CN102329810B - 一种siRNA输送载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种siRNA输送载体，所述输送载体的活性成分为超顺磁性氧化铁纳米粒子与聚乙二醇-聚乙烯亚胺偶联形成的纳米颗粒。另外，本发明还公开了一种真核细胞转染液，包含由siRNA和所述siRNA输送载体组成的复合物。本发明的siRNA输送载体具有粒径小、表面电位合适的理化性质，拥有良好siRNA复合能力、低细胞毒性和高转染率，是一个安全、高效、具有siRNA输送功能的纳米载体，在siRNA输送和基于RNA干扰的疾病治疗中具有良好的应用前景。

Description

一种siRNA输送载体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种siRNA输送载体及其在制备癌症的基因治疗药物中的应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的在生物界普遍存在的一种古老的生物学现象，是生物进化的产物。具体是指由双链RNA(doublestrand RNA，dsRNA)指导的，在特定酶参与下，以外源或内源mRNA为降解目标，在转录后水平上使特异性靶基因发生的沉默现象，即不表达。目前研究表明，RNAi广泛存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物的大多数真核生物中，原核生物暂未发现。RNAi不仅参与了细胞正常的生长、发育、衰老和凋亡的调控，还可使外源基因导入时或病毒入侵后基因不被表达，从而成为生物体的一种有效的特异性自我防御机制。RNA干扰能特异而有效的阻断靶基因的表达外源性或内源性dsRNA，在细胞内导致与其序列同源的分子发生特异性降解，从而干扰相应基因的表达。dsRNA引起RNA干扰的过程为：核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的siRNA，大小约21-23bp。siRNA具有一些特征性结构：即siRNA的序列与所作用的靶mRNA序列具有同源性；siRNA两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基。此外，每条单链的3′端均有2-3个突出的非配对的碱基，这种结构形式对siRNA进入蛋白复合体是必须的。siRNA是RNAi赖以发生的重要中间效应分子。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义链再与体内一些酶结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。携带反义链的的RISC与mRNA的互补序列特异性结合并切割mRNA。被切割后断裂的mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞内特定mRNA的降解反应。RNAi具有普遍、高效、特异、操作简单等突出优点，目前该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。

胃癌的发生是一个多步骤多阶段的过程，其特征是原癌基因的激活和抑癌基因的失活。还有凋亡相关基因的异常表达、部分自分泌生长因子和受体的过量表达也与细胞癌变有密切关系。研究发现，多个分子标志物与胃癌转移潜能相关，其中研究较为深入的包括CD44异构体6(CD44 variant isoform 6，CD44v6)。CD44由一个包含20个外显子的基因编码，其中10个外显子是组成型外显子，另外10个外显子可选择性拼接而被称为变异外显子(variant exon，v1-v10)。仅含有组成型外显子称为CD44标准体(CD44 standard form，CD44s)，而含有变异外显子则为CD44异构体(CD44 variant isoform，CD44v)。CD44s广泛存在于在正常组织和癌组织中，而CD44v主要出现在机体的病理过程，特别是肿瘤的发生发展过程中。CD44v胞内区域与下游因子的选择性相互作用在协调细胞内信号通路起着重要作用，如Rho/Ras、酪氨酸激酶途径等，并与肿瘤细胞生长、迁移和侵袭作用密切相关。CD44v6是目前研究较为广泛的异构体，被认为是上皮起源恶性肿瘤，包括肝细胞癌，乳腺癌，结直肠癌和胃癌发生转移的分子标志物，尤其是胃癌发生转移相对特异的分子标志物，制备抗CD44v6单链抗体用于进展期胃癌的生物治疗，可以封闭性结合胃癌组织表达的CD44v6，阻断其与细胞外间质或基底膜的正常连接及其所促进的肿瘤细胞浸润转移，延缓肿瘤进展；破坏CD44v6蛋白在肿瘤细胞表面形成的糖蛋白伪装，有利于免疫系统对肿瘤细胞的识别和杀灭，抑制肿瘤的淋巴转移。采用RNAi技术可特异地抑制相关基因的表达，使这些基因呈现沉默或休眠状态.从而达到肿瘤治疗的目的。与传统的基因治疗的方法相比，RNAi能够实现同一基因家族的多个基因同时敲除，且抑制效果互不干扰，因为其特有的优势成为基因治疗的新策略。

