CN101385857A - 一种新型蛋白质稳定的纳米制剂及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型蛋白质稳定的纳米制剂及其制备方法和用途。本发明通过白蛋白、其它含有巯基或二硫键的物质通过二硫键互相交联形成蛋白质包衣，其中所述蛋白质包衣具有与其缔合的游离蛋白质或蛋白质衍生物，其中难溶性药物的一部分包含在所述蛋白质包衣中，该药物的一部分与游离的蛋白质或蛋白质衍生物缔合，蛋白质包衣颗粒的平均直径不超过1微米，该制剂的用途在于将水难溶性药物输送到生物体内。

Description

一种新型蛋白质稳定的纳米制剂及其制备方法和用途

技术领域：

本发明涉及药物制剂领域，确切地说它是一种新的蛋白质稳定的纳米制剂及其制备方法和用途。

背景技术：

在药物研究中发现，大量药物是水难溶性的，一些药物甚至难溶于有机溶剂，导致其难以给药。在制剂过程中，采用环糊精包合技术、表面活性剂增溶、乳剂、微乳及固体分散技术等可解决一些难溶性药物的溶解问题，但仍有大量的药物由于溶解问题而被放弃使用。

2005年，FDA批准了American Pharmaceutical Partners公司开发的以人血清白蛋白(HSA)为载体的紫杉醇产品Abraxane，Abraxane具有胜过紫杉醇注射液(Taxol)的显著优点。该产品是将紫杉醇与人血清白蛋白结合的一种纳米制剂。由于Abraxane的溶解度较紫杉醇大大提高，且不使用紫杉醇注射液中易导致过敏反应的辅料，无需提前给药预防其过敏反应，可采用标准静脉输注导管、以较Taxol高50％的剂量30分钟内静脉给药完毕。临床试验显示，Abraxane用于治疗经蒽环类药物辅助联合化疗失败或6个月内又复发的转移性乳腺癌病人，其疗效反应率和病人存活率均显著优于Taxol。研究显示Abraxane在快速生长的肿瘤中可以被动积蓄。Abraxane中紫杉醇纳晶保持长时间稳定的原因在于：一方面在于人血清白蛋白分子间在高压和高剪切力作用下二硫键交联在紫杉醇纳晶周围形成一层外壳；另一方面在于人血清白蛋白分子荷电所形成的空间静电排斥力。专利(200310123461.X)介绍了Abraxane的制备方法。

但是采用专利200310123461.X方法制备以白蛋白为载体的纳米制剂尚存在不足：由于单纯依靠人血清白蛋白分子间的二硫键在高压和高剪切力作用下重排而使蛋白质分子间交联，高压均质的时间较长，一方面药物的稳定性会受到影响，特别紫杉醇等热不稳定的药物易降解，高压均质器械的损耗也很大；另一方面白蛋白中的二硫键数目有限，因此在药物纳晶周围蛋白质分子间重排交联的比例较小，形成的外壳不稳固，药物纳晶在24小时内还是会聚集成较大颗粒，不利于稳定地生产。

发明内容：

本发明的目的旨在提供一种新型蛋白质稳定的纳米制剂及其制备方法和用途，此新型制剂采用安全有效的含巯基或二硫键的物质，帮助蛋白质分子间的二硫键在高压和高剪切力作用下重排而使蛋白质分子间加速交联和提高交联比例。

本发明所述的蛋白质稳定的纳米制剂是一种药物输送系统，其特征包括：

含有较多巯基或二硫键的蛋白质、其它含有巯基或二硫键的物质通过二硫键互相交联形成蛋白质包衣，其中所述蛋白质包衣具有与其缔合的游离蛋白质或蛋白质衍生物，其中难溶性药物的一部分包含在所述蛋白质包衣中，该药物的一部分与游离的蛋白质或蛋白质衍生物缔合，蛋白质包衣颗粒的平均直径不超过1微米。蛋白质包衣颗粒是非晶体或结晶体或两者的混合物。

