができる。本発明は、生体由来の核酸試料を用いた各種解析（例えば、遺伝子解析、診断等）の感度、精度、又は効率の向上に貢献する。
　本発明の方法で調製される核酸は、角層に含まれ得るものである限り、いかなる種類の核酸であってもよく、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、オリゴヌクレオチドなどが挙げられる。好ましくは、該核酸はＲＮＡ又はＤＮＡである。これらの核酸はいずれも、１本鎖であっても２本鎖であってもよい。ＲＮＡの例としては、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｍａｌｌ　ＲＮＡ（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）等）、ｌｏｎｇ　ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ　ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ（ｌｉｎｃ）ＲＮＡなど、及びそれらのいずれか２種以上の組み合わせが挙げられる。ＤＮＡの例としては、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
　角層を採取する被験体は、皮膚（表皮）を有する生物であればよい。被験体の例としては、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。例えば、該被験体は、自身の核酸の解析を必要とするか又は希望するヒト又は非ヒト哺乳動物であり得る。あるいは、該被験体は、角層における遺伝子発現解析、又は角層由来の核酸を用いたその他の各種解析を必要とするか又は希望するヒト又は非ヒト哺乳動物であり得る。
　被験体の角層が採取される皮膚の部位としては、頭、顔、首、体幹、手足等の身体の任意の部位の皮膚、健常な皮膚、アトピー、ニキビ、乾燥、炎症（赤み）、腫瘍等の疾患を有する皮膚、創傷を有する皮膚、などが挙げられるが、特に限定されない。
　被験者への侵襲性の観点から、本発明で核酸の抽出に用いられる角層は、角層の浅層由来であり、具体的には皮膚の表面から５μｍ以内の深さの角層である。本発明では、皮膚の表面から５μｍ以内の深さの角層が採取され、それに含まれる核酸が抽出される。好ましくは、本発明では、皮膚の表面から２．６μｍ以内の深さの角層が採取され、それに含まれる核酸が抽出される。このような領域の角層には、角化や、脂質の合成もしくは代謝に関連するＲＮＡが多く含まれている（後述の実施例、表４）。好ましくは、本発明では、皮膚の表面から５μｍ、より好ましくは２．６μｍよりも深い層にある角層は採取されない。皮膚の表面から５μｍ以内の深さとは、角層３～４枚分の厚さに相当し、表面から２．６μｍの深さとは、角層１～２枚分の厚さに相当する。
　被験体からの皮膚角層の採取には、角層の浅層を主に回収することを可能にするあらゆる手段を採用することができる。例えば、ガラス板、接着テープ等を皮膚表面へ当てて浅層の角層を接着させる方法、スパーテル、スクレイパー等により角層を皮膚表面からこすり落として回収する方法、などが挙げられる。このうち、接着テープを用いる方法（いわゆるテープストリッピング）が好ましい。接着テープは、接着力を有する粘着層とそれを保持する保持体から構成される。保持体としては、粘着層を保持することが可能で、かつ粘着層の粘着剤に影響を与えなければ、特にその形状や材質に限定はない。保持体は、皮膚表面に密着させるのに適した柔軟性を持ち、かつ後記する角層からの核酸の抽出に対して不活性であることが好ましい。粘着層を構成する粘着剤は、角層を接着し剥離する接着力を有するものであれば特に限定されず、アクリル系粘着剤、ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤、ウレタン系粘着剤等が挙げられる。本発明では、１回から数回のテープストリッピングにより皮膚表面から５μｍの深さまでの角層を剥離することができる粘着力を有する粘着剤が好ましく用いられ、例えばアクリル系粘着剤が好ましい。接着テープのサイズは特に限定されないが、例えば０．５～２５ｃｍ2の範囲が挙げられ、好ましくは１～１７．５ｃｍ2の範囲であり、より好ましくは２～１０ｃｍ2の範囲である。このような接着テープとしては、ディスク状のアクリル系粘着テープであるＤ－Ｓｑｕａｍｅ（直径２．２ｃｍ、クリニカル＆ダーム社製）などが挙げられる。上記手順による角層の採取の前に、角層を採取する皮膚の標的領域から皮脂、汚れ等を取り除いておくことが好ましい。テープストリッピングの手順の好ましい実施形態においては、皮膚の標的領域にテープを、その粘着面を皮膚表面に接するように当て、テープ全体に均等な力、例えば１００～３００ｇ／ｃｍ2の範囲内、好ましくは２００～２５０ｇ／ｃｍ2の範囲内の均等な力を加えるように皮膚に押し付け、次いで均等な力でテープを剥ぎ取ればよい。
　皮膚の同じ標的領域から繰り返し角層を採取することができる。例えば、テープストリッピングの場合であれば、本願発明の方法は、１回又は複数回、接着テープを被験体の皮膚の同じ標的領域に当てて、該テープに角層を接着させ採取することを含む。皮膚にテープを当てる回数に応じてより深い層の角層を採取することができる。所望の深さにある角層を採取できるように、テープの粘着力に応じて、テープを当てる回数を適宜変更することができる。本発明の方法は、同じテープを皮膚に複数回当てることを必ずしも除外しないが、好ましくは、複数枚のテープがそれぞれ１回ずつ皮膚に当てられる。好ましくは、本願発明の方法では、１枚又は２枚の接着テープが皮膚の同じ標的領域に当てられ、好ましくは、各テープはそれぞれ１回ずつ皮膚に当てられる。これによって、皮膚の表面から５μｍ以内、好ましくは２．６μｍ以内の深さの角層をテープに接着させ採取する。
