JP3453871B2 - デスモソーム機能の評価方法 - Google Patents
デスモソーム機能の評価方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトの皮膚の上皮（表
皮）におけるデスモソームの機能を検査する方法、なら
びにかかる検査方法の化粧品分野への応用に関する。
皮）におけるデスモソームの機能を検査する方法、なら
びにかかる検査方法の化粧品分野への応用に関する。
【０００２】
【従来の技術】デスモソーム（接着斑は、隣接する表皮
細胞間に形成される構造で、細胞間結合の強化機能を有
する構造物であることが知られている。この表皮細胞の
死細胞である角質細胞から構成される角層の形成、生理
的剥離による脱落の調和がとれることにより美しい皮膚
表面が保たれるものと考えられている。従つて、皮膚表
面に落屑が生じたり、皮膚がかさつくなどの好ましくな
い皮膚状態を呈することは、前記調和の乱れによるもの
といえる。
細胞間に形成される構造で、細胞間結合の強化機能を有
する構造物であることが知られている。この表皮細胞の
死細胞である角質細胞から構成される角層の形成、生理
的剥離による脱落の調和がとれることにより美しい皮膚
表面が保たれるものと考えられている。従つて、皮膚表
面に落屑が生じたり、皮膚がかさつくなどの好ましくな
い皮膚状態を呈することは、前記調和の乱れによるもの
といえる。
【０００３】従来、角層（または角質細胞の層状構造
物）の接着には脂質が関与しているという説が一般的で
あつたが、最近になつて、電顕的な知見に基づきデスモ
ソームが角質細胞の接着のための本質的な構造であると
の示唆も見られる（例えば、北島、香油会誌、Ｖｏｌ．
１５．Ｎｏ．４（１９９１）、２２５−２３０ページ参
照）。さらに北島は、前記論文でプロテアーゼによるデ
スモソームの消化が角層剥離の第一要素であるとの推論
も提起している。さらに、A. Lundstroem らは、Acta D
erm Venereol（Stockh）１９９１：７１：４７１−４７
４において、イン・ビボ（in vivo）条件下の落屑に関
し角層に存在するとみなされる分子量２５ｋＤａのキモ
トリプシン様酵素が一定の役割を果たしたものと示唆し
ている。
物）の接着には脂質が関与しているという説が一般的で
あつたが、最近になつて、電顕的な知見に基づきデスモ
ソームが角質細胞の接着のための本質的な構造であると
の示唆も見られる（例えば、北島、香油会誌、Ｖｏｌ．
１５．Ｎｏ．４（１９９１）、２２５−２３０ページ参
照）。さらに北島は、前記論文でプロテアーゼによるデ
スモソームの消化が角層剥離の第一要素であるとの推論
も提起している。さらに、A. Lundstroem らは、Acta D
erm Venereol（Stockh）１９９１：７１：４７１−４７
４において、イン・ビボ（in vivo）条件下の落屑に関
し角層に存在するとみなされる分子量２５ｋＤａのキモ
トリプシン様酵素が一定の役割を果たしたものと示唆し
ている。
【０００４】一方、本発明者の一部も、角層の落屑に関
与する可能性のある内因性プロテアーゼとして分子量約
３０ｋＤａのトリプシン様酵素を同定して報告した(Y.
Suzukiら、Arch. Dermatol. Res.（１９９３）２８５：
３７２−３７７、および Y.Suzuki ら、ibid（１９９
４）２８６：２４９−２５３）。
与する可能性のある内因性プロテアーゼとして分子量約
３０ｋＤａのトリプシン様酵素を同定して報告した(Y.