siRNA给药载体的研究和开发一直是困扰各国科学家的关键问题。人们一直在研究合适的载体材料能有效地将siRNA药物分子输送到靶细胞和部位，并在一段合理时间维持其功效。目前所采用的载体体系大多是阳离子脂质体或水溶性的阳离子聚合物，将这些载体分子与siRNA溶液互混得到二者的复合物，从而实现传递siRNA的目的，这类方法的不足就是不容易放大规模并且重复性较差。另外，基于高分子的纳米颗粒已经广泛用于从小分子到生物活性DNA分子的传递的研究，取得了不菲成绩，其中很多成果已经用于临床或临床试验。高分子纳米颗粒的传递体系生物相容性好，具有靶向传递的潜能，具有更好的稳定性，能有效保护生物活性分子对生理环境的耐受性，并增强细胞对被传递分子的吸收。特别值得指出的是高分子自组装的纳米粒具有EPR效应(Enhancedpermeability and retention)，可促进药物在肿瘤组织的富集，并能有效地被肿瘤部位细胞吸收，进入细胞质和各种细胞器，因此高分子纳米粒是极具潜能的siRNA传递系统的候选者。而具有良好生物相容性的可降解高分子载体，特别是具有快速去质子化能力的可降解阳离子型高分子载体能有效结合和保护siRNA分子，又能使siRNA在细胞质中迅速释放，实现阻断基因表达的目的，这将使这类载体在siRNA给药中具有更好的优势和应用前景。

发明内容

有鉴于此，本发明的所解决的技术问题在于提供一种siRNA输送载体，具有粒径小、表面电位合适的理化性质，拥有良好siRNA复合能力、低细胞毒性和高转染率，是一个安全、高效、具有siRNA输送功能的纳米载体。

一方面，本发明提供了一种siRNA输送载体，其活性成分为超顺磁性氧化铁纳米粒子与聚乙二醇-聚乙烯亚胺偶联形成的纳米颗粒。

优选地，所述聚乙二醇-聚乙烯亚胺为单甲基醚聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺形成的水溶性共聚物，所述水溶性共聚物通过配体交换包裹超顺磁性氧化铁纳米粒子。

其中，超顺磁性氧化铁纳米粒子控制在40-60kD之间，优选控制在50-60kD之间，最优为55KD；聚乙二醇-聚乙烯亚胺控制在40-60kD之间，优选控制在40-50kD之间，更优控制在42-48kD之间，最优为45KD。例如在本发明的实施例1中，即是选择2kD的单甲基醚聚乙二醇与25kD枝化聚乙烯亚胺以10∶1的摩尔比合成聚乙二醇-聚乙烯亚胺；而后再与55kD的超顺磁性氧化铁纳米粒子以偶联形成的本发明的siRNA输送载体，通过对胶粒理化性质的测试，超顺磁性氧化铁纳米粒子占胶粒质量的55％。而且结合本发明实施例中的实验结果表明，采用上述分子量范围内或者本发明实施例中所用的成分，能够使本发明的siRNA载体与待输送的siRNA有效结合，提高siRNA的输送效率，对RNA干扰效果有积极的影响。

优选地，所述纳米颗粒的平均粒径为60-80nm，表面zeta电位为30-40mV。本发明实施例中纳米颗粒的平均粒径优选为67.3±2.0nm，表面zeta电位优选为34.38±1.66mV。

从分子结构上分析，本发明提供的siRNA输送载体含有由超顺磁性氧化铁纳米粒子与聚乙二醇-聚乙烯亚胺偶联形成的纳米颗粒。其中，聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)是一种广泛采用的高分子纳米载体，是一种水溶性的高分子聚合物，具有一级、二级和三级胺，胺基基团所带的阳性电荷和核酸的磷酸基团带的阴性电荷中和，产生强大的核酸亲和力，形成稳定的PEI/核酸复合物。此外，PEI突出的优势在于结构灵活，易调整其分子量，可以通过引入侧链和特异靶向性基团来修饰多聚物骨架，进而调整和改善载体的性能，其体积比脂质体小，易于通过血管内皮间隙。然而，PEI和PEI/核酸复合物有较大的细胞毒性，而本发明的siRNA输送载体中，通过聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修饰，构成PEG-g-PEI能够降低细胞毒性且保证PEI的基因转染效率。需要说明的是，本发明siRNA输送载体用到的PEG是一种常用药用辅料，具有良好的水溶性，其分子量当控制在200-35,000Da之间。而超顺磁性氧化铁纳米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPION)是一种高效的磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)造影剂，本发明的siRNA输送载体通过将SPION与PEG-g-PEI偶联形成PEG-g-PEI-SPION(PPS)，同时具备基因输送和MRI成像功能，通过MRI这一非侵入性成像技术能够及早地发现肿瘤并更准确地观察、分析治疗效果。本发明的siRNA输送载体具有良好的生物相容性和可降解性，其在水溶液中自组装形成纳米颗粒，具有合适的理化性质，良好的稳定性，制备方法简单，可重复性高，同时拥有良好的siRNA复合能力，低细胞毒性和高转染率，作为载体能保护siRNA免于降解，又能结合纳米颗粒本身的尺度效应，是一种安全、高效、优良的siRNA输送载体。

