CN105288622B

CN105288622B - 同时负载化疗药物和光动力治疗药物的细胞膜微囊的制备方法

Info

Publication number: CN105288622B
Application number: CN201510736015.9A
Authority: CN
Inventors: 毛峥伟; 韩利杰; 高长有
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2015-11-03
Filing date: 2015-11-03
Publication date: 2018-06-19
Anticipated expiration: 2035-11-03
Also published as: CN105288622A

Abstract

本发明公开了一种同时负载化疗药物和光动力治疗药物的细胞膜微囊。选用人源细胞作为原料制备细胞膜微囊；将得到的细胞膜微囊浸泡在洋地黄皂苷溶液中，提高细胞膜通透性；依次加入化疗药物盐酸阿霉素和光动力治疗药物吲哚菁绿，使药物渗透进入细胞膜微囊；使用钙离子封闭细胞膜，得到同时负载化疗药物和光动力治疗药物的细胞膜微囊。该细胞膜微囊在808nm的激光照射下可产生活性氧，与化疗药物共同作用杀死肿瘤细胞，有望用于肿瘤治疗。本发明制备方法简便可控，生产效率高，有良好的应用前景。

Description

同时负载化疗药物和光动力治疗药物的细胞膜微囊的制备方法

技术领域

本发明涉及一种同时负载化疗药物和光动力治疗药物的细胞膜微囊的制备方法。

背景技术

光动力治疗是采用激光与光动力治疗药物（光敏剂）结合对疾病组织进行特异性杀伤的一种新型治疗手段。激光刺激光动力治疗药物后，周围O₂转变为单线态氧等活性氧物质，活性氧通过氧化作用杀伤靶细胞。但起主要杀伤作用的单线态氧存活时间短，实现光动力治疗药物的定位作用是光动力治疗研究的重点内容之一，通过载体对其传递是实现该功能的一种方法。

化疗也是治疗肿瘤等疾病的常用方法。阿霉素为一种蒽环类抗肿瘤抗生素，为细胞周期非特异性药，其作用机制主要是阿霉素分子嵌入DNA 而抑制核酸的合成。主要用于治疗急性白血病、恶性淋巴瘤、肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、宫颈癌、膀胱癌、睾丸癌、甲状腺癌、软组织肿瘤、骨肉瘤和神经母细胞癌等。目前临床给药多为静脉滴注，但该药对骨髓和心脏都有较为严重的毒副作用，并且长期用药导致肿瘤多药耐药，易造成化疗失败。

可通过微米和纳米尺度的药物载体，将光动力治疗药物和化疗药物联合使用，从而克服两种治疗方式各自的缺点，提高疗效。通常的药物载体主要是使用人工合成的聚合物或天然来源的蛋白质和多糖作为原料，其结构比较简单。但是往往生物相容性差，较易被人体的免疫系统识别并清除，具有体内循环时间短且不易到达病变部位的缺点，这些缺点限制了其推广与应用。

仿细胞微囊是由细胞膜将囊内空间与囊外空间隔离开来形成的球状物质。利用细胞松弛素处理哺乳动物细胞，破坏维持细胞形态的肌动蛋白的组装，然后在机械剪切的作用下制备仿细胞微囊。

仿细胞微囊作为药物载体有诸多优点：由于微囊表面实质是一层类细胞膜结构，因此具有极佳的生物相容性；并且有望降低自体免疫系统的清除作用，具有更好的临床应用价值。洋地黄皂苷是一种表面活性剂，可以提高细胞膜的通透性，使得不能自由渗透细胞膜的亲水性药物分子也可以进入细胞膜微囊内部；同时洋地黄皂苷可以与高浓度的钙离子结合，实现细胞膜的再次封闭。因此，可使用洋地黄皂苷暂时地通透细胞膜，将化疗药物和光动力治疗药物装载入细胞膜微囊中；随后封闭囊壁，实现药物的缓释和保护。

发明内容

本发明的目的是提供一种同时负载化疗药物和光动力治疗药物的细胞膜微囊的制备方法。

本发明的同时负载化疗药物和光动力治疗药物的细胞膜微囊的制备方法，包括以下步骤：

1）在培养有人源细胞的培养盘中加入20µL 浓度为1mg/mL的细胞松弛素溶液，37℃下孵育30min；生理盐水洗数次，胰酶消化，离心去掉细胞，得细胞膜微囊悬液；