一些蛋白质中含有较多的半胱氨酸残基，在受热的情况下含有较多巯基或二硫键的蛋白质、其它含有巯基或二硫键的物质之间可以通过二硫键互相交联。

本发明所述的含有较多巯基或二硫键的蛋白质包括下列物质的一种或多种：白蛋白、免疫球蛋白、酪蛋白、胰岛素、血红蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白、巨球蛋白、纤维连接素、玻璃连接素纤维蛋白原、脂肪酶等。本发明优选的蛋白质是白蛋白，白蛋白包括各种人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、牛血清白蛋白等，本领域技术人员已知的白蛋白均在本发明的保护范围之内。

本发明所述的其它含有巯基或二硫键的物质包含本领域技术人员已知的除蛋白质外任意含有巯基或二硫键的可药用物质，其中包括下列的一种或多种：半胱氨酸、乙酰半胱氨酸、胱氨酸、二巯基丙醇、二巯基丙磺酸、二巯基丙磺酸钠、二巯基丁二酸、二巯基丁二酸钠、青霉胺、巯乙胺、2，3-二巯基乙二酸、1，2-乙二硫醇、巯基壳聚糖、盐酸半胱氨酸、谷甘胱肽、N-巯基乙酰丝氨酸、N-乙酰半胱氨酸、辅酶A、N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸(硫普罗宁)、巯基乙酸、巯基乙酸钠、巯基乙酸钙、巯基丙酸、巯基丙酸钠、巯基乙醇、巯基乙胺、巯基丙酸钙、二硫苏糖类、盐酸巯乙胺、泛酰巯基乙胺、含有巯基的血管紧张素转换酶抑制剂类药物等，及它们的各种有机或无机盐、各种异构体、各种晶型、各种混合物。

目前用于对蛋白质进行修饰的含有巯基或二硫键的物质优选的是胱氨酸、半胱氨酸、乙酰半胱氨酸、谷甘胱肽、辅酶A、N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸、二巯基丙醇、二巯基丙磺酸、二巯基丙磺酸钠、二巯基丁二酸、二巯基丁二酸钠、青霉胺、巯乙胺以及它们的各种有机或无机盐、各种异构体、各种晶型、各种混合物，它们是非常安全的药用原料。

本发明所述的难溶性药物指在室温每毫升水中溶解度小于1mg或1μl的物质，包括(但不仅限于)下列的一种或多种：紫杉烷类、喜树碱类、长春碱类、阿霉素类、环孢菌素类、黄酮类、二氢吡啶类、维A酸类、挥发油类物质或上述物质的衍生物中的难溶性药物。

本发明所述的药物输送系统，它是由难溶性药物、含有较多巯基或二硫键的蛋白质、其它含有巯基或二硫键的物质借助适当的有机溶剂接触而制备的。更确切的它是由难溶性药物、含有较多巯基或二硫键的蛋白质、其它含有巯基或二硫键的物质借助适当的有机溶剂通过包括(但不仅限于)下列的一种或多种组合而制备的：挤压、混合、研磨、均质、乳匀、剪切、碰撞、超声。本发明所述的药物输送系统制备方法可以更具体地说明如下：

(1)将蛋白质溶于水中，必要时调节pH；药物溶于适当的有机溶剂中；其它含有巯基或二硫键的物质溶于蛋白质溶液中或药物溶液中，混合两种溶液，搅拌成乳液(该步骤有的药物可以没有)，通过包括(但不仅限于)下列的一种或多种组合操作：挤压、混合、研磨、均质、乳匀、剪切、碰撞、超声，分离未交联到蛋白质上的含有巯基或二硫键的物质(根据需要也可以不分离未交联到蛋白质上的含有巯基或二硫键的物质)，干燥，即得到本发明所述的药物输送系统。

或者：

(2)将蛋白质溶于水中，必要时调节pH；其它含有巯基或二硫键的物质溶于蛋白质溶液中或适当的有机溶剂中，加入适当粒度的药物粉末混合，搅拌成乳液(该步骤有的药物可以没有)，通过包括(但不仅限于)下列的一种或多种组合操作：挤压、混合、研磨、均质、乳匀、剪切、碰撞、超声，分离未交联到蛋白质上的含有巯基或二硫键的物质(根据需要也可以不分离未交联到蛋白质上的含有巯基或二硫键的物质)，干燥即得到本发明所述的药物输送系统。