Suzukiら、Arch. Dermatol. Res.（１９９３）２８５：
３７２−３７７、および Y.Suzuki ら、ibid（１９９
４）２８６：２４９−２５３）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上述のように、角層の
脱落動態の研究には、電顕による組織の観察や、角層に
存在するプロテアーゼ類の作用の観点からアプローチ可
能であることが予期される。しかし、本質的な角層中の
デスモソームの機能、特に角層または角質細胞の接着機
能またはそれらの剥離機能、がどのような指標によれば
イン・ビトロ（in vitro）でより正確に検査できるかに
ついては何等の教示も存在しない。従つて、本発明の目
的は、角層中のデスモソームの本質的な機能をより正確
に検査する方法を提供し、さらにかかる方法に基づき、
特に化粧品分野での具体的な利用方法を提供することに
ある。
脱落動態の研究には、電顕による組織の観察や、角層に
存在するプロテアーゼ類の作用の観点からアプローチ可
能であることが予期される。しかし、本質的な角層中の
デスモソームの機能、特に角層または角質細胞の接着機
能またはそれらの剥離機能、がどのような指標によれば
イン・ビトロ（in vitro）でより正確に検査できるかに
ついては何等の教示も存在しない。従つて、本発明の目
的は、角層中のデスモソームの本質的な機能をより正確
に検査する方法を提供し、さらにかかる方法に基づき、
特に化粧品分野での具体的な利用方法を提供することに
ある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、前記課題を
解決すべく、主として角層の動態をその中に含まれる酵
素利用の観点から研究してきた。その結果、角層剥離酵
素として作用している可能性のあるキモトリプシン様酵
素およびトリプシン様酵素は、いずれか一方の酵素活性
だけでは、角層デスモソームの機能を説明することがで
きず、両酵素活性を評価して初めて前記機能、特に角層
の脱落、が総合的に説明できることを見い出した。
解決すべく、主として角層の動態をその中に含まれる酵
素利用の観点から研究してきた。その結果、角層剥離酵
素として作用している可能性のあるキモトリプシン様酵
素およびトリプシン様酵素は、いずれか一方の酵素活性
だけでは、角層デスモソームの機能を説明することがで
きず、両酵素活性を評価して初めて前記機能、特に角層
の脱落、が総合的に説明できることを見い出した。
【０００７】従つて、前記課題は、本発明による、角層
中のデスモソームの機能をイン・ビトロ（in vitro）で
検査する方法であつて、（Ａ） 角層中のトリプシン様
酵素活性とキモトリプシン様酵素活性をそれぞれ独立し
て測定する工程、ならびに（Ｂ） 工程（Ａ）で測定さ
れた両酵素活性の多寡をデスモソーム機能の指標として
評価する工程、を含んでなる方法、を提供することによ
つて解決できる。
中のデスモソームの機能をイン・ビトロ（in vitro）で
検査する方法であつて、（Ａ） 角層中のトリプシン様
酵素活性とキモトリプシン様酵素活性をそれぞれ独立し
て測定する工程、ならびに（Ｂ） 工程（Ａ）で測定さ
れた両酵素活性の多寡をデスモソーム機能の指標として
評価する工程、を含んでなる方法、を提供することによ
つて解決できる。
【０００８】本発明によれば、こうして提供した前記デ
スモソームの機能の検査方法を、被検者の肌の状態を検
査する方法に向けた、すなわち、デスモソームの機能の
検査方法により健常人と被験者にそれぞれ由来する表皮
におけるデスモソームの機能を検査し、次いで、得られ
た両検査結果を比較検討することによつて被験者の肌の
状態、特に肌荒れの程度または皮膚疾患症状の検査方法
も提供する。
スモソームの機能の検査方法を、被検者の肌の状態を検
査する方法に向けた、すなわち、デスモソームの機能の
検査方法により健常人と被験者にそれぞれ由来する表皮
におけるデスモソームの機能を検査し、次いで、得られ
た両検査結果を比較検討することによつて被験者の肌の
状態、特に肌荒れの程度または皮膚疾患症状の検査方法
も提供する。
【０００９】またさらに、前記デスモソームの機能の検
査方法を、肌荒れ防止剤、特に肌荒れ防止用化粧料の開
発に向けた、すなわち、デスモソームの機能の検査方法
により健常人に由来する表皮と被検物質を適用した健常
人の表皮におけるデスモソームの機能を検査し、次い
で、得られた両検査結果を比較検討することによつて被