2）取200 µg步骤1）所得的细胞膜微囊加入到1mL洋地黄皂苷与化疗药物的混合溶液中，混合溶液中洋地黄皂苷浓度为10 µg/mL，化疗药物的浓度为20-200 µg/mL；37℃孵育1～6h；

3）将步骤2）所得的细胞膜微囊离心，用生理盐水洗去多余的化疗药物；加入1mL光动力治疗药物溶液，溶液中光动力药物浓度为20-200 µg/mL；37℃孵育1～6h；

4）在步骤3）的溶液中加入10µL 0.5mol/mL氯化钙溶液，37℃下孵育2h；离心收集细胞膜微囊，洗涤，得到同时装载化疗药物和光动力治疗药物的细胞膜微囊。

本发明中所说的人源细胞可以是内皮细胞、平滑肌细胞或成纤维细胞；本发明中所说的化疗药物可以是盐酸阿霉素；本发明中所说的光动力治疗药物可以是吲哚菁绿。

本发明的原理：使用洋地黄皂苷提高细胞膜通透性，利用细胞内外化疗药物的浓度差将化疗药物装入细胞膜微囊；随后利用化疗药物和光动力治疗药物相反的电荷性质，通过静电吸引将大量的光动力治疗药物装入细胞膜微囊；最后使用氯化钙溶液封闭细胞膜。

本发明的有益效果在于：

本发明工艺过程简单，制备速度快，可控性好，材料来源于天然细胞，具有优越的生物相容性和传递性能；洋地黄皂苷的引入，可暂时增加细胞膜微囊的通透性，实现不能穿透完整细胞膜的化疗药物盐酸阿霉素和光动力治疗药物吲哚菁绿的装载，并调控其装载量，起到保护和缓释的作用。该细胞膜微囊在808nm的激光照射下可产生活性氧，与化疗药物共同作用杀死肿瘤细胞，有望用于肿瘤治疗。

附图说明

图 1 是细胞膜微囊的透射电镜照片，其中（a）为原始的细胞膜微囊，（b）为装载有盐酸阿霉素和吲哚菁绿的细胞膜微囊。

图2 是实施例1所得的同时负载化疗药物和光动力治疗药物的细胞膜微囊中的盐酸阿霉素的释放曲线。

图3 是实施例1所得的同时负载化疗药物和光动力治疗药物的细胞膜微囊中的

吲哚菁绿的释放曲线。

图 4是实施例1所得的同时负载化疗药物和光动力治疗药物的细胞膜微囊在不同光照剂量下对肿瘤细胞HepG2的杀伤效果。

图5是实施例1 所得的同时负载化疗药物和光动力治疗药物的细胞膜微囊注射到裸鼠体内肿瘤部位并光照30s或90s，至第9天解剖后所获得的肿瘤体积。

图6 是实施例1 所得的同时负载化疗药物和光动力治疗药物的细胞膜微囊注射到裸鼠体内肿瘤部位并光照90s，随后每3天测量的裸鼠体重。

具体实施方式

以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。

实施例1

1）在培养有人源内皮细胞的培养盘中加入20µL 浓度为1mg/mL的细胞松弛素溶液，37℃下孵育30min；生理盐水洗三次，胰酶消化，500rpm离心10min去掉细胞，上清液即为细胞膜微囊悬液；

2）取200µg步骤1）所得的细胞膜微囊加入到1mL洋地黄皂苷与化疗药物盐酸阿霉素的混合溶液中，混合溶液中洋地黄皂苷浓度为10 µg/mL，盐酸阿霉素的浓度为200 µg/mL；37℃孵育6h；

3）将步骤2）所得的细胞膜微囊离心，用生理盐水洗去多余的盐酸阿霉素；加入1mL光动力治疗药物吲哚菁绿溶液，溶液中吲哚菁绿浓度为200 µg/mL；37℃孵育6h。

4）在步骤3）的溶液中加入10µL 0.5mol/mL氯化钙溶液，37℃下孵育2h；离心收集细胞膜微囊，生理盐水洗涤三次，得到同时装载盐酸阿霉素和吲哚菁绿的细胞膜微囊。