　採取した角層に含まれる核酸は、常法に従って抽出することができる。例えば、テープストリッピングの場合であれば、テープに付着した角層から、フェノール／クロロホルム法、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ＰＣＩ）法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ　ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ　ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、又はそれらの変法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ磁性体粒子を用いる方法、あるいは市販の核酸精製用試薬（例えばＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）、ＩＳＯＧＥＮ、ＤＮｅａｓｙ、ＤＮＡｚｏｌ、ＩＳＯＧＥＮＯＭＥ、等）、などを用いて核酸を抽出することができる。
　好ましくは、抽出された核酸は、該核酸を含む水性溶液として調製される。例えばフェノール／クロロホルム法であれば、核酸を含む水層（上層）とフェノール－クロロホルム層（下層）が分離されるので、該水層を回収することで核酸を含む水性溶液を調製することができる。
　一実施形態として、フェノール／クロロホルム法によるＲＮＡ抽出手順の例を以下に説明する：核酸を含むサンプル（例えば、上述した接着テープに付着した角層を溶解させた液）に酸性フェノールを加えて混合し、次いでクロロホルムを加えて混合することで、サンプルからＲＮＡを抽出する。次いで、得られた混合液を遠心分離して、ＲＮＡを含む水層（上層）とフェノール－クロロホルム層（下層）に分離させる（さらに中間層が分離されることがある）。該水層を回収することで、ＲＮＡを含む水性溶液を調製する。該ＲＮＡ抽出に用いる酸性フェノールとしては、水飽和フェノールを単独で用いてもよいが、フェノールを含む試薬混合液を用いてもよい。例えば、グアニジンチオシアネートを含む市販のＲＮＡ抽出用試薬（例えばＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ、ＱＩＡｚｏｌ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ、ＩＳＯＧＥＮ等）を含む、生体試料からのＲＮＡ抽出用の試薬液を、該フェノールを含む試薬混合液として用いることができる。サンプルからのＲＮＡ抽出効率の観点からは、上述したような市販のＲＮＡ抽出用の試薬液を用いることが好ましい。すなわちＡＧＰＣ変法でＲＮＡ抽出を行うのが好ましい。該ＲＮＡ抽出に用いるクロロホルムとしては、クロロホルムを単独で用いることが好ましいが、必要な量のＲＮＡが水層に分配される限りにおいて、クロロホルムを含む試薬混合液を用いてもよい。必要に応じて、調製した該ＲＮＡを含む水性溶液を、再度フェノール及びクロロホルムと混合し、遠心分離して水層を回収してもよい。この手順を２回以上繰り返してもよい。さらに、調製した該ＲＮＡを含む水性溶液を、再度クロロホルムと混合し、遠心分離して水層を回収してもよい。この手順を２回以上繰り返してもよい。
　本発明においては、該抽出された核酸を含む水溶性アルコール水溶液（以下、核酸含有水溶性アルコール水溶液ともいう）を調製する。例えば、前記の抽出された核酸又はそれを含む水性溶液と、水溶性アルコール又は水溶性アルコール水溶液とを混合すればよい。水溶性アルコールの例としては、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールなどが挙げられ、このうちメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール及びブタノールが好ましく使用され得る。ブタノールは直鎖状及び分岐状のいずれでもよい。これらの水溶性アルコールは単独で又は２種以上組み合わせて使用することができる。環境負荷及び作業者への有毒性を低減する観点からは、エタノールがより好ましい。該核酸含有水溶性アルコール水溶液における水溶性アルコールの最終濃度は、後記の固相材料を用いた核酸分離における核酸の収量向上の観点から、固相材料と接触させる前において、３９～５０体積％、好ましくは４０～４６体積％、より好ましくは４１～４５．５体積％、さらに好ましくは４２～４５体積％である。好ましくは、水溶性アルコールの最終濃度が３９～５０体積％、好ましくは４０～４６体積％、より好ましくは４１～４５．５体積％、さらに好ましくは４２～４５体積％の核酸含有水溶性アルコール水溶液を調製し、これを固相材料と接触させる。なお、本発明において体積％とは、２５℃、１気圧における体積％を意味する。
　次いで、該核酸含有水溶性アルコール水溶液から核酸を分離する。該核酸含有水溶性アルコール水溶液からの核酸の分離は、固相材料を用いた核酸分離法に従って行われ得る。例えば、上記の最終濃度で水溶性アルコールを含有する核酸含有水溶性アルコール水溶液を固相材料に接触させて、該溶液中の核酸を該固相材料に吸着させる。次いで、必要に応じて該固相材料から夾雑物を洗浄した後、該固相材料から核酸を脱離させ回収する。
　該固相材料としては、核酸吸着性の固相材料であればよく、例えばシリカベースの固相材料が挙げられる。核酸の吸着性の観点からは、該固相材料は、多孔性のシリカメンブレンを有する固相材料であることが好ましい。夾雑物の洗浄や核酸の溶出の操作を容易にする観点からは、該固相材料は、スピンカラム、カラム付きピペットチューブ、又は遠心チューブもしくはピペットチューブに装着可能なカラムカートリッジの形態であることが好ましく、さらに汚染防止と操作効率の観点からは、スピンカラム又、は遠心チューブに装着可能なカラムカートリッジの形態であることがより好ましい。さらに、回収される核酸の量が比較的少ないことを考慮すると、該固相材料は、ミニプレップカラムなどの少量の核酸を精製できる形態であることが好ましい。該固相材料には、市販のＤＮＡ又はＲＮＡ精製用カラムを用いることができ、その例としては、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＱＩＡａｍｐ　Ｍｉｎｉ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ　Ｃｏｌｕｍｎ（タカラバイオ）等が挙げられる。