検物質のデスモソーム機能への影響度を評価し、肌荒れ
防止剤、特に肌荒れ防止用化粧料を開発するためのスク
リーニング方法も提供する。
査方法を、肌荒れ防止剤、特に肌荒れ防止用化粧料の開
発に向けた、すなわち、デスモソームの機能の検査方法
により健常人に由来する表皮と被検物質を適用した健常
人の表皮におけるデスモソームの機能を検査し、次い
で、得られた両検査結果を比較検討することによつて被
検物質のデスモソーム機能への影響度を評価し、肌荒れ
防止剤、特に肌荒れ防止用化粧料を開発するためのスク
リーニング方法も提供する。
【００１０】以下、本発明を具体的に説明する。
【００１１】本発明にいう角層（または角化層）とは、
先にも若干説明したように、ヒトの皮膚表面を覆う表皮
細胞が角化した角質細胞の層状構造をいう。デスモソー
ムはこれらの細胞間にランダムに分布した蛋白質等から
なることが知られている。このような構造は体を覆う細
胞に広く分布しているので、本発明でいうデスモソーム
は、本発明の目的に沿う限りヒトの体の特定された部位
の表皮に係るものに限定されない。
先にも若干説明したように、ヒトの皮膚表面を覆う表皮
細胞が角化した角質細胞の層状構造をいう。デスモソー
ムはこれらの細胞間にランダムに分布した蛋白質等から
なることが知られている。このような構造は体を覆う細
胞に広く分布しているので、本発明でいうデスモソーム
は、本発明の目的に沿う限りヒトの体の特定された部位
の表皮に係るものに限定されない。
【００１２】このような角層中のトリプシン様酵素と
は、前述の Y. Suzuki ら、Arch. Dermatol. Res.,（１
９９３）２８５：３７２−３７７に記載されているよう
なトリプシンに対する一定の基質を加水分解する活性を
示し、カゼイン−アクリルアミド電気泳動で約３０ｋＤ
ａの分子量を有する酵素を意味する。一方、キモトリプ
シン様酵素とは、前述の A. Lundstroem ら、Acta. Der
m. Venerel.（Stockh）１９９１；７１：４７１−４７
４に記載されているような約２５ｋＤａの分子量を有す
る酵素をいう。
は、前述の Y. Suzuki ら、Arch. Dermatol. Res.,（１
９９３）２８５：３７２−３７７に記載されているよう
なトリプシンに対する一定の基質を加水分解する活性を
示し、カゼイン−アクリルアミド電気泳動で約３０ｋＤ
ａの分子量を有する酵素を意味する。一方、キモトリプ
シン様酵素とは、前述の A. Lundstroem ら、Acta. Der
m. Venerel.（Stockh）１９９１；７１：４７１−４７
４に記載されているような約２５ｋＤａの分子量を有す
る酵素をいう。
【００１３】本発明では、角質中におけるこれらのトリ
プシン様酵素とキモトリプシン様酵素の両活性を測定す
ることが必要である。これらの両酵素活性を対象とする
ことの必要性は、表皮細胞の動態に異常を来し、皮膚の
乾燥とサメ肌様鱗屑を保持する魚鮮癬患者の角層や加齢
人の角層、における前記両酵素活性を健常人（または健
康な若年者）の角層におけるそれらとの比較の結果から
説明できる。例えば、前者の角層では、キモトリプシン
様酵素活性およびトリプシン様酵素活性がともに有意に
低下しており、後者の角層では、トリプシン様酵素活性
が有意に低下していることから、キモトリプシン様酵素
活性とトリプシン様酵素活性のいずれかの低下は、角層
の剥離を妨げるものと信じられるからである。すなわ
ち、角層の剥離に関する角層中のデスモソームの機能を
正確に評価するには、少なくともキモトリプシン様酵素
活性とトリプシン様酵素活性を測定することが必須であ
る。
プシン様酵素とキモトリプシン様酵素の両活性を測定す
ることが必要である。これらの両酵素活性を対象とする
ことの必要性は、表皮細胞の動態に異常を来し、皮膚の
乾燥とサメ肌様鱗屑を保持する魚鮮癬患者の角層や加齢
人の角層、における前記両酵素活性を健常人（または健
康な若年者）の角層におけるそれらとの比較の結果から
説明できる。例えば、前者の角層では、キモトリプシン
様酵素活性およびトリプシン様酵素活性がともに有意に
低下しており、後者の角層では、トリプシン様酵素活性
が有意に低下していることから、キモトリプシン様酵素
活性とトリプシン様酵素活性のいずれかの低下は、角層
の剥離を妨げるものと信じられるからである。すなわ
ち、角層の剥離に関する角層中のデスモソームの機能を
正確に評価するには、少なくともキモトリプシン様酵素
活性とトリプシン様酵素活性を測定することが必須であ