另一方面，本发明还提供了一种真核细胞转染液，所述转染液包括siRNA和上述方案中揭示的siRNA输送载体，所述siRNA被吸附于siRNA输送载体形成复合物。

其中，其中，复合物的N/P比值计算公式为：

优选地，所述复合物的N/P比值控制在5-20之间。在合适的N/P比值情况下，纳米颗粒能够与siRNA完全结合形成稳定的负载siRNA分子的纳米颗粒。

另外，siRNA输送载体与siRNA形成复合物后，整个复合物的平均粒径表面zeta电位会随N/P比值变化而发生变化。本发明中复合物的平均粒径控制在80-100nm之间。而表面zeta电位随N/P比值的变化差异范围很大，而且在N/P比值较小时，表面zeta电位随N/P比值的变化非常明显。

另一方面，本发明还提供了一种向细胞输送siRNA的方法，该方法包括将siRNA与如权利要求1-4中任意一项所述的siRNA输送载体制备成复合物，而后根据复合物粒径、表面电位、siRNA复合能力、细胞毒性和转染率确定合适的N/P比值，再用具有合适的N/P比值的复合物向细胞中转染siRNA。

优选地，siRNA为siCD44v6，所述siCD44v6具有如下序列：

sense strand：5′-GAACAGUGGUUUGGCAACA dTdT-3′<SEQ ID NO.1>，

antisense strand：3′-dTdT CUUGUCACCAAACCGUUGU-5′<SEQ ID NO.2>，

所述输送载体与siCD44v6形成复合物，将复合物的N/P比值控制在5-15之间，向胃癌细胞转染siCD44v6。其中，所述胃癌细胞优选为SGC-7901细胞。

在本发明的具体实施例中采用PEG-g-PEI-SPION(PPS)输送针对CD44v6基因的siCD44v6，并和Lipofectamine比较沉默CD44v6在SGC-7901细胞的表达，证明了纳米颗粒能够将siRNA运输到细胞内并发挥沉默基因表达的作用。本发明利用针对Luciferase蛋白的siRNA进一步定量分析检验了纳米颖粒输送siRNA的能力，PEG-g-PEI-SPION(PPS)纳米颗粒转染siRNA与Lipofectamine转染siRNA后，比较CD44v6基因的沉默效率，采用PEG-g-PEI-SPION(PPS)纳米颗粒转染siRNA使CD44v6基因具有更高的沉默效率，而且该结果得到了Western blot试验进一步验证。

将上述向细胞输送siRNA的方法运用到癌症的治疗中，能够降低癌细胞迁移和侵袭能力。在本发明的实施例中，用PEG-g-PEI-SPION(PPS)输送针对CD44v6基因的siCD44v6，通过迁移和侵袭试验观察沉默CD44v6对SGC-7901细胞迁移和侵袭能力的影响，实验结构表明CD44v6与对SGC-7901细胞迁移和侵袭能力密切相关，而且PPS/siCD44v6复合物能够有效地抑制SGC-7901细胞的迁移和侵袭能力。

另外，本发明还公开所述的siRNA输送载体和真核细胞转染液在制备癌症基因治疗药物中的应用，尤其是在制备胃癌基因治疗药物中的应用。本发明通过细胞毒性实验证明本发明的siRNA输送载体具有良好的生物相容性，同时具有很好的稳定性和方便制备等特点，在siRNA输送和基于RNA干扰的疾病治疗中具有良好的应用前景。

附图说明

图1是PEG-g-PEI-SPION/siRNA复合物凝胶阻滞电泳图。其中1：裸siRNA；2-6：N/P比值＝1，2，3，4，5和10。

图2是PEG-g-PEI-SPION/siRNA细胞毒性试验结果图。采用MTT法测定N/P＝1.25，5，10和20PEG-g-PEI-SPION/siRNA复合物对SGC-7901细胞的毒性作用，绘制成细胞存活率曲线。

图3是图10PEG-g-PEI-SPION转染率实验结果图。PEG-g-PEI-SPION/siNC-Cy3按N/P＝3，5和10转染SGC-7901细胞，并以lipofectamine/siNC-Cy3为对照组，流式细胞仪检测转染率。