　該固相材料からの夾雑物の洗浄に用いられる洗浄液としては、水溶性有機溶媒及び水溶性塩の少なくとも１種を含む溶液（例えば水溶液）などを用いることができる。該洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、水溶性アルコールを用いることができる。水溶性アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどが挙げられる。プロパノールとしては、イソプロパノール、ｎ－プロパノールのいずれでもよく、ブタノールは直鎖状及び分岐状のいずれでもよい。これら水溶性アルコールは、複数種類を併用することもできる。中でもエタノールを用いることが好ましい。該洗浄液中に含まれる該水溶性有機溶媒の量は、該固相材料上の核酸を保持し夾雑物を洗浄できる量であればよく、当業者が適宜決定することができるが、３０～１００体積％が好ましく、３５～５０体積％がより好ましい。一方、該洗浄液に含まれる水溶性塩は、ハロゲン化物の塩であることが好ましく、中でも塩化物塩が好ましい。また、該水溶性塩は、一価又は二価のカチオン塩であることが好ましく、より好ましくはアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩であり、さらに好ましくはナトリウム塩及びカリウム塩であり、なお好ましくはナトリウム塩である。該水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上が好ましく、２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上がより好ましい。一方、濃度の上限は、不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１ｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ以下がより好ましい。さらに好ましくは、該水溶性塩は塩化ナトリウムであり、その洗浄液中の濃度は２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、０．１ｍｏｌ／Ｌ以下であると好ましい。
　該固相材料からの核酸の脱離は、好ましくは、該固相材料に溶出液を流し、核酸を溶出させることで行われ得る。核酸の溶出に用いられる溶出液としては、水やＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ＴＥ）バッファーなどを用いることができる。該洗浄液及び溶出液には、市販の核酸精製用カラムに付属の洗浄液及び溶出液を用いてもよい。該固相材料の洗浄や溶出は、通常の手順で行うことができる。例えば、該固相材料がスピンカラムに装着されている場合、カラムに核酸含有アルコール水溶液を通液し、核酸が吸着したカラムに洗浄液を添加し、遠心して洗浄液とともに夾雑物を洗い流す。続いて、カラムに溶出液を添加し、遠心して核酸をカラムから溶出させる。
　核酸がＲＮＡの場合、必要に応じて、ＲＮＡが吸着した固相材料をＤＮａｓｅ、例えばＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ　ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で処理してもよい。ＤＮａｓｅ処理により、混入したＤＮＡを除去して回収するＲＮＡの純度を向上させることができる。該ＤＮａｓｅ処理は、該固相材料の洗浄とＲＮＡ溶出との間に行われることが好ましい。
　続いて、本発明においては、該分離した核酸を一本鎖核酸結合タンパク質の存在下で逆転写及び／又は増幅して核酸試料を調製する。核酸は、マルチプレックスＰＣＲ（ＭＰＣＲ）により増幅される。核酸がＲＮＡである場合、好ましくは、該ＲＮＡから逆転写（ＲＴ）によってｃＤＮＡを合成し、次いで該ｃＤＮＡを増幅する。
　したがって、核酸がＤＮＡの場合、該ＤＮＡを一本鎖核酸結合タンパク質の存在下でマルチプレックスＰＣＲにより増幅して核酸試料を調製する。核酸がＲＮＡの場合、該ＲＮＡを一本鎖核酸結合タンパク質の存在下でのマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲ（ＲＴ－ＭＰＣＲ）により逆転写及び増幅して核酸試料を調製する。
　ＲＮＡの逆転写（ＲＴ）は、反応系に一本鎖核酸結合タンパク質を添加する以外は、通常の手順で行うことができる。例えば、一本鎖核酸結合タンパク質の存在下で、逆転写すべき対象ＲＮＡ、プライマー、逆転写酵素、及び基質を含有する反応液をインキュベートして、対象ＲＮＡに逆転写酵素を作用させてｃＤＮＡを合成すればよい。該プライマーとしては、解析したい特定のＲＮＡを標的としたプライマーを用いてもよいが、より包括的な核酸の保存及び解析のためにはオリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、又はそれらの混合物を用いることが好ましい。該逆転写酵素としては、一般的な逆転写酵素を使用することができるが、ＲＴの正確性及び効率性の高い逆転写酵素（例えばＭ－ＭＬＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及びその改変体、あるいは後述する市販の逆転写反応用酵素）を使用することが好ましい。該基質は、該逆転写酵素の基質であり、好ましくはデオキシリボヌクレオチド、例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、ならびにそれらの混合物を使用することができる。該デオキシリボヌクレオチドは修飾されていてもよい。本発明において、ＲＴのための酵素及びその他の試薬としては、市販の逆転写反応用酵素及び逆転写試薬キット、例えばＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（タカラバイオ社）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）等が挙げられ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III  Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（いずれもライフテクノロジーズジャパン株式会社）を好ましく用いることができる。ＲＴ反応の温度及び時間は、用いる酵素又は試薬の種類、対象ＲＮＡ、合成すべきｃＤＮＡなどに応じて適宜設定することができる。例えば、市販の逆転写反応用試薬を用いて、そのマニュアルに従って反応液を調製し、該反応液に一本鎖核酸結合タンパク質を添加すればよい。ＲＴの条件も該試薬のマニュアルに従って設定すればよい。