る。
【００１４】これらの酵素活性の測定は、上述の引用文
献に記載の方法を始め、当該技術分野で知られているい
ずれの方法によつてもよい。例えば、トリプシン様酵素
活性は、トリプシンの基質として知られているＢｏｃ−
Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡやＢｏｃ−Ｇｌｎ−Ａ
ｌａ−Ａｒｇ−ＭＣＡを基質（ここで、Ｂｏｃは、アミ
ノ保護基ｔ−ブトキシカルボニル基を表し、ＭＣＡは４
−メチル−クマリル−７−アミノ基を表し、他の三文字
は、通常の三文字表記によるＬ−アミノ酸残基を表す）
を用い、被験角層に由来する試料のこれらの基質に対す
る加水分解活性を測定することにより行うことができ
る。一方、キモトリプシン様酵素活性は、ＭｅＯ−Ｓｕ
ｃ−Ｔｙｒ−ｐＮＡ（ここで、ＭｅＯ−ＳｕｃはＮ−メ
トキシコハク酸を表し、ｐＮＡはパラニトロアミノ基を
表す）などを基質とすることにより測定することができ
る。
献に記載の方法を始め、当該技術分野で知られているい
ずれの方法によつてもよい。例えば、トリプシン様酵素
活性は、トリプシンの基質として知られているＢｏｃ−
Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡやＢｏｃ−Ｇｌｎ−Ａ
ｌａ−Ａｒｇ−ＭＣＡを基質（ここで、Ｂｏｃは、アミ
ノ保護基ｔ−ブトキシカルボニル基を表し、ＭＣＡは４
−メチル−クマリル−７−アミノ基を表し、他の三文字
は、通常の三文字表記によるＬ−アミノ酸残基を表す）
を用い、被験角層に由来する試料のこれらの基質に対す
る加水分解活性を測定することにより行うことができ
る。一方、キモトリプシン様酵素活性は、ＭｅＯ−Ｓｕ
ｃ−Ｔｙｒ−ｐＮＡ（ここで、ＭｅＯ−ＳｕｃはＮ−メ
トキシコハク酸を表し、ｐＮＡはパラニトロアミノ基を
表す）などを基質とすることにより測定することができ
る。
【００１５】上記の方法は、酵素活性を至適条件で測定
するため角層中に存在する酵素量の多寡は判定できる
が、角層中での酵素活性の様子は判定できない。すなわ
ち、酵素量が同じでも角層中で酵素が不活性となってい
る場合には評価できないからである。しかしながら、本
発明では、こうして測定された被験対象の角層中の両活
性の多寡がデスモソームを測定することにより評価され
る。両活性が活性または不活性であるかを評価するに
は、角層の処理環境を変えた試料に対する測定値を比較
検討するか、特定の健常人の角質に対する測定値と比較
検討することにより行う。より具体的には、角層の形成
と剥離の制御が正常に保たれるイン・ビトロ（in vitr
o）試験試料および環境下での前記両酵素作用が被験角
層のものと比較される。前記の制御が正常に保たれるイ
ン・ビトロ試験試料および環境は、健常人由来の角層を
前記酵素活性に悪影響を及ぼさない防腐防黴溶液（例え
ば、カナマイシン６０μｌ／ｍｌ、０.５％ＮａＮ3）に
一定時間浸漬した後、相対湿度がほぼ４０〜８０％の内
の一定条件に維持され、温度が３７℃に設定された恒温
槽に前記角層を保持することによつて作出できること
が、本発明者によつて見い出された。
するため角層中に存在する酵素量の多寡は判定できる
が、角層中での酵素活性の様子は判定できない。すなわ
ち、酵素量が同じでも角層中で酵素が不活性となってい
る場合には評価できないからである。しかしながら、本
発明では、こうして測定された被験対象の角層中の両活
性の多寡がデスモソームを測定することにより評価され
る。両活性が活性または不活性であるかを評価するに
は、角層の処理環境を変えた試料に対する測定値を比較
検討するか、特定の健常人の角質に対する測定値と比較
検討することにより行う。より具体的には、角層の形成
と剥離の制御が正常に保たれるイン・ビトロ（in vitr
o）試験試料および環境下での前記両酵素作用が被験角
層のものと比較される。前記の制御が正常に保たれるイ
ン・ビトロ試験試料および環境は、健常人由来の角層を
前記酵素活性に悪影響を及ぼさない防腐防黴溶液（例え
ば、カナマイシン６０μｌ／ｍｌ、０.５％ＮａＮ3）に
一定時間浸漬した後、相対湿度がほぼ４０〜８０％の内
の一定条件に維持され、温度が３７℃に設定された恒温
槽に前記角層を保持することによつて作出できること
が、本発明者によつて見い出された。
【００１６】また本発明を構成する上で重要な知見は、
前記イン・ビトロ環境下の試料におけるキモトリプシン
様酵素活性およびトリプシン様酵素活性の強さが、それ