图4是PEG-g-PEI-SPION/siRNA复合物细胞内分布图。PEG-g-PEI-SPION/siNC-Cy3复合物转染SGC-7901细胞后，荧光显微镜下拍照，可见红色荧光出现在细胞内。普鲁士蓝染色后可见细胞胞浆出现蓝色颗粒。

图5A是CD44v6沉默效应实验结果图一。siCD44v6分别通过PEG-g-PEI-SPION和lipofectamine转染至SGC-7901细胞，通过qRT-PCR反应其基因沉默效应的实验结果图。

图5B是CD44v6沉默效应实验结果图二。siCD44v6分别通过PEG-g-PEI-SPION和lipofectamine转染至SGC-7901细胞。通过Western blot反应其基因沉默效应的实验结果图。

图6A是迁移实验结果示意图一。

图6B是迁移实验结果示意图二。

图6C是侵袭实验结果示意图一。

图6D是侵袭实验结果示意图二。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实施手册中所述的条件。

本发明的以下实施方式中，通过研究siRNA输送载体PEG-g-PEI-SPION(polyethylene glycol-grafted polyethylenimine and superparamagnetic iron oxidenanoparticles，PEG-g-PEI-SPION，简称PPS)作为siRNA输送载体的理化性质，确定合适N/P比值。并以PPS向胃癌细胞输送靶向CD44v6基因的siRNA(siCD44v6)为例，通过检测siCD44v6所介导的基因沉默和生物学效应，确定本发明的siRNA输送载体PPS的作用和效果，以及其在制备基因治疗药物尤其是癌症治疗药物中的应用。

下列实施例中，采用的生物材料及其来源为：

1、细胞株

人胃腺癌细胞株SGC-7901购买自上海生物化学与细胞研究所。人胃正常上皮细胞株GES-1购买于北京肿瘤研究所。人恶性黑色素瘤细胞株A375由上海肿瘤研究所惠赠。

2、主要试剂

3、序列

(1)siCD44v6序列

sense strand：5′-GAACAGUGGUUUGGCAACA dTdT-3′<SEQ ID NO.1>，

antisense strand：3′-dTdT CUUGUCACCAAACCGUUGU-5′<SEQ ID NO.2>，

(2)CD44v6引物序列

forward primer：5′-GCA CAA TCC AGG CAA CTC C-3′<SEQ ID NO.3>，

reverse primer：5′-GCT GTC CCT GTT GTC GAA TG-3′<SEQ ID NO.4>，

(3)β-actin引物序列

forward primer：5′-TGG CAC CCA GCA CAA TGAA-3′<SEQ ID NO.5>，

reverse primer：5′-CTAAGTCAT AGTCCGCCT AGAAGC A-3′<SEQ ID NO.6>

实施例1、PPS纳米颗粒的制备

1、聚乙二醇接枝聚乙烯亚胺(mPEG-g-PEI)的合成。

称取4.0g单甲基醚聚乙二醇(mPEG-OH，2kD)于干燥两口瓶中60℃真空干燥8h，冷却后Ar保护下加入30mL已干燥的四氢呋喃(THF)，充分溶解。称取N，N’-羧基二咪唑(CDI)3.2g置于另一干燥两口瓶中，Ar保护下将溶有mPEG-OH的THF溶液缓慢滴加到两口瓶中，室温下继续搅拌反应12h。加入200μL水使过量的CDI失活，反应进行0.5h，用大量无水乙醚沉淀2次，过滤后干燥得白色粉末状固体。

再称取支化聚乙烯亚胺(hy-PEI，25kD)1.1g和上述白色粉末0.8g共溶于20mL CHCl₃，室温下继续搅拌反应24h。而后通过再生纤维透析除去CHCl₃，部分溶质在常压下挥发，将浓缩后的溶液用大量无水乙醚沉淀3次，收集沉淀物干燥得白色粉末状固体，产率为80％。对产物进行核磁共振分析(H-NMR)，其结果为：¹H-NMR in CDCl₃：2.5-2.9ppm(m，-CH₂CH₂NH-)，3.4ppm(s，CH₃-OCH₂CH₂-)，3.65ppm(s，-OCH₂CH₂-)，4.2ppm(t，-OCH₂CH₂-O(C＝O))。与理论值相符，从而表明PFG成功接枝于PEI分子链中。

2、PPS的制备。

将300mg mPEG-g-PEI溶解于3ml氯仿中，而后使15mg超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPION，55kD)均匀分散于该溶液中，室温下继续搅拌过夜。而后加入大量正己烷沉淀，离心收集沉淀物，用正己烷洗涤2次，而后进行真空干燥除去有机溶剂。将上述得到的产物通过超声波均匀溶解于双蒸水，并通过200nm超滤膜除去大的凝聚颗粒。

