CN115887677A - 一种蛋白质仿生胶囊的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白质仿生胶囊的制备方法和应用。涉及药物释放控制技术领域。配制BSA蛋白质的水溶液，加入正丁醇，超声处理，静置，离心收集蛋白质胶囊组装体溶液；加入戊二醛溶液，反应后，依次用乙醇/水溶液、乙醇/水溶液、乙醇/水溶液和超纯水透析，得到蛋白质胶囊。本发明制备出大量表面光滑软性膜组成的蛋白质胶囊；含有大量的C、N、O、S元素；交联后的蛋白质胶囊在水相的稳定性能优异；通过简单地改变BSA浓度大小就可以实现调控蛋白质胶囊的形貌结构的目的；制备的蛋白质胶囊能够封装水溶性分子，并且能够实现水溶性分子的缓慢释放，在药物控制释放领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及药物释放控制技术领域，更具体的说是涉及一种蛋白质仿生胶囊的制备方法和应用。
背景技术
生物微室是一类结构完整的膜和生物分子组织，其密闭的空腔结构可以为生物体进行复杂代谢反应提供必要的场所。近些年，基于细胞空腔结构的仿生材料引起了人们的广泛关注。其中，仿生胶囊是一种典型的中空结构微胶囊，具有形貌小、空心、通透性可设计、可装载药物且能提供隔离内部和外部环境的物理屏障等优点，被广泛应用于药物递送体系和纳米反应器等。通过将不同的构筑单元组装成不同功能的仿生细胞模型，可以构筑出各种多功能化的仿生胶囊，其中比较典型的有脂质体胶囊、聚合物胶囊、树枝状大分子胶囊和胶体囊泡。如何有效地提高仿生胶囊的生物相容性、生物降解性以及膜渗透能力，增加膜界面的物质传输效率等一直都是制备仿生胶囊材料面临的关键问题。
蛋白质分子因其固有的生物相容性、生物可降解性和多功能性，成为构建仿生胶囊最有吸引力的构筑基元之一。众所周知，蛋白质具有确定的结构和功能，该结构是通过将多肽链卷曲和折叠各种二级结构而形成的高级结构。研究发现，通过多种条件刺激如pH，离子强度和温度等能够实现蛋白质结构的可逆的折叠与解折叠，从而使其具有了多态变化的特征。同时，控制蛋白质-蛋白质间相互作用的强度、数量和方向也可以精确调控蛋白质的自组装行为。以生物相容性好，稳定性高的蛋白质作为构筑基元制备仿生胶囊，不但可以封装各类型的小分子荧光染料、药物分子、蛋白质、酶和各种无机纳米粒子等，而且蛋白质仿生膜还能够模拟细胞的膜透性，物质传输，以及膜介导的界面酶催化反应等。因此，设计并合成新型的蛋白质胶囊显得尤为重要。
近些年来，界面自组装的兴起为构建大尺寸的仿生组装体提供了有利条件，由于其操作简单和高效受到了科学家们的广泛关注。界面自组装是驱动蛋白质构筑基元自发组装的重要方式，将蛋白质组装作为构筑基元能够构筑出各种新颖的功能性蛋白质组装体，为开发功能性仿生材料提供了新的方向。
但是，基于界面自组装方法构建蛋白质组装体通常需要进行精细的设计和精确的控制。例如，现有技术中存在将带负电的BSA蛋白质与带正电的十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)通过静电相互作用形成复合物，再通过界面自组装方法将该复合物组装为超级微胶囊。往往需要预先对蛋白质结构进行修饰与改性，使得制备过程较为繁琐且工艺成本较高，开发工艺流程简单且适用于大规模生产的蛋白质胶囊制备方法具有极大的应用价值。
因此，如何提供一种蛋白质仿生胶囊的制备方法和应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种蛋白质仿生胶囊的制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种蛋白质仿生胶囊的制备方法，包括以下步骤：