らの酵素作用の結果、角層中に残存するデスモソームタ
ンパク質、デスモグレインおよびデスモコリン量の多さ
に、それぞれ逆の相関性をもつことである。より具体的
には、本発明によれば、被験試料中のキモトリプシン様
酵素活性およびトリプシン様酵素活性を直接測定するこ
となく、前記環境下に一定期間保持された試料中のデス
モグレインおよびデスモコリンの残存率を測定すること
により、前記酵素活性の多寡、すなわちデスモソームの
角質の剥離に対する機能を知ることができる。
前記イン・ビトロ環境下の試料におけるキモトリプシン
様酵素活性およびトリプシン様酵素活性の強さが、それ
らの酵素作用の結果、角層中に残存するデスモソームタ
ンパク質、デスモグレインおよびデスモコリン量の多さ
に、それぞれ逆の相関性をもつことである。より具体的
には、本発明によれば、被験試料中のキモトリプシン様
酵素活性およびトリプシン様酵素活性を直接測定するこ
となく、前記環境下に一定期間保持された試料中のデス
モグレインおよびデスモコリンの残存率を測定すること
により、前記酵素活性の多寡、すなわちデスモソームの
角質の剥離に対する機能を知ることができる。
【００１７】従つて、本発明によれば、イン・ビトロ試
験により、対照試料、例えば、健常人の角層の機能に対
する環境の変化や処理手段の変化の角層に及ぼす作用
を、デスモグレインおよびデスモコリンの処理角層に残
存する量の多寡によつて、角層の剥離に対する環境の変
化や処理手段の有効性が評価できる。こうして、一定の
処理（被検体）をイン・ビトロで被験表皮に施こしたと
き、未処理のものに比較してデスモグレインとデスモコ
リンの残存率があまり低下しない場合には、そのような
処理はデスモソームの接着機能の低減、すなわち角質の
正常な剥離による美しい肌の保持にあまり有意に働かな
いものと推定できるので、これらの評価または検査系を
使用して、美しい肌を保持するための肌荒れ防止剤、特
に肌荒れ防止用化粧料のスクリーニング方法が提供でき
る。
験により、対照試料、例えば、健常人の角層の機能に対
する環境の変化や処理手段の変化の角層に及ぼす作用
を、デスモグレインおよびデスモコリンの処理角層に残
存する量の多寡によつて、角層の剥離に対する環境の変
化や処理手段の有効性が評価できる。こうして、一定の
処理（被検体）をイン・ビトロで被験表皮に施こしたと
き、未処理のものに比較してデスモグレインとデスモコ
リンの残存率があまり低下しない場合には、そのような
処理はデスモソームの接着機能の低減、すなわち角質の
正常な剥離による美しい肌の保持にあまり有意に働かな
いものと推定できるので、これらの評価または検査系を
使用して、美しい肌を保持するための肌荒れ防止剤、特
に肌荒れ防止用化粧料のスクリーニング方法が提供でき
る。
【００１８】他方、健常人の表皮に由来する角層と被験
者の角層とを同一環境下で、前記のように処理した後、
それぞれの角層に残存するデスモグレインとデスモコリ
ンの量を比較することにより、被験者が肌荒れ状態また
は何等かの皮膚疾患にかかつているか否かの検査が可能
になることが理解できるであろう。
者の角層とを同一環境下で、前記のように処理した後、
それぞれの角層に残存するデスモグレインとデスモコリ
ンの量を比較することにより、被験者が肌荒れ状態また
は何等かの皮膚疾患にかかつているか否かの検査が可能
になることが理解できるであろう。
【００１９】
【実施例】以下、本発明を各種試験例を参照しながらさ
らに具体的に説明する。
らに具体的に説明する。
【００２０】例１：健常人および魚鱗癬患者に由来する
角層におけるトリプシン様酵素活性およびキモトリプシ
ン様酵素活性 魚鱗癬患者１２名と健常人２４名の下体から粘着テープ
により角層を剥離した。テープをトルエンで洗浄し、角
層を粘着テープから回収した。１ｍｇの角層をｐＨ８の
緩衝液（トリス緩衝液など）０.９ｍｌと１ｍＭのトリ
プシン様酵素に対する合成基質（Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅ
ｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡなど）と１ｍＭのキモトリプシンに
対する合成基質（Ｍｅｏ−Ｓｕｃ−Ｔｙｒ−ｐＮＡな
ど）をそれぞれ０.１ｍｌ加え、３７℃で２時間反応さ
せた。反応後、トリプシン様酵素の活性は蛍光強度（Ｅ
ｘ／Ｅｍ＝３８０／４６０ｎｍ）を測定し、あらかじめ
調べておいたＡＭＣ（アミノメチルクマン）濃度と蛍光