根据上述的制备方法，制备过程中蛋白质与其它含有巯基或二硫键的质量比为1:1～100000:1，优选为10:1～10000:1。

根据上述的制备方法，制备过程中蛋白质的水溶液浓度为0.001％～30％(w/v，后同)，优选为0.1％～10％。

根据上述的制备方法，制备过程中其它含有巯基或二硫键的物质的水溶液浓度为0.0001％～60％，优选为0.001％～10％。

根据上述的制备方法，必要时需要调节蛋白质溶液的pH，合适的pH范围为2～8，pH调节剂包括药学上可以接受的各种无机酸、无机碱、有机酸、有机碱、氨基酸。

根据上述的制备方法，分离未交联到蛋白质上的含有巯基或二硫键的物质可以采用包括(但不仅限于)下列的一种或多种方法的组合：超滤、高速离心、透析等方法，优选超滤。

根据上述的制备方法，溶液的干燥方法可以采用包括(但不仅限于)下列的一种或多种方法的组合：冷冻干燥、喷雾干燥、减压干燥、常压干燥，优选采用下列的一种或多种方法的组合：冷冻干燥、喷雾干燥和减压干燥。

根据上述的制备方法，用于溶解药物或其它含有巯基或二硫键的物质的溶剂并无特殊限制，只要有适当的溶解度即可。适合的溶剂实例包括甲醇、无水乙醇、含一定量水的乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、二甲基亚砜、N，N—二甲基甲酰胺、N，N—二甲基乙酰胺、乙酸甲酯、乙酸乙酯、醋酸异丙酯、丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、甲苯、四氢呋喃、1，4一二氧六环、二甲氧基乙烷、二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷、四氯甲烷、乙醚等，这些溶剂可能单独使用或两种或多种溶剂联合使用。优选自下列溶剂的一种或多种：二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、乙醇。

根据上述的制备方法，药物有机溶液的浓度为0.001％～60％，优选为0.01％～30％。

根据上述的制备方法，其它含有巯基或二硫键的物质的有机溶液的浓度为0.0001％～60％，优选为0.001％～30％。

本发明所述的药物输送系统其用途在于将水难溶性药物输送到生物体内的药物制剂中的用途，本发明所述的体内概念包括口腔、胃肠道、鼻腔、皮下、肌肉组织、血液循环、器官等。

本发明的用途包括将紫杉醇等难溶性药物制备成蛋白质稳定的纳米制剂，不借助表面活性剂和有机溶剂仅采用的一般的注射用水或输液即可输注入人体内。

本发明的优点在于通过安全的含有巯基的物质帮助蛋白质分子间的二硫键在高压和高剪切力作用下重排而使蛋白质分子间交联，与专利(200310123461.X)介绍的单纯依靠人血清白蛋白分子间的二硫键在高压和高剪切力作用下重排而使蛋白质分子间交联的制备方法相比，高压均质操作的时间短，有利于紫杉醇等易降解的药物保持稳定，对高压均质等器械的损耗也比较小，而且由于有更多的巯基参与形成蛋白质分子间的交联，因此在药物纳晶周围蛋白质分子间重排交联的比例较大，形成的外壳稳固，药物纳晶在更长的时间内可以保持稳定，有利于稳定地生产。

本发明的有益成果在于可以帮助难溶性药物安全输送到生物体内，例如紫杉醇注射液(Taxol)1ml中含有527mg聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)和49.7％无水乙醇，该溶剂系统对血管具有极大的刺激性，导致Taxol的使用很麻烦，需采用手术用的大的特殊输注导管才能顺利给药，且用药后还可能引起过敏反应，其静脉输注时间通常至少需要3小时。此注射剂在静脉给药前必须采用抗过敏治疗。而本发明制备的紫杉醇药物输送系统不含有表面活性剂和有机溶剂，仅采用的一般的输液即可输注入人体内，而且本发明制备的紫杉醇药物输送系统与紫杉醇注射液比较显示了更好的治疗效果。