需要说明的是，实施例1仅仅是本发明中制备PPS的一种实现方式，其中采用的单甲基醚聚乙二醇(mPEG-OH，2kD)和二支化聚乙烯业胺(hy-PEI，25kD)均购自Sigma公司，而超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPION，55kD)由中山大学化学与工程学院合成提供，PPS也是根据实施例1中方案委托中山大学化学与工程学院合成，通过对胶粒理化性质的测试，超顺磁性氧化铁纳米粒子占胶粒质量的55％。当然，在本发明的其他实施例中，对于PPS的制备也会根据需要，对其用料和方法上做出调整，以实现解决本发明的技术问题为准。为此，本发明的技术方案中，超顺磁性氧化铁纳米粒子控制在40-60kD之间，优选控制在50-60kD之间，最优为55KD；聚乙二醇-聚乙烯亚胺控制在40-60kD之间，优选控制在40-50kD之间，更优控制在42-48kD之间，最优为45KD。而PPS纳米颗粒的平均粒径则应控制在60-80nm之间，表面zeta电位为30-40mV。采用上述分子量范围内或者本发明实施例中所用的成分，能够使本发明的siRNA载体与待输送的siRNA有效结合，提高siRNA的输送效率，对RNA干扰效果有积极的影响。

实施例2、PPS/siRNA复合物的制备及其理化性质的测定

1、PPS溶于灭菌去离子水，按照不同的N/P比值，将一定量的siRNA溶液与PPS溶液在去离子水或PBS中轻轻混匀，室温下静置孵育10-15分钟，即得到不同N/P值的PPS/siRNA复合物。

其中，PPS/siRNA N/P比值计算公式

2、粒径和电位的测定

按N/P比值5，10，15，20形成PPS/siRNA复合物，各复合物所含siRNA量设定为10μg，用去离子水稀释至500μl，用Zeta-Plus粒度分析仪测定复合物的粒径和电位。每个样本测定5次，所得数值表示为均数±标准差。

测定结果表明，PPS的平均粒径是67.3±2.0nm，表面zeta电位为34.38±1.66mV。当其与siRNA复合形成PPS/siRNA复合物后，粒径和电位随N/P比值的增加而变化，详见表1。N/P＝5和10时，复合物粒径分别为98.5±2.2nm和93.8±0.6nm，随着N/P比值增加粒径缩小，当N/P＝20时复合物粒径为88.4±2.6nm。此外，复合物的zeta电位随着N/P比值增加而增大，N/P＝5和10时，zeta电位分别为4.18±0.18mV和15.10±0.64mV，而N/P＝20时，zeta电位增加至18.22±1.20mV。

表1不同N/P比值下PPS/siRNA复合物的粒径和电位

数据以均数±标准差表示。

3、凝胶阻滞电泳

凝胶阻滞电泳用于评估PPS复合siRNA的能力。按照不同的N/P比值(1-10)，合成PPS/siRNA复合物，各复合物所含siRNA量设定为10pmol。将复合物分别与6×DNA上样缓冲液、胶体金溶液混匀后上样，在1％的琼脂糖凝胶上恒压100V电泳15分钟。在UV凝胶成像仪上观察条带并照相。

带负电荷的siRNA在电场中从负极向正极泳动。当带正电荷PPS按不同的N/P比值复合siRNA后，部分或全部中和siRNA所带的负电荷，从而使siRNA在电场中无法泳动。如图1所示，以裸siRNA作为对照组，随N/P增加(1-10)，siRNA条带亮度减弱。当N/P＝5时，siRNA条带基本消失；当N/P＝10时，siRNA条带消失，表明PPS完全复合siRNA并将siRNA所带的负电荷完全中和，故无siRNA泳出。

实施例3、细胞培养及细胞毒性试验

1、细胞培养

人胃腺癌细胞株SGC-7901、人胃正常上皮细胞株GES-1、人恶性黑色素瘤细胞株A375在含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，恒温37℃，5％CO₂培养箱中培养。

2、细胞毒性试验

为评估PPS/siRNA复合物对SGC-7901的细胞毒性，进行MTT实验。每组设3个复孔，该实验独立重复3次，所得数值表示为均数±标准差。

(1)SGC-7901细胞接种在96孔板，5×10³/孔，贴壁生长24小时。

(2)去除旧培养基，加入N/P比值为1.25，5，10，20的PPS/siRNA复合物及新鲜培养基共200μl，各复合物所含siRNA量设定为100nM。空白组仅含DMEM培养基，对照组含细胞和DMEM培养基。