強度の関係から合成基質が分解して生じるＡＭＣ量を算
出し、トリプシン様酵素の活性とした。キモトリプシン
様酵素の活性は４０５ｎｍの波長の吸収を測定し、あら
かじめ調べておいたパラニトロアニリン（ｐＮＡ）濃度
と吸収強度の関係から合成基質が分解して生じるｐＮＡ
量を算出し、キモトリプシン様酵素の活性とした。結果
を図１に示す。
角層におけるトリプシン様酵素活性およびキモトリプシ
ン様酵素活性 魚鱗癬患者１２名と健常人２４名の下体から粘着テープ
により角層を剥離した。テープをトルエンで洗浄し、角
層を粘着テープから回収した。１ｍｇの角層をｐＨ８の
緩衝液（トリス緩衝液など）０.９ｍｌと１ｍＭのトリ
プシン様酵素に対する合成基質（Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅ
ｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡなど）と１ｍＭのキモトリプシンに
対する合成基質（Ｍｅｏ−Ｓｕｃ−Ｔｙｒ−ｐＮＡな
ど）をそれぞれ０.１ｍｌ加え、３７℃で２時間反応さ
せた。反応後、トリプシン様酵素の活性は蛍光強度（Ｅ
ｘ／Ｅｍ＝３８０／４６０ｎｍ）を測定し、あらかじめ
調べておいたＡＭＣ（アミノメチルクマン）濃度と蛍光
強度の関係から合成基質が分解して生じるＡＭＣ量を算
出し、トリプシン様酵素の活性とした。キモトリプシン
様酵素の活性は４０５ｎｍの波長の吸収を測定し、あら
かじめ調べておいたパラニトロアニリン（ｐＮＡ）濃度
と吸収強度の関係から合成基質が分解して生じるｐＮＡ
量を算出し、キモトリプシン様酵素の活性とした。結果
を図１に示す。
【００２１】魚鱗癬患者ではキモトリプシン、トリプシ
ンいずれの酵素活性も正常人に比べて有意に低い結果が
得られた。この結果は魚鱗癬患者においては両酵素の活
性が低下し、そのためデスモソームの分解が不全となり
魚鱗癬に特徴的な角層の肥厚を招いたと考察できる。
ンいずれの酵素活性も正常人に比べて有意に低い結果が
得られた。この結果は魚鱗癬患者においては両酵素の活
性が低下し、そのためデスモソームの分解が不全となり
魚鱗癬に特徴的な角層の肥厚を招いたと考察できる。
【００２２】例２：角層水分量とデスモソーム蛋白質の
分解 種々の飽和塩溶液により湿度をコントロールした容器の
なかに防腐防黴溶液（例えばカナマイシン６０μｌ／ｍ
ｌ、０.５％ＮａＮ3）に３０秒浸した角層２ｍｇを入
れ、３７℃の条件で一定期間（１日から２週間）放置し
た。その後角層を取出し、カールフィッシャー水分測定
装置により角層中の水分量を測定した。さらに角層を９
Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、１％メルカプトエタノールを含む
０.１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９）０.５ｍｌにて３７℃、
１５時間抽出し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩
衝液（２倍濃度のＬａｅｍｍｌｉ溶液）０.７ｍｌを加
え１５分間加熱した。この溶液１０μｌをとり７.５％
濃度のゲルにて電気泳動を行なった。泳動後、ＰＶＤＦ
に転写し、抗デスモグレイン抗体および抗デスモコリン
抗体を用いた染色を行いデスモソーム蛋白質の多寡を判
定した。結果を図２に示す。
分解 種々の飽和塩溶液により湿度をコントロールした容器の
なかに防腐防黴溶液（例えばカナマイシン６０μｌ／ｍ
ｌ、０.５％ＮａＮ3）に３０秒浸した角層２ｍｇを入
れ、３７℃の条件で一定期間（１日から２週間）放置し
た。その後角層を取出し、カールフィッシャー水分測定
装置により角層中の水分量を測定した。さらに角層を９
Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、１％メルカプトエタノールを含む
０.１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９）０.５ｍｌにて３７℃、
１５時間抽出し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩
衝液（２倍濃度のＬａｅｍｍｌｉ溶液）０.７ｍｌを加
え１５分間加熱した。この溶液１０μｌをとり７.５％
濃度のゲルにて電気泳動を行なった。泳動後、ＰＶＤＦ
に転写し、抗デスモグレイン抗体および抗デスモコリン
抗体を用いた染色を行いデスモソーム蛋白質の多寡を判
