CN108159086A - 一种螺旋藻生物转化天然纳米硒及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种螺旋藻生物转化纳米硒及其制备方法与应用，属于纳米硒营养制剂和功能性食品制备技术领域。本发明是率先从富硒螺旋藻中通过高硒胁迫诱导制备出生物转化纳米硒(BTSNP)。制备出的红色单质硒具有纳米尺度，是平均粒径为160±50nm的球形颗粒，硒含量不低于74％。并在动物实验模型中进一步证明BTSNP对砷毒性诱导的肝细胞氧化损伤和肝纤维化具有拮抗和治疗作用。该BTSNP主要适用于辅助治疗肝炎、脂肪肝及各种环境污染因素诱发的肝功能损伤和其它相关疾病的辅助预防治疗。将该本发明转化成保肝护肝功能食品添加剂或保健品制剂，将产生较大规模的社会经济效益。

Description

一种螺旋藻生物转化天然纳米硒及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于纳米硒营养制剂和功能性食品制备技术领域，特别涉及一种新的螺旋藻生物转化天然纳米硒及其制备方法与拮抗肝损伤的应用。
背景技术
病毒性肝炎、酒精性肝炎、脂肪肝、肝吸虫病以及环境污染物诱发的肝损伤等危害严重。肝细胞氧化损伤和炎症反应触发的肝组织结构与功能异常，以及继发慢性肝纤维化是所有慢性肝病共有的病理生理机制，而且是最终造成肝硬化和原发性肝癌的最主要原因。因此，慢性肝病从本质上讲属炎症性疾病，尚缺乏根治手段。临床治疗视不同病因在病患急性发作期以支持治疗为主，着重控制症状促进病情恢复，防止病情发展。针对慢性转变期后，则以饮食调理，合理选择药物辅助治疗，以保肝护肝改善肝功能恢复原则。目前有大量保肝护肝药，主要用于保护肝脏功能、促进肝细胞再生、增强肝脏解毒能力、调节代谢和能量供应。如通常使用的肝维乐、护肝片和复方益肝灵等，通常含有还原型谷胱甘肽、抗坏血酸、肌酐、辅酶Q、ATP和联苯双酯等有效成分。它们实际是各种肝病的通用药物，主要从抗氧化、调节能量代谢、解毒和降低转氨酶等方面起辅助治疗作用。
人体必需微量元素硒(selenium，Se)在体内以硒代半胱氨酸(selenocysteine，Se-Cys)形式，通过构成数十种重要硒蛋白(selenoprotein)或硒酶(selenoenzyme)的功能活性中心而发挥作用。缺硒与肝坏死病、肝炎感染及预后、肝纤维化和肝癌的发生均有明显关系。已经确认的人体25种硒蛋白对机体调节氧化还原平衡、激素和代谢稳态、先天和获得性免疫应答、炎症反应均至关重要，从而参与肿瘤发生、心血管疾病和病毒感染等众多疾病病理生理过程。硒的抗氧化作用突出表现在谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)家族、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)家族以及含有-CXXU-基序硒蛋白成员的活性Se-Cys功能上。另外，硒蛋白P、内质网15KD硒蛋白和细胞核硒蛋白H也对细胞内微区氧化还原平衡起重要调节作用。我们的研究结果还表明，硒蛋白K通过调节钙流信号在机体天然免疫炎症调控中起特定作用。因此，合理利用硒的营养，研发新的活性硒形态，增强硒蛋白质的功能，将是拮抗和治疗慢性肝病的合理策略。
螺旋藻(Spirulina platensis，SP)被誉为“21世纪最佳食品”，富含优质蛋白，无任何毒副作用。我们长期致力于生物体活性硒形态的鉴定、作用机制和应用开发研究，发现螺旋藻具有富集和转化无机硒产生活性含硒蛋白的能力，并已成功研制富硒螺旋藻(Seenriched Spirulina platensis，Se-SP)及活性含硒藻蓝蛋白多肽，证明富硒螺旋藻是优良的天然有机硒营养源。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种螺旋藻生物转化天然纳米硒的制备方法。本发明在富硒螺旋藻养殖技术基础上，以高密度活体螺旋藻细胞作为纳米硒生物转化反应器，发明高效大量制备螺旋藻生物转化天然纳米硒BTSNP的技术方法。在富硒螺旋藻的培养过程中我们首次鉴定和表征了螺旋藻生物转化天然纳米硒(BTSNP)形态，初步证明BTSNP是一种新型生物活性硒源，具有药物载运、缓释和免疫细胞亲嗜等良好特性，显示出较好的抗氧化和抗炎症效应。