　ＭＰＣＲによる核酸の増幅は、反応系に一本鎖核酸結合タンパク質を添加する以外は、通常の手順で行うことができる。例えば、一本鎖核酸結合タンパク質の存在下で、対象のＤＮＡやｃＤＮＡ、複数のプライマーペア、ＤＮＡ合成酵素、及び基質を含有する反応液をＭＰＣＲにかければよい。該プライマーペアは、標的ＤＮＡ配列に応じて適宜設計され得る。該ＤＮＡ合成酵素としては、一般的なＤＮＡ合成酵素を使用することができるが、増幅の正確性及び効率性の高いＤＮＡ合成酵素を使用することが好ましい。該基質は、該ＤＮＡ合成酵素の基質であり、好ましくはデオキシリボヌクレオチド、例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、ならびにそれらの混合物を使用することができる。該デオキシリボヌクレオチドは修飾されていてもよい。ＭＰＣＲのための酵素及びその他の試薬は、市販の酵素及び試薬を用いることができる。ＭＰＣＲのための市販の酵素及びその他の試薬としては、例えば、Ｉｏｎ　ＡｍｐｌｉＳｅｑ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を挙げることができる。増幅反応の温度及び時間は、増幅の手法、用いる酵素又は試薬の種類、鋳型ＤＮＡなどに応じて適宜設定することができる。例えば、市販のＭＰＣＲ用試薬を用いて、そのマニュアルに従って反応液を調製し、該反応液に一本鎖核酸結合タンパク質を添加すればよい。ＰＣＲの条件も該試薬のマニュアルに従って設定すればよい。
　核酸のＲＴ及びＭＰＣＲに用いられる一本鎖核酸結合タンパク質としては、Ｔ４ＧＰ３２（Ｔ４　ｇｅｎｅ　３２　ｐｒｏｔｅｉｎ）、及びその改変体が挙げられる。Ｔ４ＧＰ３２は、代表的には配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、一本鎖ＤＮＡに対して結合する。Ｔ４ＧＰ３２の改変体としては、Ｔ４ＧＰ３２のアミノ酸配列上の任意のアミノ酸に対して修飾又は変異を加えて得られるタンパク質が挙げられる。Ｔ４ＧＰ３２の改変体の例としては、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつ一本鎖核酸、好ましくは一本鎖ＤＮＡに結合するタンパク質が挙げられる。Ｔ４ＧＰ３２は購入することができる（例えばＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢｉｏＬａｂｓ　Ｉｎｃ．、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈなどより）。該ＲＴ及びＭＰＣＲの反応液中における該一本鎖核酸結合タンパク質の初期濃度（反応前の溶液における終濃度）は、好ましくは３μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは９μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは２０μｇ／ｍＬ以上であればよく、他方、好ましくは３００μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは２００μｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１５０μｇ／ｍＬ以下であればよく、あるいは、好ましくは３～３００μｇ／ｍＬであればよく、より好ましくは９～２００μｇ／ｍＬであればよく、さらに好ましくは２０～１５０μｇ／ｍＬであればよい。
　本発明の方法において、ＲＮＡのＲＴ及びＭＰＣＲは、別々の反応系（２ステップ）で行われることが好ましいが、簡便さの点では１反応系（１ステップ）で行われてもよい。１ステップ反応の場合、ＲＴに用いた一本鎖核酸結合タンパク質をそのままＭＰＣＲに用いることができる。例えば、ＲＴ－ＭＰＣＲでの反応液中の一本鎖核酸結合タンパク質の初期濃度を、好ましくは３μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは９μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは２０μｇ／ｍＬ以上に調整すればよく、他方、好ましくは３００μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは２００μｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１５０μｇ／ｍＬ以下に調整すればよく、あるいは、好ましくは３～３００μｇ／ｍＬ、より好ましくは９～２００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは２０～１５０μｇ／ｍＬに調整すればよい。
　上記の逆転写及び／又はＭＰＣＲで得られた反応産物は、皮膚角層由来の核酸試料として利用することができる。該反応産物は、そのまま核酸試料として用いてもよく、又は必要に応じて精製されて、核酸試料として用いられる。
　逆転写及び／又はＭＰＣＲにより増幅された核酸の精製は、サイズ分離によって行われることが好ましい。サイズ分離により、増幅産物（目的の核酸）を、反応液中に含まれるプライマーやその他の不純物から分離することができる。核酸のサイズ分離は、例えば、サイズ分離カラムや、サイズ分離チップ、サイズ分離に利用可能な磁気ビーズなどによって行うことができる。サイズ分離に利用可能な磁気ビーズの好ましい例としては、Ａｍｐｕｒｅ　ＸＰ等のＳｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）磁性ビーズが挙げられる。例えば、Ａｍｐｕｒｅ　ＸＰとＤＮＡ溶液を混合すると、ＤＮＡは磁性ビーズの表面にコーティングされたカルボキシル基に吸着され、マグネットを用いて磁性ビーズのみを回収することでＤＮＡが精製される。またＡｍｐｕｒｅ　ＸＰ溶液とＤＮＡ溶液の混合比を変化させると磁性ビーズに吸着するＤＮＡの分子サイズが変化する。この原理を利用することで、捕捉したい特定の分子サイズのＤＮＡを磁性ビーズ上に回収し、それ以外の分子サイズのＤＮＡや不純物を精製することが可能である。