定した。結果を図２に示す。
【００２３】角層中の水分量が少なくなるとデスモグレ
イン、デスモコリンともに残存率が高くなることがわか
る。このことは角層の水分量が減少することによりトリ
プシン様酵素、キモトリプシン様酵素が不活性となりデ
スモソームの分解が不十分となることを示している。そ
の結果、角層表面からの角層細胞の剥離が不全となり肌
荒れ状の皮膚表面を呈することが示された。
イン、デスモコリンともに残存率が高くなることがわか
る。このことは角層の水分量が減少することによりトリ
プシン様酵素、キモトリプシン様酵素が不活性となりデ
スモソームの分解が不十分となることを示している。そ
の結果、角層表面からの角層細胞の剥離が不全となり肌
荒れ状の皮膚表面を呈することが示された。
【００２４】例３：各種薬剤のデスモソーム蛋白質の分
解作用 例２で示した防腐防黴処理を施した角層の表面をグリセ
リン、プロピレングリコール、ＥＰＣ−Ｋ等の保湿剤、
リジン、トリメチルグリシン等のアミノ酸やアミノ酸誘
導体、乳酸やグリコール酸等のオキシ酸、トレハロース
等の糖類、ＥＤＴＡ等のキレート剤を０.１〜３０％の
濃度で角層の両面に１〜３０μｌ塗布した。この角層を
例２で示したデスモソームの分解が不十分となる角層水
分量３０％以下の条件下に３７℃で１週間放置した。そ
の後、例２で示した方法によりデスモソームの多寡を評
価した。結果を図３に示す。
解作用 例２で示した防腐防黴処理を施した角層の表面をグリセ
リン、プロピレングリコール、ＥＰＣ−Ｋ等の保湿剤、
リジン、トリメチルグリシン等のアミノ酸やアミノ酸誘
導体、乳酸やグリコール酸等のオキシ酸、トレハロース
等の糖類、ＥＤＴＡ等のキレート剤を０.１〜３０％の
濃度で角層の両面に１〜３０μｌ塗布した。この角層を
例２で示したデスモソームの分解が不十分となる角層水
分量３０％以下の条件下に３７℃で１週間放置した。そ
の後、例２で示した方法によりデスモソームの多寡を評
価した。結果を図３に示す。
【００２５】グリセリン、ＥＰＣ−Ｋ、トリメチルグリ
シン、トレハロース、乳酸、ＥＤＴＡ−２Ｎａ等で処理
した角層のデスモソームは処理していない角層に比べて
大幅に減少しておりこれらの薬剤により角層中の酵素が
活性化し角層の剥離が正常になることが示された。
シン、トレハロース、乳酸、ＥＤＴＡ−２Ｎａ等で処理
した角層のデスモソームは処理していない角層に比べて
大幅に減少しておりこれらの薬剤により角層中の酵素が
活性化し角層の剥離が正常になることが示された。
【００２６】
【発明の効果】本発明によれば、角層中のトリプシン様
酵素活性とキモトリプシン様酵素活性を評価して、角層
中のデスモソームの機能を検査する方法が提供できる。
この検査方法は、具体的に、肌荒れ防止剤のスクリーニ
ングや肌荒れの程度を検査する方法に使用できる。
酵素活性とキモトリプシン様酵素活性を評価して、角層
中のデスモソームの機能を検査する方法が提供できる。
この検査方法は、具体的に、肌荒れ防止剤のスクリーニ
ングや肌荒れの程度を検査する方法に使用できる。
【図１】健常人および魚鱗癬患者に由来する角層におけ
るトリプシン様酵素活性およびキモトリプシン様酵素活
性の測定結果を示すグラフである。
るトリプシン様酵素活性およびキモトリプシン様酵素活
性の測定結果を示すグラフである。
【図２】角層の水分量とデスモソーム蛋白質の分解の相
関性を示すグラフである。グラフ中、残存率は処理前の
角層中のデスモグレイン、デスモコリンとの比率を表
す。
関性を示すグラフである。グラフ中、残存率は処理前の
角層中のデスモグレイン、デスモコリンとの比率を表
す。
【図３】各種薬剤によるデスモソーム蛋白質の分解作用
に対する影響を示すグラフである。
に対する影響を示すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 野村 淳子
神奈川県横浜市港北区新羽町1050 株式
会社資生堂第一リサーチセンター内
(56)参考文献 Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅ
ｓ．，Ｖｏｌ．286，ｐ249−253
香油会誌 Ｖｏｌ．15 Ｎｏ．４
（1991）ｐ225−236
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/48 - 33/98
ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (3)