(1)配制BSA蛋白质的水溶液，加入正丁醇，超声处理，静置，离心收集蛋白质胶囊组装体溶液；
(2)向蛋白质胶囊组装体溶液中加入戊二醛溶液，反应后，依次用乙醇/水溶液、乙醇/水溶液、乙醇/水溶液和超纯水透析，得到蛋白质胶囊。
进一步的，蛋白质胶囊组装体溶液为乳白色的。
有益效果在于：步骤(2)加入戊二醛溶液实现对蛋白质分子进行交联。
优选的：步骤(1)BSA蛋白质的水溶液的浓度：5～30mg/mL；蛋白质溶液和正丁醇的体积比：100μL：0.9～2.0mL；超声处理的时间：10～15s，静置的时间：10～30min；离心：转速2000rpm，时间2min。
优选的：步骤(2)蛋白质胶囊组装体溶液和戊二醛溶液的体积比50：1～2，戊二醛溶液质量分数为25％；反应的时间：4～6h；乙醇/水溶液、乙醇/水溶液、乙醇/水溶液：体积比为50％的乙醇/水溶液、30％乙醇/水溶液、10％乙醇/水溶液；透析的时间：2～3h。
有益效果：透析以除去残留的正丁醇油相。
优选的：还包括步骤(3)，将步骤(2)得到的蛋白质胶囊按照1～5mg/mL的浓度分散到水溶液中。
本发明还提供了上述任一的制备方法制备的蛋白质仿生胶囊。
本发明还提供了上述的蛋白质仿生胶囊在制备制备可控制释放药物中的应用。
优选的：药物为葡萄糖。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种蛋白质仿生胶囊的制备方法和应用，取得的技术效果为：
通过水-正丁醇反向乳液技术可以快速制备出大量表面光滑软性膜组成的蛋白质胶囊；蛋白质胶囊含有大量的C、N、O、S元素；
交联后的蛋白质胶囊在水相的稳定性能优异，为其后期作为药物递送载体及纳米反应器提供了基础；
通过简单地改变BSA浓度大小就可以实现调控蛋白质胶囊的形貌结构的目的；
制备的蛋白质胶囊能够封装水溶性分子，并且能够实现水溶性分子的缓慢释放，在药物控制释放领域具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的实验流程示意图。
图2附图为本发明提供的蛋白质胶囊的扫描电镜图。
图3附图为本发明提供的蛋白质胶囊的元素含量分析图，其中，a：蛋白质胶囊的透射电镜图；b：蛋白质胶囊的C、N、O和S元素能谱分析结果图。
图4附图为本发明提供的蛋白质胶囊的扫描电镜图，其中，a：在水中放置7天的蛋白质胶囊的扫描电镜图；b：在水中放置30天的蛋白质胶囊的扫描电镜图。
图5附图为本发明提供的蛋白质胶囊的扫描电镜图，浓度分别为5，10，20和30mg/mL BSA蛋白质组装得到的蛋白质胶囊的扫描电镜图。
图6附图为本发明提供的不同时间条件下蛋白质胶囊的葡萄糖的释放率图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种蛋白质仿生胶囊的制备方法和应用。
实施例1
一种蛋白质仿生胶囊的制备方法，包括以下步骤(实验流程示意参见图1)：
(1)配制浓度为20mg/Ml
(2)BSA蛋白质的水溶液，充分混合均匀后，用液枪取100μL上述蛋白质溶液，小心地加入到含有0.9mL正丁醇的离心管中，超声处理10s，最后静置30min便可离心管底部收集到乳白色的蛋白质胶囊组装体。
其中，为了表征蛋白质胶囊的形貌结构，取10μL含有蛋白质胶囊的正丁醇溶液滴加到干净的硅片基底表面，室温晾干后，利用扫描电子显微镜(SEM)对其微观结构表征。
结果分析：