　精製した核酸に対して、その後の解析を行うために必要なさらなる処理を施してもよい。例えば、精製した核酸が逆転写で得られたｃＤＮＡであれば、上述の手順で増幅することができる。また例えば、ＤＮＡのシーケンシングやフラグメント解析のために、精製したＤＮＡを、適切なバッファー溶液へと調製したり、該ＤＮＡに含まれるプライマー領域を切断したり、該ＤＮＡにアダプター配列をさらに付加したりしてもよい。例えば、精製したＤＮＡをバッファー溶液へと調製し、該ＤＮＡに対してプライマー配列の除去及びアダプターライゲーションを行い、得られた反応産物を、必要に応じて増幅して、各種解析のためのライブラリーを調製することができる。これらの操作は、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×ＶＩＬＯ　ＲＴ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘ、及びＩｏｎ　ＡｍｐｌｉＳｅｑ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｋｉｔ（ライフクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×Ｉｏｎ　ＡｍｐｌｉＳｅｑ　ＨｉＦｉ　Ｍｉｘ、及びＩｏｎ　ＡｍｐｌｉＳｅｑ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｃｏｒｅ　Ｐａｎｅｌを用いて、各キット付属のプロトコルに従って行うことができる。
　本発明で調製された核酸試料は、核酸を用いる各種の解析又は診断、例えば、遺伝子発現解析、トランスクリプトーム解析、被験体の機能解析、疾患の診断、被験体に投与した薬物の効能評価などの、遺伝子の網羅的解析又は特定の遺伝子を標的とした発現解析に用いることができる。したがって、本発明はまた、上述した本発明による核酸試料の調製方法により調製された皮膚角層由来の核酸試料を、各種解析に用いることに関する。一実施形態において、本発明は、上記の本発明による核酸試料の調製方法により調製された皮膚角層由来の核酸試料における遺伝子発現を検出することを含む、皮膚の遺伝子発現を検出する方法を提供する。
　本発明による遺伝子発現を検出する方法は、本発明による核酸試料の調製方法により調製された皮膚角層由来の核酸試料を用いる限り、遺伝子発現検出の手順や手法は特に限定されない。例えば、シーケンシングによる遺伝子発現検出を行う場合、増幅及び精製した核酸にアダプターライゲーションしてライブラリーを調製し、該ライブラリーをシーケンシングにかけることができる。シーケンシングで得られた各遺伝子由来配列のリード数に基づいて遺伝子発現を検出又は定量することができる。
　本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、方法等をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
〔１〕皮膚角層由来の核酸試料の調製方法であって、以下：
　皮膚の表面から採取した角層から核酸を抽出し、該核酸を含む水溶性アルコール水溶液を調製すること、該角層は、該皮膚の表面から５μｍ以内の深さの角層である；
　該水溶性アルコール水溶液中の核酸を固相材料に接触させ、該核酸を分離すること、該固相材料に接触させる前の該水溶性アルコール水溶液における水溶性アルコールの濃度は３９～５０体積％である；
　該分離した核酸を、一本鎖核酸結合タンパク質の存在下で増幅するか、又は逆転写及び増幅して核酸試料を調製すること、該増幅は、マルチプレックスＰＣＲによる増幅であり、該一本鎖核酸結合タンパク質は、Ｔ４ＧＰ３２又はその改変体である、
を含む、方法。
〔２〕好ましくは、前記皮膚の表面から角層を採取することをさらに含む、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記皮膚の表面から採取した角層が、
　好ましくは、該皮膚の表面から角層４枚以内分の角層であり、より好ましくは、該皮膚の表面から角層２枚以内分の角層であり、あるいは、
　好ましくは、皮膚の表面から２．６μｍ以内の深さの角層であり、かつ皮膚の表面から５μｍよりも深い層にある角層を含まない、
〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕好ましくは、前記皮膚の表面からの角層の採取がテープストリッピングによる角層の採取である、〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕好ましくは、前記テープストリッピングに用いる接着テープがアクリル系粘着テープである、〔４〕記載の方法。
〔６〕好ましくは、前記テープストリッピングによる角層の採取が、皮膚の標的領域に１枚又は２枚の前記アクリル系粘着接着テープを当てて、該テープに角層を接着させて剥離することを含む、〔５〕記載の方法。
〔７〕好ましくは、前記角層から抽出される核酸がＲＮＡ又はＤＮＡである、〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載の方法。
〔８〕好ましくは、前記角層から抽出される核酸及び前記分離した核酸がＲＮＡであり、かつ該分離したＲＮＡを、前記一本鎖核酸結合タンパク質の存在下で逆転写及び増幅して核酸試料を調製する、〔７〕記載の方法。
〔９〕好ましくは、前記逆転写及び増幅の反応液中における前記一本鎖核酸結合タンパク質の初期濃度が、
　好ましくは３μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは９μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは２０μｇ／ｍＬ以上、かつ、好ましくは３００μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは２００μｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１５０μｇ／ｍＬ以下であるか、あるいは、