- 【請求項１】 （ａ） 健常人由来の角層試料を用意
し、 （ｂ） 該角層試料に被検物質を適用し、 （ｃ） 該被検物質を適用しない場合には、該角層試料
におけるデスモソームの分解が不十分になる角層中の水
分含量が３０％以下となる環境下に前記（ｂ）で得られ
る角層試料を適当な時間放置し、 （ｄ） 次いで（ｃ）由来の角層試料中におけるデスモ
グレイン及びデスモコリンからなる群より選ばれるデス
モソーム蛋白質の量を該蛋白質に対する抗体を用いて測
定し、 （ｅ） 該被検物質を適用することにより、該被検物質
を適用しない場合に比べてデスモソーム蛋白質の量が少
なくなることを該被検物質が肌荒れ防止作用を有する指
標とする、 ことを特徴とする肌荒れ防止剤のスクリーニング方法。 - 【請求項２】 （ｃ）に記載の環境が３７℃の温度下で
ある請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 デスモソーム蛋白質がデスモグレインで
ある請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22904194A JP3453871B2 (ja) | 1994-08-31 | 1994-08-31 | デスモソーム機能の評価方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22904194A JP3453871B2 (ja) | 1994-08-31 | 1994-08-31 | デスモソーム機能の評価方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0868791A JPH0868791A (ja) | 1996-03-12 |
| JP3453871B2 true JP3453871B2 (ja) | 2003-10-06 |
Family
ID=16885821
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22904194A Expired - Fee Related JP3453871B2 (ja) | 1994-08-31 | 1994-08-31 | デスモソーム機能の評価方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3453871B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU754471B2 (en) * | 1998-08-18 | 2002-11-14 | Dermtech International | Method for detection of biological factors in epidermis |
| KR100624434B1 (ko) | 2004-09-07 | 2006-09-19 | 삼성전자주식회사 | 저항성 팁을 구비한 반도체 탐침 및 그 제조방법 |
| JP4805794B2 (ja) * | 2005-12-28 | 2011-11-02 | 株式会社コーセー | 角層蛋白質の検出方法並びにこれを利用する表皮ターンオーバーの評価方法及び肌状態評価方法 |
| JP2015226493A (ja) * | 2014-05-30 | 2015-12-17 | ポーラ化成工業株式会社 | 目元の肌状態の推定方法 |
| JP6863548B2 (ja) * | 2015-08-11 | 2021-04-21 | ポーラ化成工業株式会社 | 肌状態改善用化粧料基剤及びそのスクリーニング方法 |
| CN113874704A (zh) * | 2019-05-23 | 2021-12-31 | 宝丽化学工业有限公司 | 一种影响角质层细胞间粘附蛋白质增减的组分的筛选方法 |
-
1994
- 1994-08-31 JP JP22904194A patent/JP3453871B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２８６，ｐ２４９−２５３ |
| 香油会誌 Ｖｏｌ．１５ Ｎｏ．４（１９９１）ｐ２２５−２３６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0868791A (ja) | 1996-03-12 |
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