本发明的另一目的在于批量提供所述的螺旋藻生物转化天然纳米硒BTSNP。一方面解决富硒螺旋藻培养时添加的无机硒元素在培养液中大量流失问题及潜在环境危害风险；另一方面通过开展BTSNP在功能食品、营养保健品、复方药物成分或候选药物等方面的转化应用，提升富硒螺旋藻产业创新性和附加值。
本发明的再一目的在于提供所述的螺旋藻生物转化天然纳米硒BTSNP拮抗肝损伤的应用。利用常见环境毒物和致癌剂砷暴露诱导建立的小鼠肝损伤模型，首次发现口服补充BTSNP对模型小鼠急、慢性肝损伤具有保护效应，包括下调转氨酶活性、脂质过氧化、内质网应激、肝细胞凋亡等指标，促进肝再生抑制肝组织损伤及纤维化病理程度。同时系统检测BTSNP对实验小鼠血液生化和炎症指标系统性病理变化的调治作用，为BTSNP辅助预防治疗肝炎、脂肪肝和污染物致肝毒害等肝病提供科学实验依据。
本发明针对环境毒物暴露所致肝细胞氧化损伤及肝炎症性纤维化，研发拮抗肝氧化损伤及肝纤维化的新型纳米硒生物制品，对保肝护肝具有普遍适用性。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种螺旋藻生物转化天然纳米硒，简称BTSNP，其中硒的含量不低于74％，稳定掺入有铁、锰、锌和钴营养元素，并富载有螺旋藻多糖；该纳米硒为球形颗粒，平均粒径为160±50nm。
本发明还提供一种螺旋藻生物转化天然纳米硒的制备方法，包括富硒螺旋藻(Se-SP)培养、过滤浓缩Se-SP活体细胞、用高硒胁迫诱导活体Se-SP细胞生物转化产生BTSNP、过滤透析制取BTSNP等步骤；具体包括以下步骤：
1)富硒螺旋藻Se-SP培养：添加亚硒酸钠溶液，最终硒浓度为200±20mg/L，4000±1000lux，光照培养周期9～12天，生产获得Se-SP活细胞悬液，藻细胞密度不低于2g/L。
2)Se-SP高密度培养：过滤浓缩5倍获得Se-SP高密度活体藻细胞悬液，藻细胞密度不低于10g/L，添加亚硒酸钠溶液，最终硒浓度为0.8±0.1g/L。
3)BTSNP生物转化：高密度活体Se-SP细胞用8000～10000lux光照培养诱导10～12h，生物转化产生BTSNP，为红色胶体溶液，高密度活体Se-SP细胞转化BTSNP每次产量不低于0.15g/L；一批高密度藻细胞可作为生物反应器用富硒培养液重悬最多进行5次生物转化制取BTSNP，Se-SP细胞最大BTSNP产量为0.75g/g。
4)过滤制取BTSNP胶体溶液，合并多次制取的BTSNP滤液，透析过夜后即得螺旋藻生物转化天然纳米硒BTSNP。
本发明还提供所述的螺旋藻生物转化天然纳米硒BTSNP是具有拮抗肝氧化损伤及肝纤维化活性的新型生物功能制品，作为保肝护肝功能性食品、营养保健品、复方药物成分或候选药物等应用开发。该纳米生物制品主要适用于辅助治疗肝炎、脂肪肝及各种环境污染因素诱发的肝功能损伤和其它相关疾病的辅助预防治疗。
BTSNP对小鼠急/慢性肝损伤的抗氧化、抗炎症和抗纤维化作用：利用砷诱导建立小鼠肝损伤模型，研究口服补充BTSNP后对模型小鼠急、慢性肝损伤的保护效应，检测其对转氨酶活性、脂质过氧化、内质网应激、肝细胞凋亡等肝功能指标的影响，组织病理分析肝细胞凋亡和纤维化程度。同时还监测BTSNP对实验小鼠血液炎症指标的调节作用。结果发现补充BTSNP在硒0.1～0.4mg/kg体重剂量水平对小鼠急/慢性肝损伤具有明显抗氧化、抗炎症和抗纤维化作用，并可明显降低小鼠血浆中IL-6和TNF-α等炎症因子的水平。