　好ましくは３～３００μｇ／ｍＬ、より好ましくは９～２００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは２０～１５０μｇ／ｍＬである、〔８〕記載の方法。
〔１０〕好ましくは、前記逆転写及び増幅がマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲである、〔９〕記載の方法。
〔１１〕好ましくは、前記角層から抽出される核酸及び前記分離した核酸がＤＮＡであり、かつ該分離したＤＮＡを、前記一本鎖核酸結合タンパク質の存在下で増幅して核酸試料を調製する、〔７〕記載の方法。
〔１２〕好ましくは、前記増幅の反応液中における前記一本鎖核酸結合タンパク質の初期濃度が、
　好ましくは３μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは９μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは２０μｇ／ｍＬ以上、かつ、好ましくは３００μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは２００μｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１５０μｇ／ｍＬ以下であるか、あるいは、
　好ましくは３～３００μｇ／ｍＬ、より好ましくは９～２００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは２０～１５０μｇ／ｍＬである、〔１１〕記載の方法。
〔１３〕前記水溶性アルコールが、
　好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール及びブタノールからなる群より選択される少なくとも１種であり、
　より好ましくはエタノールである、
〔１〕～〔１２〕のいずれか１項記載の方法。
〔１４〕好ましくは、前記Ｔ４ＧＰ３２又はその改変体が、配列番号１のアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつ一本鎖核酸に結合するタンパク質である、〔１〕～〔１３〕のいずれか１項記載の方法。
〔１５〕好ましくは、フェノール／クロロホルム法又はその変法により、前記角層から核酸が抽出される、〔１〕～〔１４〕のいずれか１項記載の方法。
〔１６〕前記水溶性アルコール水溶液における該水溶性アルコールの濃度が、好ましくは４０～４６体積％、より好ましくは４１～４５．５体積％、さらに好ましくは４２～４５体積％である、〔１〕～〔１５〕のいずれか１項記載の方法。
〔１７〕前記固相材料が、
　好ましくは、シリカベースの固相材料であり、
　より好ましくは、多孔性のシリカメンブレンを有する固相材料である、
〔１〕～〔１６〕のいずれか１項記載の方法。
〔１８〕前記水溶性アルコール水溶液中の核酸の分離が、該水溶性アルコール水溶液中の核酸を前記シリカベースの固相材料に吸着させることを含む、〔１７〕記載の方法。
〔１９〕好ましくは、前記固相材料がスピンカラム、カラム付きピペットチューブ、又は遠心チューブもしくはピペットチューブに装着可能なカラムカートリッジの形態である、〔１８〕記載の方法。
〔２０〕好ましくは、前記固相材料に吸着した核酸を回収することをさらに含む、〔１８〕又は〔１９〕記載の方法。
〔２１〕好ましくは、前記核酸が吸着した固相材料を洗浄し、次いで該固相材料から核酸を溶出させて回収することを含む、〔２０〕記載の方法。
〔２２〕好ましくは、前記固相材料の洗浄のための洗浄液が、水溶性有機溶媒及び水溶性塩からなる群より選択される少なくとも１種を含む溶液であり、
ここで、
　該水溶性有機溶媒が、好ましくは水溶性アルコールであり、より好ましくはメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール及びブタノールからなる群より選択される少なくとも１種であり、さらに好ましくはエタノールであり、
　該水溶性塩が、好ましくは一価又は二価のカチオン塩であり、より好ましくはアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩であり、さらに好ましくはナトリウム塩及びカリウム塩であり、かつ好ましくは塩化物塩であり、なお好ましくは塩化ナトリウムである、
〔２１〕記載の方法。
〔２３〕前記洗浄液における前記水溶性有機溶媒の濃度が、好ましくは３０～１００体積％、より好ましくは３５～５０体積％である、〔２２〕記載の方法。
〔２４〕前記洗浄液における前記水溶性塩の濃度が、好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上１ｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．１ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上１ｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．１ｍｏｌ／Ｌ以下である、〔２２〕記載の方法。
〔２５〕好ましくは、前記固相材料からの核酸の溶出のための溶出液が水又はバッファーである、〔２１〕～〔２４〕のいずれか１項記載の方法。
〔２６〕前記逆転写が、
　好ましくは、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、又はそれらの混合物を含む反応液中で行われ、
　より好ましくは、ランダムプライマーを含む反応液中で行われる、
〔１〕～〔２５〕のいずれか１項記載の方法。
〔２７〕好ましくは、〔１〕～〔２６〕のいずれか１項記載の方法により調製された皮膚角層由来の核酸試料における遺伝子発現を検出することを含む、皮膚の遺伝子発現を検出する方法。
〔２８〕好ましくは、前記遺伝子発現の検出がシーケンシングにより行われる、〔２７〕記載の方法。
　以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
試験１　皮膚角層における遺伝子発現の検出：ライブラリー調製法による比較
１）角層採取及びＲＮＡ抽出