以下通过非限定性实施例进一步详细说明本发明。

实施例1

(按专利200310123461.X的方法制备)将30mg紫杉醇(Paclitaxel)溶于3.0ml二氯甲烷，溶液中加入27.0ml人血清白蛋白(1％，w/v，下同)，混合物在低转速下匀浆5分钟，以形成粗制乳化液，然后将其转移到高压匀质器内(Avestin)，高压匀质在9000—18000磅/英寸(psi)下进行循环5次，匀质液在40℃减压下蒸发20分钟，迅速除去氯仿，得到半透明分散液，紫杉醇颗粒的平均直径为190nm，冷冻干燥48小时，不加任何冻干支撑剂。所得饼块加入无菌水或生理盐水后很容易再构成原来的分散液，再构成后颗粒大小与冷冻干燥前相同，分散液稳定16小时后出现沉淀。

(按本发明的方法制备)将30mg紫杉醇(Paclitaxel)和3mg二巯基丙醇溶于3.0ml二氯甲烷，溶液中加入27.0ml人血清白蛋白(1％)，混合物在低转速下匀浆5分钟，以形成粗制乳化液，然后将其转移到高压匀质器内(Avestin)，高压匀质在9000—18000磅/英寸(psi)下进行循环4次，匀质液在40℃减压下蒸发20分钟，迅速除去氯仿，得到半透明分散液，紫杉醇颗粒的平均直径为180nm，冷冻干燥48小时，不加任何冻干支撑剂。所得饼块加入无菌水或生理盐水后很容易再构成原来的分散液，再构成后颗粒大小与冷冻干燥前相同，分散液稳定28小时出现沉淀。

本实施例说明与专利(200310123461.X)介绍的单纯依靠人血清白蛋白分子间的二硫键在高压和高剪切力作用下重排而使蛋白质分子间交联的制备方法相比，本发明提供的方法高压均质操作的时间短，药物纳晶分散液在更长的时间内可以保持稳定。

实施例2

将200mg紫杉醇(Paclitaxel)溶于3.7ml的氯仿和0.3ml的无水乙醇中，加入97.0ml含有人血清白蛋白(3％)和二巯基丁二酸钠(0.02％)的水溶液，混合物在低转速下匀浆5分钟，以形成粗制乳化液，然后将其转移到高压匀质器内，高压匀质循环4～5次，匀质液在40℃减压下蒸发20分钟，迅速除去氯仿，得到半透明分散液，紫杉醇颗粒的平均直径一般为130～160nm，加水稀释，分子量为1万的超滤膜超滤，将浓缩液冷冻干燥48小时，不加任何冻干支撑剂。所得饼块加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，再构成后颗粒大小与冷冻干燥前相同。

实施例3

将200mg紫杉醇(Paclitaxel)、20mg二巯基丙醇溶于3.7ml的氯仿和0.3ml的无水乙醇中，加入97.0ml人血清白蛋白(3％)溶液，混合物在低转速下匀浆5分钟，以形成粗制乳化液，然后将其转移到高压匀质器内，高压匀质循环4～5次，匀质液在40℃减压下蒸发20分钟，迅速除去氯仿，得到的分散液为半透明，紫杉醇颗粒的平均直径一般为130～150nm，加水稀释，分子量为1万的超滤膜超滤，将浓缩液冷冻干燥48小时，不加任何冻干支撑剂。所得饼块加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，再构成后颗粒大小与冷冻干燥前相同。

实施例4

将20mg二巯基丙醇溶于3.7ml的氯仿和0.3ml的无水乙醇中，加入97.0ml的柠檬酸调节pH为5.5人血清白蛋白(3％)溶液，再加入200mg紫杉醇(Paclitaxel)粉末，混合，然后将其转移到高压匀质器内，高压匀质循环5～6次，匀质液在40℃减压下蒸发20分钟迅速除去氯仿，得到的分散液为半透明，紫杉醇颗粒的平均直径一般为110～160nm，加水稀释，分子量为1万的超滤膜超滤，将浓缩液冷冻干燥48小时，不加任何冻干支撑剂。所得饼块加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，再构成后颗粒大小与冷冻干燥前相同。