目前技术研发进度：鉴于硒是人体必需微量营养元素，螺旋藻是一种营养丰富全面均衡的健康食品，本发明基于高密度活体螺旋藻细胞作为生物反应器大量制备的生物转化纳米硒形态安全无毒，能够广泛开展BTSNP在功能食品、营养保健品、复方药物成分或候选药物等方面的转化应用，提升富硒螺旋藻产业创新性和附加值，其成药性正在进行评价之中。同时，该发明技术可解决富硒螺旋藻培养时添加的过量硒元素随废弃培养液而大量流失的问题及潜在环境危害风险。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
(1)利用高密度螺旋藻活体细胞高效大量制备生物转化纳米硒(BTSNP)。在本课题组已建立的高效富硒螺旋藻转化培养技术基础上，利用高硒胁迫诱导、过滤透析分离，实现活体藻细胞生物转化产生BTSNP，对添加到富硒培养液中的硒实现纳米转化率大于98％，大大减少废弃培养基中硒元素残留。研制的新型BTSNP稳定掺入有铁、锰、锌和钴营养元素，并富载有螺旋藻胞外多糖。
(2)利用小鼠急/慢性肝损伤模型发现BTSNP对肝细胞的抗氧化、抗炎症和抗纤维化疗效。在小鼠急、慢性肝损伤模型中，口服补充BTSNP在硒0.1～0.4mg/kg bw剂量水平对小鼠肝组织细胞具有明显抗氧化、抗炎症和抗纤维化作用，显著降低小鼠血浆中IL-6和TNF-α等炎症因子的水平。提示BTSNP适用于保肝抗肝，也可用于其它炎症相关疾病的辅助预防治疗。
(3)本发明以螺旋藻作为纳米硒生物转化反应器，进行高效大量制备BTSNP，并在动物实验模型中进一步证明BTSNP对砷毒性诱导的肝细胞氧化损伤和肝纤维化具有拮抗和治疗作用。将该本发明转化成保肝护肝功能食品添加剂或保健品制剂，将产生较大规模的社会经济效益。
附图说明
图1是BTSNP的SEM图与EDX能谱分析图。
图2是BTSNP对砷诱导的小鼠肝损伤的干预作用(HE染色，100倍)；其中，(A)空白对照组；(B)三氧化二砷(ATO)致肝损伤模型对照组；(C)BTSNP药物对照组；(D)BTSNP低剂量(L)干预组；(E)BTSNP高剂量(H)干预组；(F)阳性药物(Na2SeO3)干预对照组(白色箭头所示为炎症细胞浸润，灰色箭头所示为细胞空泡化)。
图3是BTSNP对小鼠抗氧化损伤作用的影响；其中，(A)～(C)小鼠肝脏中GSH、GSH-Px及GST水平的变化；(D)小鼠血清中GSH水平的变化。
图4是BTSNP对小鼠脂质过氧化作用的影响；其中，(A)小鼠血液中SOD水平的变化；(B)小鼠肝脏中NO水平的变化。
图5是BTSNP对砷诱导的小鼠肝损伤的干预作用(免疫组化观察iNOS的表达，200倍)；其中，(A)空白对照组；(B)三氧化二砷(ATO)致肝损伤模型对照组；(C)BTSNP药物对照组；(D)BTSNP低剂量(L)干预组；(E)BTSNP高剂量(H)干预组；(F)阳性药物(Na2SeO3)干预对照组。
图6是BTSNP对小鼠炎症因子水平的影响；其中(A)小鼠血浆中IL-6水平的变化；(B)小鼠血浆中TNF-α水平的变化。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1)螺旋藻生物转化纳米硒(BTSNP)分离制备(小试)：过滤浓缩富硒螺旋藻使之成为高密度藻细胞悬液(该富硒螺旋藻的制备在文献“钝顶螺旋藻富集转化硒及硒在藻体中的分布.植物生理学通讯,2001,37:12-14”中公开)，在原有培养液基础上添加亚硒酸钠(最终硒浓度为0.8±0.1g/L)，8000～10000lux高光照旋转培养诱导10～12h至大量纳米红硒生成，过滤后藻细胞用富硒培养液重悬，进行第2次BTSNP生物转化，一批高密度藻细胞可作为生物反应器如此反复进行5轮次BTSNP生物转化。合并含有BTSNP的过滤液，透析后即获得红色BTSNP。该方法对培养液中硒的纳米转化率大于90％，掺入有铁、锰、锌和钴营养元素，富载有螺旋藻胞外多糖。BTSNP中硒的含量大于74％(包括74％)。BTSNP的SEM图与EDX能谱分析图，如图1所示，从图1可知，该BTSNP为球形颗粒，平均粒径为160±50nm。