　３０～５０歳代の健常な男女各２名（計４名）を被験者とした。被験者の顔面頬部の左右１カ所ずつ２カ所から、それぞれＤ－Ｓｑｕａｍｅテープ（直径２．２ｃｍディスク状；クリニカル＆ダーム社製）１枚を用いて角層を採取した。具体的には、洗顔後の被験者の頬部の採取部位に該テープを当て、２２５ｇ／ｃｍ2程度の一定圧を加えた後、ゆっくりと均等な速度でテープを剥がし、角層を採取した。角層を採取したそれぞれのテープにＱＩＡｚｏｌ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）１ｍＬを添加し、テープ表面に付着した角層を溶解させてチューブに回収した。そこに、クロロホルム２００μＬを添加、混合し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して水層（上層）を新しいチューブに回収し、サンプルとして用いた。一人の被験者から調製した２つのサンプルを、それぞれの別の方法（下記方法Ａ及び方法Ｂ）に従って処理し、遺伝子発現検出用ライブラリーを作成した。
２）遺伝子発現検出用ライブラリーの調製
方法Ａ）
・１）で調製した２つサンプルの片方を、等量の７０％（ｖ／ｖ）エタノールと混合した。得られたサンプルを含むエタノール水溶液から、シリカベースカラム（ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ）を用いてキットに添付のプロトコルに従いＲＮＡを精製した。
・精製したＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。
・得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより検出可能な２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ　ＡｍｐｌｉＳｅｑ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。
・得られたＰＣＲ産物をＡｍｐｕｒｅ　ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、及び増幅を行い、ライブラリーを調製した。
・本手順で調製したＲＮＡやＰＣＲ産物、及びライブラリーの収量を、Ａｇｉｌｅｎｔ　４２００　ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて測定した。
方法Ｂ）
・１）で調製した２つのサンプルのもう片方を、等量の８５％（ｖ／ｖ）エタノールと混合した。得られたサンプルを含むエタノール水溶液から、シリカベースのカラム（ＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ）を用いてキットに添付のプロトコルに従いＲＮＡを精製した。
・精製したＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。逆転写の際、反応液に、Ｔ４ＧＰ３２（ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢｉｏＬａｂｓ）を終濃度１００μｇ／ｍＬで添加した。
・得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ　ＡｍｐｌｉＳｅｑ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。ＰＣＲの際、反応液に、Ｔ４ＧＰ３２（ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢｉｏＬａｂｓ）を終濃度３５μｇ／ｍＬで添加した。
・得られたＰＣＲ産物をＡｍｐｕｒｅ　ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した後に、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、及び増幅を行い、ライブラリーを調製した。
・本手順で調製したＲＮＡやＰＣＲ産物、及びライブラリーの収量を、Ａｇｉｌｅｎｔ　４２００　ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて測定した。
３）遺伝子発現検出
　方法Ａ及びＢで調製したライブラリーを、それぞれＩｏｎ　５４０　Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ　Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。シーケンシングで得られた各リード配列をヒトゲノムのリファレンス配列であるｈｇ１９　ＡｍｐｌｉＳｅｑ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　ＥＲＣＣ　ｖ１を用いて遺伝子マッピングすることで各リード配列の由来する遺伝子を決定した。測定した各遺伝子の発現量のデータ（リードカウント値）をＤＥＳｅｑ２という手法を用いて補正した。補正されたカウント値（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ　ｃｏｕｎｔ値）を遺伝子発現の検出に用いた。
４）ライブラリー収量と検出遺伝子の比較
　方法Ａ及び方法ＢにおけるマルチプレックスＰＣＲで得られたＰＣＲ産物の収量、及び最終的に得られたライブラリーの収量を被験者ごとに表１に示した。ＰＣＲ産物及びライブラリーのいずれも、方法Ａよりも方法Ｂで収量が増加していた。
　方法Ａ及び方法Ｂで調製したライブラリーについて、３）で検出された遺伝子を比較した。方法Ａで調製したライブラリーでは全被験者で補正されたカウント値が０の値を示し、かつ方法Ｂで調製したライブラリーでは４被験者中少なくとも３人の被験者で補正されたカウント値が０を超える値を示した遺伝子を選抜したところ、１３９個の遺伝子が確認された（表２）。一方で、方法Ｂで調製したライブラリーでは全被験者で補正されたカウント値が０の値を示し、かつ方法Ａで調製したライブラリーでは４被験者中少なくとも３人の被験者で補正されたカウント値が０を超える値を示した遺伝子を選抜したところ、２２個の遺伝子のみが確認された（データ示さず）。この結果より、方法Ａと比較して方法Ｂで調製したライブラリーでは、より多くの数の遺伝子を検出できることが示された。さらに上記１３９個の遺伝子（表２）の中には、皮膚のかゆみに深く関与するＴＳＬＰ（Ｃｅｌｌ，１５５：２８５－２９５，２０１３）、メラノーマに深く関与するＭＣ１Ｒ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｍａｎａｇ　Ｒｅｓ，１０：１１４３－１１５４，２０１８）といった皮膚の機能に重要な遺伝子が含まれていることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例２　角層深さごとの遺伝子発現プロファイルの比較