采用扫描电子显微镜对蛋白质胶囊的微观结构进行表征。由图2a结果可以清晰地看到，采用水-正丁醇反向乳液技术能够在10s内快速地制备出大量直径为几个微米的球形蛋白质胶囊。当将蛋白质水溶加入到正定醇溶液中，二者存在明显的相界面，蛋白质分子被束缚在水相中无法发生组装。借助超声乳化处理，包含蛋白质分子的水相在正丁醇相中形成微液滴，随后水相的水分子快速自发地扩散到正丁醇相中。在此过程中，蛋白质分子的两亲特性驱动自身向油水界面出迁移，最后在两相界面出发生界面组装，从而得到大量的巨型蛋白质胶囊。图2b和2c是蛋白质胶囊高倍的扫描电镜图片，可以看到蛋白质胶囊由表面光滑的软性膜组成。
上述研究结果说明，通过水-正丁醇反向乳液技术可以快速制备出大量表面光滑软性膜组成的蛋白质胶囊。
采用透射电子显微镜和EDS能谱仪联用对蛋白质胶囊的元素含量进行分析。图3a为单个蛋白质胶囊的透射电子显微镜图片，也进一步证明了组装得到的蛋白质胶囊为球形。接下来，利用EDS能谱仪对该蛋白质胶囊采集C、N、O、S元素信号，如图3b所示。
由上述结果可以看出，EDS能谱图上出现明显的C、N、O、S信号峰，证明了蛋白质胶囊含有大量的C、N、O、S元素。
(2)为了实现蛋白质胶囊能够由油相(正丁醇)到水相(纯水)的转移，得到在水相中结构稳定的蛋白质胶囊，利用戊二醛对蛋白质胶囊进行交联，具体操作如下：
向步骤(1)制备收集到的乳白色的蛋白质胶囊组装体溶液中加入20μL质量分数为25％的戊二醛加入到上述离心管中，用手轻轻摇晃30s。静置反应4h后，依次用体积比为50％乙醇/水溶液、30％乙醇/水溶液、10％乙醇/水溶液和超纯水透析2h，以除去残留的正丁醇，即可得到结构稳定的蛋白质胶囊。最后，将其按照1mg/mL的浓度分散到水溶液中，分别室温放置7天和30天，利用扫描电子显微镜对蛋白质胶囊的结构稳定性进行探究。
结果分析：
采用扫描电子显微镜对在水相中放置不同天数的蛋白质胶囊形貌结构进行表征，结果如图4所示。可以清晰地看出，当将交联后的蛋白质胶囊分别置于水中7天和30天后，蛋白质胶囊在水相中均能维持其稳定的内部结构。这是因为戊二醛可以与BSA蛋白质分子表面游离的伯胺基团发生反应，从而通过化学交联的方式显著提高蛋白质胶囊的结构稳定性。上述研究结果表明，交联后的蛋白质胶囊在水相的稳定性能优异，为其后期作为药物递送载体及纳米反应器提供了基础。
实施例2
一种蛋白质仿生胶囊的制备方法，包括以下步骤：
(1)配制浓度为5mg/mL BSA蛋白质的水溶液，用液枪取100μL上述蛋白质溶液，小心地加入到含有1.5mL正丁醇的离心管中，超声处理13s，最后静置20min便可离心管底部收集到乳白色的蛋白质胶囊组装体；
(2)向上述溶液中加入10μL质量分数为25％的戊二醛溶液，对胶囊组装体中的蛋白质分子进行交联。反应5h后，依次用体积比为50％的乙醇/水溶液、30％乙醇/水溶液、10％乙醇/水溶液和超纯水2.5h，以除去残留的正丁醇油相，即可得到结构稳定的蛋白质胶囊。
实施例3
一种蛋白质仿生胶囊的制备方法，包括以下步骤：
(1)配制浓度为30mg/ml BSA蛋白质的水溶液，用液枪取100μL上述蛋白质溶液，小心地加入到含有2.0mL正丁醇的离心管中，超声处理15s，最后静置30min便可离心管底部收集到乳白色的蛋白质胶囊组装体；
(2)向上述溶液中加入15μL质量分数为25％的戊二醛溶液，对胶囊组装体中的蛋白质分子进行交联。反应6h后，依次用体积比为50％的乙醇/水溶液、30％乙醇/水溶液、10％乙醇/水溶液和超纯水3h，以除去残留的正丁醇油相，即可得到结构稳定的蛋白质胶囊。
对比实验
探究BSA浓度大小对于蛋白质胶囊形貌结构的影响，具体操作如下：首先，分别配制浓度为5，10，20和30mg/mL BSA蛋白质的水溶液，充分混合均匀后。然后，将100μL蛋白质溶液小心地加入到含有900mL正丁醇的离心管中，超声处理10s。最后静置30min后在离心管底部得到乳白色的蛋白质组装体。最后，利用扫描电子显微镜对上述蛋白质组装体的结构稳定性进行表征。