(3)37℃，5％CO₂培养箱中培养48小时后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4小时。

(4)去除培养基和MTT溶液，每孔加入DMSO溶液150μl，室温下摇床混匀10分钟。

(5)以空白组调零，酶标仪检测492nm吸光度值。

细胞存活率(％)＝(A_实验组/A_对照组)×100％。

PPS/siRNA复合物对SGC-7901细胞的毒性作用通过MTT试验观察。SGC-7901细胞接触不同N/P比值的PPS/siRNA复合物48小时后，细胞存活率如图2所示。N/P＝5时，细胞存活率为90.37％±1.54％，随着N/P比值的增加，细胞存活率有所下降，当N/P＝10和20时，细胞存活率分别为79.61％±2.06％和69.02％±1.34％。

实施例4、转染率测定实验

按如下步骤测定转染率：

(1)转染前24小时，SGC-7901细胞以2×10⁵个细胞/孔的密度接种于6孔板中，37℃，5％CO₂培养箱中培养。

(2)按不同的N/P比值3，5和10分别制备PPS/siNC-Cy3复合物。100pmol荧光标记的siNC-Cy3和一定量的PPS水溶液先后加入400ulPBS溶液中，轻轻吹打混匀，室温下孵育10-15分钟。

(3)弃去6孔板中旧DMEM培养基，每孔加入1.6ml新鲜的DMEM完全培养基。然后将上述400μl混合物逐滴加入孔板中，轻轻摇匀。

(4)同时以lipofectamine作为对照，lipofectamine/siNC-Cy3复合物的形成参照Lipofectammine 2000说明书进行。

(5)37℃，5％CO₂培养箱中培养4小时后，去除旧DMEM培养基，每孔加入2ml新鲜的DMEM完全培养基，继续培养。

(6)12小时后去除旧培养基，PBS轻轻洗细胞一遍后，用0.25％的胰酶把细胞从6孔板上消化下来，1,000转离心5分钟，去上清。

(7)PBS重悬细胞，1,000转离心5分钟，去上清。

(8)用0.5ml PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测。

以上均为避光操作。

用红色荧光标记的siNC-Cy3检测PPS的转染率，并以lipofectamine为对照组。如图3所示，N/P＝3，5和10时，PPS的转染率均超过95％，与lipofectamine相仿。此外，随着N/P比值增加，PPS转染率并没有明显增加。

实施例5、荧光成像和普鲁士蓝染色

(1)为观察PPS/siNC-Cy3复合物在SGC-7901细胞内的分布情况，转染后4小时后，去除旧培养基，PBS轻轻洗细胞一遍后，加入2ml PBS，并在荧光显微镜下观察细胞荧光图像。避光操作。

(2)由于PPS含有四氧化三铁，可在普鲁士蓝染色下显示蓝色颗粒，从而可以进一步证实PPS在SGC-7901细胞内。

细胞荧光图像观察结束后，去除PBS，用4％多聚甲醛室温下固定细胞10分钟。

PBS轻轻洗细胞2遍后，加入含3％HCl和1％亚铁氰化钾的普鲁士蓝染色液，37℃孵育30分钟。

去除染色液，PBS轻轻洗细胞2次，显微镜下观察铁染色情况。

如图4所示，实验结果表明，转染4小时后荧光显微镜和普鲁士蓝染色观察SGC-7901细胞内PPS/siNC-Cy3复合物分布情况：红色荧光出现在细胞胞浆，表明PPS/siNC-Cy3复合物已进入细胞内。普鲁士蓝染色后可见蓝色颗粒出现在细胞浆，进一步证实PPS已在细胞内。

实施例6、siCD44v6转染SGC-7901细胞

选取N/P＝10通过PPS向SGC-7901细胞转染siCD44v6。同时以lipofectamine作为对照。按上述实施例4中转染率测定实验的(1)-(5)步骤进行。

3.10qRT-PCR试验

(1)Trizol法抽提RNA

①转染48小时后，6孔板每孔加1mlTrizol，反复吹打细胞，并转移至1.5mlEP管，室温静置5分钟。

②每个EP管加入0.2ml氯仿，盖紧盖子后，用力摇晃15秒，室温静置2-3分钟。

③4℃，12,000×g离心15分钟。

④小心吸取上层水相(约400ul)到另一新的1.5mlEP管中，内含有细胞总RNA。

⑤加入0.5ml异丙醇，上下颠倒8次，室温静置10分钟。

⑥4℃，12,000×g离心10分钟。

⑦去上清，每个EP管加入1ml冰上预冷的75％乙醇(用DEPC水配)，吹打重悬附着在管壁的白色絮状沉淀物(为RNA)。

⑧4℃，7,500×g离心5分钟。

⑨去上清，室温干燥5-10分钟。

⑩每管加入30-40ul DEPC水，吹打重悬干燥后的RNA。

(2)RNA琼脂糖电泳

①电泳槽处理：去污剂洗干净；水冲洗；乙醇干燥；灌满3％的双氧水溶液，静置10min；0.1％DEPC冲洗。

②电泳缓冲液(TBE)：Tris 54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)20ml，加水至500ml，用时稀释至0.5×TBE工作液。