１）角層からのＲＮＡ抽出及びＲＮＡシーケンシング
　３０代の健常な女性１名の顔面頬部において、１０枚のＤ－Ｓｑｕａｍｅテープ（直径２．２ｃｍディスク状；クリニカル＆ダーム社製）を用いて、同一部位からテープ１０枚分の深さまでの角層を順次採取した。具体的には、洗顔後の被験者の頬部の採取部位に該テープを当て、２２５ｇ／ｃｍ2程度の一定圧を加えた後、ゆっくりと均等な速度でテープを剥がし、角層を採取する操作をテープ１０枚分繰り返した。表面から、１から２枚目までのテープでの採取分（Ａ群）、３から５枚目までのテープでの採取分（Ｂ群）、６から８枚目までのテープでの採取分（Ｃ群）、９から１０枚目までのテープでの採取分（Ｄ群）の角層をそれぞれプールし、実施例１の方法Ｂと同様にライブラリー調製し、シーケンシングし、遺伝子発現を検出した。Ｃａｒｏｌｉｎｅ　Ｍｅｙｅｒ　Ｏｌｅｓｅｎらの報告（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，９：１２２１７，２０１９）によれば、角層テープは、５枚目までであれば１．３μｍ／枚、６枚目から１０枚目であれば０．７μｍ／枚の厚みで角層を採取できる。この報告に従うと、Ａ群では０～２．６μｍ、Ｂ群では２．７～６．６μｍ、Ｃ群では６．７～８．８μｍ、Ｄ群では８．９～１０．３μｍの表面からの深さの角層が採取されていると考えられる。
　シーケンシングデータの解析から、Ｂ、Ｃ、Ｄ群のそれぞれと比較してＡ群で１．３倍以上発現レベルが上昇する遺伝子が１２４個検出された（表３）。これらの遺伝子について公共データベースであるＰａｎｔｈｅｒを用いて遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント解析によるｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓ（ＢＰ）の探索を行った。結果、１～２枚目のテープに由来する浅い部分の角層には、角化や、脂質合成／代謝に関連するＲＮＡが豊富に含まれていることが示された（表４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004

Claims (14)

  1. 　皮膚角層由来の核酸試料の調製方法であって、以下：
    　皮膚の表面から採取した角層から核酸を抽出し、該核酸を含む水溶性アルコール水溶液を調製すること、該角層は、該皮膚の表面から５μｍ以内の深さの角層である；
    　該水溶性アルコール水溶液中の核酸を固相材料に接触させ、該核酸を分離すること、該固相材料に接触させる前の該水溶性アルコール水溶液における水溶性アルコールの濃度は３９～５０体積％である；
    　該分離した核酸を、一本鎖核酸結合タンパク質の存在下で増幅するか、又は逆転写及び増幅して核酸試料を調製すること、該増幅は、マルチプレックスＰＣＲによる増幅であり、該一本鎖核酸結合タンパク質は、Ｔ４ＧＰ３２又はその改変体である、
    を含む、方法。
  2. 　前記皮膚の表面から角層を採取することをさらに含む、請求項１記載の方法。
  3. 　前記皮膚の表面から採取した角層が、該皮膚の表面から角層４枚以内分の角層である、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　前記皮膚の表面からの角層の採取がテープストリッピングによる角層の採取である、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
  5. 　前記テープストリッピングに用いる接着テープがアクリル系粘着テープである、請求項４記載の方法。
  6. 　前記角層から抽出される核酸がＲＮＡ又はＤＮＡである、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　前記角層から抽出される核酸及び前記分離した核酸がＲＮＡであり、かつ該分離したＲＮＡを、前記一本鎖核酸結合タンパク質の存在下で逆転写及び増幅して核酸試料を調製する、請求項６記載の方法。
  8. 　前記逆転写及び増幅がマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲであり、該マルチプレックスＲＴ－ＰＣＲの反応液中における前記一本鎖核酸結合タンパク質の初期濃度が３～３００μｇ／ｍＬである、請求項７記載の方法。
  9. 　前記角層から抽出される核酸及び前記分離した核酸がＤＮＡであり、かつ該分離したＤＮＡを、前記一本鎖核酸結合タンパク質の存在下で増幅して核酸試料を調製する、請求項６記載の方法。
  10. 　前記増幅の反応液中における前記一本鎖核酸結合タンパク質の初期濃度が３～３００μｇ／ｍＬである、請求項９記載の方法。
  11. 　前記水溶性アルコールがメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノール及びブタノールからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１～１０のいずれか１項記載の方法。
  12. 　前記Ｔ４ＧＰ３２又はその改変体が、配列番号１のアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつ一本鎖核酸に結合するタンパク質である、請求項１～１１のいずれか１項記載の方法。
  13. 　前記固相材料が、シリカベースの固相材料である、請求項１～１２のいずれか１項記載の方法。
  14. 　請求項１～１３のいずれか１項記載の方法により調製された皮膚角層由来の核酸試料における遺伝子発現を検出することを含む、皮膚の遺伝子発現を検出する方法。
      
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