结果分析：
研究发现，BSA浓度大小能够显著影响组装得到的蛋白质胶囊的形貌结构。由图5的扫描电镜结果可知，当BSA蛋白的浓度较小时(5和10mg/mL)，组装得到的是一侧呈凹陷的蛋白质胶囊。当增大BSA蛋白至浓度为20和30mg/mL时，组装得到的是完美的球形蛋白质胶囊。由此可知，通过简单地改变BSA浓度大小就可以实现调控蛋白质胶囊的形貌结构的目的。
实施例4
将荧光FITC标记的葡萄糖(FITC-葡聚糖)封装到蛋白质胶囊结构内，探究蛋白质胶囊在水中释放葡萄糖速率。具体操作如下，整个过程在避光状态下完成：首先，将体积为80uL 20mg/mL BSA蛋白质的水溶液与体积为20μL，浓度为0.5mg/mL FITC-葡聚糖水溶液充分混合。然后，上述混合溶液加入到900mL正丁醇中，超声处理10s。最后静置30min后；
将20μL质量分数为25％的戊二醛加入到上述离心管中，用手轻轻摇晃30s。静置反应4h后，依次用体积比为50％乙醇/水溶液、30％乙醇/水溶液、10％乙醇/水溶液和超纯水透析2h，即可得到内部封装FITC-葡聚糖的蛋白质胶囊。最后，将上述蛋白质胶囊按照1mg/mL浓度分散到水中，利用酶标仪测试不同时间间隔的溶液荧光强度，从而探究蛋白质胶囊的葡萄糖释放能力。
结果分析：
将荧光标记的葡萄糖封装在蛋白质胶囊中，通过测定在固定的时间间隔内溶液的荧光强度大小来研究导致葡萄糖的释放情况，结果如图6所示。可以发现，葡萄糖在1h内的释放量是非常少的，仅为2％左右。随着时间的推移，葡萄糖的释放量缓慢增加，累积释放量在200h内接近30％。葡萄糖分子能够从蛋白质胶囊中释放到水溶液中归因于，组装得到的蛋白质胶囊的膜结构具有一定的通透性。
上述研究结果表明，制备的蛋白质胶囊能够封装水溶性分子，并且能够实现水溶性分子的缓慢释放，在药物控制释放领域具有广阔的应用前景
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
1.一种蛋白质仿生胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制BSA蛋白质的水溶液，加入正丁醇，超声处理，静置，离心收集蛋白质胶囊组装体溶液；
(2)向蛋白质胶囊组装体溶液中加入戊二醛溶液，反应后，依次用乙醇/水溶液、乙醇/水溶液、乙醇/水溶液和超纯水透析，得到蛋白质胶囊。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述BSA蛋白质的水溶液的浓度：5～30mg/mL；所述蛋白质溶液和正丁醇的体积比：100μL：0.9～2.0mL；所述超声处理的时间：10～15s，所述静置的时间：10～30min；所述离心：转速2000rpm，时间2min。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述蛋白质胶囊组装体溶液和戊二醛溶液的体积比50：1～2，戊二醛溶液质量分数为25％；所述反应的时间：4～6h；所述乙醇/水溶液、乙醇/水溶液、乙醇/水溶液：体积比为50％的乙醇/水溶液、30％乙醇/水溶液、10％乙醇/水溶液；所述透析的时间：2～3h。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤(3)，将步骤(2)得到的蛋白质胶囊按照1～5mg/mL的浓度分散到水溶液中。
5.权利要求1～4任一所述的制备方法制备的蛋白质仿生胶囊。
6.权利要求5所述的蛋白质仿生胶囊在制备制备可控制释放药物中的应用。
7.如权利要求6所述的药物为葡萄糖。
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