③制备1.5％琼脂糖凝胶：0.30g琼脂糖+18ml DEPC水+10×TBE 2ml置于微波炉中融化。

④在5v/cm的电压下电泳至溴酚蓝带跑到电泳槽中央，以确定RNA的纯度。若出现清晰的28S、18S条带，5S带比较模糊，表明所提取RNA无明显降解。

(3)分光光度计测定RNA的OD₂₆₀和OD₂₈₀值

用紫外分光光度计测定提取RNA的OD₂₆₀和OD₂₈₀值，以评估其纯度和计算其浓度。OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值在1.8-2.0之间，表明RNA无明显蛋白质污染。RNA原液浓度＝OD₂₆₀×稀释倍数×40(ng/μl)。

(4)cDNA的合成

①在PCR管中加入以下反应混合物(冰上操作)

②轻轻混匀，微型离心机离心3-5秒。

③反转录反应条件如下

37℃ 15min

85℃ 5sec

④合成的cDNA放-20℃保存备用。

(5)Real Time PCR反应

①在96孔PCR板中每孔加入以下PCR反应液(冰上操作)

②4℃，3,000×g离心3分钟。

③按下列反应条件进行Real Time PCR反应

实施例7、Western blot试验

(1)细胞总蛋白提取

转染72小时后提取细胞总蛋白，过程如下：

①去除6孔板内旧培养基，用PBS轻轻洗细胞一遍。

②每孔加入100μl RIPA和1μl PMSF(终浓度为1mM)。

③细胞刮刮数下，使裂解液与细胞充分接触，冰上裂解30分钟。

④4℃，12,000×g离心30分钟。

⑤小心吸取上清，内含有细胞总蛋白，-80℃保存备用。

(2)蛋白浓度测定

BCA-100蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度(96孔板法)，具体过程如下：

①按每个反应使用200μl Solution A、4μl Solution B准备A+B混合液，混匀后使用，即配即用。每个样品要做3个平行反应。

②BSA标准品和样品的准备：样品用三蒸水配制，稀释5倍(5μl蛋白原液+20μl三蒸水)，使待测定的浓度位于标准曲线的线性部分。每个反应准备3个平行测定。标准曲线一般取5-6个点即可，根据样品的浓度确定各点的具体浓度。BSA也用三蒸水稀释。按下表的次序加入BSA标准品或样品及Solution A+B混合液，混匀。具体情况如表2所示。

表2BSA标准品和样品的浓度情况

③盖上盖子混合30秒，37℃孵育30分钟。

④冷却至室温。

⑤酶标仪上测定562nm的吸光度值(OD值)。

⑥用蛋白测定浓度软件分析并绘制标准曲线。未知样品的浓度可以从标准曲线中查得，实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。

(3)制胶。依次制备8％分离胶和5％浓缩胶。

(4)蛋白变性。蛋白样品与5×蛋白上样缓冲液混匀，置于100℃水浴8分钟，瞬时离心，冷却至室温。

(5)上样。每孔20μl，根据测定的蛋白浓度计算每孔所加的样品量，不足20μl用RIPA不足。并在边缘孔上预染蛋白marker。

(6)电泳。浓缩胶80V恒压电泳，当溴酚蓝至分离胶时，改用120V恒压电泳，至溴酚蓝至分离胶底部，停止电泳。

(7)转膜。标记好的PVDF膜置于甲醇中活化10min后放入转移缓冲液中备用。从玻璃板中取下凝胶，按照一定的顺序将海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜置放于电转夹上，放入电转槽中，200mA恒流电转130min。

(8)封闭。转膜后，取出PVDF膜，TBST洗10min，置于封闭缓冲液中室温封闭2h。

(9)孵育一抗。用抗体稀释液稀释一抗(CD44v6 mAb 1∶1000，β-actin mAb1∶1000)。根据预染蛋白marker大小切PVDF膜，分别孵育一抗，4℃过夜。TBST洗膜10min×3次。