实施例5

将30mg紫杉醇(Paclitaxel)、3mg二巯基丙醇溶于3.0ml的二氯甲烷中，加入27.0ml人血清白蛋白(1％)，混合物在低转速下匀浆5分钟，以形成粗制乳化液，然后将其转移到高压匀质器内，高压匀质循环4～5次，匀质液在40℃减压下蒸发20分钟迅速除去氯仿，得到的分散液为半透明，紫杉醇颗粒的平均直径一般为150～200nm，冷冻干燥48小时，不加任何冻干支撑剂。所得饼块加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，再构成后颗粒大小与冷冻干燥前相同。

实施例6

将30mg紫杉醇(Paclitaxel)、1mg二巯基丙醇溶于3.0ml的二氯甲烷中，加入27.0ml含有人血清白蛋白(1％)和二巯基丁二酸钠(0.01％)的水溶液，混合物在低转速下匀浆5分钟，以形成粗制乳化液，然后将其转移到高压匀质器内，高压匀质循环4～5次，匀质液在40℃减压下蒸发20分钟迅速除去氯仿，得到的分散液为半透明，紫杉醇颗粒的平均直径一般为150～200nm，加水稀释，分子量为1万的超滤膜超滤，将浓缩液冷冻干燥48小时，不加任何冻干支撑剂。所得饼块加入无菌水或生理盐水后很易再构成原来的分散液，再构成后颗粒大小与冷冻干燥前相同。

【急性毒性试验】：

试验动物：昆明种小鼠，体重18～22g，雌雄各半，由南京军区南京总医院动物中心提供，饲以全价颗粒饲料，自由饮水。

试验药物：注射用紫杉醇纳米粒，规格：30mg/5ml，由中国药科大学药剂教研室提供(按实施例1制备，下同)。临用前用5％葡萄糖注射液配制成所需浓度。紫杉醇注射液，北京协和制药厂，规格：30mg/5ml，临用前用5％葡萄糖注射液配制成所需浓度。

试验方法：按化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则中所述安排设计试验。

试验结论：注射用紫杉醇纳米粒和紫杉醇注射液小鼠急性毒性试验结果表明：一天内两次给药，①注射用紫杉醇纳米粒经静脉注射给药的LD₅₀为105.76mg/kg。给药后次日开始出现小鼠活动和摄食减少，竖毛，体重减轻等症状，并且开始有小鼠死亡。给药后第7天开始，存活小鼠逐渐恢复正常。②紫杉醇注射液经静脉注射给药的LD₅₀为75.47mg/kg。给药后次日开始出现小鼠活动减少，竖毛，摄食减少等症状，并且开始有小鼠死亡。给药第11天，中剂量组仍然有小鼠死亡。其余各组存活小鼠逐渐恢复正常，至给药后第16天，存活小鼠不再死亡。解剖死亡小鼠，肉眼未见各脏器出现明显异常。

【对小鼠移植瘤EAC的抑制作用】：

试验动物：ICR种小白鼠，18-22g，雌雄各半，由中国药科大学动物室提供。饲料：颗粒饲料，由中国药科大学动物室供给；饲养条件：空调房间，温度18-24℃，相对湿度70％。

剂量设置：空白对照组(生理盐水)，紫杉醇注射液：10mg/kg，注射用紫杉醇纳米粒：10mg/kg，5mg/kg，2.5mg/kg共5个剂量组。

试验方法：取上述规格小鼠50只按移植性肿瘤研究法接种EAC实体型，接种后24小时称鼠重，并随机分为5组，每组10只，雌雄各半。接种24小时后iv给药，隔天一次，共给药4次，于停药后第2天小鼠称重，处死荷瘤小鼠并分离瘤块，称瘤重，所得数据进行统计学处理(t检验)。