2)BTSNP对肝细胞的抗氧化、抗炎症和抗纤维化疗效：小鼠分组实验，在暨南大学医学院国家许可动物实验室进行。每批取雄性C57BL/6小鼠72只，随机分为6组，每组6只，分别为(1)空白对照组(Control)；(2)BTSNP药物对照组(BTSNP)；(3)三氧化二砷(ATO)致肝损伤模型组(As)；(4)BTSNP低剂量保护组(As+BTSNP(L))；(5)BTSNP高剂量保护组(As+BTSNP(H))；(6)阳性药物(亚硒酸钠，Na2SeO3)干预对照组(As+Na2SeO3)。分笼正常饲喂1周后，(3)～(6)组小鼠灌胃喂服ATO诱导急性肝损伤，其中(4)～(5)施以不同剂量BTSNP(按给硒量分别为0.1mg/kg体重、0.4mg/kg体重)进行预保护3天。每天对各组小鼠体重和其它症状进行详细记录。实验结束处死小鼠，取各组小鼠血液、肝组织，进行转氨酶活性、脂质过氧化、内质网应激、肝细胞凋亡等肝功能指标的检测，组织病理分析肝细胞凋亡和纤维化程度，还监测血液炎症指标。结果如图2～6所示，结果发现，口服补充BTSNP在硒0.1～0.4ppm剂量水平对小鼠肝组织细胞具有明显抗氧化、抗炎症和抗纤维化作用，显著降低小鼠血浆中IL-6和TNF-α等炎症因子的水平。
3)BTSNP转化应用预测：近期将该发明专利转化成保肝护肝功能食品或保健品制剂，将产生较大规模的社会经济效益。按我国现有2亿多肝功能受损人群估算，以1‰市场占有率计，若每人每天使用该制剂20元，使用疗程3个月，单一产品可创造3.6亿产值，按20％计利税，年利税可达7200万元。同时还将带动富硒螺旋藻养殖、精细加工、蛋白质工程及附属产品产业链的发展。对患者来说，使用方便，安全无毒，可减轻患病痛苦，提高生活质量，经济负担较少。远期具有研制成药的巨大潜力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种螺旋藻生物转化天然纳米硒，其特征在于：所述的纳米硒中硒的含量不低于74％，稳定掺入有铁、锰、锌和钴营养元素，并富载有螺旋藻多糖。
2.根据权利要求1所述的螺旋藻生物转化天然纳米硒，其特征在于：
所述的纳米硒为球形颗粒，平均粒径为160±50nm。
3.权利要求1或2所述的螺旋藻生物转化天然纳米硒的制备方法，其特征在于：通过富硒螺旋藻Se-SP培养、过滤浓缩Se-SP活体细胞、用高硒胁迫诱导活体Se-SP细胞生物转化产生BTSNP、过滤透析制得螺旋藻生物转化天然纳米硒BTSNP。
4.根据权利要求3所述的螺旋藻生物转化天然纳米硒的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：
1)富硒螺旋藻Se-SP培养：添加亚硒酸钠溶液，最终硒浓度为200±20mg/L，4000±1000lux光照培养周期9～12天，生产获得Se-SP活细胞悬液，藻细胞密度不低于2g/L；
2)Se-SP高密度培养：过滤浓缩5倍获得Se-SP高密度活体藻细胞悬液，藻细胞密度不低于10g/L，添加亚硒酸钠溶液，最终硒浓度为0.8±0.1g/L；
3)BTSNP生物转化：高密度活体Se-SP细胞用8000～10000lux培养诱导10～12h生物转化产生BTSNP，为红色胶体溶液，高密度活体Se-SP细胞转化BTSNP每次产量不低于0.15g/L；一批高密度藻细胞作为生物反应器用富硒培养液重悬最多进行5次生物转化制取BTSNP，Se-SP细胞最大BTSNP产量为0.75g/g；
4)过滤制取BTSNP胶体溶液，合并多次制取的BTSNP滤液，透析过夜后即得螺旋藻生物转化天然纳米硒BTSNP。
5.权利要求1或2所述的螺旋藻生物转化天然纳米硒的应用，其特征在于：
所述的螺旋藻生物转化天然纳米硒作为生物功能制品的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：
所述的生物功能制品为功能性食品、营养保健品、复方药物成分或候选药物。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：
所述的生物功能制品适用于辅助治疗肝炎、脂肪肝及各种环境污染因素诱发的肝功能损伤和与其相关疾病的辅助预防治疗。
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