(10)孵育二抗。用抗体稀释液稀释二抗(1∶5000)，室温孵育二抗1小时。TBST洗膜10min×3次。

(11)曝光。把PVDF膜置于曝光盒内，均匀涂上化学发光液，盖上胶片，暗室内曝光1-5min。把胶片置于显影液中显影，定影液中定影。观察条带。用Quantity One软件分析图像。

实施例5A和5B的实验结果能够表明采用PPS/siCD44v6对CD44v6的基因沉默效果。具体实现时，根据粒径、电位、siRNA复合能力、细胞存活率和转染率，选择N/P＝10作为最佳N/P比值进行siCD44v6转染SGC-7901细胞。并以lipofectamine作为对照组，β-actin作为内参。如图5A所示，qRT-PCR结果表明PPS/siCD44v6组和lipofectamine/siCD44v6组均可在mRNA水平沉默CD44v6，沉默效率分别为0.5550±0.031(^*p＜0.05)和0.1332±0.025(^*p＜0.05)。

Western blot试验进一步验证蛋白水平沉默效率。如图5B所示，以β-actin作为内参，PPS/siCD44v6组和lipofectamine/siCD44v6组的CD44v6蛋白表达量均较阴性对照组低。通过Quantity One软件分析条带亮度，结果显示PPS/siCD44v6组和lipofectamine/siCD44v6组的CD44v6蛋白表达分别下降至0.6622±0.061和0.3844±0.032。

实施例8、迁移和侵袭试验

(1)侵袭试验前，在Transwell小室的上室铺BME胶，置于37℃4小时，待胶凝固后备用。迁移试验无需铺胶。迁移和侵袭试验以下步骤相同。

(2)SGC-7901细胞转染72小时后，从6孔板消化下来，并用无血清高糖DMEM培养基重悬，按1×10⁵/孔接种在Transwell小室的上室，在下室加入500μl含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基诱导其迁移、穿过8μm孔径的聚碳酸酯膜。

(3)37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养12小时(迁移试验)或36小时(侵袭试验)。

(4)取出小室，用棉签轻轻擦去上室面细胞。

(5)4％多聚甲醛室温下固定下室面细胞15min。

(6)PBS洗2次，棉签擦干上室面，室温下风干5min。

(7)0.1％结晶紫染色15min，用双蒸水洗3次，室温下风干5min。

(8)置于显微镜下观察，每小室各取5个200×视野，计数穿膜细胞数，求得单个视野的平均穿膜细胞数。

qRT-PCR和Western blot证实PPS/siCD44v6和lipofectamine/siCD44v6均可沉默CD44v6后，进行迁移和侵袭试验观察沉默CD44v6对SGC-7901细胞迁移和侵袭能力的影响。如图6所示，PPS/siCD44v6组和lipofectamine/siCD44v6组使SGC-7901细胞的迁移能力分别下降了44.29％和61.54％，而侵袭能力则分别下降了65.88％和76.66％。说明CD44v6与对SGC-7901细胞迁移和侵袭能力密切相关，而PPS/siCD44v6复合物可有效地抑制SGC-7901细胞的迁移和侵袭能力。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种真核细胞转染液，该转染液包括siRNA和siRNA输送载体，所述siRNA被吸附于siRNA输送载体形成复合物；其中，所述的siRNA输送载体的活性成分为超顺磁性氧化铁纳米粒子与聚乙二醇-聚乙烯亚胺偶联形成的纳米颗粒；siRNA为siCD44v6，所述siCD44v6具有如下序列：

sense strand：5'-GAACAGUGGUUUGGCAACA dTdT-3'<SEQ ID NO.1>，

antisense strand：3'-dTdT CUUGUCACCAAACCGUUGU-5'<SEQ ID NO.2>。

2.根据权利要求1所述的真核细胞转染液，其中，所述聚乙二醇-聚乙烯亚胺为单甲基醚聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺形成的水溶性共聚物，所述水溶性共聚物通过配体交换包裹超顺磁性氧化铁纳米粒子。

3.根据权利要求1所述的真核细胞转染液，其中，所述超顺磁性氧化铁纳米粒子的分子量控制在40-60kD之间，聚乙二醇-聚乙烯亚胺的分子量控制在40-60kD之间。

4.根据权利要求1所述的真核细胞转染液，其中，所述纳米颗粒的平均粒径为60-80nm，表面zeta电位为30-40mV。

5.根据权利要求1所述的真核细胞转染液，其中，所述复合物的N/P比值控制在5-20之间。

6.如权利要求1-5之一所述的真核细胞转染液在在制备癌症基因治疗药物中的应用。

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