试验结果：与空白对照组相比，注射用紫杉醇纳米粒高、中剂量(10、5mg/kg)组可显著地抑制肉瘤EAC的肿瘤生长(P<0.01)，并且高剂量组抑制作用较紫杉醇注射液(10mg/kg)组好(P<0.05)。同时注射用紫杉醇纳米粒对试验小鼠的体重影响较紫杉醇注射液小，低剂量(2.5mg/kg)组对小鼠EAC肉瘤也有抑制作用，但与空白对照组比较无显著性差异，同时对小鼠体重影响较小。见表1。

表1 注射用紫杉醇纳米粒对小鼠移植瘤EAC的抑制作用

^*P<0.05   ^**P<0.01与空白对照组比较

附图说明

图1为实施例2的注射用紫杉醇纳米粒的透射电镜照片。

Claims (10)

1.一种药物输送系统，其特征包括：

含有较多巯基或二硫键的蛋白质、其它含有巯基或二硫键的物质通过二硫键互相交联形成蛋白质包衣，其中所述蛋白质包衣具有与其缔合的游离蛋白质或蛋白质衍生物，其中难溶性药物的一部分包含在所述蛋白质包衣中，该药物的一部分与游离的蛋白质或蛋白质衍生物缔合，蛋白质包衣颗粒的平均直径不超过1微米。

2.根据权利要求1所述的药物输送系统，其中所述蛋白质包衣颗粒是非晶体或结晶体，或两者的混合物。

3.根据权利要求1所述的药物输送系统，其中所述含有较多巯基或二硫键的蛋白质包括下列的一种或多种：白蛋白、免疫球蛋白、酪蛋白、胰岛素、血红蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白、巨球蛋白、纤维连接素、玻璃连接素纤维蛋白原、脂肪酶等。

4.根据权利要求3所述的含有较多巯基或二硫键的蛋白质是白蛋白。

5.根据权利要求1所述的药物输送系统，其中所述含有巯基或二硫键的物质包括下列的一种或多种：半胱氨酸、乙酰半胱氨酸、胱氨酸、二巯基丙醇、二巯基丙磺酸、二巯基丙磺酸钠、二巯基丁二酸、二巯基丁二酸钠、青霉胺、巯乙胺、2，3-二巯基乙二酸、1，2-乙二硫醇、巯基壳聚糖、盐酸半胱氨酸、谷甘胱肽、N-巯基乙酰丝氨酸、N-乙酰半胱氨酸、辅酶A、N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸(硫普罗宁)、巯基乙酸、巯基乙酸钠、巯基乙酸钙、巯基丙酸、巯基丙酸钠、巯基乙醇、巯基乙胺、巯基丙酸钙、二硫苏糖类、盐酸巯乙胺、泛酰巯基乙胺、含有巯基的血管紧张素转换酶抑制剂类药物等，及它们的各种有机或无机盐、各种异构体、各种晶型、各种混合物。

6.根据权利要求5所述的药物输送系统，其中所述含有巯基或二硫键的物质选自下列的一种或多种：胱氨酸、半胱氨酸、乙酰半胱氨酸、谷甘胱肽、辅酶A、N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸、二巯基丙醇、二巯基丙磺酸、二巯基丙磺酸钠、二巯基丁二酸、二巯基丁二酸钠、青霉胺、巯乙胺以及它们的各种有机或无机盐、各种异构体、各种晶型、各种混合物。

7.根据权利要求1所述的难溶性药物是紫杉醇。

8.根据权利要求1所述的药物输送系统，它是由难溶性药物、含有较多巯基或二硫键的蛋白质、其它含有巯基或二硫键的物质借助适当的有机溶剂接触而制备的。

9.根据权利要求8所述的制备方法，它是由难溶性药物、含有较多巯基或二硫键的蛋白质、其它含有巯基或二硫键的物质借助适当的有机溶剂通过下列的一种或多种组合而制备的：挤压、混合、研磨、均质、乳匀、剪切、碰撞、超声。

10.根据权利要求1所述的药物输送系统，其用途在于将难溶性药物输送至生物体内的药物制剂中的用途。

Images