将1 mg上述所得的细胞膜微囊分散在1 mL的含有2.5%的戊二醛的生理盐水中固定24 h；乙醇梯度脱水后包埋到环氧树脂中，用超薄切片机切片，醋酸铀染色，在透射电镜下观察原始的细胞膜微囊(图1a)和装载有盐酸阿霉素和吲哚菁绿的细胞膜微囊(图1b)。

将1 mg上述所得的负载盐酸阿霉素和吲哚菁绿的细胞膜微囊分散在1 mL生理盐水中，间隔1 h、2 h、6 h、12 h和24 h离心收集细胞膜微囊，分别检测上清液中盐酸阿霉素和吲哚菁绿的释放量(见图2和图3)。由图可知，细胞膜微囊可实现盐酸阿霉素和吲哚菁绿的缓释。

实施例2

同实施例1，区别在于步骤2)中， 37℃孵育时间为1h。

实施例3

同实施例1，区别在于步骤2)中，化疗药物盐酸阿霉素在混合溶液中的浓度为20 µg/mL。

实施例4

同实施例1，区别在于步骤3)中，37℃孵育时间为1h。

实施例5

同实施例1，区别在于步骤3)中，光动力治疗药物吲哚菁绿的浓度为20 µg/mL。

实施例6

将1mg实施例1中制备的同时负载盐酸阿霉素和吲哚菁绿的细胞膜微囊加入到细胞培养液中，使得盐酸阿霉素和吲哚菁绿的浓度分别为1.5µM和50µM。使用此细胞培养液孵育HepG2细胞（人肝癌细胞）30 min，随即给予200，300或600 J/cm²的808 nm的激光照射（即以10 w/cm²的强度分别照射20s，30s或60s），继续在37 ^oC下培养细胞3.5 h，使用MTT法检测细胞活性(图4)。由图4可见，在没有光照条件下该细胞膜微囊仅能造成部分细胞死亡，而在适宜的光照条件下可基本上杀死所有细胞。说明可实现两种药物的协同作用。

实施例7

将1 mg实施例1中制备的同时负载盐酸阿霉素和吲哚菁绿的细胞膜微囊注射到荷瘤裸鼠的肿瘤部位，使得盐酸阿霉素和吲哚菁绿的浓度分别为1.5µM和50µM。随即用 808nm的激光以10w/cm²的强度照射30s或90s（对应的能量为300或900 J/cm²），随后继续饲养裸鼠至第9天，处死裸鼠并测量肿瘤体积 (图5)。由图可知，在不光照条件下，同时负载盐酸阿霉素和吲哚菁绿的细胞膜微囊不能显著抑制肿瘤组织的增长，治疗效果不佳；而给予光照后，治疗组的肿瘤体积明显降低，且与光照强度正相关；对照组的肿瘤体积没有明显变化。说明同时负载化疗药物和光动力治疗药物的细胞膜微囊可实现光动力治疗和化疗的联用，更有效地抑制肿瘤增生。

实施例8

将1mg实施例1中制备的同时负载盐酸阿霉素和吲哚菁绿的细胞膜微囊注射到荷瘤裸鼠的肿瘤部位，使得盐酸阿霉素和吲哚菁绿的浓度分别为1.5µM和50µM。随即用 808nm的激光以10w/cm²的强度照射90s（对应的能量为900 J/cm²），继续饲养裸鼠，每三天测量一次裸鼠的体重 (图6)。由图可知，治疗组的动物体重与对照组没有明显变化，说明使用同时负载化疗药物和光动力治疗药物的细胞膜微囊对裸鼠无明显毒副作用。

Claims

1.同时负载化疗药物和光动力治疗药物的细胞膜微囊的制备方法，包括以下步骤：

2）取200 µg步骤1）所得的细胞膜微囊加入到1mL洋地黄皂苷与化疗药物的混合溶液中，混合溶液中洋地黄皂苷浓度为10 µg/mL，化疗药物的浓度为20-200 µg/mL；37℃孵育1～6h；所述的化疗药物是盐酸阿霉素；

3）将步骤2）所得的细胞膜微囊离心，用生理盐水洗去多余的化疗药物；加入1mL光动力治疗药物溶液，溶液中光动力药物浓度为20-200 µg/mL；37℃孵育1～6h；所述的光动力治疗药物是吲哚菁绿；

2.根据权利要求1所述的同时负载化疗药物和光动力治疗药物的细胞膜微囊的制备方法，其特征在于所述的人源细胞是内皮细胞、平滑肌细胞或成纤维细胞。